JPS6339580A - 新規なグリコシダ−ゼ及びその調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 皇呈上生剋■立■ 本発明は、溶菌作用を有する新規なグリコシダーゼ２０
４２及びその調製法に関する。

孜王煎宣旦 グリコシダーゼとはグリコシド結合を加水分解する酵素
の総称である。従来知られているグリコシダーゼ型溶菌
酵素を、ムラミダーゼ型とグルコサミニダーゼ型に大別
して示すと表１のとおりである。

表　　１ 本発明者は、新たに分離したノカルデイア属（Ｎｏｃａ
ｒｄｉａ）に属する放線菌によって生産されるグリコシ
ダーゼが上掲の公知のグリコシダーゼ型溶菌酵素とは分
子量及び等電点の点で明らかに相違しており、また、Ｎ
−アシルグルコサミンを細胞壁に含むセレウス菌を溶菌
する作用を有することに鑑み、新規なグリコシダーゼで
あることを確認した。

発明が解決、ようとする課題 本発明者は、上述したごとく、栃木県石橋町の土壌より
新しく分離したノカルデイア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）に
属する放線菌が、枯草菌細胞壁及びＮ−アシルグルコサ
ミンを含有するセレウス菌細胞壁を分解する溶菌作用を
示す新規なグリコシダーゼを産生ずることを見出し、本
発明をなすに至った。

したがって、本発明は、上記溶菌作用の特性を有する新
規なグリコシダーゼ及びその調製法を提供することを課
題とするものである。なお、上記グリコシダーゼはノカ
ルデイア５Ｐ２０４２により生産されることから、ここ
では上記のようにグリコシダーゼ２０４２と称する。

以下本発明を詳しく述べる。

ユ里至盪底 本発明に係るグリコシダーゼ２０４２は、下記に示す理
化学的性質を有することにより特徴づけられる。

■作用：溶菌作用、 ■分子量：約１０，０００　（ゲル濾過法により測定）
、■基’Ｊｔ特性：ｐ−二トロフェニルーβ−Ｄ−グル
コピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロ フェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ゲルコサミドを基質
とし、特に、枯草 菌細胞壁及びバチルス・セレウス 菌細胞壁を分解する、 （４）等電点：　８．２（アンホライン等電点電気泳動
法による）、 （５）至適ｐｉｔ　　：　　ｐＨ５付近、（６）至適作
用温度：５０℃付近 また、本発明に係るグリコシダーゼ２０４２の調製法の
特徴は、ノカルデイア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）に属する
グリコシダーゼ生産菌を培地中で好気条件下に培養し、
培養上清中からグリコシダーゼ２０４２を採取すること
にある。

課題を解決するための 本発明に係るグリコシダーゼ２０４２の上記理化学的性
質は下記により測定した。

■酵素作用については、前記のとおり枯草菌細胞壁を分
解するとともに、細胞壁にＮ−アシルグルコサミンを含
むセレウス菌も分解する溶菌作用を有する。

またグリコシダーゼ２０４２を、Ｂｒｏｗｎの方法〔ア
プライドマイクロバイオロジイ（Ａｐｐｌ、Ｍｉ−ｃｒ
ｏｂｉｏｌ、）　ｖｏｌ、２５．２９５　、（１９７３
））で調製した粗ペプチドグリカンに作用させてその作
用点を、アミノ基ヲＤＮＰ−化法〔「メソッドインエン
チモロジイＪ　（Ｍｅｔｈ、ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、
ｖｏｌ、８．６８５、（１９６６）　）により、また還
元基をＰａｒｋ−Ｊｏｈｎｓｏｎ法〔「ジャーナルオブ
バイオロジカルケミストリイｊ　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈ
ｅｍ、、）ｖｏｌ、１９５．１９、（１９５２）　）に
より測定した結果、酵素作用により還元基のみが生成し
、グリコシダーゼ２０４２は細胞壁ペプチドグリカンの
糖鎖を切断することが確認された。

■分子量は、５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００ゲル濾過法
により下記手順で測定した。

カラムを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６，８，０，２Ｍ
ＮａＣＩ含有）で平衡化して試料を溶出し、分子量既知
の蛋白質として、リボヌクレアーゼＡ（分子ｌ　１３．
７００）、キモトリプシノーゲンＡ（分子量２５．００
０）、オバアルプミン（分子量４３．０００）及び牛血
清アルブミン（分子量６７．０００）を用いて溶出容積
の比較により分子量を求めた。

■基質特異性については、前掲の物質を基質とスル力、
ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−１７’ルコピラノシド及
びｐ−ニトロフェニル−β−０−グルクロニドを基質と
しない。なお、細菌の細胞壁の分解性については上述し
たとおりである。

■等電点は、２％キャリアアンホライトを含む７．５％
ポリアクリルアミドゲルを用いて、１５℃、２００ｖで
４時間泳動を行って測定した。

■至適ｐＨは、セレウス菌細胞壁を放射性前駆体で標識
化したものを用いて、上記Ｂｒｏｉｍｎの方法により調
製した粗ペプチドグリカン分画を基質として至適ｐＨを
測定した。

■至適作用温度は、上記至適ｐｉと同様にして測定した
。

次にグリコシダーゼ２０４２の調製法について説明する
。

本発明の調製法で利用するノカルデイア属（Ｎｏｃａｒ
ｄｉａ）に属するグリコシダーゼ生産菌は、前述のごと
く、新たに土壌より分離した放線菌であって、その菌株
ノカルデイア５Ｐ２０４２は工業技術院微生物工業技術
研究所に微工研菌寄第８７９７号（ＦＥＲＭ　Ｐ−８７
９７号）の申請受理番号で寄託されている。

ノカルデイアＳＰ　２０４２の菌学的性質を以下に示す
。

（Ｉ）形態上の性状 スターチ・イースト寒天培地（可溶性澱粉１％、酵母エ
キス０．０５％、Ｎ８アミン０．０５％、寒天１．５％
）上で基中菌糸はよ（分枝して伸長し、分断がみられる
。気菌糸は豊富に着生し、胞子形成も良好である。気菌
糸の分枝は単純分枝で車軸分枝はしない、胞子のうや菌
核はみられない、胞子は１０個以上直線状に連鎖してい
て、柱部形を呈し、直径０．４０〜０．４５μ曙×長さ
１．０×１．７μ−の大きさを有し、かつその表面は平
滑状である。

なお、胞子の運動性はない。

（ＩＩ）各種培地中の生育状況 各種培地中で２７℃、７〜１４日間培養した結果は表２
に示すとおりである。なお、表中の色の表示はＪＩＳ−
Ｚ−８７２１に準拠している。

（ＩＩＩ）炭素源の同化性 アラビノース、キシロース、グルコース、フルクトース
、ラムノース、シュクロース、ラフィノース、マンニト
ール及びイノシトールを同化し、サリシンを梢々同化す
る。しかし、ラクトースは同化しない。

（ＩＶ）生理的性質 １）生育温度 スターチ・イースト液体培地において、２０〜４０℃の
温度範囲で生育し、２５〜３７℃で良好に生育し、特に
、２７〜３２℃で生育が速い。

ｉｉ）ゼラチンの液化　　　　　　　　　陰性１ｉｉ）
Ｒ粉の分解　　　　　　　　　　　陰性ｉｖ）脱脂乳の
ペプトン化並びに凝固　　陰性■）メラニン様色素の生
成　　　　　　陰性（Ｖ）細胞壁組成 全細胞中にジアミノピメリン酸を含み、その旋光性はメ
ソ型である。また、グリシンを含まず、糖組成としてア
ラビノース、ガラクトースを含み、キシロース、マジュ
ロースを含まないことから、細胞壁タイプはＩＶＡ型で
あるＣＭ、Ｐ。

Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ　＆　Ｉ（、Ｌｅｃｈｅｖａｌ
ｉｅｒ　　：　　ｒインターナショナルジャーナルオブ
システマチックバクテリオロジイ（Ｔｎｔ、Ｊ、５ｙｓ
ｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、２０．４３５（１９７０）
　）。

また、全細胞から単純脂質を抽出し、薄層クロマトグラ
フィー法によりミコール酸を検出したところ、その存在
が確認された。

畝上の菌学的性質から、２０４２株は、形態的にはスト
レプトミセス属のものに類似するが、細胞壁中にメソ型
ジアミノピメリン酸を含むことからストレプトミセス属
からは明りように区別され、また、特徴的な長い胞子鎖
を有し、細胞壁組成がＩＶＡ型であることから、ノカル
デイア属に属する苗種であると同定し得る。

本発明においては、上記性状を有するノカルデイア属の
グリコシダーゼ生産菌を、グルコース、スターチのごき
と炭素源、ソイビーンミール、ミートエキス、ドライイ
ーストのごとき窒素源及び食塩その他の無機塩類等を含
む液体培地中で、９１）７前後、２７〜３２℃程度の温
度下でに培養することによりグリコシダーゼ２０４２を
生産し得る。

通常４日間程度の培養を行った後、培養物を急冷し、遠
心により菌体を除去して培養上清を得、次いでこの培養
上清を硫安塩析したものにフェニルセファロースクロマ
トグラフィー、ゲル・濾過法を適用して目的のグリコシ
ダーゼ２０４２を得る。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明する。実施
例中の％は重量を示す。

実施例 ノカルデイアＳＰ　ＮＱ２０４２株を、グルコース２％
、スターチ１％、ソイビーンミール２．５％、ミートエ
キス０．１％、ドライイースト０．４％、食塩０．２％
、リン酸−水素二カリウムｏ、ｏｏｓ％を含み、ｐ）Ｉ
　７．３に調整した液体培地中で、通気、撹拌下に２８
℃で４日間培養した。培養後、得られた培養物を急冷し
て遠心分離により菌体を除去した０次いで、得られた培
養上清を、硫酸アンモニウム等の塩析剤を用いて塩析し
、得られたグリコシダーゼ２０４２を含む沈澱物を得、
これを０．２５Ｍの硫酸アンモニウムを含む緩衝液（例
えばリン酸緩衝液）に溶解し、次いで、この溶液を前述
の緩衝液で平衡化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ
にグリコシダーゼ２０４２を吸着させ硫酸アンモニウム
を含まない緩衝液で溶出した。

次いで、グリコシダーゼ２０４２を含む分画を集め、限
外濾過等の手段により濃縮した。この濃縮物をらにセフ
ァデックスＧ−７５、Ｇ−１００等のようなゲル濾過ク
ロマトグラフィーで処理することにより高純度なグリコ
シダーゼ２０４２を得た。

上述のようにして得られたグリコシダーゼ２０４２は白
色粉末状であって、前述したとおりの理化学的性質を示
した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）下記に示す理化学的性質を有することを特徴とす
   るグリコシダーゼ２０４２； ［１］作用：溶菌作用、 ［２］分子量：約１０，０００（ゲル濾過法により測定
   ）、［３］基質特性：ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−グ
   ルコピラノシド、ｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−ガラクトピラノシド、ｐ−ニトロ フエニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グル コサミドを基質とし、特に、枯草 菌細胞壁及びバチルス・セレウス 菌細胞壁を分解する、 （４）等電点：８．２（アンホライン等電点電気泳動法
   による）、 （５）至適ｐＨ：ｐＨ５付近、 （６）至適作用温度：５０℃付近 （２）ノカルデイア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）に属するグ
   リコシダーゼ生産能を有する微生物を培地中で好気条件
   下に培養し、培養上清液からグリコシダーゼ２０４２を
   採取することを特徴とするグリコシダーゼ２０４２の調
   製法。 （３）上記微生物がノカルデイアＳＰ２０４２株（ＦＥ
   ＲＭＰ−８７９７号）である特許請求の範囲第（１）項
   記載の調製法。