JP3122333B2 - 赤血球を原料とするスフィンゴミエリンおよびセラミドの新規製造方法とセラミド配合治療剤又は化粧品 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は皮膚の保湿成分として利
用するセラミドの製造方法に関し、従来知られていなか
った安価かつ大量にセラミドを取得するその製造方法を
提供する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類の神経組織がセラミドの誘導体で
あるスフィンゴ脂質を含有していることが知られてい
る。ウシの脳のスフィンゴ脂質はセラミドにまで誘導す
ることなく、そのまま化粧品原料として利用されてい
る。（特開昭６４−１６７０８号公報。化粧品種別配合
成分規格「ウシ脳抽出エキス」「ウシ脳脂質」参照） 一方、スフィンゴ脂質を分解してセラミドに導く方法と
して、以下のものが報告されている。 ・フッ化水素を用いる加水分解（Reddy, P. V. ; Natar
ajan, V. ; Sastry,P. S. : Chem . Phys. Lipids, 197
6, 17, 373 〜7 参照）。 ・細菌が産生するホスホリパーゼによる酵素分解。 しかしこれらの方法を応用したセラミドの製造方法は報
告されていない。本発明のように、家畜類・家禽類の赤
血球を原料として、安価にスフィンゴ脂質類からセラミ
ドを取得する方法は今日までに確立されていない。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】皮膚炎などの疾患、
または生理的な条件や乾燥などの環境によって、皮膚か
ら水分が失われ肌荒れがおきる。肌荒れは美容上の問題
であることはもちろん、皮膚の持つ保護作用の低下につ
ながり皮膚医学上も好ましくない。この肌荒れに対して
は、医薬品として軟膏剤やローション剤などの外用剤、
化粧品としてクリームや乳液・ローションがもちいられ
る。これらの製剤は機能的には皮膚の水分を２０％前後
の健康な状態に保つものである。この目的には、従来は
皮膚上に存在する皮脂膜と類似の機能を持つ乳化製の基
剤や、また皮膚中に存在する乳酸やピロリドンカルボン
酸・アミノ酸類などの天然湿潤因子（ＮＭＦ）といわれ
る成分が用いられている。

【０００４】近年、セラミドを主体とした角質細胞間の
脂質が、皮膚の水分を保持する機能を持っていることが
判ってきた。肌荒れに対して用いる製剤にさらに充分な
量のセラミドを配合することにより、その効果を高める
ことができる。そこでセラミドの安価で大量の供給が求
められていた。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】化粧品原料として用い
られているスフィンゴ脂質類（セラミドの誘導体である
スフィンゴミエリン、グルコシルセラミドなど）は、角
質細胞間の脂質中には存在しないとされている。これら
の物質にはホスホリルコリンや糖などの極性の高い大き
な置換基があるため、セラミドとは性状に大きな差異が
ある。皮膚が持つ本来の保水機能を補完するために、本
発明者らは“セラミド”そのものを応用することをめざ
して、セラミドの製造方法につき鋭意研究し、生物試料
からスフィンゴ脂質を効率よく抽出して、さらにセラミ
ドに変換する方法を開発した。そのために、まずセラミ
ドを取得するための安価な原料ソースを探求した。従来
は前述の特開昭６４−１６７０８とその引用文献および
化粧品種別配合成分規格「ウシ脳抽出エキス」「ウシ脳
脂質」の如く、スフィンゴ脂質の原料を主にウシ脳など
の神経組織に求めている。しかしその資源の量は限られ
ているため高価であり、充分な供給量は賄い難い。そこ
で本発明者らはセラミドの資源として赤血球に着目し
た。

【０００６】家畜・家禽は食用の用途から大量に飼育さ
れ、屠殺されるたびに大量の血液が発生することは周知
の事実である。組織培養の培地などの需要から、血液か
らは血清や血漿蛋白が大量に製造されている。また血液
から血清を得た残りの血球からは、ヘモグロビンが抽出
され医薬品や食品などに利用されている。その一方で、
血液から血清とヘモグロビンを製造して最後に残る赤血
球膜には現在のところ需要がなく、経費をかけて廃棄し
ているのが現状である。赤血球膜からのスフィンゴ脂質
の有効な抽出方法について鋭意検討を重ねた結果、極性
の高い脂質からグリセロリン脂質を分解して除去するこ
とにより、少ない工程数と安価な溶媒で純度の高いスフ
ィンゴミエリンを収率よく得ることができた。また赤血
球膜にバクテリアを接種して、含まれているスフィンゴ
ミエリンを直接にセラミドに導びいてから抽出する技術
も開発した。本発明の方式により脂質を抽出した赤血球
膜は、３／４程度の重量（乾燥重量）に減少し、水分も
失った無臭の固形物に圧縮されるので、高蛋白の飼料や
肥料への転用が容易になる。したがって赤血球をセラミ
ドの原料に利用することは、廃棄物に付加価値をもたら
し、環境の汚染を防止することにもつながる。

【０００７】次にスフィンゴミエリンからセラミドに導
く方法を検討した。スフィンゴミエリンは、ホスホリパ
ーゼＣやスフィンゴミエリナーゼにより特異的にセラミ
ドに変換できること、またクロストリジウム パーフリ
ンゲンス（Clostridium perfingens）やバチルス セレ
ウス（Bacillus cereus ）などのバクテリアがこれらの
ホスホリパーゼを産生することが知られている。セラミ
ドの１級水酸基とコリンリン酸のエステル結合は化学的
な加水分解には比較的に安定であるので、酵素をもちい
てこれを切断することにした。バクテリアから調製した
これらのホスホリパーゼが試薬レベルでは販売されてい
るが、工業的に利用するには非常に高価である（1000un
it（約１０mg）で＄200 程度）。本発明ではセラミドの
原料自体または、最も基本的な液体培地である普通ブイ
ヨンでB.cereusを培養することにより、ホスホリパーゼ
を簡便な方法で、安価に再生産しつつ利用している。さ
らにこの酵素の活性を保持するバイオリアクターを利用
することにより、セラミドの製造を効率的に実施するこ
とができた。

【０００８】赤血球中にはスフィンゴミエリンに匹敵す
る量のコレステロールが存在する。コレステロールの極
性はセラミドに似通っているため、本発明の方法で製造
した粗セラミドは、コレステロールとの混合物となる。
一方、皮膚の水分を保持する機能を持つ角質細胞間の脂
質は、セラミドとコレステロールが主成分であり、これ
らの成分が共存することにより結合水を強固に保持する
ことが知られている。そこでコレステロールとセラミド
の混合物であることは、皮膚の保湿剤としてはむしろ好
適である。しかし、ブタなどの赤血球を原料に求めた場
合はコレステロールの比率がかなり高くなるので、スフ
ィンゴミエリンからセラミドを生成させる前の段階で、
ある程度の量のコレステロールを除去することとし、そ
のための溶媒抽出を検討した。 ヘム鉄の残渣から得た
沈殿を各種の有機溶媒（ジエチルエーテル、ジクロロメ
タン、ヘキサン、ベンゼン、シクロヘキサン）で洗った
結果、ジクロロメタンで洗浄すると、特異的にコレステ
ロールの抽出効率が高く、スフィンゴミエリンのロスが
少ないことがわかった。

【０００９】

【実施例】以下に本発明をその好適な実施態様により説
明する。

【００１０】実施例１．赤血球からヘム鉄を製造する際
に発生する残渣から、セラミドを製造する方法を示す。
ブタの赤血球からヘモグロビンを分離した残りの液を中
和するために所用量のリン酸水素二ナトリウムを添加
し、生成する沈殿１０mlを分取し、バチルス セレウス
（Bacillus cereus ）（IAM 1208）を接種し、２０時間
振盪培養する。この沈殿にジクロロメタン５mlを加え
て、３０℃で２時間かき混ぜる。ジクロロメタン層を分
取し、沈殿をさらにジクロロメタンで抽出し、合せた有
機層を減圧留去して粗セラミド８１mgを得る。中和する
ために加えるものはリン酸水素二ナトリウムに限らず、
緩衝作用のある酸・塩基とその塩類ならば種類を問わな
い。

【００１１】実施例２．赤血球膜から脂質を抽出し、さ
らにスフィンゴミエリンを単離する方法を示す。採血し
ＥＤＴＡ・Ｎａ₂ を加えたウシの血液を遠心分離にかけ
て、赤血球を得る。得られた赤血球に１０倍量の０．２
％酢酸を加えて溶血させ、遠心分離により得た沈殿を水
でよく洗浄して赤血球膜を得る。凍結乾燥したウシの赤
血球膜４．００ｇをソックスレー抽出器にいれ、メタノ
ール２００mlで２回抽出する。抽出液を室温まで放冷
し、０．１Ｍの濃度になるように水酸化カリウムを加え
て溶解し、室温で２時間放置する。過剰のアルカリを濃
塩酸で中和した後、溶媒を減圧留去し、得られた固形の
脂質をアセトンでよく洗浄して、スフィンゴミエリン
０．６９ｇを得る。ヒツジ、ブタの赤血球膜について
も、上記と同様な方法でスフィンゴミエリンを得た。

【００１２】実施例３．細菌の培養液をもちいて、回分
式の操作でスフィンゴミエリンからセラミドを製造する
方法を示す。普通ブイヨンにバチルス セレウス（IAM
1208）を接種し、２０時間振盪培養する。培養液を遠心
分離（18000rpm, ３０分）にかけ、上清を取り出す。上
清１０mlにスフィンゴミエリン１００mgを加えてよく分
散させた後、ジエチルエーテル５mlを加えて、混合物を
３０℃でかき混ぜながら、１８時間反応させる。反応終
了後、エーテル層を分取し、反応液をさらにエーテルで
抽出し、合せた有機層を減圧留去して粗セラミド５１mg
を得る。

【００１３】実施例４．バチルス セレウスの培養液か
ら調製した粗酵素をもちいて、回分式の操作でスフィン
ゴミエリンからセラミドを製造する方法を示す。バチル
ス セレウスを普通ブイヨンに接種し、３０℃で１日
間、振盪培養する。培養液を５０００ｇで２０分間遠心
分離し、上清を７０％飽和 硫酸アンモニウムで塩析さ
せ、沈殿を分取して粗酵素を得る。スフィンゴミエリン
６７mgに０．１Ｍトリス緩衝液（pH７．４）５mlを加え
る。バチルス セレウスからの粗酵素１０mgとジエチル
エーテル５mlを加えて、混合物を３７℃でかき混ぜなが
ら、１８時間反応させる。反応終了後、エーテル層を分
けさらにエーテルで抽出し、合せた有機層を減圧留去し
て粗セラミド３２mgを得る。

【００１４】実施例５．固定化酵素を充填したカラムを
用いて、連続式の操作でスフィンゴミエリンからセラミ
ドを製造する方法を示す。０．１Ｍトリス緩衝液（pH
７．４）５０mlに、アンバーライト（Amberlite)ＸＡＤ
−８を１０ｇおよびバチルス セレウスの培養液から得
られる粗酵素５００mgを入れ、５時間かき混ぜる。吸着
した固定化酵素をろ過して集め、０．０３ＭＣａＣｌ₂
を含む０．１Ｍトリス緩衝液（pH７．４）２０mlで洗
う。緩衝液で湿らせた固定化酵素をカラムに充填し、
１．７mg/ml の濃度のスフィンゴミエリンを含有する
０．０３Ｍ ＣａＣｌ₂ を含有する０．１Ｍトリス緩衝
液（pH７．４）で飽和したジエチルエーテルを、０．４
ml/minの流速で７２時間流下させる。流出した液に飽和
食塩水とエーテルを加え激しくかき混ぜ、有機層を分け
さらにエーテルを加えて抽出し、合せた有機層の溶媒を
減圧留去して粗セラミド２．４５ｇを得る。

【００１５】実施例６．ブタの赤血球から実施例１．の
方法で製造した粗セラミドには、コレステロールが混入
している。そのコレステロールの量を調整するために、
ブタの赤血球からヘモグロビンを分離した残りの液を中
和して生成する沈殿１０mlを、同量のジクロロメタンで
洗浄した。この沈殿に高圧蒸気滅菌の処理をした後、バ
チルスセレウスを接種して、以下実施例１．と同様に操
作した。ジクロロメタンで洗浄する操作の有無と、得ら
れた粗セラミド中のコレステロールとセラミドの比率を
分析した結果を示す。 コレステロール セラミド（％） 未処理 ５８．３ ３７．４ ジクロロメタンで洗浄 ２９．３ ６５．２

【００１６】実施例７．女性患者５名にセラミドをプロ
ピレングリコールに０．１％溶解した溶液を目尻に塗布
し、小じわ（鳥の足跡）に対する影響を観察した。効果
の判定は歯科用速乾性レジン［商品名：Exafine （エク
ザファイン）］によるレリーフを処置前・処置後に作成
し、顕微鏡下でしわの深度と本数を観測した。以下の表
は２ヶ月塗布の成績の総括である。

【表１】 ２ヶ月間の処置後の小じわの深度と本数の減少の程度

【００１７】

【実施例８．】実験的に細胞間脂質を除き、いわゆる荒
れ肌状態にした健常男子の皮膚にセラミドを適用し、皮
膚生理機能の補完ができるか否かの確認をした。荒れ肌
の水分保持機能の回復を見るため、健常人（ｎ＝３）の
左前腕部３か所（直径２cm、円形）をアセトン・エーテ
ル（１：１）に１０分間暴露することにより細胞間脂質
を除き、それぞれの部位に精製水、１％ヒアルロン酸ナ
トリウム溶液、０．１％セラミド溶液を塗布した。角層
水分の指標として角層表面高周波伝導度を経時的に測定
した（ＳＫＩＣＯＮ２００、ＩＢＳ社）。測定は室温２
０℃湿度６０％の恒温室にておこなった。図１．にヒト
角層水分保持に対するセラミドの効果を示す。有機溶媒
により細胞間脂質を除かれ、角質水分量の著しい低下を
見た皮膚は、０．１％セラミド溶液の塗布により、いず
れの例でも角質内の水分保持機能は速やかに回復した。
その効果は１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液よりも優れ
ていた。

【００１８】

【実施例９．】実施例１．に記したと同様の荒れ肌の状
態において、経表皮水分喪失に対するバリア機能の改善
効果を、セラミドについて評価することを目的とした。
実施例１．と同様の操作で誘発せしめた荒れ肌の経表皮
水分喪失量（ＴＷＬ）をエバポリメーター（Servo Med
社）を用いて経時的に追跡し、セラミドの効果を検討し
た。測定は室温２０℃、湿度６０％の恒温室にておこな
った。図２．にセラミドの経表皮水分喪失に対するバリ
ア機能の改善効果を示す。実験的荒れ肌により上昇した
ＴＷＬ値は、０．１％セラミド溶液の塗布により改善を
みた。その効果は１％ヒアルロン酸ナトリウム溶液の場
合よりやや強かった。塗布３時間後にはＴＷＬは健常な
皮膚の値に復した。

【００１９】

【実施例１０．】４名のアトピー性皮膚炎患者にセラミ
ドを０．１％配合した親水軟膏を、原則として朝夕２回
塗布し、治療効果について観察した。軟膏は原則として
朝夕２回塗布した。治験期間は、寒冷と乾燥から角化症
が一般的に増悪する冬季に設定した。アトピー性皮膚炎
の改善の程度を下記の基準に従い判定した。 著効 完治したもの 有効 ほとんどの症候に改善を示したもの やや有効 なんらかの改善を示したもの 無効 不変・増悪したもの 症例の詳細な結果を表に示す。 No. 性別 年齢 部位 治療日数 効果 １ Ｆ １３ 全身 ３週間 有効（ピリピリ感あり） ２ Ｍ ９ 四肢 ３ヵ月 有効（ピリピリ感あり） ３ Ｍ ７ 四肢 ３ヵ月 有効（ピリピリ感あり） ４ Ｆ １０ 全身 ３ヵ月 有効 （まとめ）アトピー性皮膚炎患者に対するセラミドを
０．１％配合した親水軟膏の適用は、有効以上１００％
と優れた治療効果をみた。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）は本発明方法の実施例を示す工程図であ
る。（ｂ）は本発明の生成物について行なったＴＬＣ展
開図である。展開溶媒はCHCl₃:Me₂CO:MeOH:AcOH:H₂O=1
0:4:2:2:1である。図中、Ｓｐｈはスフィンゴミエリン
である。

【図２】実験的に作成した荒れ肌の水分保持機能に対す
るセラミドの改善効果をグラフとして示す図である。

【図３】実験的に作成した荒れ肌のバリア機能に対する
セラミドの改善効果をグラフとして示す図である。

【図４】原発明及び後発明を包含する本発明の製造工程
図である。Ａは前者、Ｂは後者の工程を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 17/00 (Ｃ１２Ｐ 13/02 Ｃ１２Ｒ 1:085） (56)参考文献 国際公開94／26919（ＷＯ，Ａ１) 社団法人日本生化学会編集、「新生化 学実験講座 ４ 脂質▲ＩＩ▼リン脂 質」第１版、株式会社東京化学同人、 1991年５月15日、Ｐ．198−203 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 13/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 家畜類または家禽類の赤血球を原料とし
   たセラミドの製造方法であって、 （１） 当該赤血球を溶血させて得られる赤血球膜また
   は当該赤血球からヘム鉄を製造する際に発生する残渣に
   含まれる赤血球膜を用いて、 （２） 当該赤血球膜を含む溶液を酸・塩基またはその
   塩類により中和した後、生成する沈殿をジクロロメタン
   で洗浄してコレステロールを除き、 （３） 洗浄後の赤血球膜を含む溶液から、有機溶媒を
   用いた抽出及び加水分解を経てスフィンゴミエリンを抽
   出し、または抽出することなく、 （４） バチルス セレウス（Bacillus cereus）を接
   種して、当該赤血球膜を含む溶液に含まれているスフィ
   ンゴミエリンを、バチルス セレウスの培養液から得ら
   れるスフィンゴミエリナーゼにより分解し、得られたセ
   ラミドを有機溶媒により抽出する、 ことを特徴とする、セラミドの製造方法。
2. 【請求項２】 スフィンゴミエリナーゼが、バチルス
   セレウス（Bacilluscereus）の培養液から抽出されたも
   のである請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 スフィンゴミエリンを含む溶液でバチル
   ス セレウス（Bacillus cereus）を培養して、スフィ
   ンゴミエリナーゼにより分解し、セラミドを得る請求項
   １に記載の方法。