ES2255060T3 - Dendrimeros antivirales. - Google Patents
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Abstract
UNA COMPOSICION ANTIVIRAL COMPRENDE UN DENDRIMERO COMO UN DENDRIMERO DE POLIAMIDOAMINA O DE POLILISINA QUE TIENE UNA PLURALIDAD DE GRUPOS TERMINALES, EN DONDE AL MENOS UNO DE LOS GRUPOS TERMINALES TIENE UNA ESTRUCTURA DE CONTENIDO ANIONICO O CATIONICO UNIDA AL MISMO, EN PARTICULAR UNA ESTRUCTURA CON CONTENIDO DE ACIDO SULFONICO, ACIDO CARBOXILICO O TRIMETILAMONIO O SIMILAR.
Description
Dendrímeros antivirales.
Esta invención se relaciona con agentes
anti-virales y en particular se relaciona con
dendrímeros los cuales se ha encontrado que tienen significativa
actividad antiviral contra el virus de inmunodeficiencia humano
(VIH) y otros virus con envoltura.
Se ha establecido que ciertos compuestos
polisacáridos sulfonados tienen actividad antiviral cuando se
prueban contra el VIH, sin embargo estos compuestos son
relativamente inestables y de acuerdo con ello se requieren grandes
cantidades de estos compuestos para obtener efectos antivirales
efectivos. Además, muchos de es estos compuestos, incluyendo la
heparina y el sulfato de dextrano, por ejemplo, son potentes
anticoagulantes y debido a esta actividad no son particularmente
adecuados para su uso clínico como agentes antivirales.
La presente invención provee una nueva clase de
agentes antivirales basados en un tipo particular de polímero
denominado aquí como "dendrímero", que tiene sustancial
actividad antiviral contra HIV1 y HIV2, CMV y HSV, y que no tiene
sustancialmente actividad anticoagulante. Estos compuestos son
entonces bien adecuados para uso profiláctico y terapéutico como
agentes antivirales en humanos.
De acuerdo con la presente invención se
provee
1. Un compuesto que siendo un dendrímero tiene
una pluralidad de grupos terminales, caracterizado porque
- i.
- dicho compuesto tiene actividad inhibidora in vitro contra un virus seleccionado del grupo consistente de VIH1 o VIH2, hepatitis B o C, virus de diarrea viral bovina, rinovirus, Virus de Parainfluenza Humana, Virus Sicticial Respiratorio (RSV), Virus de Varicela Zoster (VZV), Citomegalovirus Humano(CMV), Virus de Epstein BArr (EBV), Virus de Papiloma Humano (HPV), Adenovirus-8, Virus de Herpes Simplex (HSV) tipo 1 y 2, Virus Measles, y Virus de Estomatitis Vesicular (VSV), y
- ii.
- al menos uno de dichos grupos terminales tiene una unidad estructural que contiene aniones o cationes enlazada al mismo.
Tal dendrímero se considera aquí como un
"dendrímero aniónico o catiónico", y el término es usado a lo
largo de esta especificación y en las reivindicaciones que siguen,
para incluir no sólo los dendrímeros per se, sino también sus sales
farmacéutica o veterinariamente aceptables, por ejemplo las sales de
metales alcalinos o alcalino térreos tales como las sales de sodio,
potasio o calcio.
Los dendrímeros son compuestos macromoleculares
altamente ramificados formados por secuencias de reacción
reiterativas que comienzan a partir de una molécula núcleo inicial
con capas o etapas sucesivas que se añaden en "generaciones"
sucesivas para construir un compuesto polimérico altamente ordenado,
tridimensional. Una estructura de dendrímero generalizada se
muestra en la Figura 1. Los dendrímeros se caracterizan por los
siguientes aspectos: i un núcleo iniciador (I) que puede tener uno
o más sitios reactivos y ser puntual o de tamaño significativo de
modo que efectúe la topología final del dendrímero; ii capas de
unidades repetitivas ramificadas enlazadas al núcleo iniciador; iii
grupos terminales funcionales (Z) unidos a la superficie del
dendrímero. La presente invención usa estructuras dendríticas como
marcos para el enlace de unidades estructurales iónicas; la
invención no está limitada a los dendrímeros esféricos descritos
aquí en detalle sino que pueden estar basados en cualquier
estructura dendrítica. La variedad de dendrímeros tanto en forma
como en constitución es bien conocida para los expertos en la
técnica.
La preparación de dendrímeros es bien conocida y
está descrita a manera de ejemplo en las patentes de los EEUU Nos.
4,289,872 y 4,410,688 (que describen dendrímeros basados en capas de
unidades de lisina), así como en las patentes de los EEUU Nos.
4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 y 4,587,329 (que describen
dendrímeros basados en otras unidades que incluyen poliamidoamina o
dendrímeros PAMAM). Los dendrímeros descritos en estas patentes de
los EEUU son descritos como apropiados para usos tales como agentes
modificadores de superficie, agentes quelantes y desemulsificadores
de emulsiones aceite/agua, agentes de fuerza humectante en la
manufactura de papel, y como agentes para modificar la viscosidad
en formulaciones acuosas tales como pinturas. También se sugiere en
las patentes de los EEUU Nos. 4,289,872 y 4,410,688 que los
dendrímeros basados en unidades de lisina pueden ser usados como
sustratos para la preparación de dosificaciones farmacéuticas.
Las publicaciones de Patente Internacional Nos.
WO 88/01178, WO 88/01179 y WO 88/01180 revelan conjugados en los
cuales un dendrímero está conjugado o asociado con otro material tal
como un material transportador farmacéutico o agrícola. Estas
publicaciones de patente junto con las patentes de los EEUU
mencionadas anteriormente contienen una amplia revelación de
diversos dendrímeros y procesos para la preparación de los
mismos.
EP-A-0328403,
EP-A-0339695,WO93/03766 y
US-5,229,490 describen todas diversos sistemas de
péptidos anfígenos múltiples, métodos para preparar tales sistemas
y usos de tales sistemas. Los sistemas de péptidos antigénicos
múltiples de estas referencias de la técnica anterior son capaces de
ilicitar una respuesta inmune cuando se administran a un sujeto.
EP-A-0328403 describe
específicamente polipéptidos que son capaces de proveer competición
inmunológica con VIH-gp 120 de al menos una de las
cepas de retrovirus VIH. La síntesis de inhibidores de sialosida
dendrítica del virus de la Influenza A hemaglutinina es revelada en
Roy et al, J. Chem. Soc, Chen Commun, 1993, pp.
1869-1993
El término "dendrímero" como se usa aquí
debe entenderse en su sentido más amplio, e incluir dentro de su
alcance todas las formas y composiciones de estos dendrímeros según
se revela elas publicaciones Nos. WO 88/01178, WO 88/01179 y WO
88/01180. El término también incluye dendrímeros enlazados o
puenteados, como se revela en estas publicaciones de patente.
Los dendrímeros preferidlos de la presente
invención comprenden un núcleo polivalente enlazado con al menos
dos ramificaciones dendríticas, y extendido preferiblemente a través
de dos generaciones. Dendrímeros particularmente preferidos son los
dendrímeros poliamidoamina (PAMAM). Los dendrímeros PAMAM (EDA) y
los dendrímeros de polilisina.
De acuerdo con la presente invención, al menos
uno, y preferiblemente un número sustancial, de los grupos
terminales sobre la superficie del dendrímero tienen una unidad
estructural aniónica o catiónica covalentemente enlazada al mismo.
Las ramificaciones del dendrímero pueden terminar en grupos amino u
otros grupos reactivos funcionales tales como OH o SH, los cuales
subsecuentemente pueden hacerse reaccionar con las unidades
estructurales aniónicas o catiónicas de la capa externa del
dendrímero. Cuando los grupos terminales del dendrímero son grupos
amino, la unidad estructural con contenido aniónico o catiónico
puede estar enlazada al dendrímero mediante una variedad de grupos
funcionales incluyendo enlaces amida y tioúrea. Las unidades
estructurales con contenido aniónico o catiónico preferidas que
pueden estar enlazadas a los grupos terminales del dendrímero
incluyen unidades estructurales de ácido sulfónico, unidades
estructurales de ácido carboxílico diferentes a unidades
estructurales de ácido 2-tiosálico, unidades
estructurales que contienen trimetilamonio y unidades estructurales
que contienen poliamino
macrociclos.
macrociclos.
Unidades estructurales con contenido aniónico y
catiónico que pueden ser enlazadas a aminos u otros grupos
terminales incluyen, a manera de ejemplo, los siguientes grupos (en
los cuales n es cero u un entero positive, más particularmente n es
cero o un entero de 1 a 20):
-NH(CH_{2})_{n}SO_{3}^{-}
-(CH_{2})_{n}SO_{3}^{-}
-Ar(SO_{3})_{n}
-CH_{2}CH(SO_{3}^{-})COOH
-CH(SO_{3}^{-})CH_{2}COOH
-ArX(CH_{2})_{n}SO_{3}^{-} (X=O,S,NH)
-(CH_{2})_{n}N ^{+}Me_{3}
-Ar(N^{+}Me_{3})_{n}
-Ar(CH_{2}N
^{+}Me_{3})_{n}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Unidades estructurales que pueden ser enlazados a
los grupos terminales del dendrímero de acuerdo con esta invención
incluyen grupos ácido sulfónico; grupos sulfoacetamida; grupos ácido
succínico; grupos N-sulfoalquil succinamida, tales
como grupos N-(2-sulfoetil)succinamida; aril
o heteroarilureas sustituidas con uno o más grupos ácido sulfónico,
tales como grupos 4-sulfofeniltiourea, grupos
3,6-disulfonaftiltiourea, grupos
4-sulfonaftiltiourea, grupos
3,5-disulfofeniltiourea y grupos
3,6,8-tritrisulfonaftiltiourea;
Unidades estructurales particulares que pueden
estar enlazadas a los grupos terminales del dendrímero de acuerdo
con esta invención incluyen grupos alquil sulfónico; grupos
sulfoacetamida; grupos ácido sulfosuccinámico; grupos
N-sulfoalquil succinamida tales como grupos
N-(2-sulfoetil)succinamida; aril o heteroaril
tioureas sustituidas con uno o más grupos ácido sulfónico, tales
como grupos 4-sulfofeniltiourea, grupos
3,6-disulfonaftiltiourea, grupos
4-sulfonaftiltiourea, grupos
3,5-disulfofenil tiourea y grupos
3,6,8-trisulfonaftiltiourea; aril o heteroaril
amidas sustituida con uno o más grupos ácido sulfónico, grupos
sulfoalquil, sulfoalcoxi, sulfoalquilamino o sulfoalquiltio, tales
como grupos 4-(sulfometil)benzamida o grupos
4-sulfobenzamida; aril o heteroaril alcanamidas
sustituidas con uno o más grupos sulfónico, tales como grupos
N-(4-sulfofenil) propanamida; aril o heteroaril
ureas sustituidas con uno o más grupos ácido sulfónico, tales como
grupos 4-sulfofenil urea;
N,N,N-trimetil derivados de aminoácidos, tales como
grupos N,N,N-trimetilglicinamida; aril o
heteroarilamidas ssustituidas con uno o mas grupos trialquilamino,
trialquilaminoalquil, trialquilaminoalquiloxi,
trialquilaminoalquilamino o trialquilaminoalquiltio, tales como
grupos 4-trimetilamonio benzamida o
4-(trimetilamonio metil) benzamida; grupos
N-(2-acetoxietil)-N,N-dimetilamonio)metilcarboxamida;
grupos guanidino; grupos
4-carboxi-3-hidroxibencilamina;
o grupos apoliamino macrocíclicos que contienen uno o más anillos
macrocíclicos conectados a través de de una unidad estructural
espaciadora alquilo o arilo al grupo terminal del dendrímero, tales
como grupos
4-([1,4,8,11-tetraazaciclotetradecane]metil)benzamida.
Los dendrímeros anionicos o catiónicos de esta
invención pueden ser preparados por métodos químicos estándar que
son bien conocidos para personas experimentadas en esta técnica.
Métodos adecuados se describen por medio de ejemplos en los
Ejemplos 1 a 20 más adelante.
Como se describió previamente, los dendrímeros
anionicos y catiónicos de la presente invención han demostrado
exhibir actividad antiviral significativa, particularmente contra el
VIH. De acuerdo con ello, estos dendrímeros anionicos o catiónicos
son útiles en el tratamiento profiláctico y terapéutico de
infecciones virales, por ejemplo infecciones por VIH1 y VIH2 y
otros virus con envoltura incluyendo falvivirus tales como Hepatitis
B y Hepatitis C, Virus de Diarrea Viral Bovina, Virus de influenza
Humana, Virus de Parainfluenza Humana, Virus Sincitial Respiratoria
(RSV), Virus de Varicela Ester (VZV), Citomegalovirus Humano (CMV),
Virus Repstein Barr (EBV), Virus de Papiloma Humano (HPV),
Adenovirus-8, Virus de Herpes Simplex (HSV) tipos 1
y 2, Virus de Measles y Virus de Estomatitis Vesicular (VSV).
Así, en otro aspecto la presente invención provee
una composición farmacéutica o veterinaria de tratamiento antiviral
profiláctico o terapéutico de un humano o de una animal no humano,
el cual comprende un dendrímero aniónico o catiónico como se
describió antes ampliamente, en asociación con al menos un
transportador o diluyente farmacéutica o veterinariamente
aceptable.
La formulación de tales composiciones es bien
conocida par alas personas experimentadas en este campo.
Transportadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables
incluyen todos los solventes, medios de dispersión, rellenos,
transportadores sólidos, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes
antibacterianos y antifúngicos, agentes de deposición isotónicos y
de absorción, y similares, convencionales. El uso de tales medios y
agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido
en la técnica, y esta descrito, por ejemplo, en Remington's
Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Mack Publishing Company,
Pennsilvania, USA. A menos que algún medio o agente convencional
sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla el uso de
los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente
invención. Ingredientes activos suplementarios también pueden ser
incorporados en las composiciones.
Es especialmente ventajoso formular composiciones
en unidades de dosificación para facilidad de administración y
uniformidad de dosificación. La forma de unidad de dosificación
según se usa aquí se refiere a unidades físicamente discretas
conformadas como dosificaciones unitarias para los sujetos humanos
que se han de tratar; cada unidad contiene una cantidad
predeterminada del ingrediente activo calculada para producir el
efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador y/o
diluyente farmacéuticamente requerido. Las especificaciones para
las novedosas formas de unidad de dosificación de la invención están
dictadas por y son directamente dependientes de (a) las
características únicas del ingrediente activo y el efecto
terapéutico particular que se desea lograr, y (b) las limitaciones
inherentes en la técnica de componer un tal ingrediente activo para
el tratamiento particular.
En otro aspecto, la presente invención provee un
método para tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección
VIH u otra infección viral en un animal humano o no humano, que
comprende la administración a dicho animal humano o no humano de
una cantidad antiviral profiláctica y terapéuticamente efectiva de
un dendrímero aniónico o catiónico como se ha descrito ampliamente
más arriba.
En aun otro aspecto, esta invención provee el uso
de una cantidad antiviral profiláctica o terapéuticamente efectiva
de un dendrímero aniónico o catiónico como se ha descrito
ampliamente más arriba para el tratamiento profiláctico o
terapéutico de, o en la manufactura de un médicamente para el
tratamiento profiláctico o terapéutico de una infección con VIH u
otra infección viral en un animal humano o no humano.
Está disponible una variedad de rutas de
administración. El modo particular seleccionado dependerá, desde
luego, de la condición particular que esté siendo tratada y de la
dosificación requerida para la eficacia terapéutica. Los métodos de
esta invención, hablando en general, pueden ser practicados usando
cualquier modo de administración que sea médicamente aceptable,
significando con ello cualquier método que produzca niveles
terapéuticos del componente activo de la invención sin causar
efectos adversos clínicamente inaceptables. Tales modos de
administración incluyen rutas orales, rectales, tópicas, nasales,
transdérmicas o parenterales (por ejemplo, subcutáneas,
intramusculares e intravenosas). Las formulaciones para
administración oral incluyen unidades discretas tales como
capsulas, tabletas, grageas y similares. Otras rutas incluyen
administración intratecal directamente en el fluido espinal,
introducción directa tal como mediante diversos dispositivos
angioplástcios como catéteres y balones bien conocidos para aquéllos
de experiencia normal[en la técnica, e inyección
intraparenquimal en áreas predefinidas
Las composiciones pueden ser presentadas
convenientemente en formas de dosificación unitaria y pueden ser
preparados convenientemente por cualquiera de los métodos bien
conocidos en el arte de la farmacia. Tales métodos incluyen etapas
de poner el componente activo en asociación con un transportador que
constituya uno o más ingredientes accesorios. En general, las
composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el
componente activo con un transportador líquido, un trasportador
sólido finamente dividido, o. ambos, y entonces, si es necesario,
dando forma al producto.
Las composiciones de la presente invención,
adecuadas para administración oral, pueden ser presentadas como
unidades discretas tales como cápsulas, cartuchos, tabletas o
grageas, conteniendo cada una cantidad predeterminada del
componente activo, en liposomas o como una suspensión en un licor
acuoso o en un licor no acuoso tal como un jarabe, un elíxir o una
emulsión.
Una composición adecuada para administración
parenteral comprende convenientemente una preparación acuosa
estéril del componente activo la cual es preferiblemente isotónica
con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa puede ser
formulada de acuerdo con métodos conocidos usando aquellos agentes
adecuados dispersantes o humidifcantes y de suspensión. La
preparación inyectable estéril también puede ser una solución o
suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico
parenteralmente aceptable como por ejemplo una solución en
polietilenglicol. Además, aceites fijos estériles pueden ser
empleados convenientemente como un medio solvente o de suspensión.
Para este propósito, puede emplearse cualquier aceite blando fijo
incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos. Además, encuentran
aplicación ácidos grasos tales como ácido oléico, en la preparación
de inyectables.
Otros sistemas de administración son aquellos que
pueden proveer liberación del componente activo de la invención en
pellas o cápsulas de liberación sostenida. Muchos tipos de sistemas
de administración por liberación sostenida están disponibles.
Incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas erosionables en los
cuales el componente activo está contenido dentro de una matriz, y
(b) sistemas de difusión en los cuales el componente activo hace
permeación a una rata controlada a través de un polímero. Además,
puede usarse un sistema de liberación con un aparato basado en una
bomba, algunos de los cuales están adaptados para implantación.
El componente activo se aplica en cantidades
profiláctica o terapéuticamente activas. Una cantidad profiláctica
o terapéuticamente active significa que la cantidad necesaria al
menos parcialmente para alcanzar el efecto deseado, o para retrasar
el inicio de, inhibir la progresión de, o detener del todo, el
arranque o progresión de la condición particular que está siendo
tratada. Tales cantidades dependerán, desde luego, de la condición
particular que está siendo tratada, de la severidad de la condición
y de los parámetros individuales del paciente incluyendo edad,
condición física, tamaño, peso y tratamientos concurrentes. Estos
factores son bien conocidos por los bien experimentados en la
técnica y pueden ser abordados con no más que experimentación de
rutina. Se prefiere en general que se use una dosis máxima, esto
es, la dosis segura más alta de acuerdo con sólido juicio médico.
Será entendido por los experimentados en la técnica, sin embargo,
que una dosis menor o una dosis tolerable podrá ser administrada
porrazotes médicas, razones sicológicas o por virtualmente cualquier
otra razón.
En general, las dosis orales diarias del
componente activo estarán entre aproximadamente 0.01 mg/kg por día
hasta 1000 mg/kg por día. Inicialmente pueden administrase pequeñas
dosis (0.01-1 mg), seguidas por dosis crecientes
hasta aproximadamente 1000 mg/kg por día. En el evento de que la
respuesta en un sujeto es insuficiente con tales dosis, pueden
emplearse dosis aun mayores (o dosis efectivas más altas por una
ruta de administración diferente más localizada) hasta el grado en
que la tolerancia del paciente lo permita. Se contemplan múltiples
dosis por día para alcanzar niveles sistémicos apropiados de los
compuestos.
A lo largo de esta especificación y de las
reivindicaciones que le siguen, la palabra "comprenden" o
variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se
entenderán como que implican la inclusión de un ingrediente o grupo
de ingredientes establecido pero no la exclusión de otro ingrediente
o grupo de ingredientes.
Aspectos adicionales de la presente invención
serán evidentes a partir de los siguientes Ejemplos que se incluyen
a manera de ilustración, no de limitación de la invención. En los
siguientes Ejemplos los dendrímeros PAMAM se refieren a dendrímeros
de poliamidoamina basados en un núcleo de amoniaco según se detalla
en las patentes de los EEUU Nos. 4,507,466, 4,558,120, 4,568,737 y
4,587,329; los dendrímeros PAMAM (EDA) se refieren a dendrímeros de
poliamidoamina basados en un núcleo de etilendiamina; y los
dendrímeros BHAlysxlysilysz se refieren a dendrímeros asimétricos
de polilisina basados en un núcleo de bincihidrilamina y unidades
ramificadas de lisina según se describe en las patentes de los EEUU
Nos. 4,289,872 y 4,410,688. Los dendrímeros de poliamidoamina
PAMAM1.0, PAMAM 2.0, PAMAM 3.0, PAMAM 4.0, PAMAM 5.0 o generaciones
mayores, PAMAM 4.0 (EDA), y los dendrímeros de polilisina
BHAlyslys2, BHAlyslys2lys4, BHAlyslys2lys4lys8 y
BHAlyslys2lys4lys8lys16,
BHAlyslys2lys4lys8lys16lys32,BHAlyslys2lys4lys8lys16lys64, o de
generaciones mayores, se preparan como se describe en las patentes
de los EEUU Nos. 4,289,872, 4,410,688, 4,507,466, 4,558,120,
4,568,737 y 4,587,329 y las Publicaciones de Patente Internacional
Nos. WO 88/01178, WO 88/01179 y WO 88/01180 referidas a lo
anterior.
Carbonato de sodio sólido (0.13 g; 1.0 mmol) fue
añadido lentamente a una solución en agitacion de ácido
2-acrilamido-2-metilpropano
sulfónico (0.41 g; 2.0 mmol), el pH de la solución era 8.0. Se
añadió entonces una solución de PAMAM 1.0 (0.12 g; 0.33 mmol) en
agua (1 ml) a la solución formada seguida por la adición de cuatro
gotas de una solución acuosa al 40% de hidróxido de venció
trimetilamonio. La solución fue entonces calentada bajo nitrógeno a
60ºC por tres días y luego concentrada. El residuo fue purificado
por filtración por gel (Separes G10; agua) y luego liofilizada para
dar el dendrímero PAMAM 1.0 sulfonado en forma de un sólido
blancuzco (0.51 g). Los espectros de ^{1}H y ^{13}C mostraban
una mezcla de del dendrímero PAMAM 1.0 dialquilado y monoalquilado
(ca. 70:30). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 31.0, 31.1, 37.1,
37.7, 41.3, 48.6, 51.5, 53.1, 53.4, 55.6, 56.2, 61.2, 61.5, 178.3,
179.0, 179.8.
El PAMAM 2.0 se hizo reaccionar con ácido
2-acrilamido-2-metil
propano sulfónico como se describió anteriormente. El producto
crudo fue purificado por filtración por gel (Separes G10; agua) y
luego liofilizado para dar un sólido blancuzco. Los espectros de
^{1}H y ^{13}Crmn mostraron una mezcla del dendrímero PAMAM 2.0
dialquilado y monoalquilado (ca. 65:35). ^{13}C rmn (D_{2}O):
\delta 31.0, 31.1, 37.1, 37.7, 41.3, 48.7, 51.5, 53.4, 55.6,
56.2, 61.2, 61.5, 178.4, 179.0, 179.1, 179.6. Cuando la reacción
anterior fue repetida omitiendo el hidróxido de
benciltrimetil-amonio se obtuvo un resultado
similar.
El PAMAM 3.0 se hizo reaccionar con ácido
2-acrilamido-2-metil
propano sulfónico como antes excepto que se usó un ligero exceso de
carbonato de sodio y se omitió el hidróxido de benciltrimetilamonio.
Los espectro s de ^{1}H y ^{13}C rmn mostraron una mezcla del
dendrímero PAMAM 3.0 diarilado y monoalquilado (ca. 50:50). ^{13}C
rmn (D_{2}O): \delta 31.0, 31.1, 36.9, 37.4, 41.1, 48.6, 51.5,
53.4, 55.7, 56.2, 61.1, 61.5, 178.2, 178.9, 179.0, 179.8.
El PAMAM 4.0 se hizo reaccionar con ácido
2-acrilamido-2-metil
propano sulfónico como se describió para el PAMAM 3.0. Los
espectros de ^{1}H y ^{13}C rmn mostraron una mezcla del
dendrímero PAMAM 4.0 dialquilado y monoalquilado PAMAM 4.0 (ca.
35:65). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 31.0, 31.1; 36.9, 37.3,
41.1, 48.5, 51.5, 53.5, 55.7, 56.2, 61.1, 61.5, 178.1, 178.9,
179.0, 179.8.
Una solución de 4-nitrofenil
bromoacetato (0.40 g; 1.5 mmol) en DMF seco (1 ml) fue añadida a una
solución en agitación de PAMAM 1.0 (0.18 g; 0.5 mmol) en DMF (3
ml). La solución amarilla resultante fue concentrada (30º/ 0.1
mmHg) para dar un aceite amarillo. Este aceite fue sometido a
partición entre agua y cloroformo y la capa acuosa fue separada y
lavada con cloroformo (2X) y finalmente con acetato de etilo. La
solución acuosa fue concentrada (35º/ 25 mmHg)para dar el
dendrímero PAMAM 1.0 bromoacetilado como un aceite amarillo (0.36
g;100%). 13C rmn (D2O): \delta 32.8, 33.3, 43.0, 43.5, 54.4,
174.5, 176.4.
Una solución de sulfito de sodio (0.2 g; 1.6
mmol) en agua (1 ml) fue añadida aminoácido una solución de PAMAM
1.0 bromoacetilado descrita antes (0.36g; 0.5 mmol) en agua (5 ml) y
la solución se dejó en reposos a temperatura ambiente por once
días. La solución amarilla fue concentrada para dar un sólido
amarillento (0.60 g). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 34.4, 43.1,
43.4, 54.0, 61.7, 171.3, 177.2.
La secuencia de reacción anterior podría
efectuarse sin aislar el dendrímero bromoacetilado añadiendo
simplemente la solución de sulfito de sodio al extracto acuoso
crudo obtenido de la primera reacción.
Método
1
Una solución de 4-nitrofenil
bromoacetato (0.18 g; 0.7 mmol) en DMF seco (1 ml) fue añadida una
solución en agitación de PAMAM 2.0 (0.10 g; 0.1 mmol) en DMF (3
ml). La solución amarilla resultante fue agitada por 20 horas a
temperatura ambiente, cuando una prueba de ninhidrina dio negativa.
La solución se añadió entonces con oscilación a sobre agua (150 ml)
y la mezcla se extrajo con cloroformo (3X) y acetato de etilo. Se
añadió una solución de sulfito de sodio (0.1 g; 0.8 mmol) en agua
(1 ml) a la solución cruda del dendrímero bromoacetilado y la mezcla
se dejó en reposo por tres días a temperatura ambiente. La solución
amarillenta fue concentrada entonces para dar un residuo sólido
amarillo, el cual purificado por filtración por gel (Separes LH20;
agua) para dar el dendrímero PAMAM 2.0 terminado en sulfoacetamida
de sodio (103 mg). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 33.0, 35.7,
36.0, 37.7, 40.3, 43.0, 43.2, 53.4, 53.7, 56.0, 61.6, 171.2, 174.6,
178.5.
Método
2
Succinimidil acetiltioacetato sólido (67 mg; 0.33
mmol) fue añadido a una solución de PAMAM 2.0 (52 mg; 0.05 mmol)
en DMF seco (2 ml) y la solución resultante se agitó a temperatura
ambiente por dos días. La mezcla fue entonces concentrada
(30º/10-3 mmHg) para dar un residuo aceitoso. El
residuo fue sometido a partición entre agua y cloroformo, y la capa
acuosa fue separada y concentrada para dar un aceite viscoso (117
mg). ^{1}H y ^{13}C rmn mostraron que el aceite era una mezcla
del dendrímero acetilado y N-hidroxi succinimida. La
filtración por gel (Separes G10; agua) produjo una muestra pura del
dendrímero PAMAM 2.0 terminado en acetiltioacetamida (29 mg).
^{13}C rmn(D_{2}O): \delta 34.0, 34.2, 37.3, 43.0,
43.1, 43.3, 53.5, 54.0, 56.3, 175.4, 177.2, 177.5.
Una solución del dendrímero funcionalizado
anterior en ácido fórmico acuoso al 40% (7 ml) a una solución
enfriada con hielo recién preparada de ácido perfórmico (1.6 mmol)
en ácido fórmico (2 ml). La mezcla fue agitada durante una hora a
0ºC y luego por veinte horas a temperatura ambiente. Se añadió
entonces una pequeña cantidad de carbón activado para descomponer
cualquier exceso de perecido, la mezcla se agitó durante 30 minutos
y luego se filtró y concentró para dar un aceite viscoso. El
producto crudo fue disuelto enagua, se ajustó el pH a 9.0 con
bicarbonato de sodio acuoso y el material se desalinizó pasándolo a
través de una columna de Sephadez G10. Se obtuvo un sólido blanco
(20 mg) después de liofilización, el cual era espectroscópicamente
el mismo en esencia que el material obtenido por el método 1.
^{13}C rmn (D2): \delta 33.0, 38.7, 42.9, 43.0, 43.1, 53.9,
54.3, 56.5, 61.6, 171.2, 176.4, 177.0.
Anhídrido maléico sólido (0.1 1 g; 1. 1 mmol)
fue añadido a una solución en agitación de PAMAM 1.0 (0.12 g; 0.33
mmol) en DMF seco (3 ml). La mezcla se calentó un poco y se hizo un
poco parda a medida que el anhídrido se disolvía y la solución
resultante fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. La
solución fue concentrada entonces (30º/10-4 mmHg)
para dar un aceite viscoso. ^{1}H y ^{13}C rmn (D_{2}O)
mostraron una conversión completa del PAMAM 1.0 a la trisamida
junto con algo de ácido maléico. ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta
33.1, 42.8, 43.1, 54.3, 135.0, 137.1, 169.1, 171.9, 173.3.
La trisamida cruda fue disuelta entonces en agua
(4 ml) y se añadió sulfito de sodio sólido (0.20 g; 1.6 mmol). La
solución resultante se dejó en reposo a temperatura ambiente por
cuatro días y luego se concentró. ^{1}H y ^{13}C rmn (D_{2}O)
mostraron una mezcla 1:1 de dendrímeros PAMAM 1.0 terminados en
ácido sodio sulfosuccinámico junto con algo de ácido
sulfosuccínico. El producto crudo fue purificado por filtración por
gel (Separes G10; agua) para obtener una muestra de los dendrímeros
PAMAM 1.0 terminados en ácido sodio sulfosuccinámico (107 mg).
^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 33.3, 39.6, 40.0, 42.9, 43.1,
54.0, 67.9, 69.4, 173.8, 176.3, 177.6, 181.8.
Una mezcla de dendrímeros PAMAM 2.0 terminados en
ácido regioisomérico sodio sulfosuccinámico fue preparada como se
describió arriba. ^{13}C mnr del derivado PAMAM 2.0 ácido
malemáico (D_{2}O): \delta 32.8, 33.0, 38.7,; 42.9, 53.8, 54.3,
56.5, 135.2, 136.8, 169.2, 171.9, 173.5, 174.6. 13C rmn PAMAM 2.0
derivados ácido sodio sulfosuccinámico (D_{2}O): \delta 37.0,
40.1, 41.1, 43.0, 43.2, 43.9, 53.0, 53.3, 55.5, 68.0, 69.4, 173.8,
177.6, 179.1, 179.5, 179.8, 182.3.
Anhídrido maléico sólido (60 mg; 0.6 mmol) fue
añadido a una solución en agitación de PAMAM 4.0 (51 mg; 0.01
mmol) en DMF seco (2 ml). La mezcla inicial se hizo turbia pero
pronto dio una solución clara que fue agitada durante la noche a
temperatura ambiente. La solución fue entonces concentrada
(35º/10-4 mmHg) para dar un aceite viscoso.
^{1}H y ^{13}C rmn (D_{2}O) mostraron conversión completa del
PAMAM 4.0 a la poliamimda junto con algo de ácido maléico. La
poliamida cruda fue disuelta entonces en agua (2 ml) y se añadió una
solución de sulfito de sodio (126 mg; 1.0 mmol) en agua (2 ml). La
solución resultante fue dejada en reposo a temperatura ambiente por
dos días y luego fue concentrada. ^{1}H y ^{13}C rmn (D_{2}O)
mostraron una mezcla de dendrímeros PAMAM 4.0 regioisoméricos
terminados en ácido sodio sulfosuccinámico junto con algo de ácido
sulfosuccínico con 24 grupos de ácido regiosisomérico
sulfosuccinámico (90 mg). ^{1}H rmn (D_{1}O): \delta
2.4-2.6; 2.7-3.1;
3.2-3.4; 3.9-4.0.13C rmn (D_{2}O):
\delta 36.2; 39.8; 40.5; 43.0; 43.2; 53.5; 55.8; 68.1; 69.5;
173.8; 177.4; 177.6; 178.7; 182.3.
Anhídrido succínico sólido (0.50 g; 5.0
mmol)fue añadido a una solución en agitacion de ácido
tetrabutilamonio 2-aminoetilsulfónico (1.83 g; 5.0
mmol) en diclorometano seco (30 ml). El anhídrido succínico se
disolvió lentamente y la solución turbia resultante fue agitada
durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla fue filtrada y
el filtrado fue concentrado para dar un aceite viscoso (2.41 g). 13C
rmn mostró conversión completa a la monoamida deseada junto con una
pequeña cantidad de ácido succínico. La precipitación repetida del
producto por adición gota a gota de solución de diclorometano en un
gran exceso de dietiléter dio el ácido tetrabutilamonio
N-(2-sulfoetil)succinámico como un sólido
blanco (1.762 g; 76%), mp 125-127ºC. ^{1}H rmn
(CDC_{l3}): \delta 0.86 (t, 12h, 4xCH_{3}), 1.28 (m, 8H,
4xCH)_{2},
1.50 (m, 8H, 4xCH_{2}), 2.33 (m, 2H, CH_{2}COOH), 2.44 (m, 2H, CH_{2}CONH), 2.76 (m, 2H, CH_{2}NHCO), 3.12 (m, 8H, 4xCH_{2}N), 3.50 (m, 2H, CH_{2}SO_{3}-), 7.53 (br t, 1H, NH). ^{13}C rmn (CDC_{l3}): \delta 13.5, 19.5, 23.8, 30.1, 30.9, 35.6, 50.0, 58.5, 172.0, 174.1.
1.50 (m, 8H, 4xCH_{2}), 2.33 (m, 2H, CH_{2}COOH), 2.44 (m, 2H, CH_{2}CONH), 2.76 (m, 2H, CH_{2}NHCO), 3.12 (m, 8H, 4xCH_{2}N), 3.50 (m, 2H, CH_{2}SO_{3}-), 7.53 (br t, 1H, NH). ^{13}C rmn (CDC_{l3}): \delta 13.5, 19.5, 23.8, 30.1, 30.9, 35.6, 50.0, 58.5, 172.0, 174.1.
Una solución de diciclohexilcarbodiimida (45 mg;
0.22 mmol) en diclorometano seco (1 ml) fue añadida a una solución
agitada de ácido tetrabutilamonio
N-(2-sulfoetil)succinámico (94 mg; 0.20
mmol) y 4-nitrofenol (28 mg; 0.20 mmol) en
diclorometano (2 ml), y la mezcla se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. La suspensión resultante fue filtrada y el
filtrado fue concentrado para dar el éster activo crudo, que fue
usado sin posterior purificación.
Una solución del tetrabutilamonio
4-nitrofenil
N-(2-sulfoetil)succinamato crudo (0.30 mmol)
en DMF seco (1 ml) fue añadida a una solución en agitación de PAMAM
4.0 (51.5 mg; 0.01 mmol) disuelto en DMF acuoso al 50% (3 ml) y
la solución amarilla resultante se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. La mezcla fue entonces concentrada (35º/
10-5 mmHg) y el residuo Amarillo fue sometido a
partición entre agua y cloroformo. La capa de agua fue separada,
lavada con cloroformo (2X) y acetato de etilo, y luego concentrada
para dar un aceite amarillo (134 mg). El producto crudo fue
convertido en la sal de sodio por paso a través de una columna de
Amberlite IR- 120(Na) para producir 85 mg del material. Este
material fue purificado adicionalmente por filtración por gel
(Separes LH20; agua) para dar el dendrímero PAMAM 4.0 terminado en
sodio N-(2-sulfoetil)succinamida (45 mg).
13C rmn (D_{2}O): \delta 33.2, 33.6, 35.5, 39.0, 39.5, 42.8,
43.2, 53.8, 54.1, 54.4, 56.6, 176.5, 176.9, 177.2, 178.9,
179.4.
Los dendrímeros correspondientes PAMAM 1.0 y
PAMAM 3.0 terminados en grupos sodio
N-(2-sulfoetil)succinamida fueron preparados
de manera similar. ^{13}C rmn PAMAM 3.0 derivado (D_{2}O):
\delta 33.4, 35.5, 39.0, 39.5, 42.9, 43.2, 53.8, 54.1, 54.3,
56.5, 176.4, 176.9, 177.4, 178.9, 179.4. ^{13}C rmn PAMAM 1.0
derivado (D_{2}O): \delta 34.9,35.5,39.5,42.9,
43.1,53.7,54.1, 179.0, 179.1, 179.3.
43.1,53.7,54.1, 179.0, 179.1, 179.3.
Se añadió ácido trifluoroacético (1 ml) a una
suspensión de BHAlysly_{2}lys_{4}lys_{8}DBL_{16} (36.5 mg;
5.0 \mumol) en diclorometano seco (1 ml) y la solución resultante
se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno por dos horas y
luego se concentró. El residuo fue disuelto en DMSO seco (2 ml) y
el pH se ajustó a 8.5 con trietilamina. Una solución del
tetrabutilamonio 4-nitrofenil
N-(2-sulfoetil)succinamato crudo (ca. 0.2
mmol) en DMSO (1 ml) fue añadida entonces gota a gota y la mezcla
se dejó en agitación durante la noche a temperatura ambiente. La
solución amarilla fue entonces concentrada
(50º/10-5mmHg) y el residuo Amarillo fue sometido a
partición entre agua y cloroformo. LA capa acuosa fue separada y
lavada con cloroformo (3X) y acetato de etilo, y luego concentrada
para dar un aceite (99 mg). El producto crudo fue convertido en la
sal de sodio por paso a través de una columna de Amberlite IR
120(Na) para dar 81 mg de material. Este material fue
purificado adicionalmente mediante filtración por gel (Separes
LH20; agua) para dar el dendrímero terminado en sodio
N-(2-sulfoetil)succinamida
tBHAlyslys_{2l}ys_{4}lys_{8}lys_{16} (39 mg). ^{13}C rmn
(D_{2}O): \delta27.0, 32.3, 35.2, 35.3, 35.6, 35.7, 39.5, 43.5,
54.1, 58.5, 131.5, 132.0, 133.3, 145.1, 177.8, 178.0, 178.4, 178.8,
178.9, 179.2, 179.7, 179.8.
El correspondiente BHAlyslys_{2},
BHAlysly_{2}lys_{4} y BHAlysly_{2}lys_{4}lys_{8} terminado
con grupos sodio N-(2-sulfoetil) succinamida fue
preparado de manera similar. ^{13}C rmn
BHAlysly_{2}lys_{4}lys_{8} derivado (D_{2}O): \delta 26.9,
32.3, 35.1, 35.3, 35.6, 35.7, 39.5, 43.5, 54.1, 58.5, 131.6, 131.9,
132.2, 132.3, 133.2, 133.3, 145.0, 145.2, 177.2, 177.8, 177.9,
178.0, 178.2, 178.3, 179.6, 178.7, 178.8, 178.9, 179.2, 179.3,
179.7, 179.8. ^{13}C rmn BHAlyslys_{2}lys_{4} derivado
(D_{2}O): \delta 26.9, 32.3, 35.1, 35.4, 35.7, 35.8, 39.5,
43.5, 54.1, 58.5, 61.8, 131.7, 132.0, 132.2, 132.3, 133.2, 133.3,
145.0, 145.1, 177.3, 178.0, 178.3, 178.4, 178.7, 178.9, 179.0,
179.3, 179.7, 179.8. ^{13}C rmn BHAlyslys_{2} derivado
(D_{2}O): \delta 26.9, 27.1, 32.2, 32.3, 34.7, 34.8, 35.1, 35.3,
35.6, 35.7, 39.5, 43.4, 54.1, 58.6, 61.8, 131.7, 131.9, 132.2,
132.3, 133.3, 144.9, 145.0, 177.7, 178.4, 178.8, 179.0, 179.3,
180.0.
Sodio 4-sulfofenilisotiocianato
monohidrato (500 mg; 1.96 mmol) se añadió a una solución de PAMAM
4.0 (300 mg; 0.0582 mmol) en agua (10 ml) y la solución
resultante se calentó bajo nitrógeno a 53º por dos horas y después
de enfrió. La solución fue concentrada y el residuo sólido amarillo
fue purificado por filtración por gel (Separes LH20; agua). Las
fracciones puras fueron combinadas y liofilizadas para dar el
dendrímero PAMAM 4.0 terminado en sodio
4-sulfofeniltiourea en forma de un sólido blanco
esponjoso (370 mg). 1H rmn (D_{2}O) : \delta 2.28; 2.52; 2.69;
3.15; 3.27; 3.60; 7.32 (d, J=9 Hz); 7.72 (d, J=9 Hz). 13C rmn
(D_{2}O) : \delta 36.9; 41.1; 43.1; 48.3; 53.6; 55.8; 129.0;
131.1; 144.4; 178.5; 179.1; 184.4.
Los correspondientes dendrímeros PAMAM 1.0 y
PAMAM 2.0, PAMAM 3.0 y PAMAM 5.0 (Compuesto No. 2) terminados en
grupos 3, 6, 12 y 48 sodio 4-sulfofeniltiourea
respectivamente fueron preparados de manera similar.
Sodio 4-sulfofenilisotiocianato
monohidrato (130 mg; 0.5 mmol) se añadió a una solución de PAMAM
4.0 (EDA) (69 mg; 0.01 mmol) en agua (4 ml) y la solución
resultante se calentó bajo nitrógeno a 53º por dos horas y luego se
enfrió. La solución fue concentrada y el residuo sólido fue
purificado por filtración por gel (Separes LH20; agua). Las
fracciones puras fueron combinadas y liofilizadas para dar el PAMAM
4.0 terminado con 32 grupos sodio
4-sulfofeniltiourea en forma de un sólido esponjoso
blanco (136 mg). 1Hrmn (D_{2}O) : \delta 2.30; 2.50; 2.70;
3.18; 3.62; 7.35 (d, J=9 Hz); 7.72 (d, J=9 Hz). 13C rmn (D_{2}O):
\delta 36.8; 41.0; 43.1; 48.4; 53.6; 55.7; 128.9; 131.0; 144.3;
178.5; 179.0; 184.5.
Ácido trifluoroacético (4 ml) se añadió a una
suspensión de BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}DBL_{16} (0.73 g;
0.1 mmol) en diclorometano seco (4 ml) bajo nitrógeno. Se observó
una vigorosa evolución de gas durante un corto tiempo y la solución
resultante fue agitada a temperatura ambiente por dos horas y luego
fue concentrada. El jarabe residual fue disuelto en agua (5 ml),
la solución se pasó a través de una columna de Amberlite
IRA-401(OH) y el filtrado fue concentrado
para dar el BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16} en forma de
un aceite viscoso (0.49 g). El aceite fue redisuelto en agua (5 ml)
y se añadió regulador de
N,N-dimetil-N-allilamina
(pH 9.5; 3 ml). Se añadió entonces sodio
4-sulfofenilisotiocianato monohidrato (1.30 g; 5.1
mmol) sólido y la solución resultante se calentó bajo nitrógeno a
53º por dos horas y luego se enfrió. La solución fue concentrada y
el residuo sólido parduzco fue purificado por filtración por gel
(Separes LH20; agua). Las fracciones puras fueron combinadas,
pasadas a través de una columna de Amberlite IR 120(Na) y
liofilizadas para dar el dendrímero
BHAlysly_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16} terminado en sodio
4-sulfofeniltiourea en forma de un sólido blanco
esponjoso (374 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O) : \delta 1.40; 1.72;
3.08; 3.42; 4.24; 4.60; 7.30; 7.40 (d, J=9 Hz); 7.78 (d, J=9 Hz).
13C rmn (D_{2}O) : \delta 27.3; 32.5; 35.9; 43.7; 48.9; 58.6;
63.3; 128.8; 131.0; 143.7; 144.7; 145.1; 177.7; 178.1; 183.8;
185.2.
Los correspondientes dendrímeros
BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8},
BHAlysly_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}lys_{32} (Compuesto No.
5), y BHA
lyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}lys_{32}lys_{64} (Compuesto No. 6) terminados con 16, 64, y 128 grupos sodio 4-sulfofeniltiourea respectivamente fueron preparados de manera similar.
lyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}lys_{32}lys_{64} (Compuesto No. 6) terminados con 16, 64, y 128 grupos sodio 4-sulfofeniltiourea respectivamente fueron preparados de manera similar.
Sodio
3,6-disulfonaftilisotiocianato (160 mg; 0.41 mmol)
sólido se añadió a una solución de PAMAM 4.0 (51 mg; 0.01 mmol) en
agua (3 ml) y la solución resultante se calentó bajo nitrógeno a 53º
por dos horas y luego se enfrió. La solución fue concentrada y el
residuo sólido pardo fue purificado por filtración por gel (Separes
LH20; agua). Las fracciones puras fueron combinadas y concentradas
para dar el dendrímero PAMAM 4.0 terminado en sodio
3,6-disulfonaftiltiourea en forma de un sólido
parduzco (73 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O): \delta 2.30; 2.60;
2.74; 3.20; 3.57; 7.75; 7.86; 8.28. 13C rmn (D_{2}O): \delta
35.0; 39.9; 43.1; 48.1; 53.8; 56.1; 128.4; 128.6; 129.3; 131.0;
131.3; 136.0; 136.8; 138.2; 145.5; 146.0; 177.2; 177.8; 185.5.
Los correspondientes dendrímeros PAMAM 2.0
terminados con grupos sodio 3,6-disulfonaftiltiourea
fueron preparados de manera similar.
Sodio
3,6-disulfonaftilisotiocianato (220 mg; 0.57 mmol)
sólido se añadió a una solución de PAMAM 4.0 (EDA) (74 mg; 0.01
mmol) en agua (4 ml) y la solución resultante se calentó bajo
nitrógeno a 53º por dos horas y luego se enfrió. La solución fue
concentrada y el residuo sólido parduzco por purificado por
filtración por gel (Separes LH20; agua). Las fracciones puras
fueron combinadas y concentradas para dar PAMAM 4.0 terminado con
32 grupos sodio 3,6-disulfonaftiltiourea en forma de
un sólido dorado (148 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O) : \delta 2:30;
2.80; 3.20; 3.54; 7.74; 7.85; 8.25. ^{13}C rmn (D_{2}O) :
\delta 36.0; 40.8; 43.1; 48.3; 53.6; 55.9; 128.5; 129.4; 131.0;
131.3; 136.0; 136.8; 138.3; 145.5; 146.0; 178.2; 185.6.
Se añadió ácido trifluoroacético (2 ml) a una
suspensión de BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}DBL_{16} (73 mg;
0.01 mmol) en diclorometano seco (2 ml) bajo nitrógeno. Se observó
una vigorosa evolución de gas durante un corto tiempo y la solución
resultante fue agitada a temperatura ambiente por dos horas y luego
concentrada, El jarabe residual fue disuelto en agua (5 ml), la
solución se pasó a través de una columna de Amberlite
IRA-401(OH) y el concentrado se filtró para
dar el BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16} en forma de un
aceite viscoso. El aceite fue redisuelto en agua (5 ml) y se
añadió regulador de
N,N-dimetil-N-allilamina(pH
9.5; 3 ml) se añadió sodio
3,6-disulfonaftilisotiocianato (234 mg; 0.60 mmol)
sólido y la solución resultante fue calentada bajo nitrógeno a 53º
por dos horas y luego fue enfriada. LA solución fue concentrada y el
residuo sólido parduzco fue purificado por filtración por gel
(Separes LH20; agua). Las fracciones puras fueron combinadas, se
pasaron a través de una columna de Amberlite IR 120(Na) y se
liofilizaron para dar BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16}
terminado con 32 grupos sodio
3,6-disulfonaftiltiourea en forma de un sólido
esponjoso blancuzco (119 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O) : \delta
1.0-2.0; 3.18; 3.43; 4.31; 7.22; 7.80; 7.89; 8.25.
^{13}C rmn (D_{2}O) : \delta 27.2; 32.4; 35.3; 43.7; 49.0;
58.5; 63.6; 128.4; 129.1; 131.4; 136.1; 136.6; 138.6; 139.0; 145.1;
145.6; 178.4; 184.8;
186.7.
186.7.
Se añadió sodio
4-sulfonaftilisotiocianato (180 mg; 0.5 mmol) a una
solución de PAMAM 4.0 (51 mg; 0.01 mmol) en agua (5 ml) y la
mezcla se calentó bajo nitrógeno a 53º por dos horas y luego se
enfrió. El agua fue destilada bajo presión reducida desde la
suspensión resultante y el residuo sólido blancuzco fue purificado
por filtración por gel (Separes LH20; agua). Las fracciones puras
fueron combinadas y liofilizadas para dar el dendrímero PAMAM 4.0
terminado con sodio 4-sulfonaftiltiourea en forma de
un sólido blanco esponjoso (60 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O) :
\delta 2.20; 2.60; 3.14; 3.48; 7.23; 7.47; 7.56; 7.77; 7.93 (d,
J=6 Hz); 8.56 (d, J=6 Hz). ^{13}C rmn (D_{2}O) : \delta 35.8;
40.5; 43.1; 48.4; 53.6; 55.9; 127.6; 128.6; 130.3; 131.9; 132.5;
133.5; 134.7; 140.5; 142.7; 177.8; 178.0; 185.4.
El sodio
3,5-disulfofenilisotiocianato (110 mg; 0.32 mmol)
se añadió a una solución de PAMAM 4.0 (63 mg; 0.012 mmol) en agua
(3 ml) y la solución resultante se calentó bajo nitrógeno a 53º por
dos horas y luego se enfrió. La solución fue concentrada y el
residuo sólido parduzco fu purificado por filtración por gel
(Separes G25; agua). Las fracciones puras fueron combinadas para
dar el PAMAM 4.0 terminado con 24 grupos de sodio
3,5-disulfofeniltiourea en forma de un sólido
blancuzco (110 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O) : \delta 2.53; 3.08;
3.36; 3.66; 7.90; 7.95. ^{13}C rmn (D_{2}O) : \delta 34.8;
41.0; 43.1; 48.0; 53.7; 56.2; 124.1; 128.6; 143.5; 148.8; 177.6;
185.0.
El sodio 3, 6,
8-trisulfonaftilisotiocianato (250 mg; 0.5 mmol) se
añadió a una solución de PAMAM 4.0 (51 mg; 0.01 mmol) y regulador
N,N-dimetil-N-allilamina
(pH 9.5; 1 ml) en agua (2 ml) y la mezcla se calentó bajo nitrógeno
a 53º por dos horas y se enfrió. La mezcla fue concentrada bajo
presión reducida para dar un sólido naranja. El sólido residual fue
disuelto en agua (2 ml) y se pasó a través de una columna corta de
Amberlite IR-120(Na). El filtrado fue
entonces concentrado y el residuo fue purificado por filtración por
gel (Separes LH20; agua). Las fracciones puras fueron combinadas y
liofilizadas para dar el dendrímero PAMAM 4.0 terminado con sodio
3, 6, 8-trisulfonaftiltiourea en forma de un sólido
blancuzco (102 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O): \delta 2.65; 3.02;
3.30; 3.66; 8.05; 8.42; 8.59; 8.67. ^{13}C rmn (D_{2}O):
\delta 33.2; 38.7; 43.2; 43.7; 47.8; 54.0; 54.3; 56.7; 131.0;
131.3; 131.9; 135.9; 138.0; 139.6; 143.8; 144.1; 145.6; 176.2;
176.5; 186.0.
El 4-nitrofenil
4-(clorometil)benzoato (200 mg; 0.68 mmol) sólido se añadió
a una solución agitada de PAMAM 4.0 (70 mg; 0.014 mmol) en DMSO
seco (4 ml) ay la solución amarilla resultante se agitó a
temperatura ambiente por dos horas. La solución fue entonces
concentrada (10-4 mmHg; 40º) y el residuo fue
extraído con una mezcla de agua y diclorometano (1:1). El material
sólido remanente fue disuelto en DMSO (5 ml) y se añadió una
solución de sulfito de sodio (130 mg; 1 mmol) en agua (3 ml). La
mezcla ligeramente turbia que resultó fue dejada en reposo por
cuatro días, tiempo después del cual la adición de más agua (2 ml)
resultó en la formación de una solución clara amarilla homogénea.
La solución fue entonces concentrada, primero a 25 mm de Hg y 40º y
a 50º para dar el producto crudo. El producto crudo fue purificado
por filtración por gel (Separes G25; agua) para dar el PAMAM 4.0
terminado con 24 grupos de sodio 4-(sulfometil)benzamida (24
mg). ^{1}H rmn (D_{2}O) : \delta 2.25; 2.66; 3.08; 3.20;
3.33; 3.38; 4.01; 7.40 (br d); 7.62 (br d). ^{13}C rmn (D_{2}O):
\delta 36.7; 40.9; 43.0; 43.6; 53.5; 55.5; 61.0; 131.6; 135.0;
137.2; 140.4; 174.5; 178.6; 179.2.
El potasio N-hidroxisuccinimidil
4-sulfobenzoato (100 mg; 0.3 mmol) se añadió a una
solución de PAMAM 4.0 (EDA) (35 mg; 0.005 mmol) en regulador 0.1M
pH 8.5 de borato (5 ml) y la solución se agitó a temperatura
ambiente por dos horas. La solución lechosa resultante en esta etapa
tenía un pH de 4.5. Se añadió entonces solución de carbonato de
sodio 1 M (1 ml) para dar una solución clara que fue concentrada
para dar el producto crudo como un sólido blanco. EL producto crudo
fue purificado por filtración por gel (Separes G25; agua) para dar
PAMAM 4.0 (EDA) terminado con 32 grupos de 32 sodio
4-sulfobenzamida (47 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O):
\delta 2.25; 2.42; 2.63; 3.05; 3.18; 3.31; 3.38; 7.72 (d, J=8 Hz);
7.78 (d, J=8 Hz). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 36.0; 40.4;
43.0; 43.7; 53.7; 55.8; 130.2; 132.2; 140.4; 150.1; 173.6; 178.0;
178.5.
El sodio
N-(4-sulfofenil)acrilamida (250 mg; 1 mmol)
sólido y carbonato de sodio sólido (106 mg; 1 mmol) fueron
añadidos sucesivamente a una solución en agitacion de PAMAM 4.0
(EDA) (78 mg; 0.011 mmol) en agua (4 ml). La solución resultante
fue agitada bajo nitrógeno durante cuatro días y luego liofilizada
para dar un sólido esponjoso blanco. El producto crudo fue
purificado por filtración por gel (Separes LH20; agua) para dar
PAMAM 4.0 (EDA) terminado con 64 grupos sodio
N-(4-sulfofenil)propanamida (206 mg).
^{13}C rmn mostró una tenue traza de lo que fue tomado como
grupos amino terminales monoalquilados. ^{1}H rmn (D_{2}O):
\delta 2.10; 2.48; 2.58; 2.79; 3.20; 7.42 (d, J=7 Hz); 7.65 (d,
J=7 Hz). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 36.5; 37.9; 41.1; 53.4;
55.6; 124.8; 130.9; 143.0; 144.2; 177.4; 178.5.
Una solución de ácido sodio sulfanílico (195 mg;
1 mmol) en DMSO seco (3 ml) fue añadida gota a gota a una solución
de N,N'- disuccinimidil carbonato (530 mg; 2 mmol) en DMSO seco (4
ml) y la solución pardusca resultante fue agitada a temperatura
ambiente durante 20 horas. Una solución de PAMAM 4.0 (EDA) (75 mg;
0.011 mmol) en DMSO seco (1 ml) fue añadidas y la solución se
agitó por 18 horas más. La solución fue concentrada entonces bajo
alto vacío (10-5 mmHg; 35º) para dar un
semi-sólido amarillento. El producto crudo fue
disuelto en DMSO (4 ml) y la solución fue añadida a 200 ml de
acetato de etilo con buena agitación. El sólido blanco precipitado
fue recogido por filtración y lavado con acetato de etilo (2X) y
éter (2X), y luego fue secado para dar un polvo blanco (275 mg). El
material fue purificado adicionalmente por filtración por gel
(Separes LH20; agua) para dar PAMAM 4.0 (EDA) terminado con 32
grupos de sodio 4-sulfofenilurea (106 mg). ^{1}H
rmn (D_{2}O): \delta 2.31; 2.55; 2.75; 3.19; 7.32 (d, J=9 Hz);
7.63 (d, J=9 Hz). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 36.3; 40.7;
43.3; 43.8; 53.7; 55.7; 123.3; 130.9; 140.9;146.0; 161.4; 178.2;
178.6.
Se añadió ácido trifluoroacético (4 ml) a una
suspensión de BHAlyslys_{2}lys_{4}DBL_{8}DBL_{16} (220 mg;
30 \mumol) en diclorometano seco (2 ml) y la solución resultante
se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno por dos horas y
luego se concentró. El residuo fue disuelto en DMSO seco (5 ml) y el
pH se ajustó a 8.5 con trietilamina. Se añadió entonces cloruro de
4-nitrofenil N,N,N-trimetilglicinato
sólido (0.50 g; 1.8 mmol) y la mezcla se agitó durante la noche a
temperatura ambiente. La solución turbia fue entonces concentrada
(50º/10^{-5} mmHg) y el residuo fue sometido a partición entre
agua y diclorometano. La capa acuosa fue separada, lavada con
diclorometano (3X) y acetato de etilo y luego concentrada para dar
un aceite (1.128 g). El producto crudo fue purificado por
filtración por gel (Separes LH20; agua) para dar el dendrímero
BHAlyslys_{2}lys_{4}lys_{8}lys_{16} terminado con
N,N,N-trimetilglicinamida (116 mg). ^{13}C rmn
(D_{2}O): \delta 25.5, 30.5, 30.8, 33.4, 42.1, 56.5, 57.1,
67.5, 68.1, 166.7, 167.0, 167.1, 176.0, 176.2.
1,1'-Carbonildiimidazol (85 mg;
0.52 mmol) se añadió a una solución de yoduro de ácido
4-trimetilamoniobenzoico (154 mg; 0.5 mmol) en DMF
seco (4 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente bajo argón
durante dos horas. Durante este tiempo un sólido blanco se separó
de la solución. Se añadió entonces una solución de PAMAM 4.0 (58
mg; 0.011 mmol) en DMF seco (2 ml) y la mezcla se agitó durante la
noche a temperatura ambiente. Después de este tiempo la mayor parte
del precipitado se había disuelto y la prueba de ninhidrina en la
solución fue negativa. La mezcla fue concentrada
(10-4 mmHg; 30º) para dar un residuo sólido blanco.
El producto crudo fue purificado por filtración por gel (Separes
LH20; 10% AcOH) para dar PAMAM 4.0 terminado con 24 grupos
4-trimetilamoniobenTamida en forma de la sal del
ácido acético (89 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O) : \delta 1.96;
2.65-2.85; 3.25-3.55; 3.64; 7.92.
^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 25.8; 33.1; 33.5; 38.7; 43.1;
43.5; 53.5; 54.1; 56.4; 61.2; 124.8; 133.6; 139.9; 153.2; 173.2;
176.3; 176.8; 182.6.
El correspondiente dendrímero PAMAM 2.0 terminado
con grupos 6 4-trimetilamonio benzamida fue
preparado de manera similar.
El 4-nitrofenil
4-(clorometil)benzoato sólido (150 mg; 0.5 mmol) se añadió a
una solución en agitación de PAMAM 4.0 (52 mg; 0.01 mmol) en DMSO
seco (3 ml). LA solución amarilla resultante fue agitada a
temperatura ambiente por 20 horas, cuando la prueba de ninhidrina
dio negativa (pH ca.8.5). La solución fue entonces concentrada
(10-5 mmHg; 40º) y el residuo agitado con una mezcla
de agua y diclorometano (1:1). El material insoluble con aspecto de
gel fue recogido por filtración, lavado con agua (2X) y
diclorometano (2X), y luego secado al aire. El dendrímero crudo
terminado con 4-(clorometil)benzamida fue disuelto en 25% aq.
trimetilamina (20 ml) y la solución amarilla se dejó en reposo
durante la noche. La solución fue entonces concentrada, el residuo
fue disuelto en agua (5 ml) y la solución se pasó a través de una
columna de Amberlite IRA-401 (OH). El filtrado
incoloro fue concentrado para dar un aceite viscoso que fue
purificado por filtración por gel (Separes G10; 10% AcOH) para dar
PAMAM 4.0 terminado con 24 grupos
4-(trimetilamoniometil)benzamida (90 mg). ^{1}H rmn
(D_{2}O): \delta 1.88; 2.65-2.80; 2.98;
3.10-3.60; 7.52 (br d, J=9 Hz); 7.72 (br d, J=9 Hz).
^{13}C rmn (D_{2}O): \delta 26.6; 33.4; 38.8; 43.2; 43.5;
53.6; 53.6; 54.1; 56.8; 62.8; 73.0; 132.1; 135.3; 137.5; 140.0;
176.4; 176.9; 183.6.
Se añadió1,1'-carbonildiimidazol
(85 mg; 0.52 mmol) sólido a una solución de bromuro de
N-(2-acetoxietil)-N-(carboximetil)-N,N-dimetilamonio
(135 mg; 0.5 mmol) en DMF seco (3 ml) y la solución resultante se
agitó bajo nitrógeno por dos horas. Se añadió entonces una solución
de PAMAM 4.0 (60 mg; 0.012 mmol) en DMF (2 ml) lo que causó la
formación inmediata de un precipitado floculante que se redisolvió
lentamente. La mezcla fue agitada por dos días y luego concentrada
(10-4 mmHg; 40º) para dar un aceite viscoso. El
producto crudo fue purificado por filtración por gel (Separes G10;
10% AcOH) para dar PAMAM 4.0 terminado con 24 grupos
N-(2-Acetoxietil)-N,N-(dimetilamonio)metilcarboxamida
(64 mg). ^{1}H rmn (D_{2}O): \delta 1.93; 2.05; 2.70;
3.10-3.60; 3.28; 3.93 (m); 4.14; 4.48 (m). ^{13}C
rmn (D_{2}O) : \delta 24.6; 26.2; 33.2; 38.7; 42.8; 42.9; 53.9;
57.4; 62.6; 67.3; 67.5; 168.9; 176.4; 176.8; 177.3; 183.2.
Una solución de PAMAM 4.0 (63 mg; 0.012 mmol) y
sulfato de metiltiopseudourea (170 mg; 0.61 mmol) en agua (5 ml)
(pH 10.5) fue calentada bajo nitrógeno a 80º por dos horas. La
solución fue entonces concentrada y el residuo se purifico por
filtración por gel (Separes G10; 10% AcOH) para dar PAMAM 4.0
terminado con 24 grupos guanidino como sal de acetato (107 mg).
^{1}H rmn (D_{2}O): \delta 2.00; 2.80 (br t); 3.09 (br t);
3.32; 3.45 (br t); 3.60 (br t). ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta
25.2; 33.2; 33.4; 38.7; 41.2; 42.6; 43.4; 44.7; 53.5; 54.0; 56.3;
176.5; 176.7; 176.9; 181.6.
El correspondiente dendrímero PAMAM 2.0
determinado con 6 grupos guanidina fue preparado de manera
similar.
Una solución de
1-(4-carboxifenil)metil-1,4,8,1]-tetraazaciclotetradecano
tetra clorhidrato (120 mg; 0.25 mmol),
N-hidroxisuccinimida (60 mg; 0.52 mmol) y
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
clorhidrato (250 mg; 1.3 mmol) en regulador de pH 7 (10 ml) fue
dejada en reposo a temperatura ambiente por una hora y luego se
añadió una solución de PAMAM 4.0 (32 mg; 0.006 mmol) en regulador
de fosfato pH 7 (10 ml). La mezcla se dejó en reposo por dos días y
luego concentrada,. El residuo fue purificado por filtración por gel
(Separes LH20; 10% AcOH) para dar PAMAM 4.0 terminado con ca. 12
grupos
4-([1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano)metil)
benzamida según se determinó por ^{1}H y ^{13}C rmn (80 mg).
Entonces el producto fue disuelto en agua (1 ml), se añadió HCl
concentrado (1 ml) y se pasó a través de una columna de Amberlite
con resina IRA-401 (Cl) y luego se concentró. El
residuo fue disuelto en agua (1 ml), se añadió HCl concentrado (1
ml) y la solución se diluyó con etanol (30 ml) para precipitar un
sólido blanco. El sólido fue recogido por filtración (68 mg). Una
vez más ^{1}H y ^{13}C rmn mostraron cerca del 50% de
funcionalización de los grupos amino terminales. ^{1}H rmn
(D_{2}O): \delta 2.17; 2.36; 2.50; 2.78; 2.85; 3.25; 3.40;
3.50; 3.60; 3.62; 4.49; 7.63 (br d); 7.78 (br d). ^{13}C rmn
(D_{2}O): \delta; 22.7; 23.1; 33.2; 38.8; 39.9; 40.2; 40.3;
41.0; 41.2; 42.0; 42.9; 43.2; 43.6; 45.5; 4b.1; 49.1; 52.2; 53.9;
54.3; 56.6; 62.7; 132.5; 135.7; 137.1; 139.7; 174.3; 176.2; 176.3;
176.7; 177.0; 178.2; 178.5.
Se añadió cianoborohidruro de sodio (32 mg; 0.5
mmol) a una mezcla de PAMAM 4.0 (EDA) (69 mg; 0.01 mmol), Ácido
4-formil-2-hidroxibenzoico
(83 mg; 0.5 mmol), e hidrógeno carbonato de sodio (42 mg; 0.5 mmol)
en agua (4 ml). La mezcla naranja no homogénea fue agitada durante
cuatro horas a temperatura ambiente, tiempo durante el cual se hizo
homogénea. La solución naranja fue entonces concentrada y el residuo
fue purificado por filtración por gel (Separes LH20; agua) para dar
PAMAM 4.0 (EDA) terminado con cerca de 32 grupos
4-carboxi-3-hidroxibencilamina
(91 mg). ^{1}H y ^{13}C rmn (D_{2}O) muestra principalmente
monoalquilación de los grupos amino terminales, mostrando ambos
espectros picos anchos. ^{13}C rmn (D_{2}O): \delta& 37.0;
41.1; 50.9; 53.4; 55.5; 55.8; 61.5; 120.9; 122.2; 122.4; 132.3;
132.7; 135.0; 135.8; 163.5; 163.7; 169.0; 178.6; 179.3. ^{1}H rmn
(D_{2}O): \delta 2.20; 2.35; 2.60; 3.15; 3.30; 3.55; 4.25; 6.68;
7.12; 7.55.
Se recolectó sangre de bovino en el matadero,
donde un animal fue sangrado en un cubo que contenía citrato de
sodio a una concentración de 3.5 g por litro de sangre fresca. Esta
sangre fue enviada al laboratorio donde fue mantenida a 37ºC en un
baño de agua.
Se centrifugaron entonces alícuotas de la sangre
entera a 3000 rpm durante 5 minutos para separar el plasma. Éste
fue recolectado y regrsado al baño de agua. También se prepare
plasma extra y se almacenó en nitrógeno líquido para pruebas
posteriores.
El procedimiento prueba realmente el tiempo de
recalcificación de la sangra citrada a 37ºC. Toda la vidriería fue
lavada, secada y silada con "Coatasil" antes de relavar y
secar. Cada tubo de cultivo de 12 x 75 mm contenía 0.1 ml de
plasma, 0.1 ml de solución salina (0.9% NaCl) seguida por 0.1 ml
de CaCl2 0.025 M momento en el cual se arrancó el reloj. Cada 15
segundos el tubo fue inclinado hacia un lado y se estableció la
coagulación. Cuando se había formado un coágulo firme, se detuvo el
reloj y se registran el tiempo. En el caso de la prueba de
anticoagulantes, 0.1 ml de la sustancia de prueba reemplazaron a la
solución salina. Los tiempos para un rango de concentraciones para
los compuestos de prueba están registrados en la Tabla 1. La
heparina, el citrato de sodio y los cms de prueba fueron preparados
en agua como soluciones de 10 mg/ml. Estas soluciones fueron
diluidas para dar un rango de concentraciones. Las concentraciones
finales en los tubos de ensayo se dan en la tabla. Las cifras en la
Tabla representan los tiempos promedio para hasta 10
replicaciones.
| Tiempo para la coagulación del plasma a 37ºC para las siguientes concentraciones | ||||||
| de anticoagulante | ||||||
| Compuesto | Control s | 0.0003 mg/ml | 0.003 mg/ml | 0.03 mg/ml | 0.33 mg/ml | 3.33 mg/ml |
| Heparina | 2.29 min - | 2.30 min | >30 min | >30 min | >30 min | - |
| Citrato de sodio | 2.29 min | - | - | 2.30 min | 2.30 min | >30 min |
| Compuesto No.1 | 2.11 min | - | - | 2.29 min | 4.00 min | >30 min |
| Compuesto No.4 | 2.08 min | - | - | 1.72 min | 10.00 min* | >30 min |
| Compuesto No. 15 | 2.20 min | - | 2.34 mn | 7 min* | 8 min* | - |
| Compuesto No.9 | 2.27 min | - | 2.19 min | 4 min | 5.40 min* | - |
Los resultados de las pruebas de actividad contra
VIH1, VIH2, CMV y diversos virus simplex de herpes (HSV) se
registran en las Tablas 2 a 5, respectivamente.
| Actividad contra cultivos celulares de Citomegalovirus Humano(cepa de Davis) | ||
| Compuesto | EC50 (\mug/ml) | CC50 (\mug /ml) |
| Compuesto No. 15 | 1.0 | >250 |
| Compuesto No. 9 | 0.2-<0.4 | >250 |
| Pruebas en células pulmonares embrionarias humanas (HEL). | ||
| IC50= Concentración inhibidora para reducir la placa de virus en 50% | ||
| CC50=Concentración citotóxica requerida para reducir el crecimiento de células HEL en 50% |
| Actividad de compuestos BRI contra virus misceláneos | |||||
| Concentración inhibidora mínima (\mug/ml) | |||||
| Compuesto | Concentración | virus Herpes | virus Herpes | virus Herpes | virus Herpes |
| citotóxica mínima | simples | simplex | simplex-1 | Simplex-1 | |
| (\mug /ml) | -1 (KOS) | -2 (G | TK-B2006 | TK-VMW1837 | |
| Compuesto | >400 | 70 | 7 | 150 | 70 |
| No.4 | |||||
| Compuesto | >400 | 7 | 20 | 20 | 20 |
| No. 20 | |||||
| a Requerido para causar una alteración detectable microscópicamente en la morfología normal. | |||||
| b Requerido para reducir la citopatogenicidad inducida por el virus en 50%. |
Claims (39)
1. Un compuesto que siendo un dendrímero tiene
una pluralidad de grupos terminales, caracterizado porque
- (i)
- dicho compuesto tiene actividad inhibidora in vitro contra un virus seleccionado del grupo consistente de VIH1 o VIH2, hepatitis B o C, virus de diarrea viral bovina, rinovirus, Virus de Parainfluenza Humana, Virus Sicticial Respiratorio (RSV), Virus de Varicela Zoster (VZV), Citomegalovirus Humano (CMV), Virus de Epstein BArr (EBV), Virus de Papiloma Humano (HPV), Adenovirus-8, Virus de Herpes Simplex (HSV) tipo 1 y 2, Virus Measles, y Virus de Estomatitis Vesicular (VSV), y
- (ii)
- al menos uno de dichos grupos terminales tiene una unidad estructural que contiene aniones o cationes enlazada al mismo.
2. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1, comprende un núcleo polivalente covalentemente enlazado a al
menos dos ramas dendríticas, y se extiende a través de al menos dos
generaciones.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 o reivindicación 2, donde dicho dendrímero es una poliamidoamina
basado en un núcleo de amoníaco.
4. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 o reivindicación 2, donde dicho dendrímero es un dendrímero de
poliamidoamina basado en un núcleo etilendiamina.
5. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
1 o reivindicación 2, donde dicho dendrímero es un dendrímero
polilisina basado en una benzhidrilamina.
6. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, donde dicha unidad estructural o unidades
estructurales están enlazadas a amina, sulfhidrilo, hidroxi u otro
grupo terminal funcional reactivo de dicho dendrímero mediante
enlaces amida o tiourea.
7. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde dicha unidad estructural o unidades
estructurales de contenido aniónico o catiónico son unidades
estructurales de ácido sulfónico que contienen unidades
estructurales diferentes a ácido 2-tiosálico.
8. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde dicha unidad estructural o unidades
estructurales con contenido aniónico o catiónico son unidades
estructurales que contienen trimetilamonio o poliamino
macrocíclicos.
9. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, donde la unidad estructural o unidades
estructurales que están enlazadas al amino de otros grupos
terminales funcionales del dendrímero son seleccionadas de los
siguientes grupos:
-NH(CH_{2})_{n}SO_{3}^{-}
-(CH_{2})_{n}SO_{3}^{-}
-Ar(SO_{3})_{n}
-CH_{2}CH(SO_{3}^{-})COOH
-CH(SO_{3}^{-})CH_{2}COOH
-ArX(CH_{2})_{n}SO_{3}^{-} (X=O,S,NH)
-(CH_{2})_{n}N ^{+}Me_{3}
-Ar(N^{+}Me_{3})_{n}
-Ar(CH_{2}N
^{+}Me_{3})_{n}
En los cuales n es cero o un entero positive.
10. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que es un dendrímero terminado en ácido
alquilsulfónico.
11. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que es un dendrímero terminado en
sulfoacetamida.
12. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que es un dendrímero terminado en ácido
sulfosuccinámico.
13. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que es un dendrímero terminado en
N-(2-sulfoetil) succinamida.
14. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde la unidad estructural enlazada a los
grupos terminales del dendrímero es una aril o heteroarilurea
sustituida con uno o más grupos de ácido sulfónico.
15. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
14 que es un dendrímero terminado en
4-sulfofeniltiourea.
16. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
14 que es un dendrímero terminado en
3,6-di-sulfonaftiltiourea.
17. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
14 que es un dendrímero terminado en
4-sulfonaftiltiourea.
18. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
14 que es un dendrímero terminado en
3,5-di-sulfofeniltiourea.
19. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
14 que es un dendrímero terminado en
3,6,8-tri-sulfonaftiltiourea.
20. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde la unidad estructural enlazada a los
grupos terminales del dendrímero es una aril o heteroarilurea
sustituida con uno o más grupos de ácido sulfónico, sulfoalquil,
sulfoalcoxi, sulfoalquilamino O sulfoalquiltio.
21. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
20 que es un dendrímero terminado en 4-(sulfometil) benzamida.
22. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
20 que es un dendrímero terminado en
4-sulfobenzannida.
23. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde la unidad estructural enlazada a los
grupos terminales del dendrímero es una aril o hetero alcanamida
sustituida con uno o más grupos de ácido sulfónico.
\newpage
24. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
23 que es un dendrímero terminado en
N-(4-sulfofenil) propanamida.
25. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en donde la unidad estructural enlazada a
los grupos terminales del dendrímero es una aril o heteroaril urea
sustituida con uno o más grupos de ácido sulfónico.
26. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
25 que es un dendrímero terminado en
4-sulfofenilurea.
27. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en donde la unidad estructural enlazada a
los grupos terminales del dendrímero es un
N,N,N-trimetil derivado de un aminoácido.
28. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
27 que es un dendrímero terminado en
N,N,N-tri-metilglicinamida.
29. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 en donde la unidad estructural enlazada a
los grupos terminales del dendrímero es una aril o heteroaril amida
sustituida con uno o más grupos trialquilamino,
trialquilaminoalquil, trialquilaminoalquiloxi,
trialquilaminoalquilamino o trialquilaminoalquiltio.
30. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
29 que es un dendrímero terminado en
4-trimetilamonio benzamida.
31. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
29 que es un dendrímero terminado en 4-(trimetilamonio
metil)benzamida.
32. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que es un dendrímero terminado
N-(2-acetoxietil)-N,N-(dimetilamonio)metil
carboxamida.
33. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que es un dendrímero terminado en
guanidino.
34. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 donde el dendrímero es u grupo poliamino
macricíclico que contiene uno o más anillos macrocíclicos conectados
a través de una unidad estructural arilo o alquilo espaciadora al
grupo terminal del dendrímero.
35. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación
34 que es un dendrímero terminado en
4-([1,4,8,11-tetraazaciclotetradecane]metil)benzamida.
36. Un compuesto de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 que es un dendrímero terminado en
4-carboxi-3-hidroxibencilamina.
37. Una composición farmacéutica o veterinaria
para tratamiento profiláctico o terapéutica antiviral de una animal
humano o no humano, que comprende un compuesto de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 36, en asociación con al menos un
transportador o diluyente farmacéutica o veterinariamente
aceptable.
38. Uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 36 para la manufactura de un
medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico antiviral
de un animal humano o no humano, donde el médicamente ha de
administrarse en una cantidad profiláctica o terapéutica antiviral
efectiva.
39. Uso de acuerdo con la reivindicación 38,
donde dicho tratamiento antiviral es el tratamiento de infección
por VIH1 o VIH2, hepatitis B o C, virus de diarrea viral bovina,
rinovirus, Virus de Parainfluenza Humana, Virus Sicticial
Respiratorio (RSV), Virus de Varicela Zoster (VZV), Citomegalovirus
Humano (CMV), Virus de Epstein BArr (EBV), Virus de Papiloma Humano
(HPV), Adenovirus-8, Virus de Herpes Simplex (HSV)
tipo 1 y 2, Virus Measles, y Virus de Estomatitis Vesicular
(VSV).
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