NO831175L - Fremstilling av et selektivt antibiotikum - Google Patents

Description

Det har lenge vært ønskelig å utvikle trangspektrede anti-

biotika som er effektive mot visse spesielle patogene mikro-organismer, men ikke mot den normale bakterieflora som ut-

gjør kroppens naturlige beskyttelsesmekanismer mot sykdom-

mer. Organismer som er relativt resistense overfor mange antibiotika, og hvor det er sterkt ønskelig med selektive baktericider, er forskjellige stafylokker såsom Stphylococcus aureus og Staphylococcus epidermidis. Disse gram-positive organismer inngår både i sårinfeksjoner og infeksjoner i forbindelse med innsettelse av proteser, og S. aureus er også årsak til en rekke forskjellige systemiske og mer lokale sykdommer. Skjønt en rekke bredspektrede antibio-

tika såsom clindamycin, gentamycin, rifampin og methicillin er effektive mot visse bakterier, så er det ikke utviklet noe trangspektret antibiotikum med selektiv antimikrobiell aktivitet mot slike stafylokokkinfeksjoner.

Det er følgelig en hensikt ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe fremgangsmåte for fremstilling av et trang-

spektret antibiotikum med selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokokkinfeksjoner forbundet med S. aureus og S. epidermidis, foruten at oppfinnelsen tilveiebringer

prepar-ater inneholdende nevnte antibiotikum. Videre er det en hensikt ved oppfinnelsen å tilveiebringe et slikt antibiotikum som er effektivt ved topikal anvendelse, og som gjør at den normale flora forblir intakt og som på

grunn av sin begrensede absorpsjon unngår en risiko for systemisk toksisitet, spesielt hos kritisk syke pasienter.

Andre hensikter og fordeler ved foreliggende fremgangsmåte

og preparater vil fremgå av den etterfølgende detaljerte

■beskrivelse av foretrukne utførelser sett i samband med

den vedlagte tegning.

Den vedlagte tegning er et diagram som viser eff-ekten av

det nye antibiotikum ifølge -foreliggende oppfinnelse på levedyktighet og turbiditet for en S. epidermidis-kultur.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse har man nå funnet en

ny rase av mikroorganismen Rothia dentocariosa. Den nye rasen som heretter vil bli betegnet som Howland-rasen av R. dentocariosa, ble funnet i en kultur av den normale aerobiske bakterieflora man finner i menneskesvelget. Ved en aerobisk fermentering gir den nye rasen et nytt antibio-tisk stoff, heretter betegnet "staphylocidin", som har et trangt antiobiotisk spektrum og som har selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokokkbakterier såsom S. aureus og S. epidermidis.

En ren kultur av Howland-rasen er innlevert til den amerikanske typekultursamling, Rockville, Maryland under tilvekstnr.

ATCC 31918. En kultur av denne organismen kan fåes på fore-spørsel fra den permanente samlingen ved ATCC.

Man har funnet at Howland-rasen (ATCC 31918) gir stafylocidin ved fermentering i vandig næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske forbindelser under nedsenkede aerobiske tilstander. Et stafylocidinholdig produkt som består av cellevegger eller murein<*>produsert under fermenteringen, blir deretter utskilt og innvunnet ved en fraksjoneringsmetode som i seg selv er kjent (Park, J.T. og Hancock, A., "A Fractionation Procedure for Studies of the Synthesis of Cell-wall Mucopeptide and of other Polymers in Cells of Staphylococcus aureus", J. ;Gen. Micro. 22:249-258 (1960)). ;Beskrivelsen av fermenteringen av Howland-rasen for å få fremstilt et antibiotikum som er selektivt effektivt mot S. aureus og S. epidermidis er beskrevet i en avhandling ;<*>Som tidligere angitt i litteraturen er cellemurein en peptidoglycan-heteropolymer som består av glycankjeder tverrbundet gjennom korte peptider ( Schleif erK . H . og Kandler,0., "Peptidoglycan Types of Bacterial Cell Walls

and their Taxonomic Implications", Bact.Rev. 36(4) ,

s. 407-477 (1972)).

av to av de foreliggende oppfinnere, med tittelen "Anti-staphylococcal Substance(s) from a Pharyngeal Organism", angitt ved et symposium for The American Pediatric Society and The Society for Pediatric Research fra 29. april til 2. mai 1970. Howland-rasen ble ikke identifisert i nevnte avhandling, og var på det tidspunkt ikke innlevert i noen offentlig kultursamling, og det var heller ikke i avhand-lingen beskrevet en separasjon, innvinning eller karakterisering av det stafylocidinholdige cellemurein fermenteringsproduktet.

R. dentocariosa er tidligere blitt identifisert basert på prototypen som er innlevert til den amerikanske typekultursamling med tilvekstnr. ATCC 17931. Basert på den typiske peptidoglycanstrukturen for cellemureiner som er beskrevet av Schleifer et al., supra, er det antatt at murein fremstilt fra ATCC 17931-rasen av R. dentocariosa (her betegnet "ATCC-murein") har en polymerisk struktur som innbefatter repeterende enheter som angitt i formel I nedenfor:

Den antatte polymeriske struktur av ATCC-murein innbefatter således en karbohydratkjede bestående av N-acetylglucosamin og N-acetylmuraminsyrerepeterende enheter, en peptidenhet og en intrapeptidbro som forbinder peptidenheten med en annen peptidenhet.

Karbohydratkjeden i de fleste bakterier består på tilsvarende måte av alternerende p-l,4-forbundet N-acetylglucosamin og N-acetylmuraminsyreenheter som angitt i formel I. Til dags dato er det bare beskrevet seks variasjoner i litteraturen, og hver av disse variasjonene er beskrevet fra N-acetylmuraminsyreresiduet (Ghuysen, J.M, Shockman, G.D., "Biosynthesis of Peptidoglycan" i "Bacterial Membranes and Walls", utgitt av Leive, L., New York: Marcel Dekker, Inc., s. 37 (1973)).

Strukturen på det cellemurein som er fremstilt ved fermenteringen av det nye Howland-rasen ifølge foreliggende oppfinnelse (heretter betegnet "Howland-murein"), antar man imidlertid at det skiller seg fra ATCC-murein både med hensyn til sammensetningen av N-acetylmuraminsyreenhetene i karbohydratkjeden og med hensyn til sammensetningen av de til-stedeværende intrapeptidbroenhetene. Denne hypotesen bygger på en analyse av aminosyrer og aminosukkere både fra ATCC

og Howland-mureinene som er mer detaljert beskrevet i det etterfølgende. Nevnte analyser indikerer at forholdet mellom muraminsyre og glucosamin i Howland-murein er ca.

1/3 mindre enn det tilsvarende forhold i ATCC-murein, og at Howland-murein inneholder ca. 1/2 av alanininnholdet i ATCC-murain. Det førstnevnte forhold indikerer en for-skjell i strukturen på karbohydratkjedene i de respektive .peptidoglycaner, kanskje ved at det er en ytterligere sub-stitusjon på N-acetylmuraminsyreenhetene i Howland-murein med et sukker som ikke har noen aminogrupper. Det sistnevnte analyseresultatet indikerer strukturelle forskje-ller i intrapeptidbroenhetene i de-respektive makromolekyler.

Det fremgår av det foregående at den presise kjemiske struk tur på Howland-mureinet ikke er nøyaktig kjent. Det er midlertid på annen måte blittkarakterisertslik dette er indikert mer detaljert nedenfor, som en peptido-glycan-polymer innvunnet fra fermenteringsproduktet av Howland-rasen, og med en molekylvekt som minst tilsvarer ca. 20 millioner Dalton, og med et omtrentlig aminosyre og amino-sukkerinnhold som angitt i det etterfølgende, og som inkorporerer antibiotikumet stafylocidin som er selektivt effektivt mot stafylokokkbakterier såsom S. aureus og S. epidermidis.

Stafylocidin har hittil ikke blitt struktureltkarakterisert. Det er imidlertid antatt at stafylocidin er en intrinisk del av Howland-murein-makromolekylet.

Bevis for st stafylocidin er en integral del av den polymeriske strukturen i Howland-murein er tilveiebragt ved at man reagerer Howland-murein med forskjellige murolytiske enzymer. Når således på den ene side Howland-mureinen behandles med enhver av enzymene amylase, ribonuklease A, fosfolipase A, chymotrypsin, pronase eller trypsin, så er det ingen forandring i mureinets antimikrobielle aktivitet. Når det på den annen side blir behandlet med enzymer som

er i stand til å nedbryte murein, f.eks. lysozym (som har en N-acetylmuramidase-aktivitet), lysostafin (som inneholder N-acetylglukosaminidase og N-acetylmuramyl-alanin-amidase) eller basidiomycet-oppløsende enzymer (som inneholder N-acetylmuramyl-alanin-amidase), så fikk man ødelagt den antimikrobielle aktiviteten i Howland-mureinet. De sistnevnte enzymene hydrolyserer bindinger mellom sukkermolekylene på karbohydratkjeden:■-. i Howland-murein eller bindingen

-mellom karbohydratkjeden og dens peptidenheter. Basert

på disse resultater synes det sånn at den intakte karbohydratkjeden i Howland-murein enten innbefatter eller er sterisk vesentlig for aktiviteten for stafylocidin, og at antibiotikumet således er en integral del av Howland-murein-makromolekylet.

Bindingen av stafylocidinet til Howland-mureinet fremgår

videre av gelfiltreringseksperimentet hvor Howland-fermen-teringsmedium ble ført gjennom en Sephadex-kolonne G-7 5_,

(en perleformet, tverrbundet dekstran-adsoberende gel som er kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia Inc.), og at den aktive fraksjonen ble innvunnet fra kolonnens hulvolum,

selv etter en eluering med en oppløsning med høy saltkonsen-trasjon (0,5 molar KCl) med 8 molar urea, eller etter koking av mediet i 1% natriumdodecylsulfat og eluering av mediet med 0,1% natriumdodecylsulfat. Ettersom gelkolonnen (som har et oppløsningsområde fra 3000 - 80000 med hensyn til molekylvekten for globulære proteiner) ikke skiller ut stafylocidinholdig fraksjon, så er det antatt at stafylo-

cidinet er kovalent bundet til mureinmakromolekylet.

Som angitt ovenfor blir antibiotikumet stafylocidin frem-

stilt ved at man fermenterer en ny rase (Howland-rasen) av R. dentocariosa. Det stafylocidinholdige fermenteringsproduktet ble oppnådd ved at man isolerer Howland-mureinet og dets aktive fragmenter (som kan være tilstede blant annet i fermenteringsmediet). Stafylocidinet i seg selv er ikke blitt utskilt fra Howland-mureinet, men man antar det er kovalent bundet og utgjør en del av mureinets makro-molekylære struktur. Foretrukne utførelser av den nye mikroorganismen og fremgangsmåter for dyrking av den samme for å fremstille stafylocidinholdige produkter, data som karakte-riserer disse produkter og dokumenterer deres selektive antimikrobielle aktivitet samt en fremgangsmåte for bruk av produkter som inneholder antibiotikumet, er angitt i det etterfølgende.

• Den stafylocidin- fremstillende bakterien

Howland-rasen (ATCC 31918) er blitt identifisert som

R. dentocariosa av den amerikanske typekultursamling, både

på basis av sin morfologi og sine biokjemiske reaksjoner.

Rasen av R. dentocariosa er-således angitt å være positiv

for katalaseproduksjon, nitratreduksjon, aeskulinhydrolyse og syreproduksjon fra glucose, maltose, mannose, melezitose,

salicin, sukrose og trehalose (Bergey's Manual of Determina-tive Bacteriology, 8. utgave). Etter inokulering i et hjerne/hjerte-infusjonsmedium (Difco BHI) og vekst i 48 timer ved 37°C, er Howland-rasen positiv for hver av disse reaksjoner. Videre er resultatene fra en hel-celle hydrolyse og analyse av karbohydratfermenteringssluttproduktene også i overensstemmelse med det man finner for R. dentocariosa.

Howland-rasen kan ytterligere karakteriseres på følgende måte: (a) Morfologi for kolonier som er dyrket på BHI-agar i 72 timer ved 37°C: koloniene er glatte, kremaktige og hvite med en hel kant, mens de individuelle celler i hver koloni er gram-positive og stavformede, og inkorporerer ingen trådformet former og er ikke syrefaste; (b) Biokjemiske reaksjoner etter dyrking i 48 timer ved 37°C som nevnt foran (prøveresultatene ble bestemt 7 dager etter at reaksjonen ble startet): (c) Syredarinende reaksjoner med: (d) Hel-cellehydrolysat: galaktose som eneste karbohydrat, ingen diaminopimelinsyre og ingen arabinose; og (e) Karbohydratfermenteringssluttprodukter: melkesyre, og ravsyre, men ingen propionsyre.

Det fremgår av morfologi og biokjemiske reaksjoner for Howland-rasen kan variere avhengig av vekstgraden på kulturen ved undersøkelsestidspunktet eller når reaksjonen foretas. Således vil kulturer som udnerkastes forskjellige vekstbetingelser innbefatte celler som har både tråd-form så vel som stavform.

Fremgangsmåte for fremstilling av stafylocidinholdige produkter.

I overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse blir Howland-rasen eller en mutant av denne, dyrket i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbohydrat, nitrogen og uorganiske salter, under nedssenkede aerobe tilstander, inntil man får produsert en vesentlig antibakteriell aktivitet som skyldes stafylocidin.

Fermenteringsbetingelsene for en biologisk omdannelse til stafylocidin er generelt de samme som anvendes i de kjente fremgangsmåter for fremstilling av forskjellige antibiotika ved en gjennomluftet nedsenket fermentering. Næringsmediet inneholder de vanlige næringsstoffer og mineralforbindelser. Egnede næringsstoffer innbefatter enhver assimilerbar kilde for karbon såsom polysakkarider eller stivelser, eller poly-alkoholer såsom glycerol. En assimilerbar kilde for nitrogen kan tilføres ved at man bruker proteiner, proteinhydro-lysater, urea, maisutsilingsvæske, pepton, destillatoppløse-lige forbindelser, fiskemel eller andre vanlige kjente forbindelser. De kjente anioner og kationer tilføres i form av ikke-toksiske salter. Sporelementer som mangan, kobolt, sink, kopper, etc, oppnås enten som urenheter i de oven-nevnte forbindelser, eller ved at man bruker vanlig rennende

■vann fra springen, eller ved at man tilsetter oppløsninger som er spesielt anriket med disse sporelementer.

Andre generelle betingelser med hensyn til fermentering, såsom hydrogenionekonsentrasjon, temperatur, tid, gjennom-luf tingsmengde , fremstilling av inokulum, sterilisering, inokulering og lignende tilsvarer de som brukes for fremstilling av andre antibiotika.

Man lar fermenteringen gå under normale betingelser fra

ca. 24 til ca. 72 timer, som er den periode som normalt er nødvendig for å oppnå god vekst av kulturen av Howland-rasen. Antibiotikum-aktiviteten innvinnes °deretter fra hele organismen ved fremgangsmåter som er utformet for å rense murein, f.eks. fremgangsmåten til Park et al., slik denne er angitt ovenfor, som innbefatter at man høster de hele cellene, oppvarmer disse med trikloreddiksyre, utfører en bufring og deretter behandler oppløsningen med trypsin. Howland-mureinet kan ellers innvinnes ved teknikk som i seg selv er kjent, f.eks. ved en behandling med trypsin, poly-oksyetylenetere, f.eks. "Triton X-100", og natriumdodecyl-sulf at .

Det er i det etterfølgende beskrevet spesielt foretrukne eksempler på fremgangsmåten for fermentering av Howland-rasen og innvinning av det stafylocidinholdige Howland-mureinet .

Eksempel 1 - Fremstilling av Stafylocidin ved fermentering

i BHI- medium

Howland-rasen ble dyrket i en presset luftinkubator i et hjerne/hjerte-infusjonsmedium (Difco BHI) ved 35°C med gjennomlufting ved hjelp av forsiktig risting. Etter 65 timers dyrking, ble cellene høstet ved sentrifugering med 10.000 G i 30 minutter og så vasket tre ganger med destillert vann. .Cellene ble så suspendert i 10% trikloreddiksyre og oppvarmet til 95°C i 20 minutter. Suspensjonen ble sentrifugert ved 10.000 G i 20 minutter, og den resulterende pellet ble vasket fem ganger med 0,IM fosfatbuffer med en pfl på 7,0. Nevnte pellet ble så resuspendert i fosfatbuffer som inne-holdt ytterligere 100 mikrogram/ml trypsin, og så ble suspensjonen inkubert i 2 timer ved 37°C.

Det Howland-murein som således var innvunnet, ble så vasket fire ganger med destillert vann. Det resulterende produkt som er et hvitt pulver viser som angitt nedenfor, utmerket antimikrobiell aktivitet både mot S. aureus og S. epidermidis.

Eksempel 2 - Fremstilling av stafylocidin ved fermentering

i gjærekstrakt/ sukrosemedium

Howland-rasen ble inkubert som beskrevet i eksempel 1 med uttak av at kultiveringen ble utført i et medium bestående av 4% kommersiell gjærekstrakt (tilgjengelig fra Yeast Products Co. som "Ardamine Z") og 2% sukrose (tilgjengelig fra Corn Products Co. som "Cerelose") som karbonkilde ved pH 6,8. Innvinningen av mureinet var som i eksempel 1.

Karakterisering av det stafylocidinholdige produktet Howland-mureinet innvunnet som beskrevet ovenfor og med stafylocidin-aktivitet, består som angitt i det ovenstående, av et peptidoglycan-makromolekyl. Den kjemiske strukturen på Howland-mureinet skiller seg imidlertid fra det man finner i ATCC-mureinet, noe som fremgår delvis ved en varia-sjon av aminosyre og aminosukkerinnholdet i de respektive mureiner.

Aminosyre og aminosukkerinnholdet ble bestemt ved en analyse i et mikrosystem hvor man anvendte et o-ftaldialdehyd-fluorescens - høyfølsomt påvisningssystem (Durrum) som var forbundet med en Perkin-Elmer-dataprosessor, intragrator og mikroprosessor. De kvantitative verdier for aminosyrene og aminosukkerne ble oppnådd ved å sammenligne kromatogrammer mellom de to mureiner med kromatogrammer av autentiske standarder. Aminosyreinnholdet ble bestemt etter hydrolyse i 6N HC1 ved 110°C i vakuum i 24 timer. Aminosukkerana-lysene ble utført etter mild syrehydrolyse (2N HCl ved 100°C i 2 timer).

Man oppnådde de følgende sammenlignbare analyser:

Det stafylocidinholdige produktet fra Howland-mureinet ble ytterligerekarakterisertog skiller seg fra ATCC-mureinet ved en tynnsjiktkromatografi-analyse. Denne ble utført på følgende måte: 200 mg av enten Howland- eller ATCC-murein ble inkubert med 10 mg lysozym, 10 mg lysostafin, 0,02% natriumazid og 0,0lM fosfatbuffer, pH 7,0 i 48 timer i et 37°C vannbacl. Det opp-løste murein ble sentrifugert ved 10000 G i 20 minutter

og filtrert med 0,45 um filter. Filtratene ble lyofilisert og resuspendert i 0,5 ml destillert vann.

"Sephadex G-10"-gel (en perleformet tverrbundet dekstran-adsorberende gel som er kommersielt tilgjengelig fra Pharmacia Inc.) ble autoklavert og pakket i en kolonne

slik det er beskrevet av fabrikken. Kolonnen ble kjørt med sterilt destillert vann og man oppnådde førti 1-ml-fraksjoner. En undersøkelse for karbohydrat, idet man brukte fenol/svovelsyremetoden bekreftet et nærvær av karbohydrater i fraksjonene. Fraksjonene ble så lyofilisert og oppløst i 50 ml destillert vann.

I de fraksjoner hvor n-acetylmuraminsyre og n-acetylglucosamin ble påvist, ble så avsatt som flekker på inak-tiverte silisiumdioksydgel G-plater og kjørt i en dimensjon ved hjelp av isopropanol/eddiksyre/vann 75:10:15 volum/volum/ volum. Etter tørking ble platene sprøytet med 5% ammoniakalsk sølvnitrat og oppvarmet i 10 minutter ved 100°C eller inntil flekkene ble tydelige.

Antimikrobiell aktivitet for stafylocidinholdige produkter Det antimikrobielle spektrum for Howland-mureinprøver fremstilt som beskrevet i eksempel 1 ovenfor, ble undersøkt og sammenlignet med det tilsvarende spektrum for ATCC-murein.

I disse prøver som er angitt i tabell III, ble hver prøve-organisme inokulert i 1 ml hjerne/hjerte-infusjonsmedium, enten med eller uten tilsetning av 5% saueblod (avhengig av den spesielle organisme som ble undersøkt), og inkubert over natten ved 37°C. Den antimikrobielle konsentrasjon av Howland-mureinet ble så bestemt som antall mikrogram Howland-murein pr. ml Møller Hinton-agar inneholdende 5% saueblod ved hvilken man fikk vekst på mindre enn fem kolonier av den spesielle organisme som var under utprøv-ing. Som angitt nedenfor, så hadde den samme konsentrasjon av ATCC-murein ingen antimikrobiell effekt. Ytterligere bevis på en selektiv antimikrobiell virkning for det stafylocidinholdige produkt mot S. aureus, ble oppnådd i prøver mot celleveggsdeformerte kulturer' (L-former) av S. aureus. Nevnte L-former ble indusert i en hjerne/hjerte-infusjonsagar inneholdende 5% NaCl i 0,05M tris HC1 ved pH 7,0, 20% hesteserum og 900 ug/ml meticillin. Prøver av Howland-mediet (etter 65 timers kultivering) og Howland- og ATCC-murein fremstilt som beskrevet i eksempel 1 ovenfor (40 mg/ml), ble på tilsvarende måte fortynnet 1:10 i 5% NaCl i 0,05M tris HCl, pH 7,0.

De celleveggsdeformerte S. aureus-rasene som ble prøvet, ble utstrekket på agarplater, hvoretter disse ble tilsatt 20 ul av de forskjellige prøveoppløsningene (den rene buffer og Howland-mediet, Howland-mureinet og ATCC-mureinet frem-stil som beskrevet ovenfor). Etter 48 timers inkubering ved 3 7°C ble det klare område omkring hver dråpe angitt semi-kvantitativt på en skala fra 1+ (lav aktivitet) til 4+ (høy aktivitet). Det fremgår av tabell IV nedenfor at både Howland-mediet og Howland-mureinet hadde 4+ aktivitet, mens både bufferen av ATCC-murein-prøvene ikke hadde noen aktivitet:

Man bestemte også den antimikrobielle virkningen av de stafylocidinholdige produkter ifølge foreliggende oppfinnelse mot kulturer av S. epidermidis. Som angitt nedenfor er stafylocidin både baktericidalt og bakteriolytisk for

. S. epidermidis.

I en første prøve ble en kultur som hadde stått over natten av S. epidermidis inokulert i et BHI-medium. Et Howland-medium fremstilt etter 65 timers fermentering som beskrevet

i eksempel 1 ovenfor, og med en antimikrobiell effekt på

4+ ved en fortynning på 1:100 og 1+ ved en fortynning på 1:400, ble deretter tilsatt en første prøve av S. epidermidis-kulturen etter at denne var dyrket i 4 timer. Man fikk en endelig fortynning av S. epidermidis : Howland-mediet på ca. 1:10 i første prøven.

De levedyktige cellekonsentrasjoner i S. epidermidis-prøven (kurve 2 i den vedlagte tegningen) og i S. epidermidis : Howland-prøven (kurve 20 på den vedlagte tegning) ble bestemt og avsatt. På lignende måte bestemte man lys-absorpsjonen (ved 620 nm) for både S. epidermidis-medium-prøven (kurve 4 på den vedlagte tegning) og S. epidermidis : Howland-mediumsprøven (kurve 40 på tegningen). Absorpsjons-verdiene som er vist på kurve 40 er korrigert for den optiske effekt av selve Howland-mediet, og kurvene 44 viser således bare den nedsatte turbiditet man oppnådde ved oppløning av S. epidermidis ved hjelp av det stafylocidinholdige Howland-mediet. Det fremgår av tegningen at både levedyktig-heten og turbiditeten på S. epidermidis-kulturen ble markert nedsatt etter inokulering med Howland-mediet.

I en ytterligere prøve ble aktiviteten påHowland-mureinet sammenlignet med aktiviteten på ATCC-murein mot S. epidermidis-rasen. Forskjellige fortynninger av Howland- og ATCC-mureiner ble således tilsatt 1 ml av en suspensjon

av S. epidermidis-rasen. Prøvene ble inkubert ved 35°C

i 3 timer under kraftig røring. Som angitt i tabell V,

så ga en tilsetning av ATCC-murein en fullstendig hemming

av den antimikrobielle aktiviteten for Howland-mureinet mot S. epidermidis:

I preliminære in vivo-prøver med mus ble det også påvist

at stafylocidinholdige fraksjoner fremstilt som beskrevet her, ikke hadde noen toksisitet overfor prøvedyrene. I

en første prøve brukte man således et autoklavert, ufor-tynnet mediumsvæskepreparat fra fermenteringen av Howland-rasen, og man fikk ingen tegn til toksisitet i mus som veide fra 13-15 gram når disse ble injisert intraperitonealt med 0,5 ml av dette prøvematerialet to ganger i løpet av 24 timer.

I et annet eksperiment ble det vist at celle-murein innvunnet ved fermentering av en populasjon av Howland-rasen, hadde aktivitet mot S. aureus ved en umiddelbar behandling av en musekirurgisk sårinfeksjonsmodell, uten at man fikk indusert noen akutte toksiske effekter under de anvendte prøvebetingelser.

Det stafylocidinholdige materialet ble fremstilt fra en

■grovfase under-populasjon av Howland-rasen (angitt i den amerikanske typekultursamling under tilvekstnr. ATCC 31919). Nevnte grovfasekolonier var tørre, rynkede og smulaktige med uregelmessige kanter, mens de individuelle celler i hver koloni var gram-positive staver, og de var pleomorfiske med diferiformer så vel som mange trådaktige former. Cellene var ikke syrefaste. Denbiokjemiske reaktiviteten på denne

under-populasjonen var den man fant i den totale kultur,

det eneste skilletegn var at den grove fasen ga en svak reaksjon i Voges-Proskauer-prøven, og fremstilte syre ved en reaksjon med raffinose. Murein fra denne grovfasen viste samme trange selektive antimikrobielle spektrum som Howland-murein, men bare ca. 1/10 av dennes antimikrobielle aktivitet.

Ved å bruke grovfasecellemurein fikk man en aktivitet som

var signifikant større enn når man brukte et placebo-mate-riale, men det var signifikant lavere enn et gentamicinholdig topikalt preparat, slik dette kunne vises i museprøven.

Tilførsel og bruk av stafylocidinholdige produkter

Det er for tiden foretrukket at stafylocidinholdige preparater fremstilt som beskrevet her, brukes topikalt for å hindre eller å behandle lokale tilstander som skyldes stafylokokkbakterier eller andre sykdomsfrembringende organismer. Når preparatene brukes topikalt, kan det aktive materialet blandes med et egnet fortynningsmiddel såsom en krem, en gel eller en salve. Det er for tiden foretrukket å bruke et gelbasert fortyningsmiddel, f.eks. en akrylsyrepolymer (som er kommersielt tilgjengelig i en 0,2% vandig suspensjon som "Carbopol 940" fra B.F. Goodrich Corporation). Vanligvis kan fra ca. 1 til ca. 50% av.den aktive ingrediens blandes med et slikt fortyningsmiddel slik at man får en egnet topikal salve. Fremgangsmåter for fremstilling, påføring etc. for slike topikale preparater er velkjente.

Man kjenner ikke mekanismen ved den antibakterielle virkningén mot organismer som S. aureus og S. epidermidis. Imidlertid så viser (a) data fra en murolytisk enzym-nedbrytning (som viser viktigheten av intakte karbohydratbindinger for aktivitet) , (b) det faktum at de stafylocidinholdige-produkter dreper celleveggsdeformerte bakterier, (c) at en aminosyre-analyse viser forskjeller med hensyn til karbohydratkjeden i aktivt og inaktivt murein, bevis på en mulig biologisk mekanisme. De trinn i murein-biosyntesen som ikke innbefatter reaksjoner i celleveggen, mens hvor det inngår intakte karbohydratbindinger, opptrer i lipid-bærersyklusen. Det er mulig at mureinkomponenter som blant annet innbefatter stafylocidin, irreversibelt binder lipidbærermolekylet, og dette vil da hindre en overføring av underenheter fra cytoplasmaet i cellemembranen eller fra membranen og over i celleveggen.

Det er selvsagt underforstått at foreliggende oppfinnelse ikke på noen måte er begrenset av de forannevnte hypoteser med hensyn til mulige reaksjonsmekanismer.

Den forannevnte beskrivelse av fremstillingen, bruken og anvendelsen av foretrukne former av fremgangsmåten og preparater ifølge foreliggende oppfinnelse, er bare ment å være illustrerende og oppfinnelsen er således ikke begrenset på annen måte enn det som fremgår av de etterfølgende krav.

Claims (12)

1. Biologisk ren kultur av mikroorganismen Rothia dentocariosa med identifiserende karakteristika som får ATCC 31918, karakterisert ved at nevnte kultur er i stand til å fremstille antibiotikumet stafylocidin som har selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokokkbakterier såsom S. aureus og S. epidermidis, og hvor dette antibiotikum fremstilles i en innvinnbar mengde ved fermentering i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske forbindelser.

2. Biologisk ren kultur ifølge krav 1, karakterisert på følgende måte: (a) Morfologi etter 72 timers vekst: koloniene er glatte, kremaktige og hvite med hel kant, mens de individuelle celler i hver koloni er gram-positive og cocco-bacillære.av form og ikke-inkorporerer noen trådformede former eller er syrefase; (b) Biokjemiske reaksjoner etter 48 timers vekst:

(c) Syredannende reaksjoner med:

(d) Hel-cellehydrolysat: galaktose som eneste karbohydrat, ingen DAP og ingen arabinose; og (e) Karbohydrat-fermenteringssluttprodukter: melkesyre og ravsyre, men ingen propionsyre.

3. Biologisk ren kultur ifølge krav 1, karakterisert ved at den ved fermentering frem-stiller et celle-murein:(a) som innbefatter en peptidoglycanpolymer med de følgende omtrentlige aminosyre- og aminosukker-innhold:

(b) viser følgende R^ -verdier ved tynnsjiktkromatografi i et system av isopropanol/eddiksyre/vann på silisiumdioksydgel G-plater etter nedbrytning med lysozym og lysostafin:

(c) og at det til mureinet er bundet et trangspektret antibiotikum stafylocidin som er selektivt effektivt mot stafylokokkbakterier som innbefatter S. aureus og S. epidermidis.

4 . Stafylocidinholdig produkt som innbefatter celle-murein innvunnet fra fermenteringsproduktet av den biologisk rene kultur ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved å bestå av(a) en peptidoglycanpolymer med følgende omtrentlige innhold av aminosyrer og aminosukkere:

(b) som viser følgende R^ -verdier ved tynnsjiktkromatografi i et isopropanol/eddiksyre/vann-system på silisiumdioksydgel G-plater etter nedbrytning med lysozym og lysostafin:

(c) hvor det til produktet er bundet et trangspektret antibiotikum stafylocidin som er selektivt effektivt mot stafylokokkbakterier som innbefatter S. aureus og S. epidermidis.

5. Stafylocidinholdig produkt, karakterisert ved å bestå av cellemurein innvunnet fra fermenteringsproduktet av den biologisk rene kultur ifølge krav 3.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et trangspektret antibiotikum stafylocidin med selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokokkbakterier som innbefatter S. aureus og S. epidermidis, karakterisert ved at man dyrker bakterien ifølge krav 1 i et vandig næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder av karbon, nitrogen og uorganisk forbindelse under nedsenkede aerobiske tilstander inntil man får en vesentlig antibakteriell aktivitet som ■skyldes det fremstilte stafylocidin.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ved at man innvinner et staf ylocridinholdig produkt ved å skille ut cellemureinet som stafylocidinet er bundet til, fra fermenteringsmediet.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et trangspektret antibiotikum stafylocidin med selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokokkbakterier som innbefatter S. aureus og S. epidermidis, karakterisert ved at man dyrker bakterien ifølge krav 2 i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder av karbon, nitrogen og uorganiske salter under nedsenkede aerobiske tilstander inntil man får en vesentlig antibakteriell aktivitet som skyldes det fremstilte stafylocidin.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at man innvinner et stafylocidinholdig produkt ved å utskille cellemureinet hvortil stafylocidinet er festet, fra fermenteringsmediet.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av et transpektret antibiotikum stafylocidin med selektiv antimikrobiell aktivitet mot stafylokokkbaktier som innbefatter S. aureus og S. epidermidis, karakterisert ved at man dyrker-bakterien ifølge krav 3 i et vandig næringsmedium som inneholder assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter under nedsenket aerobiske tilstander inntil man får en vesentlig antibakteriell aktivitet som skyldes det fremstilte stafylocidin.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at man innvinner et stafylocidinholdig produkt ved at man utskiller cellemureinet hvortil stafylocidinet er bundet, fra næringsmediet.

12. Et stafylocidinholdig produkt, karakterisert ved å være fremstilt ved en fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 6 til 11.