JPS5843786A - スフインゴミエリナ−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、発酵法によるスフインゴミエリナーゼの製造
法に関するもので、さらに詳しくは、ストレプトマイセ
ス属に属するスフインゴミエリナーゼ生産菌を培地に培
養し、培養物からスフィンゴミエリナーゼを採取するス
フインゴミエリナーゼの製造法に関するものである。

従来、スフィンゴミエリンに作用してセラミドとホスホ
リルコリンを生成するスフィンゴミエリナーゼ生産菌と
して、スタフィロコッカス・オーレウス（５ｔａｐｈｙ
ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　）およびバチルス本
発明者らは、上記スフインゴミエリナーゼを生産する微
生物について探索を進めた結果、土壌微生物中、ストレ
プトマイセス・エスピー・Ａ９１０７（８ｔｒｅｐｔｃ
ｍｙｃｅｓ　ｓｐ、ム９１０７）の放騙菌が本酵素を′
生産することを見い出し、本発明を完成するに到ったの
である。

ストレプトマイセス・エスピー・Ａ９１０７は静岡県田
方郡戸田村のダイコン畑土壌から分離したもので、その
菌学的性状は次のとおりである。

（Ｉ）　　形態的性状 肉眼的視察によると、熟成した胞子を着生し九気菌糸は
、褐色ないし灰色を呈し、基生菌糸は黄色ないし黄褐色
で可溶性色素は生成しない。

スターチ無機寒天培地上で３０℃、１０日間培養し、観
察した所見は次のようである。なお、オート・ミール寒
天およびイースト・エキス・麦芽エキス寒天培地上でも
、はｙ同様の形態が観察された。

気菌糸は直径０．８〜１．０μ、直状ないし波状で単純
分岐をなして伸長し、多数の胞子の連鎖を形成する。胞
子の連鎖はまっすぐないし波状で、螺旋は形成しない。

胞子は短円柱状で、大きさ１．０〜１，２　Ｘ　１．５
〜２．０μであり、その表面は平滑である。基生菌糸は
分岐をなして波状または屈曲状に伸長し、直径０．５〜
０．７μであシ、菌糸の分裂や胞子の着生Ｆｉ認められ
ない。鞭毛胞子や胞子のうけ形成しない。

（２）　ジアミノピメリン酸組成 Ｌ−ジアミノピメリン酸が検出された。

［株］　培養性状 各種培地上で３０℃、２０日間培養した所見は表に示す
とおシである。なお、色の表示は、□ Ｃｏ１ｏｒ　Ｈａｒｍｏｎｙ　Ｍａｎｕａｌ第４版”：
」？　５８年。

Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　
Ａｍｅｒｉｃａによる色の分類にしたがった。

■生理的性状 （１）生育温度範囲＝１０〜４０℃ （２）ゼラチンの液化：陽性 （３１スターチの加水分解：陽性 （４）脱脂牛乳：ペプトン化および凝固ともに陽性（５
）メラニン様色素の生成：陰性 （６）糖の利用性：陽性；Ｌ−アラビノース、Ｄ−７ラ
クトース、Ｄ−グルコースおよびＤ−キシヒース、隘性
；ｉ−イノシトール、Ｄ−マンニトール、ラフィノース
、Ｌ−ラムノースおよびシュクロース 上記のように、Ａ９１０７株は分裂を生じない真生の基
性菌糸よシ、多数の胞子の連鎖を有する気菌糸を生じ、
また菌糸の直径および胞子の大きさ、さらにはＬ−型の
ジアミノピメリン酸を有することより、ストレプトマイ
セスに属するものである。よって、Ａ９１０７株をスト
レプトマイセス・エスピーＡ？１０７と称することとし
、工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した（微工研
菌寄第４９７８号）。

本発明における使用菌としては、上記したストレプトマ
イセス・エスピーＡ９１０７のみでなく、ストレプトマ
イセス属に属しスフインゴミエリナーゼを生産する菌で
あれば、すべて用いることができる。

本発明において使用する培地としては、プロトフラワー
１〜５チ、コーンスターチ０．５〜３チ、ＫＣｔＯ０１
〜０．５チ、ＣａＣ０，０，１〜０．５　％　、ジスフ
オームＢＣ−５１ＹＯ，１チよシなるｐＨ７，０の培地
が好ましく、培養は通気攪拌下に２４〜２８℃で４０〜
５０時間行なう。これによって、培養液中にスフインゴ
ミエリナーゼが生成蓄積される。

培養終了後、培養液よシスフインゴミエリナーゼを採取
精製するに当って、菌体外に分泌されたスフインゴミエ
リナーゼは、硫安等の無機塩類による塩析、アセトン、
エタノール等の有機溶媒を用いる沈澱分画、またはＣＭ
　−盤ロース、七７７Ｑ−＝２、−１！７アデツクス、
ＳＰ−セファデックス等の陽イオン交換担体を用いる吸
着クロマトや、セファデックスＧ−７５、Ｇ　１００、
バイオゲルＰ−１００等、のゲル沖過剤を用いる分子ふ
るいクロマト等の操作により、電気泳動的に単一な酵素
標品を得ることができる。

得られる酵素の諸性質を示すと次のとおシである。

（１１作用 スフィンゴミエリンに作用して、セラばドとホスホリル
コリンを生成する反応を触媒する。

＋２１　　酵素活性測定法 下記の反応組成液０．４５−を３７℃で前培養した後、
酵素液５０μｔを加え、反応を開始し、正確に１０分後
、０．１　Ｍ　ＥＤＴＡ　０．１−を加えて反応を止め
る。

０．２　Ｍ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣｔバッファーｐＨ８，０
０，２ｍｌ　０　ｍＭ　ＭｇＣ４０，０５ｚ ｌ　　０　ｍＭ　スフィンゴミエリンエマルジョン　　
　　０．０　５　＃５チ　　　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　−１
０００，０５＃Ｈ２０“：九　　　　　Ｏｊ　Ｏ＃ 生成したホスホリルコリンを下記の反応組成液により　
Ｈｅ（ｈ　、さらに発色系にまで導き、５００ｎｍにお
ける吸光厩を測定する。

Ｃ０Ｄ（５０ｕ／ｍ）　　　　　　　　　０，１　ａｄ
Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　（４０ｕ
／ｄ）　　０．１　＃ＰＯＤ（４５ｕ／ｄ）　　　　　
　　　　０，１　＃０．３チ４−アミノアンチビン　　
　　　　　０．１１Ｏ０２チフエノール　　　　　　　
　０．１１Ｈ叩０１．９Ｉ 酵素活性標示は、１分間１μｍｏｔのホスボリルコリン
を生成する活性を１単位とし、次の計算式によシ算出し
た。

Ｕｎｉｔ／ｓ（＝ΔＡ５００ｎｍ　Ｘ　００２５Ｘ２０
Ｘ止０ （ΔＡ５００ｎｍは反応時間１０分間のｓ　ｏ　ｏ　ｎ
ｍにおける吸光度差を示す。） （３］　　至適ｐＨ 酵素活性測定法の反応液中のＴｒｉｓ−ＨＣＩバッファ
ーを、０．２Ｍジメチルグルタルｉｌ　−ＮａＯＨバッ
ファー　ｐＨ５〜７．０．２　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｔ
バッファーｐＨ７、２〜９．０．２Ｍグ９ｙンーＮａＯ
Ｈハッ７７−ｐＨ９，５〜１０に換えて測定した結果を
第１図に示した。

ｐＨ７〜８で最もよく作用する。

１４１　９Ｈ安定性 酵素液を１００　ｍＭの種々のバッファー、ｐＨ５〜７
グルタル酸ジメチル−ＮａＯＨバッファー、ｐＨ８〜？
　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｔバッファー、ｐＨ１０グリシン−
ＮａＯＨバッファに、２６ｕ／−になるように溶解した
酵素液を４０℃、６０分処理後の残存活性を求めた。第
２図に示すように、ｐＨ６〜９の範囲で安定である。

（５）熱安定性 １００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｔバッファーｐＨ７，
０に２３Ｕ／−になるように調製した酵素液を、第３図
の横軸に示した各温度で１０分間加熱した後の残存活性
を求めた。４０℃、１０分間処理までは安定に保たれ喪
。

（６）金属イオンの影響 相対活性（チ） 無添加　　　　　　１００ １　ｍＭ　ＭｇＣｔ４２５２ ＃　　ＣａＣ１４４８ ＃　　Ｍｎｅｔ、　　　　　２５６ １　ｍＭ　　ＺｎＣｌ４　　　　　　　　　　　　３’
　　　ＮｉＣ４１２ ＃　　　ＢａＣ／、　　　　　　　　　　　　　８９’
　　　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　　　３５＃　　　
ＣｕＣ１４１？ １００ｍＭ　ＮａＣ１７３ ＃　　　ＫＣｔ　　　　　　　　　　　　　　９ＱＩ　
　　ＮＨ，Ｃｔ　　　　　　　　　　　　　７９（７）
界面活性剤の影響 相対活性（チ） 無添加　　　　　　　　　１００ ０．１　　　％　　　）　　　リ　　ト　ン　Ｘ−１０
０３５８Ｉ　　アデカト−ｈＢｏ−１４５５６７Ｉ　　
アデカトールＰＣ−８４２６ Ｉ　　アデカトールＬ−６１２６７ １デオキシコール酸ナトリウム　　１６１　　ラウリル
硫酸ナトリウム　　　１３（８）分子量 精製酵素を用い、５Ｄｓ−ポリアクリルアミド電気泳動
法によシ求めた値は５６，０００（９）等電点 キャリアアンフオライトを用いた電気泳動法によシｐＨ
８，６ ０１基質特異性 相対活性（チ） スフィンゴミニリフ　　　　１００ レシチン　　　　　　　　　　　Ｏ リゾレシチン　　　　　　　　　０ ホス７アチジルエタノールアミン　　　　０ホス７アチ
ジルセリン　　　　　　０ ホスフアチジルイノシトール　　　０ 次に、本発明の実施例を挙けて説明する。

２．１ｉ 実施例１ プロトフラワー１．０％、コーンスターチ２チ、ＭＣＩ
　０．５　Ｔｏ％ＣａＣ０，０，４−％　ジス７オーム
ＢＣ−５１Ｙ　Ｏ，１嘔、ｐＨ７，０の培地２０ｔを１
２ＤＣ。

２０分間加圧滅菌する。２６Ｃに温度調節後、同上組成
の培地で３日間前培養したストレプトマイセス・エスピ
ーＡ−９１０７の培養液４０（１ｗｔｔ−３０を容ジャ
ーファメンターに移植する。３００ｒ　ｐｍ　、　２０
　ｌ／ｉｗｗ　（）通気攪拌条件下で、４３時間後に菌
体外の酵素力価は最大値（４，６ｕ／讐）に達した。菌
体を５００Ｏｒｐｍ、１０分間の遠心分離によシ除去す
ると、粗製のスフィンゴミニリナーゼ溶［１５ｔが得ら
れた。

実施例２ 実施例１に示した方法によって得られた酵素液１５ｔを
減圧濃縮して３ｔにする。この濃縮液に−２００に冷却
し・たアセトン５ｔを加え、酵素を沈澱させる。この沈
澱物を１ｔの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔバッファーｐ　
Ｈ７’、５　Ｋ溶解させる。この溶液を２０ｔの１０　
ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬバッファーＰ　Ｈ７，５に対し
て透析し、凍結乾燥すると、粉末８．４１が得られた（
　５，８ｕ、Ａ号）。

実施例３ 実施例２の方法で得られる粉末２．ｏ？を１０−酢酸バ
ツフアーｐ　Ｈ５，５５０−に溶解し、同じバッファー
で緩衝化したＳＰ−セファデッｐｘｃ−２５カラム（１
，ｓ　Ｘ　２　ｏａａ）に通し、酵素を吸着させる。そ
の後、２５ｏ−の１０ｍＭ酢酸バッファーと０．２ＭＫ
Ｃ４を含む２５０Ｗ１ｔＯバツフアーとで作製した直線
濃度勾配法による溶出を行なった（流速２０　ｍｌ／　
ｈｒ　］。各画分の活性を測足し、活性画分（Ｎｎ４８
−５８．９５−）を集め。

これをアミコン社限外濾過１［ＸＭ−５０で濃縮後、セ
ファデックスＧ−７５のｐうＡ　（３，Ｏｘ　９　ｏａ
ｔ。

１０ｍＭジメチルグルタル酸バッファー）にかけ、活性
画分（ｒｌｈ２１−２８．５２７）ｌ集Ｊ６テ、凍結乾
燥によｐ５．０■の精製＃累（比活性１．０５０ｕ　／
ｑ　）が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で得られるスフィンゴミニリナーゼの至
適ｐＨの測足結果を示すグラフ、第２図は同ｐＨ安定性
についての測足結果を示すグラフ、第３図は同熱安定性
について測足した結果を示すグラフである。 代理人　　清　水　　１２．些ｈ １′−町−５・９Ｉ 乍亡ン

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ＋ｌ＋　　ストレプトマイセス属に属するスフィンゴミ
   エリナーゼ生、産菌を培地に培養し、培養物からスフイ
   ンゴミエリナーゼを採取することを特徴とするスフイン
   ゴミエリナーゼの製造法。 ｔ２Ｊ　　ストレプトマイセス属に属するスフインゴミ
   エリナーゼ生産菌がストレプトマイセス・エスピー・Ａ
   ９１０７菌株である特許請求の範囲第１項記載のスフイ
   ンゴミエリナーゼの製造法。