CN101003607B - 封闭树状大分子的方法、经封闭的树状大分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
公开了一种封闭树状大分子上非特异性位点的方法，它包括使具有封闭效量的分子量为3,000至5,000,000(效果较好的是：肝素、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素分子量为8,000至100,000，聚丙烯酸为100,000至300,000)的带负电荷的封闭试剂，与带有正电荷的树状大分子进行反应的步骤。还公开了通过此反应步骤而形成的树状大分子。本发明方法简单实用，快速有效，可应用于生物、医药等领域。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域中对树状大分子(dendrimer)上非特异性位点进行封闭的方法，还涉及用所述方法封闭的树状大分子及其在生物医药领域中的用途。
背景技术
树状大分子(Dendrimer)是上世纪八十年代由Donald A.Tomalia等人工合成的一种新型树枝状聚合物，它具有高度枝化，球形表面，单分散性及分子内部具有大量空腔等特点。可根据实际用途在合成过程中控制它的大小，形状和结构等。由于树状大分子分子的均一性、多功能表面和内部的空腔等特点，使其在诸多领域都有巨大的应用潜力。
例如，Barbara Klajnert和Maria Bryszewska在Acta Biochimica Polonica，Vol.48，No.1/2001，pp199-208中发表的题为“Dendrimers：properties andapplications”一文提到所述树状大分子可具有如下结构：
作为一类新型纳米高分子，所述树状大分子核芯和表面经过修饰可以连接抗体和基因等物质，内部空腔可以包裹药物分子，而且具有无免疫原性，高度水溶性，以及无细胞毒性等性质，在生物医药领域中有广泛的应用前景，包括作为药物载体、分离蛋白质，基因靶向治疗等。
树状大分子由于其表面独特的结构，特别是带有较高的阳性基团，因此能吸附多种蛋白质，且不改变蛋白质的性质，从而可作为新型生物载体，应用于免疫诊断或相关的研究中。
以免疫诊断为例，可在树状大分子表面的端基上包被抗原或抗体，使该包被了抗原或抗体的树状大分子与被检测物中相应的抗体或抗原结合，随后通过检测与所述树状大分子结合的抗体-抗原复合物的量来测定被测物中相应的抗体或抗原的量。
但是，这种检测方法存在如下问题：由于抗原或抗体包被时所用的浓度较低，因此吸附后所述树状大分子载体表面尚有未被抗体或抗原占据的位点(下面称为非特异性位点)，这种位点通常带有正电荷，在免疫检测过程中会与待测试样中的杂质蛋白等结合，从而影响最终测量的可靠性和灵敏度。由于树状大分子上非特异性位点较多，因此这些未被包被分子占据的非特异性位点会大大影响抗原抗体的特异性结合和实验中的可操作性。需要封闭树状大分子上非特异性位点。
通常的封闭主要针对固相材料，如聚苯乙烯、聚氯乙烯等。这些固相载体和蛋白质的结合是通过物理吸附作用实现的，即依靠固相载体表面的疏水基团和蛋白质上的疏水基团的相互作用，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量，等电点和浓度等的影响，在包被过程中，通过这种吸附，固相载体不仅与目标蛋白结合同时也与非特异性蛋白结合，从而干扰随后的实验结果，为此必须对这些非特异性结合位点进行封闭。封闭是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程，就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在其后的免疫反应步骤中干扰物质的再吸附。
与传统固相材料的结构和性质有很大差异的树状大分子，它与目标蛋白的结合是通过催化作用所形成的共价键将蛋白质牢固的固定在其表面，但树状大分子表面含有大量-NH2，形成了较多的正电荷，可与带负电荷的非特异性蛋白结合，因此，应用通常的封闭方法反而造成了更多的非特异性结合。
最常用的封闭剂是0.05％-5％的牛血清白蛋白，10％的小牛血清，1％明胶或脱脂奶粉等。常规的封闭步骤包括：将包被有抗体或抗原的固相载体与上述封闭剂相混合、在37℃孵育1-2小时。
利用常规方法封闭树状大分子的缺点在于：
1)尽管树状大分子和固相载体与非特异性蛋白质的结合都是物理吸附作用，可是原理不同，固相载体和非特异性蛋白质的结合是通过各自表面的疏水基团相互作用实现的，树状大分子和非特异性蛋白质的结合是通过正负电荷的相互吸引实现的，所以应用传统的封闭方法，即用不相关蛋白质来封闭树状大分子上的非特异性位点，不仅不能起到有效的封闭效果，反而会因为这些带负电荷的不相关蛋白与树状大分子上多余的正电荷结合，产生适得其反的结果。
2)由于需要孵育1-2小时，因此封闭所需的时间较长且需要孵育的设备。
因此，仍然需要开发封闭树状大分子上非特异性位点的方法和由该方法制得的封闭产品。
发明的内容
本发明的目的是提供一种封闭树状大分子上非特异性位点的方法。
本发明的另一个目的是提供一种用本发明封闭方法制得的封闭产品。
因此，本发明提供一种封闭树状大分子上非特异性位点的方法，它包括使用具有封闭效量的分子量为3,000至5,000,000的带负电荷的封闭试剂与带有正电荷的树状大分子进行反应的步骤。
本发明的另一方面提供一种其非特异性位点已经被封闭的树状大分子，它包括：
(1)树状大分子基体；
(2)包被在该树状大分子基体表面上的抗体或抗原；以及
(3)在该树状大分子基体表面上分子量为3,000至5,000,000的带负电荷的封闭试剂。
具体实施方式
在本发明中，术语“树状大分子”是指一种纳米级的具有如下三个明显结构特征的单分子聚合物：
(1)具有一个引发核心，这个引发核心具有Nc个反应官能团，例如，对于NH3，Nc＝3，对于季戊四醇C(CH2OH)4，Nc＝4等等；
(2)具有内层，它是由重复单元组成并且径向连接到引发核心。一般由反应试剂不断加成到所述核心上形成，这个反应试剂具有Nb(Nb＞1)个新反应基团；
(3)外表面层，它具有终端官能团并连接到最外面一层，所述外表面层裸露的官能团通常带有正电荷。
有关树状大分子的描述可例如参见白进发等的树状大分子研究在医学中的 应用展望(《化学通报》2001年第64卷)和Barbara Klajnert和Maria Bryszewska在Acta Biochimica Polonica，Vol.48，No.1/2001，pp199-208中发表的题为“Dendrimers：properties and applications”的文章。这两篇文献作为本说明书的一部分以引用的方式插入本文。
本发明用于封闭经包被的树状大分子上非特异性位点的封闭试剂无特别的限制，只要它带负电荷基团并可通过电荷相互作用与树状大分子中带正电荷的基团相互作用即可。
在本发明的一个实例中，所述封闭试剂包括分子量为3,000至5,000,000，较好为8,000-1,000,000，更好为12,000-800,000的带负电荷的分子。这种封闭试剂的非限定性例子有，例如肝素、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素，阴离子交换树脂等。还可以是接枝有阴离子基团，例如磺酸基、硫酸基和磷酸基等有机聚合物。
在本发明的一个较好实例中，所述封闭剂选自肝素、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素、接枝有羧基、磺酸基、硫酸基和磷酸基的有机聚合物，它们的酸值为20至1000g KOH/g，或它们的盐，如钾盐、钠盐、铵盐等，或者它们的混合物。
在本发明的另一个较好实例中，所述羧甲基纤维素的分子量为8,000至100,000，所述聚丙烯酸的分子量为100,000至300,000。
用于封闭经包被的树状大分子的封闭试剂的用量取决于具体的树状大分子和封闭试剂。该用量可采用常规方法确定。例如，可将封闭试剂配制成由稀至浓的一系列溶液，取相同的量各自加至同一种经包被的树状大分子的溶液中，稍许搅拌后形成经封闭的树状大分子溶液，将其加入不含目标抗体(抗原)的待测液，测量其荧光信号。如果该待测液的测试结果由阳性转为阴性，则表明此时该树状大分子已经被完全封闭，该封闭试剂相对于树状大分子的用量即为封闭有效量。
也可采用这样的方法测定封闭试剂相对于树状大分子的用量：将其加入阴阳两组已知检测液中，测荧光信号，如果阴性无荧光，阳性有强弱，则表明树状大分子已经被完全封闭。在阅读了本发明公开的内容后，本领域的普通技术人员结合其专业知识可容易地确定具体树状大分子和封闭试剂的封闭有效量。
用于溶解封闭试剂的溶剂可以是任何极性溶剂，例如水、醇、醚、酮等。其非限定性例子有去离子水、甲醇、乙醇、丙醇、乙醚、甲乙醚、丙酮等。所述溶剂可以与用于溶解树状大分子的溶剂相同或不同，但是较好是同一类溶剂，更好是相同的溶剂。
封闭试剂在所述溶剂中的浓度无特别的限制，只要它不影响最终封闭反应的结果或者封闭后的树状大分子的最终用途即可。在本发明的一个较好实例中，所述封闭试剂的浓度为0.05％-50％(V/V)，较好为0.1％-20％(V/V)，更好为1％-10％(V/V)。
本发明采用带负电荷的分子封闭树状大分子上非特异性位点的方法，操作简单，能有效封闭树状大分子上未被蛋白占据的位置；封闭剂用量少，不影响免疫反应本身；由于正负电荷的反应时间极短，可迅速这中和阳性基团上的正电荷，所以不需要常规37℃孵育，大大缩短了封闭时间，可以更快的获得检测结果；此外，这类封闭剂取材广泛，容易获得，价格便宜。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅仅用于说明本发明，而非对本发明范围进行限定。
实施例
实施例中使用的封闭剂：
1.树状大分子：Sigma Aldrich Chemical Company生产的第五代树状大分子，溶于5％的甲醇溶液中，浓度为5g/100ml。
2.肝素：自猪肠系膜或牛肺中提取的一种硫磺氨基葡聚糖，属粘多糖类，在糖链上带有COO-、SO3 -等大量负电荷，分子量为12,000，购自常州千红生化制药有限公司。根据出厂肝素的最初效价，可直接使用或将其配成适当浓度的水溶液。
3.聚丙烯酸：它是一类聚阴离子的高分子电介质，表面所带的阴性基团为COO-，分子量为250,000，购自Sigma Aldrich Chemical Company。
4.羧甲基纤维素：分子量90,000，购自Sigma Aldrich Chemical Company。
5.聚甲基丙烯酸钠：分子量15,200，购自Sigma Aldrich ChemicalCompany。
实施例1
使用肝素作为封闭剂
1.确定封闭剂的加入量
将肝素配制成浓度为1％至100％，两个浓度间间隔为10％的10个水溶液试样备用。
将二抗与树状大分子(dendrimer)结合，二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10；随后取10个等量的二抗-树状大分子结合体的水溶液，分别加入上面制得的10个肝素水溶液试样，搅拌后将形成的溶液，按常规剂量点样到玻璃纤维膜上凉干，然后加入与带有一抗的荧光微粒充分反应的待测试样中，测定其荧光信号(测量设备为时间分辨荧光仪)，发现在第2个试样测量结果由阳性转为阴性(相当于2体积树状大分子中加入1体积12,500U肝素)。从而确定在二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10的情况下，封闭2体积树状大分子所需的12,500U肝素的量为1体积。
2.配制免疫分析试剂
将12,500U的肝素加入到结合有二抗的树状大分子溶液中，肝素的终浓度为1％-10％，接着将封闭后的树状大分子溶液按常规剂量点样到玻璃纤维膜上，凉干备用。
3.测定其储存稳定性
将制得的免疫分析试剂置于37℃温度、80％湿度的加速分解试验环境中测定其储存稳定性。每隔1天测量其在待测液中的荧光信号。结果在长达1个月的连续跟踪测定后未发现其荧光信号有明显变化。
4.时间分辨荧光免疫诊断试验
滴加100至200μl全血或血清，应用双抗体夹心法或竞争法检测抗原；根据荧光强度确定被测抗原的含量，结果列于表1。
| 阴性血清 | 阳性血清 | |
| 未封闭 | 566 | 604 |
| 12,500U肝素封闭 | 12 | 598 |
注：时间分辨荧光仪的判断标准，阳性信号＞200，临界区间100～200，阴性信号＜100。
实施例2
用聚丙烯酸作为封闭剂
1.确定封闭剂的加入量
将聚丙烯酸配制成浓度为0.01％至0.1％，两个浓度间间隔为0.01％的10个水溶液试样备用。
将二抗与树状大分子结合，二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10；随后取10个等量的二抗-树状大分子结合体的水溶液，分别加入上面制得的10个聚丙烯酸水溶液试样，搅拌后将形成的溶液，按常规剂量点样到玻璃纤维膜上凉干，然后加入与带有一抗的荧光微粒充分反应的待测试样中，测定其荧光信号(测量设备为时间分辨荧光仪)，发现在第4个试样测量结果由阳性转为阴性(相当于20体积树状大分子中加入1体积聚丙烯酸)。从而确定在二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10的情况下，封闭20体积树状大分子所需的聚丙烯酸的量为1体积。
2.配制免疫分析试剂
将聚丙烯酸加入到结合有二抗的树状大分子溶液中，聚丙烯酸的终浓度为0.01％-0.1％，接着将封闭后的树状大分子溶液按常规剂量点样到玻璃纤维膜上，凉干备用。
3.测定其储存稳定性
将制得的免疫分析试剂置于37℃温度、80％湿度的加速分解试验环境中测定其储存稳定性。每隔1天测量其在空白待测液中的荧光信号。结果在长达一个月的连续跟踪测定后未发现其荧光信号有明显变化。
4.时间分辨荧光免疫诊断试验
滴加100至200μl全血或血清，应用双抗体夹心法或竞争法检测抗原；根据荧光强度确定被测抗原的含量，结果列于表2。
| 阴性血清 | 阳性血清 | |
| 未封闭 | 485 | 736 |
| 阴性血清 | 阳性血清 | |
| 聚丙烯酸封闭 | 24 | 773 |
注：时间分辨荧光仪的判断标准，阳性信号＞200，临界区间100～200，阴性信号＜100。
实施例3
用羧甲基纤维素作为封闭剂
1.确定封闭剂的加入量
将羧甲基纤维素配制成浓度为0.1％至1％，两个浓度间间隔为0.1％的10个水溶液试样备用。
将二抗与树状大分子结合，二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10；随后取10个等量的二抗-树状大分子结合体的水溶液，分别加入上面制得的10个羧甲基纤维素水溶液试样，搅拌后将形成的溶液，按常规剂量点样到玻璃纤维膜上凉干，然后加入与带有一抗的荧光微粒充分反应的待测试样中，测定其荧光信号(测量设备为时间分辨荧光仪)，发现在第5个试样测量结果由阳性转为阴性(相当于4体积树状大分子中加入1体积羧甲基纤维素)。从而确定在二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10的情况下，封闭4体积树状大分子所需的羧甲基纤维素的量为1体积。
2.配制免疫分析试剂
将羧甲基纤维素加入到结合有二抗的树状大分子溶液中，羧甲基纤维素的终浓度为0.1％-1％，接着将封闭后的树状大分子溶液按常规剂量点样到玻璃纤维膜上，凉干备用。
3.测定其储存稳定性
将制得的免疫分析试剂置于37℃温度、80％湿度的加速分解试验环境中测定其储存稳定性。每隔1天测量其在空白待测液中的荧光信号。结果在长达半个月的连续跟踪测定后未发现其荧光信号有明显变化。
4.时间分辨荧光免疫诊断试验
滴加100至200μl全血或血清，应用双抗体夹心法或竞争法检测抗原；根据荧光强度确定被测抗原的含量，结果列于表3。
| 可疑血清 | 阳性血清 | |
| 未封闭 | 585 | 421 |
| 羧甲基纤维素封闭 | 159 | 457 |
注：时间分辨荧光仪的判断标准，阳性信号＞200，临界区间100～200，阴性信号＜100。
实施例4
用聚甲基丙烯酸作为封闭剂
1.确定封闭剂的加入量
将聚甲基丙烯酸配制成浓度为0.1％至1％，两个浓度间间隔为0.1％的10个水溶液试样备用。
将二抗与树状大分子结合，二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10；随后取10个等量的二抗-树状大分子结合体的水溶液，分别加入上面制得的10个聚甲基丙烯酸水溶液试样，搅拌后将形成的溶液，按常规剂量点样到玻璃纤维膜上凉干，然后加入与带有一抗的荧光微粒充分反应的待测试样中，测定其荧光信号(测量设备为时间分辨荧光仪)，发现在第6个试样测量结果由阳性转为阴性(相当于5体积树状大分子中加入2体积聚甲基丙烯酸)。从而确定在二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10的情况下，封闭5体积树状大分子所需的聚甲基丙烯酸的量为2体积。
2.配制免疫分析试剂
将聚甲基丙烯酸加入到结合有二抗的树状大分子溶液中，聚甲基丙烯酸的终浓度为0.1％-1％，接着将封闭后的树状大分子溶液按常规剂量点样到玻璃纤维膜上，凉干备用。
3.测定其储存稳定性
将制得的免疫分析试剂置于37℃温度、80％湿度的加速分解试验环境中测定其储存稳定性。每隔1天测量其在空白待测液中的荧光信号。结果在长达半个月的连续跟踪测定后未发现其荧光信号有明显变化。
4.时间分辨荧光免疫诊断试验
滴加100至200μl全血或血清，应用双抗体夹心法或竞争法检测抗原；根据荧光强度确定被测抗原的含量，结果列于表4。
| 阴性血清 | 阳性血清 | |
| 未封闭 | 733 | 913 |
| 聚甲基丙烯酸封闭 | 21 | 886 |
注：时间分辨荧光仪的判断标准，阳性信号＞200，临界区间100～200，阴性信号＜100。
比较例1
用牛血清白蛋白作为封闭剂
1.确定封闭剂的加入量
将牛血清白蛋白配制成浓度为0.05％至6.4％，两个浓度间间隔为2倍的8个水溶液试样备用。
将二抗与树状大分子(dendrimer)结合，二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10；随后取8个等量的二抗-树状大分子结合体的水溶液，分别加入上面制得的8个牛血清白蛋白水溶液试样，搅拌后将形成的溶液，按常规剂量点样到玻璃纤维膜上，并在37℃孵育1-2小时，然后加入与带有一抗的荧光微粒充分反应的待测试样中，测定其荧光信号(测量设备为时间分辨荧光仪)，未发现以上8个试样测量结果由阳性转为阴性，时间分辨荧光免疫诊断试验结果列于表5。
| 阴性血清 | 阳性血清 | |
| 未封闭 | 564 | 913 |
| 牛血清白蛋白封闭 | 632 | 886 |
注：时间分辨荧光仪的判断标准，阳性信号＞200，临界区间100～200，阴性信号＜100。
比较例2
用脱脂乳粉作为封闭剂
将脱脂乳粉配制成浓度为0.05％至6.4％，两个浓度间间隔为2倍的8个水溶液试样备用。
将二抗与树状大分子结合，二抗与所述树状大分子的质量比是1∶10；随后取8个等量的二抗-树状大分子结合体的水溶液，分别加入上面制得的8个脱脂乳粉水溶液试样，搅拌后将形成的溶液，按常规剂量点样到玻璃纤维膜上，在37℃孵育1-2小时，然后加入与带有一抗的荧光微粒充分反应的待测试样中，测定其荧光信号(测量设备为时间分辨荧光仪)，未发现以上8个试样测量结果由阳性转为阴性，时间分辨荧光免疫诊断试验结果列于表5。
| 阴性血清 | 阳性血清 | |
| 未封闭 | 699 | 781 |
| 脱脂乳粉封闭 | 701 | 678 |
注：时间分辨荧光仪的判断标准，阳性信号＞200，临界区间100～200，阴性信号＜100。
本发明不仅适用于医药诊断上对树状大分子上非特异性位点的封闭，还可用于其它生物医药领域对树状大分子上非特异性位点的封闭。
Claims (7)
1.一种其非特异性位点已经被封闭的树状大分子，它包括：
(1)树状大分子基体；
(2)包被在该树状大分子基体表面上的抗体或抗原；以及
(3)在该树状大分子基体表面上分子量为3,000-5,000,000,且与上述树状大分子通过电荷连接的封闭剂；所述封闭剂选自肝素、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素、接枝有羧基、磺酸基、硫酸基和磷酸基的有机聚合物、它们的盐及其混合物。
2.如权利要求1所述的树状大分子，其特征在于所述肝素、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、羧甲基纤维素、接枝有羧基、磺酸基、硫酸基和磷酸基的有机聚合物的酸值为20至1000g KOH/g。
3.如权利要求1-2中任一项所述的树状大分子，其特征在于所述封闭剂的分子量为8,000-1,000,000。
4.如权利要求3所述的树状大分子，其特征在于所述封闭剂的分子量为12,000-800,000。
5.如权利要求1-2中任一项所述的树状大分子，其特征在于所述封闭剂是分子量为8,000至100,000的羧甲基纤维素或者分子量为100,000至300,000的聚丙烯酸。
6.如权利要求1-2中任一项所述的树状大分子，其特征在于所述封闭剂为肝素。
7.如权利要求1-2中任一项所述的树状大分子在用于制备免疫分析用试剂中的用途。
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| Rosa-Maria Sebastian, et al..Dendrimers with N,N-Disubstituted Hydrazines asEndGroups,Useful Precursors for the SynthesisofWater-Soluble DendrimersCapped withCarbohydrate,Carboxylicor Boronic Acid Derivatives.TETRAHEDRON56.2000,566269-6277. * |
| Rosa-MariaSebastian et al..Dendrimers with N |
| 莫尊理 等.聚酰胺-胺树状大分子的合成与荧光性质的研究.西北师范大学学报(自然科学版)41 3.2005,41(3),55-57,62. |
| 莫尊理等.聚酰胺-胺树状大分子的合成与荧光性质的研究.西北师范大学学报(自然科学版)41 3.2005,41(3),55-57,62. * |
| 韩巧荣 等.树状大分子的自组装表面修饰与荧光客体分子的相转移.功能材料36 12.2005,36(12),1951-1953. |
| 韩巧荣等.树状大分子的自组装表面修饰与荧光客体分子的相转移.功能材料36 12.2005,36(12),1951-1953. * |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101003607A (zh) | 2007-07-25 |
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