ES2585394T3 - Procedimiento de detección de interacciones moleculares - Google Patents

Abstract

Procedimiento de detección de interacciones en una solución que comprende las siguientes etapas: a. introducir en una solución al menos una primera sustancia y al menos una segunda sustancia que puede interaccionar con dicha primera sustancia, b. introducir en la solución obtenida en la etapa a) de 2 a 10.000.000 partículas magnéticas o magnetizables, reposando dichas partículas en una superficie sumergida en dicha solución, teniendo dichas partículas un tamaño comprendido entre 10 nm a 100 μm, c. determinar la interacción de dichas sustancias por aplicación de un campo eléctrico, magnético o electromagnético diseñado para poner en movimiento dichas partículas, detectándose la interacción entre dichas sustancias cuando la movilidad de dichas partículas sobre dicha superficie se modifica.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento de deteccion de interacciones moleculares Campo tecnico

La presente invencion se refiere a un procedimiento de deteccion de interacciones moleculares. En particular, la presente invencion se refiere a un procedimiento de deteccion de interacciones moleculares entre al menos dos sustancias que pueden interaccionar entre si.

La presente invencion encuentra una aplicacion particularmente en el campo de la investigacion cientifica, en el campo medico, en particular en el analisis de muestras biologicas.

En la siguiente descripcion, las referencias entre parentesis (Ref.) corresponden a la lista de referencias presentada al final del texto.

Estado de la tecnica

En el campo medico y analitico, hay muchas situaciones en las que es interesante, o incluso necesario, detectar eventos de interacciones entre moleculas y/u objetos tales como anticuerpos, celulas, bacterias, virus y macromoleculas. Por ejemplo, para detectar una contaminacion bacteriana, se utiliza con frecuencia una prueba de antigeno / anticuerpo.

Para determinar el grupo sanguineo de una persona, se utiliza con frecuencia una prueba de afinidad entre anticuerpos y globulos rojos de la persona, que permite de este modo determinar el grupo sanguineo de dicha persona.

En el estado de la tecnica existen metodos “sencillos” que pueden realizarse cuando las sustancias a detectar se presentan en gran numero. Puede tratarse, por ejemplo, de un metodo que comprende una mezcla de sustancias a detectar con sustancias de afinidad, es decir, sustancias que pueden interaccionar con las sustancias a detectar. Las interacciones permiten formar un precipitado o un agregado visible a simple vista y que revela el resultado. De esta manera, por ejemplo, es posible realizar la tipificacion del grupo sanguineo, anadiendo anticuerpos a una gota de sangre y observando la formacion o la no formacion de un agregado de globulos rojos.

Tambien existen procedimientos que permiten medir las variaciones de viscosidad de un medio, que se producen cuando en ese medio se juntan sustancias de afinidad.

Por ejemplo, el documento US 3 635 678 (Ref 1) describe un procedimiento en el que una sola esfera de acero de tamano macroscopico (muy superior a la micra) sumergida en el fluido, se pone en suspension por un juego de imanes, midiendose el movimiento de la esfera en suspension mediante un sistema optico. Cuando la viscosidad del medio aumenta, la amplitud del movimiento de la esfera disminuye a lo largo del tiempo, el objetivo es deducir la velocidad de coagulacion de la sangre.

Un inconveniente principal de la tecnica descrita en ese documento es la complejidad de su realizacion ya que debe mantenerse una esfera en suspension. Por otro lado, la esfera en movimiento, debido a su tamano y a su masa, tal como se describe en la patente, puede romper interacciones debiles en el origen de la variacion de la viscosidad e impedir su deteccion. La sensibilidad del metodo es debil y se limita a la deteccion de variaciones de viscosidad relativamente significativas. Adicionalmente, para la lectura de los resultados deben utilizarse sistemas complejos y reactivos.

En el documento WO 01/86255 (Ref 2) se describe otro sistema que comprende un microscopio con el que es posible observar un movimiento de una particula en suspension en un liquido. La viscosidad del liquido se deduce del desfase de la segunda armonica de senal obtenida a partir de la observacion de la particula en suspension en un liquido con el microscopio.

En el documento EP 1 544 536 (Ref 3) se describe otra variante de esta estrategia, que comprende la oscilacion de una particula magnetizable en un campo magnetico para generar una senal y por tanto obtener un resultado.

El documento FR 2 866 706 describe un procedimiento que permite estudiar el desarrollo de una biopelicula en un medio de cultivo no homogeneo. Segun este documento, la viscosidad del medio se determina sumergiendo al menos una particula magnetica en el cultivo, sometiendo el cultivo a un campo magnetico y detectando el grado de libertad de movimiento de la particula magnetica.

Uno de los inconvenientes principales de estos metodos es la complejidad de su puesta en marcha y del seguimiento de la oscilacion de una particula accionada por una fuerza aplicada de manera periodica y controlada.

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La instrumentacion compleja, costosa y dificil de parametrizar por un lado para hacer oscilar y mantener la oscilacion de la particula, y por otro lado, para observar el movimiento periodico de la particula.

Adicionalmente estos metodos solo permiten medir modificaciones de viscosidad que deben tener lugar en la zona de oscilacion de la particula en suspension. Ademas las modificaciones de viscosidad deben ser significativas para que puedan detectarse. De este modo, es necesario disponer de soluciones que contengan un gran numero de sustancias de afinidad. Estos procedimientos son por tanto poco sensibles y no permiten alcanzar una precision satisfactoria para metodos que utilizan, por ejemplo, anticuerpos, u otras sustancias de afinidades dirigidas especificamente a detectar o dosificar.

Otro procedimiento normalmente utilizado para detectar reacciones de afinidades es la tecnica ELISA y sus numerosas variaciones. Dicha tecnica consiste en:

- adherir, sobre un soporte, un primer anticuerpo que presente una afinidad con una sustancia,

- poner en contacto durante un tiempo determinado la sustancia a detectar con el primer anticuerpo adherido

sobre su soporte,

- retirar por aclarado la sustancia que no haya reaccionado con el anticuerpo,

- poner en contacto la sustancia unida a los anticuerpos adheridos en la superficie y un segundo anticuerpo

que presente una afinidad con dicha sustancia,

- retirar por aclarado los anticuerpos que no hayan reaccionado con la sustancia, y

- detectar la presencia del segundo anticuerpo unido a la sustancia unida al primer anticuerpo unido al soporte.

Muy a menudo, el segundo anticuerpo esta unido a un marcador que es detectable directamente por un metodo fisico, por ejemplo un marcador fluorescente o magnetico, o un marcador unido a una enzima, por ejemplo la fosfatasa alcalina o la peroxidasa de rabano picante, para detectar el producto de la reaccion catalizada por la enzima a partir de un sustrato adecuado.

Este procedimiento presenta varios inconvenientes, por ejemplo, requiere numerosos lavados controlados que disminuyen su sensibilidad. Tambien comprende numerosas etapas de manipulacion por el experto en la materia; la realizacion de al menos dos reacciones de afinidad; el marcaje obligatorio del segundo anticuerpo con, al menos un marcador sensible y sofisticado, la utilizacion de un dispositivo complejo y dificil de parametrizar para detectar y cuantificar la serial emitida por el marcador. Este procedimiento es por tanto largo, costoso y necesita una instrumentacion compleja para su aplicacion.

Se han desarrollado otros metodos para detectar una reaccion de afinidad que tan solo requiere un anticuerpo, por ejemplo tecnicas, basadas en la resonancia de plasmon superficial (“plasmon surface resonance”), balanzas piezoelectricas, es decir, una simple observacion al microscopio para determinadas sustancias que lo permitan. Para hacer esto, el anticuerpo se fija sobre un soporte que sea adecuado a la tecnica de deteccion, la sustancia se pone en contacto durante un tiempo determinado con el anticuerpo fijado sobre el soporte, despues se realiza la lectura directamente o tras un aclarado para eliminar las sustancias que no hayan reaccionado por afinidad con los anticuerpos.

Estos metodos presentan numerosos inconvenientes, por ejemplo, el instrumento necesario para realizar la lectura es sofisticado y costoso. Ademas requieren soportes particulares para la fijacion de dichos anticuerpos. Por otro lado, requieren un gran numero de etapas y dependen de la calidad y de la cantidad de anticuerpos fijados.

En los metodos anteriormente indicados, es por tanto esencial adherir el anticuerpo, o cualquier otra sustancia de afinidad, sobre un soporte. En el estado de la tecnica se conocen superficies de afinidad. Dichas superficies pueden obtenerse, por ejemplo, por “moldeado molecular”.

Tambien se sabe que los procedimientos anteriormente citados pueden realizarse fijando, de manera inespecifica sobre un soporte, la sustancia que quiere detectarse. La sustancia asi fijada se pondra en contacto con un anticuerpo, o con cualquier otra sustancia de afinidad adecuada, marcada o no marcada, segun el procedimiento de deteccion, despues eventualmente de aclarar antes de proceder a la lectura.

No obstante, estas variantes presentan numerosos inconvenientes. En particular, se requiere unir la sustancia a detectar sobre el soporte, lo que no es posible de manera universal ni especifica. Adicionalmente, esta fijacion puede modificar la estructura de la sustancia fijada. Esta modificacion de la estructura puede alterar la sensibilidad y/o la especificidad de la deteccion, en particular cuando se utilizan anticuerpos. Adicionalmente, la fijacion puede conducir a la obtencion de resultados falsos negativos y/o falsos positivos. Adicionalmente, la fijacion puede ser diferente de una aplicacion a otra, pudiendo por tanto ser, los resultados asi obtenidos, no reproducibles. Ademas, para la deteccion se requieren dispositivos complejos y costosos.

Por tanto, existe una necesidad real de encontrar un procedimiento de deteccion de interacciones moleculares que palie estos defectos, inconvenientes y obstaculos de la tecnica anterior, en particular un procedimiento que permita

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mejorar la sensibilidad de deteccion de interacciones moleculares, reducir los costes de aplicacion, un procedimiento cuya aplicacion sea sencilla y que permita obtener resultados rapidos, fiables y reproducibles.

Descripcion de la invencion

El objeto exacto de la presente invencion es responder a las numerosas necesidades e inconvenientes anteriormente citados de la tecnica anterior proporcionando un procedimiento de deteccion de interacciones moleculares.

En particular la presente invencion tiene por objeto un procedimiento de deteccion de interacciones en una solucion que comprende las siguientes etapas:

a. introducir en una solucion al menos una primera sustancia y preferentemente al menos una segunda sustancia que puede interaccionar con dicha primera sustancia,

b. introducir en la solucion obtenida en la etapa a) de 2 a 10.000.000 particulas magneticas o magnetizables reposando dichas particulas sobre una superficie sumergida en dicha solucion, teniendo dichas particulas un tamano comprendido entre 10 nm a 100 pm,

c. determinar la interaccion de dichas sustancias por aplicacion de un campo electrico, magnetico o electromagnetico con el fin de poner en movimiento dichas particulas, detectandose la interaccion entre dichas sustancias cuando la movilidad de dichas particulas sobre dicha superficie se modifica.

De acuerdo con la invencion, por movilidad se entiende el movimiento de las particulas por aplicacion y/o bajo el efecto de campo electrico, magnetico o electromagnetico. Esta movilidad puede definirse, por ejemplo, a partir de la relacion entre la velocidad de las particulas en un punto del espacio dado y la intensidad de gradiente del cuadrado del campo magnetico en ese lugar del espacio dado, por ejemplo, a partir de relacion entre la velocidad de las particulas en un punto del espacio dado y la intensidad de gradiente del potencial electrico en este lugar del espacio dado.

De acuerdo con la invencion, la modificacion de la movilidad puede seleccionarse entre una ralentizacion, una desaceleracion, una modificacion de la trayectoria, una aceleracion o una detencion de dichas particulas.

De este modo, de acuerdo con la invencion, la aplicacion de campo electrico, magnetico o electromagnetico puede provocar o no un reagrupamiento o una dispersion de dichas particulas.

De acuerdo con la invencion, por interaccion de sustancias se entiende, por ejemplo, una interaccion molecular, por ejemplo, interacciones de tipo enlace de hidrogeno, ionico, van der Waals, una interaccion biologica, por ejemplo, interacciones de reconocimiento de motivos tridimensionales especificos de tipo hormona-receptor, anticuerpos- antigenos, una interaccion electrostatica, una interaccion magnetica, un gradiente de concentracion de iones o de moleculas, en otros terminos, cualquier gradiente de potencial, de concentracion molecular o ionica que encuentre su origen a nivel de sustancias y que tienda a hacer que se aproximen o se repelan, por ejemplo, mediante enlaces de hidrogeno, interacciones de van der Waals, enlaces hidrofobos, enlaces covalentes, enlaces ionicos, por ejemplo, mediante movimiento de quimiotaxis. Puede tratarse, por ejemplo, de una interaccion antigenos-anticuerpos, enzimas-sustratos, receptores-ligandos, moleculas-celulas, celulas-vectores, celulas-virus, celulas eucariotas-celulas procariotas, celulas eucariotas-celulas eucariotas, celulas procariotas-celulas procariotas.

La solucion que puede de utilizarse en la presente invencion puede ser una solucion liquida o un gas. La solucion puede ser cualquier solucion conocida por el experto en la materia. Puede tratarse, por ejemplo, de un medio de cultivo, por ejemplo un medio de cultivo de celulas eucariotas y/o procariotas, un medio tampon, por ejemplo cualquier medio tampon conocido por el experto en la materia, por ejemplo, un medio de tampon disponible en el comercio, por ejemplo, tampon fosfato salino (PBS, por sus siglas en ingles), una muestra biologica, por ejemplo, una muestra de sangre, de plasma, de orina, de liquido cefalorraquideo, una solucion salina, por ejemplo una solucion fisiologica, un medio de cultivo, por ejemplo infusion de corazon y cerebro disponible en el comercio, un disolvente, por ejemplo, acetona, dimetilsulfoxido, etanol, metanol, propanol, acetonitrilo, acetato de etilo, eter, fenol, cloroformo, tetrahidrofurano, difluoroetileno, y/o un hidrocarburo, por ejemplo hexano, ciclohexano, benceno, octano, decano, petroleo, gasolina, gasoil.

De acuerdo con la invencion, el gas puede ser, por ejemplo, aire, oxigeno, nitrogeno, neon, argon, gas carbonico, metano, ozono.

De acuerdo con la invencion una solucion liquida puede tener una masa volumica de 0,1 a 4 kg/l, de 0,3 a 3 kg/l; una solucion gaseosa puede tener una densidad de 10- kg/m a 1000 kg/m , de 10- a 30 kg/m de 10- a 3 kg/m .

A traves de estos conocimientos generales, el experto en la materia sabra determinar facilmente la masa volumica de una solucion. Por ejemplo, la medida de la masa volumica de la solucion puede realizarse, por ejemplo, midiendo la proporcion de la masa sobre el volumen, por ejemplo, pesando una solucion de volumen conocido.

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De acuerdo con la invencion, la solucion puede tratarse previamente, por ejemplo, la solucion puede purificarse, diluirse, concentrarse.

De acuerdo con la invencion, la solucion puede purificarse mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia, por ejemplo, por dialisis, filtracion, ultrafiltracion, clarificacion y por centrifugacion. Por ejemplo, el procedimiento de filtracion puede comprender pasar la solucion sobre un tamiz con poros de 0,2 a 100 pm, pudiendo el procedimiento de ultrafiltracion comprender, por ejemplo, una centrifugacion a una velocidad de 1 a 3000 vueltas por minuto durante un tiempo de 0,1 a 30 minutos, el procedimiento de dialisis puede ser, por ejemplo, un procedimiento que comprenda una etapa de deposito de la solucion sobre una membrana de dialisis, por ejemplo, a un umbral de corte de 500 Da, flotando dicha membrana sobre agua destilada contenida en un recipiente. El procedimiento de clarificacion puede ser, por ejemplo, un procedimiento que comprenda la adicion de 0,1 % (peso/peso) de albumina de suero bovino en la solucion.

De acuerdo con la invencion, la purificacion de la solucion puede permitir, ventajosamente, eliminar de la solucion cualquier contaminante y/o moleculas que puedan alterar la deteccion de la interaccion molecular, por ejemplo, la purificacion puede permitir eliminar independientemente bacterias, virus, proteinas, moleculas quimicas, sales, granos de materias, agregados de moleculas. Naturalmente, el experto en la materia, a traves de estos conocimientos generales, sabra adaptar el procedimiento de purificacion en funcion de la solucion.

De acuerdo con la invencion, la solucion tambien puede diluirse, por ejemplo, mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia, por ejemplo, por dilucion en serie. La dilucion puede realizarse con cualquier diluyente conocido por el experto en la materia. Puede tratarse, por ejemplo, de una solucion tampon, por ejemplo, tampon de fosfato salino, una solucion salina, por ejemplo suero fisiologico, etanol, DMSO, acetona, hexano y/o cualquier disolvente, hidrocarburo o solucion descrita anteriormente.

La solucion puede diluirse, por ejemplo, a un factor de 2 a 20.000, de 5 a 500, de 5 a 50.

La dilucion de la solucion puede permitir, ventajosamente, modificar la concentracion de los componentes presentes en la solucion, por ejemplo, disminuyendo la concentracion, por ejemplo, la dilucion puede permitir disminuir la concentracion proteica. La dilucion puede permitir de este modo disminuir la concentracion de eventuales compuestos interferentes y asi ventajosamente mejorar la especificidad y/o la sensibilidad del procedimiento de la invencion.

De acuerdo con la invencion, la solucion tambien puede concentrarse, por ejemplo, mediante cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia, por ejemplo, por ultracentrifugacion, ultrafiltracion, evaporacion, liofilizacion.

De acuerdo con la invencion, la purificacion, dilucion y/o concentracion de dicha solucion puede permitir, ventajosamente, ajustar la masa volumica de dicha solucion.

El ajuste de la masa volumica de la solucion permite mejorar, ventajosamente, la especificidad y/o la sensibilidad del procedimiento de la invencion, particularmente aumentando, disminuyendo o anulando el efecto de la fuerza de la gravedad que dirige a las particulas hacia la superficie.

De acuerdo con la invencion, el volumen de la solucion utilizado en el procedimiento puede ser, por ejemplo, de 0,3 pl a 100 ml, de 3 pl a 100 ml, de 30 pl a 1 ml.

De acuerdo con la invencion, la solucion puede ser susceptible de modular la interaccion entre dichas primera y segunda sustancias. Por ejemplo, la solucion puede aumentar o disminuir la interaccion entre dichas sustancias.

De acuerdo con la invencion, la solucion puede comprender, ventajosamente, un compuesto que aumente o disminuya la interaccion entre dichas primera y segunda sustancias. El compuesto puede anadirse a la solucion, por ejemplo, antes de realizar el procedimiento de la invencion. El compuesto puede ser, por ejemplo, moleculas quimicas, sales, iones, polimeros de macromoleculas, coloides, microparticulas, por ejemplo, acidos y bases que modifican el pH de la solucion, por ejemplo, NaCl que modifica la fuerza ionica de la solucion, por ejemplo, polietilenglicol que puede, por ejemplo, aumentar la afinidad de dichas sustancias.

La presente invencion permite, ventajosamente, determinar si dicha solucion modula realmente la interaccion, comparando los resultados obtenidos por el procedimiento de la invencion en el que las sustancias son identicas con soluciones diferentes.

De acuerdo con la invencion la primera sustancia puede seleccionarse del grupo que comprende celulas eucariotas, celulas procariotas, membranas, virus, priones, mitocondrias, cloroplastos, vesiculas, liposomas, constituyentes celulares, flagelos, proteinas, lipoproteinas, glucoproteinas, anticuerpos, acidos nucleicos, complejos lipidicos, coloides, macromoleculas, microparticulas, nanoparticulas, antigenos, hormonas, ligandos de proteinas y moleculas quimicas.

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De acuerdo con la invencion, las celulas eucariotas que pueden utilizarse en la presente invencion pueden ser, por ejemplo, celulas eucariotas de animales, por ejemplo, celulas de sangre, por ejemplo, leucocitos, por ejemplo, granulocitos, neutrofilos polinucleares; eosinofilos polinucleares; basofilos polinucleares; linfocitos B, linfocitos T, linfocitos citoliticos naturales (NK, por las siglas en ingles Natural Killer), monocitos, eritrocitos, trombocitos. Tambien puede tratarse de celulas eucariotas vegetales, por ejemplo, celulas de la epidermis vegetal, del xilema, floema, parenquima, colenquima, esclerenquima. Tambien puede tratarse de hongos, levaduras. Puede tratarse, por ejemplo, de Candida, Cryptococcus, Malassezia, Pityrosporum, Pneumocystis, Epidermo-phyton, Microsporum, Trichophyton. Tambien puede tratarse de protozoos, por ejemplo, Entamoeba histolytica, Acanthamoeba castellanii, Naegleria fowleri.

De acuerdo con la invencion, las celulas procariotas pueden ser, por ejemplo, cualquier bacteria conocida por el experto en la materia. Las bacterias que pueden utilizarse en la presente invencion son, por ejemplo, bacterias comprendidas en el grupo, sin limitarse al mismo, constituido por Acetobacter aurantius, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Agrobacterium tumefaciens, Azorhizobium caulinodans, Azotobacter vinelandii, Bacillus anthracis, Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus fusiformis, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, Bacteroides gingivalis, Bacteroides melaninogenicus, Bartonella henselae, Bartonella quintana, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Branhamella catarrhalis, Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter pylori, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydophila pneumoniae, Chlamydophila psittaci, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium welchii, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium fusiforme, Coxiella burnetii Ehrlichia chaffeensis, Enterococcus avium, Enterococcus durans, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus galllinarum, Enterococcus maloratus, Escherichia coli Francisella tularensis, Fusobacterium nucleatum Gardnerella vaginalis Haemophilus ducreyi, Haemophilus influenzae, Haemophilus parainfluenzae, Haemophilus pertussis, Haemophilus vaginalis, Helicobacter pylori Klebsiella pneumoniae, Klebseilla rhinoscleromatis-klebsiella oxytoca Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Methanobacterium extroquens, Microbacterium multiforme, Micrococcus luteus, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis, Mycobacterium diphtheriae, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium leprae, Mycobacterium lepraemurium, Mycobacterium phlei, Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis , Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Nocardia asteroides Pasteurella multocida, Pasteurella tularensis, Porphyromonas gingivalis, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas maltophilia, Rhizobium radiobacter, Rickettsia prowazekii, Rickettsia mooseri, Rickettsia psittaci, Rickettsia quintana, Rickettsia rickettsii, Rickettsia trachomae, Rochalimaea henselae, Rochalimaea quintana, Rothia dentocariosa, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Serratia marcescens, Shigella dysenteriae, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus avium, Streptococcus bovis, Streptococcus cricetus, Streptococcus faceium, Streptococcus faecalis, Streptococcus ferus, Streptococcus gallinarum, Streptococcus lactis, Streptococcus mitior, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus rattus, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus, Treponema pallidum, Vibrio cholerae, Vibrio comma, Vibrio parahemolyticus, Vibrio vulnificus, Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica,Yersinia pestis y Yersinia pseudotuberculosis, etc.

Las membranas que pueden utilizarse en la presente invencion pueden ser cualquier fragmento de membranas de celulas eucariotas, procariotas, por ejemplo, celulas procariotas o eucariotas anteriormente citadas, cualquier fragmento de membrana celular y/o de compartimento celular, por ejemplo mitocondrias, cloroplastos, endoplastos, reticulo endoplasmatico.

Las proteinas que pueden utilizarse en la presente invencion pueden ser proteinas plasmaticas, proteinas celulares, proteinas bacterianas. Por ejemplo, las proteinas pueden ser hormonas, por ejemplo, progesterona, vasopresina, hormona tirotropica, hormona luteinizante (LH) hormona estimulante de la tiroides (TSH), hormona del crecimiento (GH), factor de crecimiento epidermico (EGF), insulina, oxitocina. Puede tratarse, por ejemplo, de canales, por ejemplo canales de calcio, por ejemplo, los canales descritos en Catterall WA. (2000) Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16: 521-55 (Ref 4), canales de potasio, por ejemplo, los canales descritos en Dick GM y Tune JD, Role of potassium channels in coronary vasodilation, Exp Biol Med (Maywood). Enero 2010; 235(1): 10-22. (Ref 6). Tambien puede tratarse de peptidos implicados en el Complejo Mayor de Histocompatiblidad (CMH), por ejemplo, el CMH I y/o el CMH II. Tambien puede tratarse de receptores, por ejemplo, receptores nucleares, intracelulares, de membrana, transmembrana, acoplados a proteinas G, receptores de acetilcolina, receptor de la FSH, receptor de testosterona, por ejemplo, los receptores descritos en Mostallino MC y colaboradores Plasticity and function of extrasynaptic GABA(A) receptors during pregnancy and after delivery, Psychoneuroendocrinology. Dic. 2009; 34 Supl 1: S74-83 (Ref 7). Tambien puede tratarse de enzimas, por ejemplo, enzimas bacterianas, por ejemplo, enzimas de restriccion, por ejemplo, Hindlll, Eco RI, BamHI, Mstll, Taql, Notl, Hinfl, AluI, BglIII, Haell, Hhal, Pstl, Smal, enzimas implicadas en la senalizacion celular, por ejemplo, proteina quinasas, enzimas implicadas en la biosintesis, por ejemplo, en la biosintesis de acidos grasos, fosforilasas, deshidrogenasas, por ejemplo, glucosa deshidrogenasa, enzimas implicadas en el metabolismo general, por ejemplo, aldehido deshidrogenasa, alfa-amilasa, L-gluconolactona oxidasa, rodopsina, citrocromo B, citocromo C.

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Tambien puede tratarse de proteinas estructurales, por ejemplo, actina, miosina, peptina, albumina, colageno, histona H4.

Los anticuerpos que pueden utilizarse en la presente invencion pueden ser cualquier anticuerpo conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, puede tratarse de cualquier anticuerpo disponible en el comercio, por ejemplo, las IgG, IgA, IgM, IgE e IgD, los anticuerpos pueden ser, por ejemplo, anticuerpos dirigidos contra una de las proteinas anteriormente citadas, anticuerpos dirigidos contra otros anticuerpos por ejemplo, anticuerpos de conejo dirigidos contra anticuerpos humanos, por ejemplo, anticuerpos dirigidos especificamente contra anticuerpos dirigidos contra el receptor de la FSH. Tambien pueden tratarse de anticuerpos obtenidos despues de la inmunizacion de un individuo, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento descrito en el documento Biologie cellulaire et moleculaire, Concepts et experiences, 2s edicion 2004, Gerald Karp (Ref 5). Puede , por ejemplo, de anticuerpos producidos por un ser humano o un animal en respuesta a una infeccion, por ejemplo, por un virus, una bacteria, un prion, un parasito, un protozoo, pero tambien respuesta a una enfermedad, por ejemplo, un cancer, una enfermedad autoinmunitaria, como por ejemplo, la enfermedad de Basedow, la esclerosis en placas, pero tambien en respuesta a una intoxicacion, a un envenenamiento, a una contaminacion, a un estimulo, a una ingestion, a una inhalacion y a una inyeccion, por ejemplo, por un pesticida, un veneno, un insecticida, un herbicida, un agente alergizante, pero tambien en respuesta a un injerto, por ejemplo, de medula osea, de organos, como por ejemplo, un rinon, un pulmon, un higado, un miembro, como por ejemplo, una mano, una pierna, un pie, pero tambien en respuesta a un implante de organo artificial, una camara implantable, un marcapasos, un corazon artificial, una cadera artificial.

Las moleculas quimicas que pueden utilizarse en el procedimiento de la invencion pueden ser cualquier molecula quimica conocida por el experto en la materia. Puede tratarse, por ejemplo, de un reactivo de coagulacion, de un reactivo descrito en el documento, de una hormona, por ejemplo, hormonas esteroideas, por ejemplo, cortisol, aldosterona, progesterona, dehidroepiandrosterona (DHEA), sulfato de dehidroepiandrosterona (DHEAS), estradiol, adrostenediona, dihidrotestosterona (DHT), estrona, estriol, testosterona, por ejemplo, tiroxina, por ejemplo hormonas peptidicas, por ejemplo eritropoyetina (EPO), glucagon, somatostatina, peptido natriuretico auricular (ANP), corticotropina (ACTH).

De acuerdo con la invencion, la primera sustancia puede estar presente en la solucion, en este caso, no es necesario introducir la primera sustancia en la solucion.

De acuerdo con la invencion, dicha primera sustancia puede fijarse previamente sobre la superficie sumergida. El procedimiento de fijacion de la primera sustancia que puede utilizarse en la presente invencion puede ser cualquier procedimiento conocido por el experto en la materia. Naturalmente, a traves de estos conocimientos generales, el experto en la materia sabra seleccionar el procedimiento de fijacion en funcion de la primera sustancia.

Segun la invencion, cuando la primera sustancia se fija, la interaccion molecular con dicha segunda sustancia, modifica la superficie sumergida y, por ejemplo, puede densificar esta superficie sobre la cual reposa dicha particula frenando asi el desplazamiento de dicha particula cuando se aplica el campo electrico, magnetico o electromagnetico, revelando de este modo la interaccion.

De acuerdo con la invencion, la segunda sustancia puede ser cualquier sustancia definida anteriormente capaz de interaccionar con la primera sustancia.

De acuerdo con la invencion, la masa volumica de la primera y/o de la segunda sustancia puede ser superior o inferior a la de la solucion, preferentemente superior a la de la solucion. Ventajosamente, la superioridad de la masa volumica de dicha primera y/o segunda sustancia permite una localizacion de dicha primera y/o segunda sustancia cerca de fondo del envase.

De acuerdo con otro metodo de realizacion de la invencion, el procedimiento de la invencion puede realizarse con una solucion que contenga previamente dicha al menos una primera, dicha al menos una segunda sustancia. En este modo de realizacion, el procedimiento puede no comprender la etapa a) y puede comprender unicamente las etapas b) y c) anteriormente citadas.

De acuerdo con la invencion, el procedimiento puede comprender en lugar de la etapa a) una etapa previa a’) de fijacion de dicha primera sustancia sobre una superficie de un envase, a’’) la introduccion de una solucion en dicho envase, y

a’’’) la introduccion de al menos una segunda sustancia que pueda interaccionar con dicha primera sustancia.

De acuerdo con la invencion, el procedimiento de la invencion puede realizarse con una pluralidad de particulas, por ejemplo, con al menos 2 particulas, con, por ejemplo, de 2 a 10.000.000, de 1000 a 1.000.000, de 10.000 a 1.000.000, de 100.000 a 1.000.000, de 10.000 a 100.000 particulas. Ventajosamente, la pluralidad de particulas permite detectar directamente, sin dispositivos de visualizacion complejos y sin colorantes, la interaccion entre dichas sustancias, a diferencia de los procedimientos de la tecnica anterior que utilizan una sola particula y que para la deteccion de la interaccion, se necesitan dispositivos de visualizacion complejos y colorantes.

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De acuerdo con la invencion, dichas al menos dos particulas pueden seleccionarse del grupo que comprende particulas cargadas electricamente, particulas magneticas, particulas revestidas de al menos una capa magnetica, particulas magnetizables, particulas revestidas de una capa magnetizable, particulas electricas, electromagneticas, electrizables, portadoras de una carga electrica o una mezcla de dos o mas de estas particulas. Puede tratarse, por ejemplo, de particulas constituidas completamente o en parte de un material magnetico y/o magnetizable, es decir, que pueden ponerse en movimiento bajo el efecto/aplicacion de un campo electrico, magnetico o electromagnetico. De hecho, puede tratarse de cualquier particula que permita llevar a cabo la presente invencion.

Ventajosamente, dichas particulas pueden ser una particula de cualquier forma adaptada a la realizacion de la presente invencion, por ejemplo en forma de esfera, disco, de forma geometrica asimetrica, por ejemplo, con una cara plana, etc.

Puede utilizarse cualquier tamano apropiado de particula magnetica. El tamano puede seleccionarse, por ejemplo, en funcion del tamano del envase de la solucion. Por ejemplo, el tamano de las particulas puede ser inferior a la decima parte del tamano del envase, preferentemente inferior a la centesima parte, de manera incluso mas preferida, inferior a la milesima parte del tamano del recipiente. Por ejemplo, la particula puede permitir un tamano, por ejemplo, de 10 nm a 100 pm, de 0,1 a 10 pm.

Ventajosamente, el procedimiento de la invencion permite medir ligeras variaciones de propiedades viscoelasticas de la solucion en la que se sumergen las particulas. Cuanto menor sea esta variacion mas sensible debera ser la medicion. La invencion permite utilizar, de manera exacta y ventajosa, una pluralidad de particulas, detectar ligeras variaciones causadas por interacciones debiles entre sustancias que estan o bien en pequenas cantidades o aplican fuerzas de interaccion de ligera intensidad. La utilizacion de una sola particula y/o esfera magnetica o magnetizable no permite detectar de manera satisfactoria las interacciones. Adicionalmente, existe un riesgo no despreciable de deteccion de fenomenos inespecificos, por ejemplo, causados por la presencia de un agregado, de impurezas que pueden interferir con el movimiento de dicha microparticula magnetizable bajo el efecto del campo magnetico, electrico o electromagnetico.

Al contrario, el procedimiento de la invencion, en el que se utilizan al menos dos particulas, permite obtener un resultado fiable y estadisticamente representativo.

Adicionalmente, cuanto mayor sea el numero de particulas, mas informacion aportara sus movimientos relativos, particularmente permitiendo una mejor cobertura de la superficie de contacto con la que se desarrolla el fenomeno medido. Por tanto, el procedimiento de la invencion permite, ventajosamente, interpretar no solamente el movimiento propio de dichas microparticulas (trayectoria, velocidad de desplazamiento...), sino tambien la imagen global que van a disenar despues de la aplicacion del campo magnetico, electrico o electromagnetico. En efecto, la distribucion homogenea inicial de una pluralidad de microparticulas se perturba por la aplicacion de este campo en funcion de las propiedades viscoelasticas del medio. Por ejemplo, si el medio es muy viscoso, por ejemplo, si se desarrollan interacciones fuertes entre las sustancias puestas en presencia, la distribucion permanece homogenea, no pudiendo desplazarse las particulas, o pudiendo desplazarse poco, bajo el efecto de dicho campo. Si el medio es poco viscoso, o no es viscoso, o si se desarrollan interacciones muy debiles o nulas entre dichas sustancias puestas en presencia, la distribucion seguira las lineas del campo mas significativas, por ejemplo, formando un anillo o una mancha por encima de un iman cilindrico, teniendo las particulas plena libertad para desplazarse bajo el efecto de dicho campo.

Adicionalmente, el procedimiento de la invencion permite, ventajosamente, gracias a la utilizacion de una pluralidad de particulas, por ejemplo, distribuyendo y/o dispersando dichas particulas de manera homogenea en la solucion que contiene dichas sustancias, observar visualmente interacciones visibles no solamente a escala molecular, es decir, del orden de nanometros, sino tambien a escala microscopica, es decir, del orden de micras e incluso macroscopica, es decir, superior a la micra.

Por ejemplo interacciones entre sustancias que conducen 1) a la formacion de agregados, de nucleos de nucleacion, cristales que interfieren de diferentes maneras con dichas particulas en comparacion con sustancias cuyas interacciones conducen 2) a la formacion de polimeros mas o menos reticulados. En el primer caso las particulas tienen tendencia a acumularse contra los agregados, nucleos de nucleacion, cristales del lado opuesto en el sentido del movimiento generado por la aplicacion del campo electrico, magnetico o electromagnetico sobre dichas particulas. Las particulas generan una imagen contrastada a nivel de zonas de acumulacion. En el segundo caso, si la polimerizacion se desarrolla de manera homogenea y regular en la solucion, la imagen refleja la inmovilizacion progresiva de dichas particulas conforme disminuye la intensidad del campo electrico, magnetico o electromagnetico (por ejemplo conforme se alejen del iman). Por tanto, el procedimiento de la invencion permite obtener, ventajosamente, imagenes que revelan las estructuras derivadas de interacciones entre las sustancias y las particulas en la solucion.

Preferentemente, el numero de particulas que se utiliza para visualizar imagenes a escala microscopica e incluso macroscopica, comprende de 1000 a 1.000.000, de 10.000 a 1.000.000, de 100.000 a 1.000.000, de 10.000 a 100.000.

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De acuerdo con la invencion, las particulas pueden tener, ventajosamente, una densidad proxima a la densidad de las sustancias que pueden que interaccionan entre si. Por ejemplo, las particulas pueden tener, por ejemplo, una densidad relativa a las sustancias comprendida entre 0,3 y 3.

De acuerdo con la invencion, la densidad de las particulas puede determinarse por cualquier procedimiento conocido por el experto de la materia, por ejemplo, puede tratarse de la relacion entre la masa de las particulas y el aumento del volumen de la solucion en la que se anaden esas particulas.

De acuerdo con la invencion, la densidad de las particulas permite mejorar, ventajosamente, la especificidad y/o la sensibilidad del procedimiento de la invencion, por ejemplo, aumentando, disminuyendo o anulando el efecto de la fuerza de la gravedad.

Preferentemente, las particulas y las sustancias tendran una masa volumica superior a la de la solucion en la que estan contenidas. Preferentemente, las particulas y las sustancias tendran una masa volumica ligeramente superior, por ejemplo de 1,0001 a 3 veces superior a la de la solucion en la que estan contenidas.

Ventajosamente, a la superficie de las particulas pueden acoplarse moleculas adherentes. Ventajosamente, el acoplamiento de dichas moleculas en la superficie de las particulas permite la adhesion de las particulas entre si. Por ejemplo, las particulas pueden estar recubiertas con polimeros, por ejemplo, polimeros de bloque que comprenden una parte hidrofila y una partida hidrofoba, permitiendo ventajosamente un reagrupamiento fijo de particulas despues de aplicacion del campo electrico, magnetico o electromagnetico. En otras palabras, la interaccion entre las moleculas adherentes permite solidarizar las particulas entre si despues de la aplicacion del campo y por tanto obtener un resultado estable y no modificable.

De acuerdo con la invencion, las particulas pueden ser del mismo tamano o de tamano o diferente.

Cuando las particulas son del mismo tamano, las particulas estan esencialmente frenadas o aceleradas al mismo tiempo durante la interaccion molecular. Cuando las particulas utilizadas son de distinto tamano, el tamano de pequenas particulas puede seleccionarse, por ejemplo, de manera que se frenen despues del inicio de la interaccion molecular, quedando frenadas mas tarde las particulas grandes. En este caso, las particulas de tamano mas pequeno se frenan antes que las particulas de tamano mas grande.

Cuando las particulas son de distinto tamano, las particulas pequenas pueden presentar un tamano, por ejemplo, de 10 nm a 1 pm, por ejemplo de 100 a 500 nm, y las particulas grandes pueden presentar un tamano, por ejemplo, de 1 pm a 100 pm, por ejemplo, de 1 pm a 10 pm, por ejemplo de 1 pm a 5 pm.

Ventajosamente, las particulas de diversos tamanos pueden permitir una deteccion y/o un analisis precoz y mas sensible de la interaccion molecular.

De acuerdo con la invencion, tambien se puede utilizar una pluralidad de particulas del mismo tamano con una magnetizacion diferente.

La diferencia de comportamiento de diferentes particulas puede permitir, ventajosamente, evaluar la fuerza de interaccion molecular. Mediante la aplicacion de campo magnetico se puede provocar un movimiento de las particulas que hayan sido mas fuertemente magnetizadas, la fuerza magnetica es mayor, mientras que las particulas que hayan sido mas debilmente magnetizadas no pueden ponerse en movimiento en comparacion con una inmovilizacion total de todas las particulas cuando la interaccion es fuerte.

De acuerdo con la invencion, dicha al menos una particula es preferentemente una particula generadora de una senal detectable. La deteccion de esta senal dependera de las propiedades de la particula. Por ejemplo, dicha al menos una particula puede ser fluorescente, fosforescente, radioactiva, quimioluminiscente, reflectante o de color.

Por ejemplo, en el caso en el que dicha al menos una particula sea fluorescente, la fluorescencia emitida por dicha particula puede detectarse, por ejemplo, visualmente y/o por cualquiera de los medios opticos conocidos por el experto en la materia. Dicha al menos una particula puede, por ejemplo, iluminarse para seguir su movimiento mediante una fuente luminosa, por ejemplo, un rayo laser.

De acuerdo con la invencion, la iluminacion puede ser continua o intermitente. Por ejemplo la iluminacion puede realizarse durante todo el procedimiento o, por ejemplo, durante la etapa a) o b) o c), a) y c), a) y b) y b) y c).

Por ejemplo, en el caso en el que dicha al menos una particula sea fosforescente, dicha particula puede visualizarse por ejemplo, visualmente, por cualquiera de los medios opticos conocidos por el experto en la materia.

Por ejemplo en el caso en el que dicha particula sea radioactiva, dicha particula puede detectarse incluso a traves de liquidos o medios de cultivo opticamente opacos, asi como a traves de placas de microdilucion opticamente opacas por cualquier dispositivo de deteccion de radioactividad emitida conocido por el experto en la materia,

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particularmente el metodo clasico de revelado sobre pelicula autorradiografica. Tan solo hay que presionar la pelicula sensible bajo la placa de microdilucion y despues revelar la imagen del fondo de dicha placa de microdilucion.

Por ejemplo en el caso en el que dicha al menos una particula sea quimioluminiscente, la deteccion de dicha particula puede formarse anadiendo al medio un reactivo quimico que permita la emision de energia luminosa por dicha particula. La deteccion de esta senal puede ser, por ejemplo, visual y/o por cualquiera de los medios conocidos por el experto en la materia, particularmente a traves de la utilizacion de una camara CCD {“Charge Coupled Device", dispositivo de carga acoplada) sensible a las longitudes de ondas emitidas, que barren (escanean) las cupulas de la placa de microdilucion.

Por ejemplo en el caso en el que dicha al menos una particula sea reflectante, la deteccion de dicha particula puede ser, por ejemplo, visual o por cualquiera de los medios opticos conocidos por el experto en la materia. Ventajosamente, dicha al menos una particula puede, por ejemplo, iluminarse, para seguir su movimiento mediante una fuente luminosa, por ejemplo, un rayo laser.

Por ejemplo en el caso en el que dichas al menos dos particulas sean de color, la deteccion de dichas particulas puede ser, por ejemplo, visual y/o por cualquier medio conocido por el experto en la materia para la deteccion de particulas de color.

De acuerdo con la invencion, ventajosamente, dichas particulas pueden seleccionarse de colores diferentes en funcion de su tamano y/o en funcion de su poder magnetico. La aplicacion del campo magnetico permite en este caso que en la superficie aparezca un punto o anillo o una mancha de color debido al reagrupamiento de dichas particulas. Ventajosamente, esta caracteristica permite realizar una deteccion visual facilitada por el reagrupamiento. En efecto, por ejemplo, en el caso de que dichas particulas sean de dos tamanos diferentes, siendo las particulas grandes de un color y las pequenas de otro, durante la aplicacion del campo magnetico si la interaccion entre dichas sustancias es debil las particulas pequenas permanecen inmovilizadas en la solucion mientras que las grandes se reagrupan. Este reagrupamiento es visible por la aparicion de un punto de color que en este caso es identico al color de las particulas de tamano mas grande. Si no hay ninguna interaccion molecular en la solucion entre las sustancias, las particulas pequenas y las grandes pueden reagruparse y la reagrupacion de las particulas se visualiza por la aparicion de un punto de color que corresponde a la superposicion de dos colores. Finalmente si la interaccion molecular es significativa, las particulas pueden estar totalmente frenadas y no pueden por tanto reagruparse y no es visible ningun punto de color.

En otras palabras, el reagrupamiento puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la mancha formada por dichas particulas reagrupadas. Por ejemplo, cuando dichas particulas son de color, midiendo el color de dichas particulas. Adicionalmente, el reagrupamiento puede evaluarse, por ejemplo, en funcion de la forma de la mancha obtenida, por ejemplo, en funcion de la forma, del diametro, de su topologia, por ejemplo, un disco, un anillo.

El experto en la materia comprendera facilmente que para la realizacion de la presente invencion, la eleccion de propiedades visuales de dichas al menos dos particulas tambien puede realizarse en funcion de la solucion. En efecto, cuanto mayor sea el contraste entre el color de dichas al menos dos particulas y el color de la solucion, mas facil sera la deteccion del movimiento de dichas al menos dos particulas.

En la presente invencion, el campo magnetico, o electrico o electromagnetico puede ser cualquier campo que permita poner en movimiento dichas al menos dos particulas sobre dicha superficie sumergida en dicha solucion, por ejemplo, un campo electromagnetico o un campo magnetico. El campo magnetico, o electrico o electromagnetico puede generarse, por ejemplo, con un iman o un solenoide. El iman puede tener, por ejemplo, forma de barra, de punta, de moneda, etc. o cualquier forma apropiada para realizar la presente invencion. El campo puede aplicarse, por ejemplo, por cualquier medio conocido por el experto en la materia, por ejemplo, por impulsion, por aumento progresivo del campo electromagnetico, por variaciones del campo electromagnetico o por una combinacion de estas aplicaciones.

Un aumento progresivo del campo electromagnetico puede obtenerse, por ejemplo, por aproximacion de un iman segun una trayectoria rectilinea o sinusoidal, o segun un movimiento oscilante que presente o no una amplitud de oscilacion y/o una frecuencia variables. Pueden obtenerse variaciones mas complejas de campo, por ejemplo, por rotacion o por combinaciones de movimientos de un material imantado cerca de dicha al menos una particula.

De este modo, de acuerdo con la invencion, dicho campo magnetico puede generarse por medios generadores de campo que pueden estar o no en movimiento.

Cuando varias particulas deben ponerse en movimiento, el campo debe poder reagrupar dichas particulas sobre dicha superficie sumergida en dicha solucion.

Cualquiera que sea el modo de realizacion de la invencion, el procedimiento de la invencion puede realizarse ventajosamente realizarse de manera simultanea en una pluralidad de compartimentos.

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En este caso, para poner en movimiento las particulas en dichos compartimentos, de manera ventajosa puede utilizarse una pluralidad de campos magneticos, por ejemplo, imanes. Los imanes pueden estar, por ejemplo, fijos sobre un soporte de tal manera que se permita una yuxtaposicion de cada compartimento en el que se realiza el procedimiento de la invencion con un iman de soporte. La aplicacion de campo magnetico sobre dichos compartimentos es independiente de un compartimento a otro. El campo magnetico aplicado a dichos compartimentos puede ser identico o diferente de un compartimento a otro, preferentemente identico.

De acuerdo con la invencion, el campo magnetico, electromagnetico, electrico puede aplicarse, por ejemplo, durante un tiempo de 1 segundo a 15 minutos, de 10 segundos a 10 minutos. Naturalmente, a traves de estos conocimientos generales el experto en la materia sabra adaptar el tiempo en funcion de las sustancias ensayadas y/o de la fuerza del campo aplicado.

En la presente invencion, por compartimento se entiende, por ejemplo, un reactor de cultivo, cupulas, tubos o pocillos, por ejemplo, de placas de microdilucion. Por placa de microdilucion se entiende el tipo de placa definido, por ejemplo, por la American National Standards Institute y la Society for Biomolecular Sciences (“microplacas”) que tiene 96, 384 e incluso 1536 pocillos.

El material que constituye dicho compartimento puede ser cualquier material adecuado para la realizacion de la presente invencion, por ejemplo, plastico, por ejemplo policarbonato, poliestireno, etc., cristal, metal, etc. Ventajosamente, pueden utilizarse placas de microdilucion de poliestireno que presentan cupulas sin fondo. El fondo de las cupulas se obtiene fijando una superficie plana bajo la placa de microdilucion. Esta superficie plana puede ser de material transparente, por ejemplo, plastico, vidrio, etc. o de material opaco, por ejemplo, metal, ceramica, etc. El modo de fijacion de la superficie plana bajo la placa de microdilucion puede ser cualquier modo apropiado conocido por el experto en la materia para una fijacion de este tipo, por ejemplo, por adhesion mediante un adhesivo, por un metodo de friccion, por adhesion mediante fusion del material de plastico, por ejemplo, con laser, etc.

De acuerdo con la invencion, los diferentes compartimentos pueden reagruparse sobre un mismo soporte, por ejemplo, sobre una placa que comprende de 1 a 1536 pocillos, por ejemplo 6, 16, 64, 96, etc.

El compartimento puede corresponder, por ejemplo, a un recinto con un extremo cerrado, de tipo tubo, pocillo, etc. o a un recinto que presente dos aberturas.

De acuerdo con una primera configuracion, el compartimento puede presentar un extremo cerrado para formar un fondo plano.

De acuerdo con una segunda configuracion, el compartimento puede presentar un extremo cerrado para formar un fondo hemisferico.

De acuerdo con la invencion, la determinacion de la interaccion entre dichas sustancias puede efectuarse directamente despues de la aplicacion del campo magnetico, electromagnetico, electrico. Por ejemplo la determinacion puede efectuarse de 0,01 segundos a 30 minutos, de 1 segundo a 3 minutos, despues de la aplicacion del campo.

De acuerdo con la invencion, la determinacion de la interaccion entre dichas sustancias tambien puede realizarse comparando el reagrupamiento de las particulas durante la aplicacion del campo magnetico, electromagnetico, electrico. Por ejemplo, es posible comparar el reagrupamiento de las particulas en una solucion que no contenga ninguna, o que solo contenga una, de dichas sustancias previamente citadas, con el reagrupamiento de las particulas en una solucion que comprenda dicha primera y dicha segunda sustancia. Si el reagrupamiento es mas significativo o si es menos significativo en la solucion que no comprende ninguna o una sola de dichas sustancias, entonces dichas sustancias interaccionan y de este modo se determina esta interaccion. En otras palabras, la interaccion entre las sustancias puede disminuir o aumentar el reagrupamiento de las particulas durante la aplicacion de dicho campo y de este modo puede determinarse. Por ejemplo, si la interaccion provoca una

agregacion de sustancias, el medio puede volverse menos viscoso y el reagrupamiento de las particulas aumentara.

Por ejemplo si la interaccion provoca una precipitacion de sustancias, la superficie puede estar, por ejemplo, saturada por el precipitado y el reagrupamiento de las particulas disminuira. Por ejemplo, si la interaccion provoca una reticulacion de las sustancias entre si, la red de sustancias va a ralentizar a las particulas y el reagrupamiento de las particulas disminuira. Por ejemplo, si la interaccion provoca la formacion de cadenas lineales de sustancias, entonces la viscosidad del medio aumentara y el reagrupamiento de las particulas disminuira.

De acuerdo con la invencion, el procedimiento puede realizarse, por ejemplo, en una pluralidad de compartimentos comprendiendo cada uno de ellos:

- dicha solucion,

- dicha al menos una particula, y

- dichas sustancias que pueden interaccionar entre si.

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De acuerdo con la invencion, el procedimiento puede comprender adicionalmente una etapa b’ de mezcla. La mezcla puede realizarse, por ejemplo, por agitacion de la solucion en la que estan presentes dichas sustancias. Puede tratarse, por ejemplo, de una mezcla con un agitador magnetico, de una mezcla con un agitador orbital. De acuerdo con la invencion, la mezcla puede realizarse, por ejemplo, durante 1 segundo a 15 minutos, de 10 segundos a 10 minutos.

La presente invencion tambien tiene por objeto la utilizacion del procedimiento de la invencion para, por ejemplo, la identificacion de sustancias presentes en una solucion, el analisis de muestras biologicas, la realizacion de ensayos biologicos, la realizacion de la tipificacion sanguinea, la realizacion de ensayos inmunohematologicos, la realizacion de la deteccion de contaminaciones naturales o de origen humano, por ejemplo, por virus, bacterias, amebas, levaduras, por celulas cancerosas, priones, pesticidas, fungicidas, antibioticos, hormonas y toxinas. La presente invencion tambien tiene por objeto la utilizacion del procedimiento de la invencion para, por ejemplo, la realizacion de ensayos de estimulacion, la realizacion de estudios cientificos sobre sustancias, por ejemplo, para estudiar el efecto de la solucion sobre la interaccion entre sustancias, por ejemplo, en soluciones acuosas, en soluciones organicas, en gases, por ejemplo, con moleculas, coloides, nanoparticulas, microparticulas. La presente invencion tambien tiene por objeto la utilizacion del procedimiento de la invencion para, por ejemplo, la realizacion de estudios cientificos sobre sujetos o sustancias que estan implicadas, por ejemplo, en biologia, en cancerologia, en endocrinologia, en infectologia, por ejemplo, para el estudio de hidrogeles formados en soluciones acuosas, aerogeles formados en gases, geles formados en disolventes o en hidrocarburos.

Por ejemplo, el procedimiento de la invencion puede utilizarse para el analisis de muestras biologicas, por ejemplo, para la serotipificacion sanguinea, la determinacion del CMH de un individuo, la determinacion de la presencia, por ejemplo, de una proteina, de un anticuerpo, de un receptor particular, en una muestra. El procedimiento de la invencion tambien puede utilizarse para la identificacion de sustancias quimicas en una solucion.

Por ejemplo, cuando el procedimiento de la invencion se utiliza para la serotipificacion, la solucion es una muestra de sangre que proviene de un individuo, por ejemplo, de un ser humano o de un animal, que comprende la primera sustancia.

Adicionalmente, el procedimiento de la invencion puede utilizarse para la determinacion de la interaccion entre un receptor y un ligando eventual, entre un anticuerpo y una proteina, una molecula quimica, un anticuerpo distinto y/o cualquier molecula que pueda reconocer un anticuerpo. El procedimiento de la invencion tambien puede utilizarse para detectar la interaccion entre celulas, por ejemplo, entre celulas eucariotas, celulas procariotas, entre celulas eucariotas y procariotas. El procedimiento de la invencion tambien puede utilizarse para detectar independientemente la interaccion entre bacterias, virus, levaduras y/o celulas eucariotas.

El procedimiento de la invencion tambien puede utilizarse, por ejemplo, para detectar fenomenos de quimiotaxis, fenomenos de adhesion celular.

El procedimiento de la invencion tambien puede utilizarse, por ejemplo, para detectar la interaccion entre nanoparticulas, entre microparticulas, entre objetos de forma compleja de tamano microscopico y nanoscopico.

El procedimiento de la invencion tambien puede utilizarse, por ejemplo, para detectar la interaccion (i) de una primera sustancia, por ejemplo, anticuerpos producidos por un ser humano o por un animal en respuesta a una infeccion, por ejemplo, por un virus, por una bacteria, por un prion, por un parasito, por un protozoo, pero tambien en respuesta a una enfermedad, por ejemplo, un cancer, una enfermedad autoinmunitaria, como por ejemplo, la enfermedad de Basedow, la esclerosis en placas, pero tambien en respuesta a una intoxicacion, a un envenenamiento, a una contaminacion, a un estimulo, a una ingestion, a una inhalacion y a una inyeccion, por ejemplo, por un pesticida, un veneno, un insecticida, un herbicida, un agente alergizante, pero tambien en respuesta a un injerto, por ejemplo, de medula osea, de organos, como por ejemplo, un rinon, un pulmon, un higado, un miembro, como por ejemplo, una mano, una pierna, un pie, pero tambien en respuesta a un implante de organo artificial, una camara implantable, un marcapasos, un corazon artificial, una cadera artificial, y (ii) de una segunda sustancia, por ejemplo, una sustancia que puede de haber provocado la produccion de dicha primera sustancia, por ejemplo, un antigeno responsable de la produccion de dichos anticuerpos previamente citados.

De acuerdo con la invencion, la solucion puede comprender la segunda sustancia que puede haber provocado la produccion de dicha primera sustancia a detectar.

Ventajosamente, la segunda sustancia puede fijarse a la superficie del envase, permitiendo ventajosamente la fijacion de dicha segunda sustancia, detectar una interaccion entre dichas primera y segunda sustancia, cualquiera que sea su concentracion, por ejemplo, entre anticuerpos y antigenos, incluso cuando estos estan presentes en pequenas cantidades.

De acuerdo con la invencion, el procedimiento de la invencion puede comprender adicionalmente la utilizacion (iii) de una tercera sustancia.

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Puede tratarse, por ejemplo, de una sustancia tal como se ha definido anteriormente, por ejemplo, anticuerpos que pueden reconocer a al menos una de dichas primera y/o segunda sustancia. Puede tratarse, por ejemplo, de anticuerpos idiotipicos, por ejemplo, anticuerpos que reconocen especificamente anticuerpos producidos por un ser humano o un animal, por ejemplo anticuerpos anti conejo, anticuerpos anti cabra, anticuerpos anti IgG, o anti IgM o anti IgA o anti IgE.

De acuerdo con la invencion, la tercera sustancia puede fijarse previamente a la superficie del envase permitiendo, por ejemplo, la deteccion de la interaccion de dicha tercera sustancia con dicha primera y/o segunda sustancia.

Ventajosamente, de acuerdo con la invencion la tercera sustancia es un anticuerpo idiotipico, es decir un anticuerpo anti anticuerpo que puede interaccionar, por ejemplo, con un anticuerpo producido por un ser humano o un animal en respuesta a un antigeno y/o un antigeno que reside o que ha residido en un ser humano o en un animal como se ha indicado anteriormente.

Por tanto, ventajosamente, la presente invencion permite detectar, indirectamente, una sustancia, por ejemplo, una sustancia que reside o que ha residido en un ser humano o en un animal, sin tener que necesitar desarrollar un anticuerpo que interaccione especificamente con esta sustancia.

Por tanto, ventajosamente, la presente invencion permite detectar, directa o indirectamente, la presencia de anticuerpos producidos en respuesta a una infeccion, una enfermedad, una intoxicacion, un envenenamiento, una contaminacion, un estimulo, una ingestion, un pesticida, un injerto. Adicionalmente, la presente invencion permite por tanto detectar infecciones silenciosas, es decir, por ejemplo, infecciones no detectables por los medios microbiologicos habituales, por ejemplo, hemocultivos, cultivos de biopsias, liquidos fisiologicos extraidos que banan o irrigan el supuesto sitio de infeccion, por ejemplo, liquido cefalorraquideo, orina, saliva, detectando, por ejemplo utilizando anticuerpos idiotipicos que interaccionan con anticuerpos dirigidos especificamente contra esas infecciones.

A partir de la lectura de los siguientes ejemplos, ilustrados por las figuras adjuntas y que se ofrecen a modo ilustrativo, podran aparecer incluso otras ventajas para el experto en la materia.

Breve descripcion de las figuras

- La figura 1 representa fotografias de manchas obtenidas con, como sustancia de afinidad, anticuerpos que presentan (swH) o que no presentan (swE) afinidad entre ellos. La fotografia 1A se ha tomado despues de 20 segundos de imantacion, la fotografia 1B despues de 5 minutos de imantacion.

- La figura 2 representa fotografias de manchas obtenidas con, como sustancia de afinidad, anticuerpos anti determinante de grupo sanguineo y de hematies.

- La figura 3 representa imagenes de manchas obtenidas con, como sustancia de afinidad, anticuerpos anti determinante de grupo sanguineo y de hematies.

Ejemplos

Ejemplo 1: Deteccion de la interaccion de anticuerpos que presentan o que no presentan afinidad entre si.

En este ejemplo, se utilizaron dos tiras de 8 pocillos de fondo plano (Referencia: MSW002B, BioFilm Control, Francia), indicadas, respectivamente, como swH, swE. En cada pocillo de cada una de las tiras, se depositaron 70 pl de solucion de anticuerpos, obtenida mezclando, respectivamente, o bien 15 pl de anticuerpos anti IgG humanos (Referencia BI2018, Paris Anticorps, Francia), o bien anticuerpos anti E.coli (Referencia BP2298, Acris Antibodies, Alemania), en 1,5 ml de tampon PBS (NaCl 8 g/l (Sigma Aldrich, USA), KCI 200 mg/l (Sigma Aldrich, USA)), Na2HPO4 1,44 g/l (Sigma Aldrich, USA), KH2PO4 240 mg/l (Sigma Aldrich, USA)) antes de colocarlas durante 16 horas en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C.

Se prepararon soluciones indicadas, respectivamente, como Slg0, SlgH y SlgE, que contenian 200 pl de reactivo de busqueda de anticuerpos humanos antieritrocitarios anti-FY1 (IJB-IH Control 3, referencia 108030357, Instituto Jacques Boy, Francia), 2 pl de microesferas paramagneticas (Ton004N, BiofilmControl, Francia) y respectivamente o bien 15 pl de agua para preparacion de inyectables, o bien 200 pl de anticuerpos anti IgG humanos (Referencia BI2018, Paris Anticorps, Francia), o 200 pl de anticuerpos anti E.coli (Referencia BP2298, Acris Antibodies GmbH, Alemania).

A continuacion, las soluciones de anticuerpos se retiraron de las tiras swH y swE, despues se depositaron 150 pl de tampon PBS y se retiraron por tres veces en cada pocillo.

En los pocillos D, E y F, de las tiras swH y swE, se depositaron 100 pl de Slg0, SlgH y SlgE, respectivamente. Despues, las tiras se colocaron durante 20 minutos en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C, y despues se colocaron sobre un bloque de ensayo imantando (BKT-MSW002 BioFilm

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Control, Francia) durante 20 segundos. A continuacion las tiras se colocaron sobre un escaner de documentos (perfection V-750 PRO, Epson, USA) con el cual se efectuo una primera toma de imagenes con el programa informatico EpsonScan (Epson, USA). El ciclo de imantacion/toma de imagenes se reprodujo una segunda vez para disponer tambien de una segunda imagen despues de un total de 5 minutos de imantacion. Las imagenes finales se obtuvieron restando el componente verde de las imagenes del componente rojo de las imagenes, colores obtenidos con el escaner utilizando el programa informatico ImageJ (
http://rsb.info.nih.gov.ij) y un recorte de imagenes obtenidas con diferentes ajustes de contraste. Las fotografias correspondientes corresponden a las imagenes de la figura 1.

Se obtuvieron dos anillos de diferentes diametros, que correspondian a la acumulacion de esferas en el fondo de los pocillos durante su migracion en el campo magnetico. El diametro del anillo se considera como una medida de acuerdo con una ley decreciente de la movilidad magnetica de las esferas.

Como se esperaba, el diametro del anillo observado en presencia de la reaccion de afinidad esperada entre las inmunoglobulinas presentes en el reactivo de busqueda de anticuerpo antieritrocitarios y los anticuerpos anti-Ig humanos (tira swH pocillos E) es mas significativo que en ausencia de reaccion de actividad entre las inmunoglobulinas presentes en el reactivo de busqueda de anticuerpos antieritrocitarios y los anticuerpos anti-£. coli (tira swH pocillos D y F) despues de 20 segundos de magnetizacion, y en los pocillos E, despues de 5 minutos de magnetizacion (tiras swH y swE pocillos E).

Como se observa en la figura 1, pocillos E, este efecto se amplifica cuando las dos sustancias de afinidad estan presentes simultaneamente en solucion y adsorbidas en los pocillos, lo que reduce fuertemente la migracion de las esferas (tira swH pocillos E) con respecto a la situacion, representada en la figura 1, tira swH pocillos D, donde solo una de las sustancias se presenta adsorbida sobre la superficie.

Ademas, cuando las dos sustancias de afinidad, es decir, los anticuerpos, estan presentes en solucion, si una de las sustancias ya esta adsorbida sobre la superficie, el fenomeno de reduccion de la movilidad de las esferas se amplifica mas (pocillos E, tira swH con respecto a sWE).

Finalmente, cuando la sustancia de afinidad no esta adsorbida sobre la superficie, la realizacion de la reaccion de afinidad en la solucion es detectable observando el diametro del anillo formado (tira SwE, pocillos E, con respecto a los pocillos D y F).

Ejemplo 2: deteccion de la interaccion entre anticuerpos anti determinante de tipo de grupo sanguineo y de hematies.

En este ejemplo, se utilizaron tres tiras de 8 pocillos con formato SBS de fondo plano (Referencia: MSW002B, BioFilm Control, Francia), indicadas, respectivamente, como swA, swB y swAB. En cada uno de los pocillos de las tiras se depositaron 70 pl de solucion de anticuerpo, respectivamente, anti A (Referencia 102010153, Institut Jacques Boy, Francia), anti B (102010253, Institut Jacques Boy, Francia) y anti AB (Referencia 102010353, Institut Jacques Boy, Francia).

Las tiras se colocaron en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C durante 10 minutos.

Se prepararon suspensiones sanguineas indicadas, respectivamente, como hA, hB, hAB y h0, diluyendo 1 ml de tampon TS compuesto por NaCl 8 g/l (Sigma-Aldrich, USA) y triptona 1 g/l (Difco, USA), con, respectivamente, 100 pl de hematies de tipo A, B, AB y 0 (IJB-IH Control 2, Referencia 108020257, Instituto Jacques Boy, Francia), respectivamente y 6 pl de microesferas paramagneticas (Ton005N, BiofilmControl, Francia) y 1 pl de colorante alimentario azul (Vahine, Francia).

Las soluciones de anticuerpos se retiraron de los pocillos antes de depositar 70 pl de preparacion respectivamente, hA, hB, hC y h0, en los pocillos respectivamente A y B, pocillos C y D, pocillos E y F, pocillos G y H de las tiras swA, swB y swAB.

Las tiras se colocaron en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C durante 10 minutos despues, y despues se colocaron sobre el bloque de ensayo imantado (BKT-MSW002 BioFilm Control, Francia) durante 1 minuto. A continuacion se colocaron sobre un escaner de documentos (perfection V-750 PRO, Epson, USA) con el que se efectuo una toma de imagenes con el programa informatico EpsonScan (Epson, USA). La imagen final se obtuvo como en el ejemplo 1 en la figura 2.

Como se muestra en la figura 2, en los pocillos C, D, G y H de la tira SwA, en los pocillos A, B, G y H de la tira SwB y en los pocillos G y H de la tira SwAB, se observo la formacion de un disco oscuro de un diametro de aproximadamente 2 mm +/- 1 mm que se atribuyo a una ausencia de reaccion de afinidad entre los anticuerpos unidos a los pocillos y los hematies. En los otros pocillos, no se observo ninguna forma oscura, demostrando una reaccion de afinidad entre los anticuerpos unidos a los pocillos y los hematies. En la tabla 1 siguiente se resumen las

5

10

15

20

25

30

35

40

observaciones, en la que la ausencia de disco se indica como - y la presencia de disco se indica como +:

Tabla 1: observacion de ^ pocillos de la figure 2

A (hA) B (hA) C (hB) D (hB) E (hAB) F (hAB) G (h0) H (h0)

SwA (anti A)

- - + + - - + +

SwB (anti B)

+ + - - - - + +

SwAB (anti AB)

- - - - - - + +

Tipificacion deducida

A A B B AB AB 0 0

Como se demuestra en este ejemplo, los resultados obtenidos muestran por tanto claramente la deteccion de la afinidad de anticuerpos con los hematies correspondientes. Por otro lado, este ejemplo demuestra claramente que el procedimiento de la invencion permite determinar el serotipo de una muestra de sangre.

Ejemplo 3: deteccion de la interaccion entre anticuerpos anti-determinante de anticuerpos antieritrocitarios.

En este ejemplo se utilizaron dos tiras de 8 pocillos de fondo plano (Referencia: MSW002B, BioFilm Control, Francia), indicadas como swD y swK. En cada uno de los pocillos de las tiras, se depositaron 50 pl de una solucion obtenida mezclando 15 pl de anticuerpos anti IgG humanos (Referencia BI2018, Paris Anticorps, Francia) en 1,5 ml de tampon TS (NaCl 8 g/l (Sigma Aldrich, USA), Triptona 1 g/l (Difco, USA)). A continuacion, las tiras se incubaron durante 16 horas en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C.

Se prepararon soluciones, respectivamente indicadas como Sp y St, que comprendian 150 pl de tampon, respectivamente PBS y TS, y 0,75 pl de Ton005N. Estas soluciones correspondian a soluciones control sin hematies.

Igualmente, se prepararon suspensiones, respectivamente indicadas como Si, Sii y Siii, que comprendian 150 pl de una suspension de hematies de tipo I, II y III (Referencia ID-DiaCell I-II-III, Diamed, Francia) y 0,75 pl de microesferas paramagneticas (Ton005N, BiofilmControl, Francia).

El proveedor verifico los antigenos presentes en la superficie de los hematies y se distribuyeron de acuerdo con la siguiente tabla 2:

Tabla 2:

Suspensiones

Hematies Duffy KEL

Si

Hematies tipo I + 0

Sii

Hematies tipo II + 0

Siii

Hematies tipo III 0 +

+: presencia del antigeno, 0: ausencia del antigeno

Igualmente, se prepararon suspensiones, respectivamente indicadas como SDi y SKi, SDii y SKii asi como SDiii y SKiii, que comprendian 100 pl de una suspension de hematies de tipo I, II y III respectivamente (Referencia, ID- DiaCell I-II-III, Diamed, Francia), 50 pl de suero, respectivamente anti FY1 (o anti Duffy) y anti KEL1 (IJB-IH Control 3, referencia 108030357, Instituto Jacques Boy, Francia) y 0,75 pl de microesferas paramagneticas (Ton005N, BiofilmControl, Francia) (ver tabla 3). Estas suspensiones son controles negativos que comprenden hematies cuyos sitios de afinidad estan bloqueados por los anticuerpos contenidos en los sueros, de manera que los complejos hematies-anticuerpos no presentan mas sitios de afinidades libres que puedan unirse a los anticuerpos fijos en el fondo de los pocillos.

Tabla 3:

Hematies Suero

SDi

I (D) Anti FY1 (anti D)

SKi

I (D) Anti KEL1 (anti K)

SDii

II (D) Anti FY1 (anti D)

SKii

II (D) Anti KEL1 (anti K)

SDiii

III (K) Anti FY1 (anti D)

SKiii

III (K) Anti KEL1 (anti K)

La solucion de anticuerpos anti IgG humanos se retiro despues de las tiras swD y swK y se depositaron 150 pl de tampon TS y se retiraron por dos veces. En cada pocillo de las tiras swD y swK se depositaron, respectivamente,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

50 pl de reactivos de busqueda de anticuerpos antieritrocitarios, respectivamente anti-FY1 (o anti Duffy) y antiKELI (IJB_IH Control 3, referencia 108030357, Instituto Jacques Boy, Francia). Despues, las tiras se colocaron durante 10 minutos en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C.

Las soluciones de reactivos de busqueda de anticuerpos antieritrocitarios se retiraron despues de las tiras swD y swK y se depositaron 150 pl de tampon TS y se retiraron por dos veces.

Se depositaron 70 pl de suspensiones distintas como se indica a continuacion en la tabla 4:

Tabla 4: Distribucion del deposito de suspensiones distintas

A B C D E F G H

swD

Si Sii Siii Sp St SDi SDii SDiii

swK

Si Sii Siii Sp St SKi SKii SKiii

Despues, las tiras se colocaron durante 20 minutos en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C, y despues se colocaron sobre el bloque de ensayo imantado (BKT-MSW002 BioFilm Control, Francia) durante 30 segundos. A continuacion las tiras se colocaron en un escaner de documentos (perfection V-750 PRO, Epson, USA), con el cual se efectuo una toma de imagenes con el programa informatico EpsonScan (Epson, USA). Estas imagenes sirvieron para analizar la tira swK. El ciclo de imantacion/toma de imagenes se reprodujo una segunda vez para disponer tambien de una imagen despues de un total de un minuto de imantacion que sirve para analizar la tira swD. Las imagenes finales se obtuvieron como en el ejemplo 1 y se representan en la figura 3.

La figura 3 muestra que un anillo perfectamente definido es visible en los pocillos de control D y E, lo que demuestra una movilidad significativa de las esferas paramagneticas, obteniendose un anillo similar en los pocillos F, G y H, lo que demuestra una movilidad significativa y conservada en presencia de hematies donde los sitios de afinidades estan bloqueados por los anticuerpos contenidos en los sueros.

En los pocillos A, B y C se puede verificar la presencia;

- de un anillo comparable al de los pocillos F, G y H, lo que demuestra una movilidad significativa atribuida a una ausencia de union de afinidad entre los hematies y los anticuerpos unidos al fondo de los pocillos,

- o bien de una mancha difusa lo que demuestra una movilidad reducida de las esferas paramagneticas atribuida a una reaccion de afinidad entre los anticuerpos unidos a los pocillos y a los hematies.

Los anillos y las manchas son visibles de acuerdo con la tabla 5 siguiente:

Tabla 5: imagenes obtenidas

A B C D E F G H

swD

mancha mancha anillo anillo anillo anillo anillo anillo

swK

anillo anillo mancha anillo anillo anillo anillo anillo

El procedimiento de la invencion permite por tanto detectar la interaccion molecular entre dos sustancias.

Ejemplo 4: deteccion de la interaccion entre anticuerpos antibacterianos presentes en un suero y sustancias obtenidas de cultivos bacterianos

En este ejemplo, se utilizaron dos tiras de 8 pocillos de fondo plano (Referencia: MSW002B, BioFilm Control, Francia), indicadas, respectivamente, como swH, swE. En cada pocillo de cada una de las tiras se depositaron 70 pl de solucion de anticuerpos obtenida mezclando 15 pl de anticuerpos anti IgG humanos (Referencia BI2018, Paris Anticorps, Francia) y anticuerpos anti E.coli (Referencia BP2298, Acris Antibodies, Alemania), respectivamente, en 1,5 ml de tampon PBS (NaCl 8 g/l (Sigma Aldrich, USA), KCI 200 mg/l (Sigma Aldrich, USA)), Na2HPO4 1,44 g/l (Sigma Aldrich, USA), KH2PO4 240 mg/l (Sigma Aldrich, USA)) antes de colocarlas durante 16 horas en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C (vease la tabla 6).

Tabla 6:

A B C D E F G H

swD

Anti humano Anti humano Anti humano Anti humano Anti humano Anti humano Anti humano Anti humano

swK

anti anti anti anti anti anti anti anti

E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli E. coli

5

10

15

20

25

30

35

A continuacion, la solucion de IgG se retiro de las tiras swH y swE y se depositaron 150 pi de tampon TS y retiro por dos veces. En cada pocillo, respectivamente, A, B, C, D y E, F, G, H, de las tiras swH y swE, se depositaron 150 pi de suero humano que provenia, respectivamente, de pacientes que padecian una infeccion estafilococica (suero Estaf +) y de controles que no padecian dicha infeccion (suero Estaf -) (ver tabla 7). A continuacion, las tiras se colocaron durante 10 minutos en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C.

Tabla 7:

A B C D E F G H

Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero A Suero

Estaf + / Estaf + / Estaf + / Estaf + / Estaf - / Estaf - / Estaf - / Estaf - /

swH

Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti Anti

humano humano humano humano humano humano humano humano

Suero a Suero Suero Suero Suero Suero Suero Suero

swE

Estaf + / Estaf + / Estaf + / Estaf + / Estaf - / Estaf - / Estaf - / Estaf - /

anti E. coli anti E. coli anti E. coli anti E. coli anti E. coli anti E. coli anti E. coli anti E. coli

En los pocillos de las tiras se depositaron 50 pl de reactivo de deteccion de infeccion estafilococica, que comprendia sustancias obtenidas de cultivos de estafilococos y microesferas paramagneticas (Referencia: RDS-01 R, BioFilm Control, Francia).

A continuacion las tiras se colocaron durante 20 minutos en una estufa termostatica (Referencia BC240, Firelabo, Francia) estabilizada a 37 °C, y despues se colocaron sobre el bloque de ensayo imantado (BKT-MSW002 BioFilm Control, Francia) durante 10 segundos. A continuacion las tiras se colocaron en un escaner de documentos (perfection V-750, Epson, USA) con el que se efectuo una toma de imagenes con el programa informatico EpsonScan (Epson, USA). El ciclo de imantacion/toma de imagenes se reprodujo una segunda vez para disponer igualmente de una imagen despues de un total de 5 minutos de imantacion. Las imagenes finales se obtuvieron como en el ejemplo 1.

El diametro del anillo observado en presencia de la reaccion de afinidad esperada entre las inmunoglobulinas presentes en el suero de pacientes infectados y las sustancias contenidas en el reactivo de deteccion de infeccion estafilococica (pocillos A, B, C y D) es mas significativo que en ausencia de reaccion de afinidad en el suero de pacientes no infectados (pocillos E, F, G y H).

Listado de referencias

1. US 3 635 678 CLOT-TIMING SYSTEM AND METHOD, Seitz, L.J. and Bowen, J.G.;

2. WO 01/86255, METHOD AND APPARATUS FOR DETERMINING LOCAL VISCOELASTICITY, Cronin-Golomb, M. Shabtai, Y. Nemet, B.;

3. EP1544596, Methode et appareil de determination de la viscosite, Kurowski D.; Schoen C.; Peters R.; Bartos H.; Yu Y.;

4. Catterall WA. (2000) Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 16: 521 - 55

5. Gerald Karp, Biologie cellulaire et moleculaire, Concepts et experiences, 2s edicion 2004

6. Dick GM y Tune JD, Role of potassium channels in coronary vasodilation, Exp Biol Med (Maywood). Ene 2010; 235(1): 10-22

7. Mostallino MC et al. Plasticity and function of extrasynaptic GABA(A) receptors during pregnancy and after delivery, Psychoneuroendocrinology. Dic 2009; 34 Sup. 1: S74-83

Claims (14)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento de deteccion de interacciones en una solucion que comprende las siguientes etapas:

   a. introducir en una solucion al menos una primera sustancia y al menos una segunda sustancia que puede interaccionar con dicha primera sustancia,

   b. introducir en la solucion obtenida en la etapa a) de 2 a 10.000.000 particulas magneticas o magnetizables, reposando dichas particulas en una superficie sumergida en dicha solucion, teniendo dichas particulas un tamano comprendido entre 10 nm a 100 pm,

   c. determinar la interaccion de dichas sustancias por aplicacion de un campo electrico, magnetico o electromagnetico disenado para poner en movimiento dichas particulas, detectandose la interaccion entre dichas sustancias cuando la movilidad de dichas particulas sobre dicha superficie se modifica.
2. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que dichas particulas magneticas o magnetizables son, independientemente, una particula cargada electricamente, magnetica o magnetizable o recubierta con al menos una capa magnetica o magnetizable.
3. 3. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dichas particulas se someten a un campo electromagnetico aplicado por impulso.
4. 4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la modificacion de la movilidad es una aceleracion del movimiento de las particulas bajo el efecto de dicho campo electrico, magnetico o electromagnetico.
5. 5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la modificacion de la movilidad es una ralentizacion del movimiento de las particulas bajo el efecto de dicho campo electrico, magnetico o electromagnetico.
6. 6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la modificacion de la movilidad es una modificacion de la trayectoria de las particulas bajo el efecto de dicho campo electrico, magnetico o electromagnetico.
7. 7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la interaccion se detecta por el reagrupamiento de las particulas bajo el efecto de dicho campo electrico, magnetico o electromagnetico.
8. 8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la interaccion se detecta por el no reagrupamiento de las particulas bajo el efecto de dicho campo electrico, magnetico o electromagnetico.
9. 9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la interaccion se detecta por la dispersion de las particulas bajo el efecto de dicho campo electrico, magnetico o electromagnetico.
10. 10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas al menos dos particulas se iluminan mediante una fuente luminosa para detectar su movimiento.
11. 11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dichas al menos dos particulas son generadoras de una senal.
12. 12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la primera sustancia seleccionada del grupo que comprende celulas eucariotas, celulas procariotas, membranas, virus, proteinas, anticuerpos, antigenos, moleculas quimicas.
13. 13. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que segunda sustancia se selecciona del grupo que comprende celulas eucariotas, celulas procariotas, membranas, virus, proteinas, anticuerpos, antigenos, moleculas quimicas.
14. 14. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende, en lugar de la etapa a)

    una etapa previa a’) de fijacion de dicha primera sustancia sobre una superficie de un envase, a’’) la introduccion de una solucion en dicho envase, y

    a’’’) la introduccion de al menos una segunda sustancia que puede interaccionar con dicha primera sustancia.