JP2740524B2

JP2740524B2 - アミラーゼ阻害物質ｎ−６１

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Publication number: JP2740524B2
Application number: JP63217223A
Authority: JP
Inventors: 澤夫村尾; 基夫荒井; 剛司川口; 公規塚尾; 隆久西村; 保広清水
Original assignee: Daiwa Fine Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiwa Fine Chemicals Co Ltd
Priority date: 1988-08-30
Filing date: 1988-08-30
Publication date: 1998-04-15
Anticipated expiration: 2013-04-15
Also published as: JPH0267299A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は，ストレプトマイセス（Streptomyces）属菌
から得られる新規アミラーゼ阻害物質Ｎ−61に関する。

（従来の技術）アミラーゼ阻害物質に関する研究は古くから行われて
おり，植物，微生物などに由来するペプチド系およびオ
リゴ糖系のいくつかのアミラーゼ阻害物質が知られてい
る。

植物由来のアミラーゼ阻害物質としては，コムギから
得られた耐熱性の塩基性タンパクが特に有名である。微
生物由来のアミラーゼ阻害物質としては，上田らのペプ
チド様物質（Agric.Biol.Chem.,37,2025（1973）），村
尾らのHaim（Agric.Biol.Chem.,44,1679（1980））およ
びPaim（Agric.Biol.Chem.,47,453（1983）），後藤ら
のＸ−２（特公昭第54−11395号公報），原田らのAI−
Ｂ（特公昭第59−10193号公報），宮川らのＩ−1001C
（特開昭第61−74587号公報），フォルカーエーディ
ングら（特公昭第62−36040号公報）などに記載のペプ
チド系の阻害物質が知られている。

アミラーゼ阻害物質は臨床診断のための各種分析用試
薬として有用である。例えば，急性膵炎時の臨床診断の
ために行われる血清アミラーゼの活性測定において，膵
臓アミラーゼのみを特異的に阻害するアミラーゼ阻害物
質が得られれば，膵臓アミラーゼと唾液アミラーゼとを
分別定量することが可能となり，臨床的な意義が大き
い。

従来知られている微生物起源の阻害物質のうち，ヒト
その他の動物由来の膵臓アミラーゼを選択的に失活さ
せ，唾液アミラーゼ，ならびに細菌由来およびカビ由来
のアミラーゼを失活させない阻害物質は，原田ら（前
出）のアミラーゼ阻害物質だけである。フォルカーエ
ーディング（前出）のアミラーゼ阻害物質は，膵臓アミ
ラーゼを強く阻害すると記載されているが，唾液アミラ
ーゼに対する作用については明らかにされていない。上
記原田ら（前出）の阻害物質はpH5.5〜10.0の間では安
定であるがpH4.0以下では37℃,1時間の処理で完全に失
活し，中性条件下においても100℃,30分の処理で完全に
失活する。そのため，種々のpHおよび温度で行われる臨
床検査の試薬として使用するためには，酸性条件下にお
ける安定性および熱安定性が十分ではない。従って，よ
り広いpH範囲および温度範囲で安定である阻害物質の開
発が望まれている。

（発明が解決しようとする課題）本発明は上記従来の課題を解決するものでありその目
的とするところは，動物由来の膵臓アミラーゼを選択的
に阻害し，唾液アミラーゼおよび細菌由来のアミラーゼ
をほとんどまたは全く阻害しないという作用特異性を有
し，広いpH範囲および温度範囲において作用しかつ安定
であるアミラーゼ阻害物質を提供することにある。

（課題を解決するための手段）本発明のアミラーゼ阻害物質Ｎ−61は次の性質を有す
る。

作用：ヒト，ブタ，ネコ，ウマ，ヒツジ，ヤギ，ウ
シ，イヌおよびヘビの膵臓アミラーゼを阻害し；ヒト唾
液アミラーゼをほとんど阻害せず；ウサギおよびモルモ
ットの膵臓アミラーゼ，バチルス属菌由来のα−アミラ
ーゼ，ダイズおよびオオムギのβ−アミラーゼ，リゾプ
ス属菌由来のグルコアミラーゼ，シュウドモナス属菌由
来のイソアミラーゼ，ペプシン，トリプシンおよびα−
キモトリプシンを阻害しない，安定pH範囲および熱安定性:pH2〜12で30℃において24
時間にわたり安定であり,pH3〜９で100℃において15分
間にわたり安定である，分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量は約8,000である，等電点：アンフォラインを担体として用いた等電点は
4.1である，および紫外線吸収スペクトル：極大吸収は約277nmであり，
極小吸収は約252nmである。

本発明のアミラーゼ阻害物質Ｎ−61は，ストレプトマ
イセス（Streptomyces）属菌，特にストレプトマイセス
ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogen
es）に属する株により生産される。例えば，発明者らに
より土壌から分離された次の菌学的性質を有する菌株に
より生産される。ここで，培養温度は特に記載のない限
り30℃である。

1.形態単純分枝であり，胞子は気菌糸上のみに10個以上がら
せん状に形成される。胞子表面は有刺型であり，胞子の
大きさは（1.0〜1.3）×（0.7〜0.8）μｍである。胞子
嚢の形成は見られない。

2.各種培地での生育状況１）イースト・麦芽寒天培地発育：オリーブイエロー気菌糸：豊富で盛り上がり，綿状，灰色がかった
緑可溶性色素：オリーブイエロー２）オートミール寒天培地発育：明るい灰色気菌糸：豊富で綿状，灰色がかった緑３）スターチ・無機塩寒天培地発育：灰色がかった黄色気菌糸：豊富で綿状，灰色がかった緑４）グリセリン・アスパラギン寒天培地発育：灰色がかった黄色，貧弱気菌糸：粉状でわずか，白色５）チロシン寒天培地発育：灰色から濃い灰色がかった褐色気菌糸：豊富で綿状，灰色がかった緑色６）シュークロース・硝酸寒天培地発育：無色，貧弱気菌糸：豊富で綿状，灰色がかった緑色，７）グルコース・アスパラギン寒天培地発育：灰色がかった黄色，貧弱気菌糸：なし８）栄養寒天培地発育：灰色がかった黄色，わずかにしわがある気菌糸：ほとんどなし，白色９）ベネット寒天培地発育：オリーブ色からオリーブがかった濃褐
色，しわがある気菌糸：綿状で豊富，灰色がかった緑色 10）スターチ合成寒天培地発育：灰色がかった黄色から灰色気菌糸：豊富で綿状，灰色がかった緑色 11）ペプトン・イースト・鉄寒天培地発育：オレンジイエローから無色気菌糸：なし 3.生理学的および生化学性質１）生育温度範囲:16〜40℃で生育し，至適生育温度は3
7℃付近である２）ゼラチンの液化：陽性（グルコース・ペプトン・ゼ
ラチン培地および単純ゼラチン培地）３）スターチの加水分解：陽性（スターチ寒天培地）４）脱脂牛乳の凝固：陰性５）脱脂牛乳のペプトン化：陽性６）メラニン様色素の生成：ペプトン・イースト・鉄寒
天培地およびトリプシン・イーストブロス寒天培地で陰
性であるが，チロシン寒天培地では陽性７）硝酸塩の還元：陽性 4.炭素源の同化性（ブリドハム・ゴットリーブ寒天培
地）Ｄ−グルコース,D−キシロース,L−アラビノース,L−
ラムノース,D−フラクトース,D−ガラクトース，ラフィ
ノース,D−マンニトール，イノシトール，サリシンおよ
びマンノースを利用し，シュークロースを利用しない。

この菌株を，上記菌学的諸性質をもとにバージェイズ
マニュアルオブディタミネイティブバクテリオ
ロジー第８版（1974）〔Bergey's Manual of Determina
tive Bacteriology,8th,Edd.（1974）〕に基づいて比較
すると，グリーンシリーズ（Green to grayish Green）
に属する菌に一致する。さらに，インターナショナル
ジャーナルオブシステマティックバクテリオロジ
ー（International Journal of Systematic Bacteriolo
gy）第18巻69−189頁（1968），同第18巻279−392頁（1
968），同第19巻391−512頁（1969）および同第22巻265
−394頁（1972）；およびワクスマン（Waksman）著“ア
クチノマイセス（The Actinomycetes）”第２巻に基づ
いて比較すると，本菌株はストレプトマイセスビリド
クロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）によ
く一致する。発明者らはこの菌株をストレプトマイセス
ビリドクロモゲネスＮ−61株と命令した（微工研菌寄第
10246号）。

培養条件上記菌株の培地は格別である必要はなく，通常の培地
が用いられる。炭素源としては，デンプン，グリセリ
ン，グルコース，シュークロースなどが用いられる。窒
素源としては，ポリペプトン，肉エキス，ダイズタンパ
ク，総合アミノ酸などが用いられる。無機塩類として
は，食塩（NaCl），リン酸一カリウム，リン酸二カリウ
ム，硫酸マグネシウムなどが用いられる。その他，必要
によりビタミン類などの微量栄養素が加えられる。例え
ば，種培養およびアミラーゼ阻害物質生産用の培地とし
て次の組成の培地が好適に用いられる。

種培養を行うには,pH6〜8,好ましくは7.0,培養温度25
〜30℃，好ましくは25℃にて好気的に撹拌または振盪し
ながら約48時間培養を行う。次いで，この培養液をアミ
ラーゼ阻害物質生産のための生産用培地に接種し，培養
pH6〜8,好ましくは7.0,培養温度は25〜30℃，好ましく
は25℃にて好気的に攪拌または振盪しながら約42時間培
養を行う。本発明のアミラーゼ阻害物質は菌体外に分泌
され，培地中から回収され得る。

阻害物質の採取法上記培養液から本発明のアミラーゼ阻害物質を採取・
精製するには既知の精製法が単独もしくは併用して利用
され得る。例えば，培養液を濾過または遠心分離にかけ
て菌体を除去し，濾液または上清液を得る。この濾液ま
たは上清液は，必要に応じて濃縮し，限外濾過または透
析を行なう。これをさらに，硫酸アンモニウム（硫安）
などにより塩析した後に透析し，次いで陰イオン交換セ
ルロース，陰イオン交換ゲルなどによるイオン交換クロ
マトグラフィー，疎水クロマトグラフィーなどの各種ク
ロマトグラフィー（例えば,DEAEセルロース,TEAEセルロ
ース,SP−セファデックスＣ−50,SP−トヨパール，セフ
ァデックスＧ−50など）を単独でもしくは組み合わせて
用いることによって精製を行う。精製法の一例を次に示
す。

（１）培養液から菌体を除去した後，硫安（80％飽和）
による塩析を行い，得られた沈澱を溶かし透析を行う。
これを，（２）DEAEセルロースカラムクロマトグラフィ
ー（pH6.0,0〜0.5M NaCl濃度勾配）にかけた後，透析を
行う。次いで，（３）TEAEセルロースカラムクロマトグ
ラフィー（ph6.0;0〜0.5M NaCl濃度勾配）にかけた後，
透析を行う。（４）透析内液をSP−セファデックスＧ−
50カラムクロマトグラフィー（pH3.0,0〜0.7M NaCl濃度
勾配）にかける。（５）硫安により塩析し，得られた沈
澱を溶かしセファデックスＧ−50カラムクロマトグラフ
ィーにかけた後，透析を行う。（６）透析内液をSP−ト
ヨパールカラムクロマトグラフィー（pH3.0,0〜1.0M Na
Cl濃度勾配）にかけ，アミラーゼ阻害活性を示す２つの
画分ＩおよびIIを得る（第３図）。（７）それぞれの画
分を凍結乾燥し，精製標品を得る。

このような方法で精製した２種類のアミラーゼ阻害物
質は，スラブ電気泳動でいずれも単一のバンドを示す。
以下に示すアミラーゼ阻害物質の性質は，このようにし
て画分Ｉから得た精製標品を用いて調べられた。

アミラーゼ阻害活性測定法コントロールとなるアミラーゼ活性は次のようにして
測定される。

約２単位のブタ膵臓アミラーゼを含有する酵素溶液0.
2mlに精製水0.2mlを添加し,37℃で５分間プレインキュ
ベーションする。次いで，この溶液に1.5％可溶性デン
プン溶液（0.1Mトリス−塩酸緩衝液溶液;pH7.0）0.8ml
を添加し,37℃で10分間反応させる。この反応液に,0.5N
酢酸（CH₃COOH）と0.5N塩酸（HCl）との5:1混合液2mlを
添加して振盪することによりアミラーゼ反応を停止させ
る。この溶液0.1mlを採取し,0.005％ヨウ素および0.05
％ヨウ化カリウムを含有する溶液5mlを添加して振盪
し，室温で20分間放置する。この溶液の660nmにおける
吸光度を測定し，この吸光度をＣとする。別にブランク
として上記アミラーゼ酵素液の代わりに精製水を用いた
反応系を調製し，同様の操作を行って得られた吸光度を
Ｂとする。このようにして得られた吸光度ＣおよびＢか
らアミラーゼ活性Ａが次式（Ｉ）を用いて算出される。
このＡの計算値が0.35であるときをアミラーゼ活性の１
単位とする。

Ａ＝（Ｂ−Ｃ）/B （Ｉ）従って，阻害物質が存在しない場合のアミラーゼ活性
をA₀とすると,A₀は上記アミラーゼ活性測定と同様にし
て測定され，得られた吸光度をT₀とすると，次式（II）
を用いて算出される。

A₀＝（Ｂ−T₀）/B （II）アミラーゼ阻害物質の阻害活性は次のようにして測定
される。

上記アミラーゼ活性測定のための反応系中の精製水0.
2mlの代わりに，阻害物質の溶液0.2mlを用いた反応系を
調製し，同様の操作を行う。この操作によって得られた
吸光度をTiとする。阻害物質が存在する場合のアミラー
ゼ活性をAiとすると,Aiは次式（III）を用いて算出され
る。

Ai＝（Ｂ−Ti）/B （III）阻害物質が存在する時の阻害率（％）Ｉとすると,Iは
次式（IV）を用いて算出される。

Ｉ＝（A₀−Ai）×100/A₀ （IV）上記ブタ膵臓アミラーゼ活性の２単位を50％を阻害す
るアミラーゼ阻害物質の量を１阻害単位（1U）とする
と，以上の式（Ｉ）〜（IV）から，アミラーゼ阻害物質
の阻害活性は次式（Ｖ）を用いて算出される。

阻害活性＝（A₀/0.7）×（I/50） ×阻害物質の希釈倍数（Ｖ）阻害物質の性質本発明のアミラーゼ阻害物質Ｎ−61の理化学的性質を
以下に示す。

作用ブタ膵臓アミラーゼの代わりに種々のアミラーゼ，お
よびプロテアーゼを用い，アミラーゼ阻害活性測定法に
準じて測定を行った。反応条件はそれぞれのアミラーゼ
およびプロテアーゼの反応に適した条件とした。

その結果，ヒト，ブタ，ネコ，ウマ，ヒツジ，ヤギ，
ウシ，イヌおよびヘビの膵臓アミラーゼを阻害した（特
に，ヒト膵臓アミラーゼを強く阻害した）が，ヒト唾液
アミラーゼをほとんど阻害せず，ウサギおよびモルモッ
トの膵臓アミラーゼ，バチルス属菌由来のα−アミラー
ゼ，ダイズおよびオオムギのβ−アミラーゼ，リゾプス
属菌由来のグルコアミラーゼ，シュウドモナス属菌由来
のイソアミラーゼ，ペプシン，トリプシン，およびα−
キモトリプシンを阻害しないことがわかった。

このことから，本発明の阻害物質Ｎ−61はヒト，ブタ
などの多くの動物由来の膵臓アミラーゼを選択的に阻害
し，唾液アミラーゼをほとんど阻害せず，植物由来，細
菌由来およびカビ由来のアミラーゼを阻害しない阻害物
質であり，さらにプロテアーゼにも作用しないことが明
らかである。

安定pH範囲および熱安定性本阻害物質Ｎ−61をpH2〜12の範囲の12種のpHの緩衝
液にそれぞれ溶解し,30℃で24時間保持した後,pHを1Mト
リス−塩酸緩衝液（pH7.0）を用いて中性域に調整し，
残存阻害活性を上記測定法に従って測定した。その結果
を第１図に示す。別に，各pHにおいて100℃で15分間保
持した後，同様にpHを中性域に調整し，残存阻害活性を
測定した。その結果を第１図に破線で示す。使用した緩
衝液は,pH2〜３では50mM塩酸−酢酸ナトリウム緩衝液
（図中○印）,pH4〜６では50mM酢酸緩衝液（図中●
印）,pH7〜８では50mMトリス−酢酸緩衝液（図中×
印）,pH9〜11では50mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝
液（図中△印）,pH12では50mM水酸化ナトリウム−リン
酸水素二ナトリウム緩衝液（図中□印）である。第１図
から，安定pH範囲は30℃でpH2〜12,そして100℃ではpH3
〜９であることがわかる。このように，本阻害物質Ｎ−
61は広いpH範囲において加熱条件下においても安定であ
り，特にpH3〜９において極めて安定である。

分子量ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によると単一のバンドが得られる。SDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子量は約8,
000である。

等電点担体としてアンフォラインを用いて測定した等電点は
4.1である。

紫外線吸収スペクトル極大吸収は277nm付近であり，極小吸収は252nm付近で
ある。この紫外線吸収スペクトルのチャートを第２図に
示す。

呈色反応銅フォーリン法で青色を呈する。

阻害剤本阻害物質Ｎ−61 25単位を含有する溶液（pH7.0）
に下記に示す化合物を存在させ,30℃で60分間処理した
後，アミラーゼ阻害活性測定法に準じて残存阻害活性の
測定を行なった。

その結果，本阻害物質Ｎ−61は，エチレンジアミン四
酢酸二ナトリウム（1mM）,p−クロロマーキュリーベン
ゾエート（1mM），モノヨード酢酸（1mM）,o−フェナン
スロリン（1mM）,8−キノリノール（1mM），ドデシル硫
酸ナトリウム（１％）または塩酸グアニジン（4M）によ
り活性が失われないことがわかった。このように、本阻
害物質Ｎ−61は種々の阻害剤に対して安定である。

失活の条件本阻害物質Ｎ−61を,1％２−メルカプトエタノール存
在下で100℃において15分間処理すると完全に失活す
る。

プロテアーゼの作用本阻害物質Ｎ−61 130単位を含有する溶液に下記の
各種プロテアーゼをそれぞれ20Pu添加し，各プロテアー
ゼの至適pH（ペプシンはpH2.0,トリプシンおよびα−キ
モトリプシンはpH9.0,およびサーモリシンはpH7.0）に
て30℃で３時間作用させた。これを100℃で５分間の処
理をすることによってプロテアーゼを失活させ,pHを1M
トリス−塩酸緩衝液（pH7.0）を用いて中性付近に調整
し，アミラーゼ阻害活性測定法に準じてアミラーゼ活性
阻害の測定を行った。上記のプロテアーゼ処理を行わな
かった阻害物質Ｎ−61について同様に測定し，これをス
タンダードとした。

これにより，本阻害物質Ｎ−61は，トリプシンを作用
させても失活しないが，ペプシンにより著しく失活し，
α−キモトリプシンおよびサーモリシンによりわずかに
失活することがわかった。

アミノ酸組成アミラーゼ阻害物質Ｎ−61のアミノ酸組成を,Spackma
nら（Anal.Chem.,30,1190（1958））の方法に従って,Hi
tachi 835型高速アミノ酸分析計（日立社）により測定
した。高速アミノ酸分析計のための試料の前処理は次の
ようにして行った：阻害物質Ｎ−61を，再蒸留した5.7N
HClと共にアンプルに入れて真空封管し,110℃で24,48,
および72時間加熱することにより加水分解する。シスチ
ン，メチオニンおよびトリプトファンはこの方法では測
定されないので，別の方法を採用した。すなわち，メチ
オニン，シスチン（およびシステイン）はSchramの方法
（Biochem.J.,57 33（1954））並びにMooreの方法（J.B
iol.Chem.,238,235（1963））に準じて過ギ酸酸化後，
加水分解を行い，メチオニンスルホン酸，システイン酸
として定量した。また，システインはEllmanの比色法
（Arch.Biochem.Biophys.,82 70（1959））に従い定量
した。そして，トリプトファンについてはEdelhochらの
方法（Biochemistry,６,1948（1967））により測定し
た。

結果を分子量8000とした時の残基数で次の表に示す。

（実施例）以下に本発明を実施例につき説明する。

実施例１１％可溶性デンプン,0.5％肉エキス,0.5％ポリペプト
ンおよび0.3％NaClを含有する種培養用培地（pH7.0）10
0mlを500ml容の坂口フラスコに入れて滅菌した後，スト
レプトマイセスビリドクロモゲネスＮ−61株を接種
し,30℃で48時間振盪培養することにより種培養を行っ
た。次いで,1％コーンスターチ,1％肉エキス,1％ポリペ
プトンおよび0.2％酵母エキスを含有する生産用培地（p
H7.0）20を30容のジャーファーメンターに入れて滅
菌した後，上記得られた種培養液のうちの400mlを接種
した。これを25℃，通気量12／分，および撹拌速度40
0rpmの条件下で42時間培養を行い，その後ブロスアウト
して培養液を取り出し，これを濾過して培養濾液を得
た。

このようにして得られた培養濾液を集めて47とし，
次いでこの濾液の硫安分画を行った。まず培養濾液に硫
安粉末を80％飽和となるまで添加し,4℃で１晩放置し
た。析出した沈澱をハイフロスーパーセルをひいたブフ
ナーロートで吸引濾過することにより集め，少量の蒸留
水に溶解して回収し，蒸留水に対して４℃で１晩透析し
て脱塩した。得られた透析内液を,10mMリン酸緩衝液（p
H6.0）で平衡化したDEAEセルロースカラム（9.5×40cm;
Brown社）にかけてアミラーゼ阻害物質を吸着させた。
次いで，同リン酸緩衝液で洗浄した後，該緩衝液中の食
塩（NaCl）濃度を０〜0.5Mまで直線的に増加させること
によってグラジエント溶出を行った。アミラーゼ阻害活
性を示す画分を回収し,10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に対
して一晩透析した。この透析内液を,10mMリン酸緩衝液
（pH6.0）で平衡化したTEAEセルロースカラ（6.0×38c
m;Serva社）にかけてアミラーゼ阻害物質を吸着させ，
同緩衝液で洗浄した後，該緩衝液中の食塩濃度を０〜0.
5Mまで直線的に増加させることによってグラジエント溶
出を行った。得られたアミラーゼ阻害活性を示す画分
（NaCl濃度0.3〜0.36M）を回収し，蒸留水に対して１晩
透析した。この透析内液をクエン酸を用いてpH3.0に調
整し,20mMクエン酸緩衝液（pH3.0）で予め平衡化してお
いたSP−セファデックスＣ−50カラム（2.5×30cm;Phar
macia社）にかけてアミラーゼ阻害物質を吸着させた。
次いで，同クエン酸緩衝液で十分に洗浄した後，食塩濃
度を０〜0.7Mまで直線的に増加させることによってグラ
ジエント溶出を行った。得られたアミラーゼ阻害活性を
示す画分（NaCl濃度0.4〜0.55M）770mlに硫安粉末468g
を添加し,4℃で数時間放置することにより硫安分画を行
い，析出した沈澱を遠心分離により回収した。この沈澱
を少量の10mMリン酸緩衝液（pH6.0）に溶解し,20mMリン
酸緩衝液（pH6.0）で平衡化したセファデックスＧ−50
（極微）カラム（2.5×60cm;Pharmacia社）にかけてゲ
ル濾過を行った。アミラーゼ阻害活性を示す画分を蒸留
水に対して５℃で１晩透析し，その後透析内液をクエン
酸を用いてpH3.0に調整した。この液を20mMクエン酸緩
衝液（pH3.0）で平衡化したSP−トヨパールカラム（2.5
×20cm;Tosoh社）に添加し，上記と同様にして阻害物質
を吸着させ，非吸着物質を洗浄除去をした。次いで緩衝
液中のNaCl濃度を０〜1.0Mまで直線的に増加させること
によって溶出を行った。溶出により得られる画分と吸光
度との関係，および得られる画分とアミラーゼ阻害活性
との関係を第３図に示す。第３図において，●印は0D
₂₈₀nmにおける吸光度（タンパクによる吸収）を示し，
○印はアミラーゼ阻害活性（U/ml）を示す。アミラーゼ
阻害活性は２つのピークとして現れ，このピークに相当
する画分を集めてそれぞれ画分ＩおよびIIとした。この
活性画分ＩおよびII（Ｉは画分番号49〜54,そしてIIは
画分番号55〜58）を回収し，それぞれ水に対して十分に
透析した。この透析内液を凍結乾燥し，画分Ｉからは3
6.5mg,そして画分IIからは13.8mgの白色粉末精製品を得
た。このうち画分Ｉから得た精製標品のアミラーゼ阻害
活性は約5,000U/mgであった。これらの精製標品は,SDS
−ポリアクリルアミドゲルを用いたスラブ電気泳動を行
うといずれも単一バンドとなり，電気泳動的に単一の物
質であることが示され，これをアミラーゼ阻害物質Ｎ−
61と名付けた。

（発明の効果）本発明によれば，このように，新規のアミラーゼ阻害
物質Ｎ−61が提供される。この阻害物質Ｎ−61はストレ
プトマイセス属菌から効果的に生産される。この阻害物
質Ｎ−61は，広いpH範囲および温度範囲において作用し
かつ安定であり，多くの動物由来の膵臓アミラーゼを選
択的に阻害するが，唾液アミラーゼをほとんど阻害せ
ず，かつ細菌由来のアミラーゼを阻害しないという作用
特異性を有する。そのため，この阻害物質Ｎ−61は，
（ｉ）膵臓アミラーゼと，唾液アミラーゼおよび細菌由
来の各種アミラーゼとを簡単に分離・精製するためのア
フィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして；
および（ii）急性膵炎などの臨床診断に用いられる血清
アミラーゼ活性の測定における膵臓アミラーゼと唾液ア
ミラーゼとの分別定量の手段として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本阻害物質Ｎ−61の30℃および100℃における
安定pH範囲を示すグラフ，第２図は本阻害物質Ｎ−61の
紫外線吸収スペクトルを示すチャート，第３図は本阻害
物質Ｎ−61のSP−トヨパールカラムクロマトグラフィー
の溶出曲線を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:465） (72)発明者西村隆久大阪府大阪市阿倍野区松崎町２丁目９番４号 (72)発明者清水保広滋賀県甲賀郡甲西町若竹町５

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の性質を有するアミラーゼ阻害物質Ｎ−
61: 作用：ヒト，ブタ，ネコ，ウマ，ヒツジ，ヤギ，ウ
シ，イヌおよびヘビの膵臓アミラーゼを阻害し；ヒト唾
液アミラーゼをほとんど阻害せず；ウサギおよびモルモ
ットの膵臓アミラーゼ，バチルス属菌由来のα−アミラ
ーゼ，ダイズおよびオオムギのβ−アミラーゼ，リゾプ
ス属菌由来のグルコアミラーゼ，シュウドモナス属菌由
来のイソアミラーゼ，ペプシン，トリプシンおよびα−
キモトリプシンを阻害しない，安定pH範囲および熱安定性:pH2〜12で30℃において24
時間にわたり安定であり,pH3〜９で100℃において15分
間にわたり安定である，分子量:SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による
分子量は約8,000である，等電点：アンフォラインを担体として用いた等電点は
4.1である，および紫外線吸収スペクトル：極大吸収は約277nmであり，
極小吸収は約252nmである。
【請求項２】ストレプトマイセス（Streptomyces）属菌
から得られる特許請求の範囲第１項に記載のアミラーゼ
阻害物質Ｎ−61。
【請求項３】ストレプトマイセスビリドクロモゲネス
（Streptomyces viridochromogenes）Ｎ−61株から得ら
れる，特許請求の範囲第１項に記載のアミラーゼ阻害物
質Ｎ−61。