CN103069264A - 检测分子相互作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于检测溶液中的分子相互作用的方法。具体地，本发明涉及一种用于检测可能彼此相互作用的两种物质间的相互作用的方法。本发明可以特别用于科学研究领域和医学分析领域中。

Description

检测分子相互作用的方法
技术领域
本发明涉及一种用于检测分子相互作用的方法。具体地，本发明涉及一种用于检测可以彼此相互作用的至少两种物质间的分子相互作用的方法。
本发明特别地可应用于科学研究领域，医学领域，特别是生物样品的分析。
在下面的描述中，括号中的参考文献(references)(参考文献(Ref.))指在文章末尾呈现的参考文献的列表。
现有技术
在医学领域和分析领域，存在检测如抗体、细胞、细菌、病毒和大分子的分子和/或对象间相互作用的事件是有用的，甚至是必须的很多情况。例如，为检测细菌污染，通常使用抗原/抗体测试。
为确定个体的血型，通常使用抗体和个体红细胞间的亲和力测试，因此使所述个体的血型得以确定。
在现有技术中，存在待检测的物质大量存在时可以进行检测的“简单的”方法。例如，这可以是包括待检测物质与亲和物质的混合物的方法，亲和物质即可以与待检测物质发生相互作用的物质。该相互作用导致揭示结果的肉眼可见的沉淀或聚集体的形成。用这种方法，例如，通过添加抗体至一滴血中并观察红细胞聚集体是否形成来鉴定血型是可能的。
还存在允许测量亲和物质在介质中共同存在时所发生的该介质粘度变化的方法。
例如，文件US 3,635,678(参考文献1)描述了一种方法，其中浸没在液体中的单个肉眼可见的(比微米大很多)钢球靠一组磁铁被悬浮，通过光学系统测量悬浮的球的移动。当介质的粘度增加时，球移动的幅度随时间降低；目的是推断血液凝固速度。
在这个文件中所描述的技术的一个主要缺点是它执行的复杂性，因为球必须被保持悬浮。而且，由于在所述专利中描述的球的大小和质量，移动中的球可以打破导致粘度变化的弱相互作用并阻碍它们的检测。所述方法不是非常的灵敏，并被限制于检测相对大的粘度变化。而且，必须使用复杂的系统和试剂以读出结果。
在文件WO 01/86255(参考文献2)中描述了另一个系统，其包括一台显微镜，使用该显微镜可以观察悬浮在液体中的颗粒的移动。通过使用显微镜观察液体中悬浮的颗粒得到的信号的二次谐波的相移来推断液体的粘度。
在文件EP 1,544,596(参考文献3)中描述了该方法的另一种变化形式，其包括在磁场中振荡可磁化的颗粒来产生信号并因此获得结果。
这些方法的主要缺点之一是其实施的复杂性和监控由以周期性的和受控制的方式施加的力激活的颗粒的振荡的复杂性。复杂地、昂贵地且困难地配置仪器来一方面启动并维持颗粒的振荡，而另一方面来观察颗粒的周期性移动。
此外，这些方法仅允许测量必须发生在悬浮颗粒的振荡区域内的粘度变化。而且，粘度变化必须是明显的以便被检测到。因此，必须具有包含大量亲和物质的溶液。因此这些方法不是非常灵敏的并且不可能获得关于使用如抗体或进行检测或测定的其他具体指定的亲和物质的方法的令人满意的精确度。
检测亲和反应的另一种普遍使用的方法是ELISA技术及其很多变化形式。它由以下组成：
-附着到基材(substrate)上的第一抗体，其具有对物质的亲和力，
-使待检测的物质与附着于其基材的第一抗体接触给定的时间段，
-冲洗掉没有与抗体反应的物质，
-使与附着于表面的抗体结合的物质和具有对所述物质的亲和力的第二抗体接触，
-冲洗掉没有与所述物质反应的抗体，和
-检测与结合于基材所结合的第一抗体的物质结合的第二抗体的存在。
最通常的，为了检测从适当底物经酶催化的反应产物，第二抗体与通过物理方法可直接检测的标记物结合，该标记物例如荧光标记物或磁性标记物，或第二抗体与结合于酶的标记物结合，该标记物例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
这个方法有若干缺点，例如它要求很多受控制的洗涤，降低了其灵敏度。它还包括由本领域技术人员操作的很多步骤：执行至少两个亲和反应，其要求用至少一个灵敏的和精密的标记物标记第二抗体，且使用难以配置的复杂仪器来检测并量化由标记物发射的信号。因此这个方法是耗时且昂贵的，并要求复杂的仪器来实施该方法。
已开发出仅需要单一抗体的其他方法来检测亲和反应的技术，例如基于表面等离子体共振、压电平衡、或对一些允许观察的物质来说甚至仅通过显微镜观察。为了实施这样的方法，所述抗体被附着于适于检测方法的基材，使物质与附着于基材的抗体接触给定的时间，然后直接读数或在冲洗以除去与抗体没有亲和反应的物质之后读数。
这些方法有很多缺点；例如，完成读数所需要的仪器是精密的且昂贵的。而且，为了附着所述抗体，它们要求特殊的基材。而且，它们要求大量的步骤并依赖于附着的抗体的数量和质量。
在上文提到的方法中，因此必须将抗体或任何其他亲和物质附着于基材。亲和表面在现有技术中是已知的。可以例如通过“分子建模”获得这样的表面。
还已知可以通过以非特异性的方式将希望检测的物质附着到基材上来实施上文提到的方法。这样附着的物质将与抗体或任何其他合适的亲和物质(根据检测方法，可能被标记)接触，然后在被读数之前可能被冲洗掉。
然而，这些变化形式有很多缺点。具体地，必须要将待检测的物质结合于基材，以普遍的或特殊的方式这都是不可能的。而且，此附着可能会改变所附着物质的结构。此结构变化可以改变检测灵敏度和/或特异性，特别是当使用抗体时。而且附着可以导致获得假阴性和/或假阳性结果。而且，所述附着从一次实施到另一次实施可能是不同的，所以因此而获得的结果可能不是可重复的。而且，需要复杂的且昂贵的设备用于检测。
因此存在找到一种减轻现有技术中的这些缺陷、缺点和障碍的检测分子相互作用的方法的实际需求，特别是一种改进分子相互作用检测的灵敏度并降低实施成本的方法，一种实施简单并且提供快速的、可靠的和可重复的结果的方法。
发明描述
本发明的目的是通过提供检测分子相互作用的方法来响应于上文提到的许多需求和现有技术的缺点。
特别地，本发明涉及在溶液中检测相互作用的方法，其包括以下步骤：
a.将至少一种第一物质和优选地至少一种可以与所述第一物质相互作用的第二物质引入溶液中，
b.将至少两种磁性颗粒或可磁化的颗粒引入步骤a)中获得的溶液中，所述颗粒停留(resting)在浸没于所述溶液内的表面上，
c.通过施加设计成使所述颗粒处于运动中的电场、磁场或电磁场来确定所述物质的相互作用，当所述颗粒在所述表面上的移动性(mobility)发生改变时，检测到所述物质间的所述相互作用。
根据本发明，移动性指通过施加电场、磁场或电磁场和/或在电场、磁场或电磁场的作用下颗粒的移动。此移动性可以如由空间中的给定点处的颗粒速度与空间中的此给定点处的磁场平方的梯度的强度的比定义，如由空间中的给定点处的颗粒速度与空间中的此给定点处的电势梯度的强度的比定义。
根据本发明，移动性改变可以选自所述颗粒的制动、减慢、轨迹的改变、加速或停止。
因此，根据本发明，施加电场、磁场或电磁场可以引起所述颗粒群集(cluster)、不群集或分散。
根据本发明，物质的相互作用指如分子相互作用，诸如氢键、离子键或范德华键相互作用的，生物相互作用，如特异性三维激素受体模式识别或抗体抗原相互作用，静电相互作用，磁性相互作用，离子浓度梯度或分子浓度梯度，即开始于物质并倾向于使它们例如通过氢键、范德华相互作用、疏水键、共价键、离子键，例如通过趋化移动移动汇聚或移动分开的任何势梯度、分子浓度梯度或离子浓度梯度。例如，它可以是抗原-抗体、酶-底物、受体-配体、分子-细胞、细胞-载体、细胞-病毒、真核细胞-原核细胞、真核细胞-真核细胞或原核细胞-原核细胞相互作用。
可以用于本发明的溶液可以是液体或气态溶液。溶液可以是本领域技术人员已知的任何溶液。它可以是，例如，培养基，如真核细胞和/或原核细胞培养基，缓冲液介质，例如本领域技术人员已知的任何缓冲液介质，例如市售的缓冲液介质如磷酸盐缓冲盐水(PBS)，生物样品，例如血、血浆、尿、脑脊髓液的样品，盐水溶液，例如生理溶液，培养基，例如市售的脑心浸液，溶剂，例如丙酮、二甲亚砜、乙醇、甲醇、丙醇、乙腈、乙酸乙酯、醚、苯酚、氯仿、四氢呋喃、二氟乙烯和/或烃，例如己烷、环己烷、苯、辛烷、癸烷、油、汽油或柴油燃料。
根据本发明，气体可以是，例如，空气、氧气、氮气、氖气、氩气、CO2、甲烷或臭氧。
根据本发明，液体溶液可以具有0.1到4kg/l或0.3到3kg/l的密度；气体溶液可以具有10-15kg/m3到1000kg/m3、10-10到30kg/m3或10-5到3kg/m3的密度。
本领域技术人员从此常规知识将容易确定溶液的密度。例如，可以测量溶液的密度，例如，通过测量质量和体积的比，例如通过称重已知体积的溶液。
根据本发明，可以预先处理溶液，例如，可以纯化、稀释或浓缩样品。
根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法纯化溶液，例如透析、过滤、超过滤、澄清和离心。例如，过滤方法可以包括使溶液通过具有0.2到100μm孔的筛子，超过滤方法可以包括，如在1到3000rpm速率下离心0.1到30分钟时间，透析方法可以是，如包括放置溶液于如截留阈值为500Da的透析膜上的步骤的方法，所述透析膜漂浮在容器中包含的蒸馏水上。澄清方法可以是，例如包括添加0.1％(重量/重量)的牛血清白蛋白于溶液中的方法。
根据本发明，纯化溶液可以有益地消除来自于溶液的可能影响分子相互作用的检测的任何污染物和/或分子，例如纯化可以独立地消除细菌、病毒、蛋白质、化学分子、盐、颗粒状物(particulate)或分子聚集体。当然，本领域技术人员，从此常规知识，可以知道如何根据溶液调整纯化方法。
根据本发明，溶液还可以被稀释，例如本领域技术人员已知的任何方法，例如通过连续稀释。可以使用本领域技术人员已知的任何稀释剂稀释溶液。这可以是，例如，缓冲液溶液，例如磷酸盐缓冲盐水，盐水溶液，例如生理盐水，乙醇，DMSO，丙酮，己烷和/或任何烃溶剂或之前描述的溶液。
溶液可以被稀释，例如2到20000、5到500或5到50倍。
稀释溶液可以有益地使存在于溶液中的组分的浓度得以改变，例如，通过减少浓度，例如稀释可以减少蛋白质浓度。稀释还可以减少任何干扰化合物的浓度并因此有益地改进本发明的方法的特异性和/或灵敏性。
根据本发明，溶液还可以被浓缩，例如通过本领域技术人员已知的任何方法，例如通过超速离心、超过滤、蒸发或冻干法。
根据本发明，所述溶液的纯化、稀释和/或浓缩可以有益地使所述溶液的密度得以调节。
调节所述溶液的密度有益地使本发明的方法的特异性和/或灵敏性得以改进，特别地通过增强、减弱或消除将颗粒推向表面的重力的影响。
根据本发明，所述方法中使用的溶液的体积可以是例如0.3μl到100ml、3μl到10ml、或30μl到1ml。
根据本发明，溶液可以能够调节所述第一物质和所述第二物质间的相互作用。例如溶液可能增强或减弱所述物质间的相互作用。
根据本发明，溶液可有益地包括增强或减弱所述第一物质和第二物质间的相互作用的化合物。可以将化合物添加入溶液，例如在实施本发明的方法之前。所述化合物可以是，例如，化学分子、盐、离子、大分子聚合物、胶体、微粒(microparticle)，例如改变溶液pH的酸和碱，例如NaCl，其改变溶液的离子强度，例如聚乙二醇，其可以例如，增强所述物质的亲和力。
本发明有益地允许，通过对本发明的方法获得的结果的比较确定所述溶液是否有效地调节相互作用，其中物质是相同的而溶液是不同的。
根据本发明，第一物质可以选自包括下述的组：真核细胞、原核细胞、膜、病毒、朊病毒、线粒体、叶绿体、小囊泡、脂质体、细胞成分、鞭毛、蛋白质、脂蛋白、糖蛋白、抗体、核酸、脂质复合物、胶体、大分子、微粒、纳米颗粒(nanoparticle)、抗原、激素、蛋白质配体和化学分子。
根据本发明，可以用于本发明的真核细胞可以是，例如，动物真核细胞，例如血细胞，例如白细胞，例如粒细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞，红细胞或血小板。它们还可以是植物真核细胞，例如植物表皮细胞，木质部、韧皮部、薄壁组织、厚角组织或厚壁组织。它们还可以是真菌或酵母。例如，它们可以是假丝酵母(Candida)、隐球酵母(Cryptococcus)、马拉色菌(Malassezia)、糠疹癣菌(Pityrosporum)、肺囊虫(Pneumocystis)、表皮癣菌(Epidermophyton)、小孢子菌(Microsporum)或毛癣菌(Trichophyton)。它们还可以是原生动物，例如溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、卡氏棘阿米巴(Acanthamoeba castellanii)、或福氏耐格里阿米巴(Naegleriafowleri)。
根据本发明，原核细胞可以是，例如，本领域技术人员已知的任何细菌。可以用于本发明的细菌是，例如，包括在但不限于由以下组成的组的细菌：橙黄醋杆菌(Acetobacter aurantius)、伴放线放线杆菌(Actinobacillusacunomycetemcomitans)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、纺锤芽孢杆菌(Bacillusfusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、龈拟杆菌(Bacteroides gingivalis)、产黑素拟杆菌(Bacteroides melaninogenicus)、横塞氏巴尔通氏体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通氏体(Bartonella quintana)、支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、粘膜炎布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)、流产布鲁氏菌(Brucella abortus)、马尔他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、肉芽肿鞘杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacterpylori)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、鹦鹉热嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)、肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭状芽孢杆菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)、破伤风梭状芽孢杆菌(Clostridium tetani)、韦氏梭状芽孢杆菌(Clostridium welchii)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、伯氏考克斯氏体(Coxiella burnetii)、查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、鸡肠球菌(Enterococcus galllinarum)、病臭肠球菌(Enterococcus maloratus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉热巴斯德氏菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德纳氏菌(Gardnerella vaginalis)、杜克雷氏嗜血杆菌(Haemophilusducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus paratnfluenzae)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、鼻硬结克雷伯杆菌-产酸克雷伯杆菌(Klebseilla rhinoscleromatis-klebsiella oxytoca)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、Methanobacterium extroquens、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分支杆菌(Mycobacterium bovis)、白喉分枝杆菌(Mycobacteriumdiphtheriae)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻疯分支杆菌(Mycobacteriumlepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖器支原体(Mycoplasmagenitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、星形诺卡菌(Nocardia asteroides)、出血败血性巴斯德菌(Pasteurella multocida)、土拉巴斯德氏菌(Pasteurella tularensis)、牙龈卟啉菌(Porphyromonas gingivalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、嗜麦芽假单胞菌(Pseudomonas maltophilia)、放射型根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、莫塞尔氏立克次氏体(Rickettsia mooseri)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsiapsittaci)、五日热立克次氏体(Rickettsia quintana)、立克氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次氏体(Rickettsia trachomae)、亨氏罗卡利马氏体(Rochalimaea henselae)、五日热罗卡利马氏体(Rochalimaeaquintana)、龋齿氏菌(Rothia dentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、痢疾志贺氏菌(Shlgelladysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、大鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球菌(Streptococcus faceiun)、粪链球菌(Streptococcus faecalis)、野生链球菌(Streptococcus ferus)、鸡链球菌(Streptococcus gallinarum)、乳链球菌(Streptococcus lactis)、温和链球菌(Streptococcus mitior)、缓症链球菌(Streptococcus mitis)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、口腔链球菌(Streptococcus oralis)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、鼠链球菌(Streptococcus rattus)、唾液链球菌(Streptococcus salivarius)、血链球菌(Streptococcus sanguis)、表兄链球菌(Streptococcus sobrinus)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、逗号弧菌(Vibrio comma)、副溶血性弧苗(Vibrio parahemolyticus)、创伤弧菌(Vibriovulnificus)、嗜麦芽黄单胞菌(Xanthomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)和假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)等等。
可以用于本发明的膜可以是真核或原核细胞膜的任何碎片(fragment)，例如上文提到的真核或原核细胞，任何细胞膜和/或细胞隔室(cell compartment)碎片，例如线粒体、叶绿体、内质体或内质网。
可以用于本发明的蛋白质可以是血浆蛋白质(plasma protein)、细胞蛋白质或细菌蛋白质。例如，所述蛋白质可以是激素，例如孕酮、加压素、促甲状腺激素、黄体生成激素(LH)、甲状腺刺激激素(TSH)、生长激素(GH)、表皮生长因子(EGF)、胰岛素或催产素。它们可以，例如，是通道，例如钙离子通道，例如在Catterall WA.(2000)Structure and regulation ofvoltage-gated Ca2+channels.Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.16：521-55(参考文献4)中描述的通道，钾离子通道，例如在Dick GM和Tune JD，Role ofpotassium channels in coronary vasodilation，Exp Biol Med(Maywood).2010Jan；235(1)：10-22.(参考文献6)中描述的通道。它们还可以是参与主要组织相容性复合体(MHC)例如MHC I和MHC II的肽。它们还可以是受体，例如核受体、细胞内受体、膜受体、跨膜受体、或g-蛋白偶联受体、乙酰胆碱受体、FSH受体、睾酮受体，例如在Mostallino MC等人，Plasticityand function of extrasynaptic GABA(A)receptors during pregnancy and afterdelivery，Psychoneuroendocrinology.2009Dec；34Suppl1：S74-83(参考文献7)中描述的受体。它们还可以是酶，例如细菌酶，例如限制酶，例如HindIII、Eco RI、BamHI、MstII、TaqI、NotI、HinfI、AluI、BgIIII、HaeII、HhaI、PstI或SmaI，参与细胞信号传导的酶，例如蛋白激酶，参与生物合成例如脂肪酸生物合成的酶，磷酸酶，脱氢酶，例如葡萄糖脱氢酶，或参与普通代谢的酶，例如醛脱氢酶、α-淀粉酶、L-古洛糖酸内酯氧化酶(L-gulonolactone oxidase)，视网膜紫质，细胞色素B或细胞色素C。它们还可以是结构蛋白，例如肌动蛋白、肌球蛋白、peptin、白蛋白、胶原蛋白或组蛋白H4。
可以用于本发明的抗体可以是本领域技术人员已知的任何抗体。例如，它们可以是商业可得的任何抗体，例如IgG、IgA、IgM、IgE和IgD，抗体可以是例如，针对上文提到的蛋白之一的抗体，针对另一个抗体的抗体，例如针对人类抗体的兔抗体，例如特异地针对针对FSH受体的抗体的抗体。它们还可以是在免疫个体后获得的抗体，例如根据在文件Biologiecellulaire et moléculaire，Concepts et experiences，[Molecular and cellularbiology，concepts and experiments]2nd edition2004，Gerald Karp(参考文献5)中描述的方法。它们可以是，例如，通过人或动物响应于感染而产生的抗体，感染例如通过病毒、细菌、朊病毒、寄生虫、原生动物的感染，和响应于疾病，例如癌症、自体免疫疾病如，例如，甲状腺机能亢进、多发性硬化而产生的抗体，和响应于迷醉(intoxication)，中毒(poisoning)，污染，服用禁药(doping)，例如杀害虫剂(pesticide)、毒药、杀昆虫剂(insecticide)、除草剂、致敏剂的摄取、吸入和注射而产生的抗体，和响应于移植，例如骨髓移植，器官移植如，例如，肾、肺或肝移植，肢体如手、腿或脚而产生的抗体，和响应于人造器官、植入式导管(implantableport)、心脏起搏器、人造心脏或人造髋的植入而产生的抗体。
可以用于本发明的化学分子可以是本领域技术人员已知的任何化学分子。它们可以，例如，是凝固试剂，在文件中描述的试剂，激素，例如类固醇激素，例如可的松、醛固酮、孕酮、脱氢表雄酮(DHEA)、脱氢表雄酮硫酸盐(DHEAS)、雌二醇、雄甾烯二酮、二氢睾酮(DHT)、雌酮、雌三醇、睾酮，例如甲状腺素，例如肽激素，例如促红细胞生成素(EPO)、胰高血糖素、生长激素抑制素、心房肽(ANP)，或促肾上腺皮质激素(ACTH)。
根据本发明，第一物质可以存在于溶液中；在这样的情况下，第一物质不需要被引入溶液。
根据本发明，所述第一物质可以附着在预先浸没的表面上。可以用于本发明的附着第一物质的方法可以是本领域技术人员已知的任何方法。当然，本领域技术人员，从此常规知识可以知道如何根据所述的第一物质选择附着的方法。
根据本发明，当第一物质被附着时，与第二物质的分子相互作用改变浸没的表面并且，例如，可以使这个表面致密，所述制动的颗粒停留在所述表面上，所以当施加电场、磁场或电磁场时，所述颗粒的移动因此揭示相互作用。
根据本发明，所述第二物质可以是上文定义的可以与第一物质相互作用的任何物质。
根据本发明，所述第一和/或第二物质的密度可以大于或小于溶液的密度，优选地大于溶液的密度。有益地，所述第一和/或所述第二物质的密度的优越性允许定位所述第一和/或第二物质于靠近容器底部。
根据本发明的另一个实施方案，可以使用预先包含所述至少一种第一物质或所述至少一种第二物质的溶液实施本发明的方法。在这个实施方案中，所述方法可以不包括步骤a)并可以仅包括上文提到的步骤b)和c)。
根据本发明，所述方法可以代替步骤a)包括，
在先步骤a’)将所述第一物质附着在容器的表面上，
a”)将溶液引入到所述容器中，和
a”’)引入至少一种可与所述第一物质相互作用的第二物质。
根据本发明，可以使用多个颗粒执行本发明的方法，例如，使用至少两个颗粒，使用，例如，2到10000000，1000到1000000，10000到1000000，100000到1000000或10000到100000。多个颗粒有益地使直接检测所述物质间的相互作用成为可能，无需复杂的成像设备和无需染料，不像使用单一颗粒并要求复杂的成像设备或染料用于检测相互作用的现有技术的方法。
根据本发明，所述至少两个颗粒可以选自包括以下的组：带电的颗粒、磁性颗粒、覆盖至少一层磁性层的颗粒、可磁化的颗粒、覆盖一层可磁化层的颗粒、带电荷的电颗粒、电磁颗粒或可起电的颗粒或两个或更多个这些颗粒的混合。它们可以是，例如，全部或部分由磁性或可磁化的材料构成的颗粒，即，可以通过电场、磁场或电磁场的作用/施加而处于运动中的颗粒。的确，它们可以是使本发明得以实施的任何颗粒。
有益地，所述颗粒可以是呈适合于实施本发明的任何形式的颗粒，例如呈球、圆盘(puck)、不对称的几何形状，例如具有平面(flat face)的形式，等等。
可以使用任何合适尺寸的磁性颗粒。可以例如根据溶液容器的尺寸选择尺寸。例如，颗粒的尺寸可以小于容器尺寸的十分之一，优选地小于容器尺寸的百分之一，更优选地还小于容器尺寸的千分之一。例如，颗粒可以具有10nm到100μm或0.1到10μm的尺寸。
有益地，本发明的方法能够测量浸没了颗粒的溶液的粘弹性性质的细微变化。此变化越低，测量的灵敏性必须越高。通过使用多个颗粒，本发明精确地并有益地能够检测由少量的或者执行低强度相互作用力的物质间的弱相互作用导致的小变化。使用单个颗粒和/或磁性球或可磁化球不能够满意地使相互作用得以检测。而且存在检测非特异性现象的不可忽视的风险，所述现象例如由存在的可以干扰所述可磁化的微粒在磁场、电场或电磁场的作用下的移动的聚集体或杂质而导致。
相反，使用至少两个颗粒的本发明的方法给出可靠的有统计代表性的结果。
而且，颗粒数量越高，它们的相对移动提供越多的信息，特别地通过允许与产生所测现象接触的表面的更好的覆盖。本发明的方法因此有益地允许阐述不仅所述微粒自身的移动(轨迹、移动速度)，而且它们将描绘在施加磁场、电场或电磁场后的全景。的确，根据介质的粘弹性性质，多个微粒的初始均匀分布被施加的这样的场而扰乱。例如，如果介质是非常粘的，例如如果其内发生接触的物质间的强相互作用，分布保持均匀，原因是颗粒在所述场的作用下不能够移动太多或根本不能够移动。如果介质不是非常粘或一点都不粘，或如果其内发生非常弱的或不发生接触的所述物质间的相互作用，分布将跟随最强的场线，如通过在圆柱形磁铁上形成环或斑点，因为所述颗粒在所述场的作用下是自由移动的。
而且，本发明的方法还通过使用多个颗粒，例如通过在包含所述物质的溶液中均匀地分布和/或分散所述颗粒，有益地能够目视观察不仅在分子尺度(即大约一纳米)而且在微观尺度(即大约一微米)并甚至在宏观尺度下(即大于一微米)可见的相互作用。
例如，导致1)聚集体、核心或晶体形成的物质间的相互作用，与其相互作用导致2)或多或少交联的聚合物形成的物质相比，以不同形式干扰所述颗粒。在第一种情况下，所述颗粒倾向于对抗聚集体、核心或晶体在由电场、磁场或电磁场施加于所述颗粒而产生的移动的方向的相反一侧聚积。颗粒在聚积的区域产生对比的图像。在第二种情况下，如果聚合均匀地并有规律地在溶液中发生，图像反映随电场、磁场或电磁场强度的降低(例如，与距磁铁的距离成比例)，所述颗粒的渐进的固定。本发明的方法因此有益地使待获得的图像揭示由物质和溶液中的颗粒间的相互作用导致的结构。
优选地，用于在微观尺度和宏观尺度下对图像成像的颗粒数目是1000到1000000，10000到1000000，100000到1000000，或10000到100000。
根据本发明，颗粒可以有益地具有与可以与它们相互作用的物质的密度接近的密度。例如，颗粒可以具有0.3到3之间的相对于所包含的物质的密度。
根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法来测定颗粒的密度，例如，它可以是颗粒质量和添加了这些颗粒的溶液的体积的增加之间的比。
根据本发明，颗粒的密度有益地改进了本发明方法的特异性和/或灵敏性，例如通过增强、减弱或消除重力的影响。
优选地，颗粒和物质将具有高于包含它们的溶液的密度的密度。优选地，所述颗粒和所述物质将具有稍微更高的密度，例如具有是包含它们的溶液的密度的1.0001到3倍的密度。
有益地，可以将粘附分子偶联至颗粒的表面。有益地，所述分子至颗粒表面的偶联帮助颗粒粘附在一起。例如，颗粒可以被聚合物覆盖，例如包括亲水部分和疏水部分的嵌段聚合物，有益地允许在施加电场、磁场或电磁场之后颗粒的固定群集。换言之，粘附分子间的相互作用在施加场之后使颗粒连接在一起，并因此给出稳定和不可修改的结果。
根据本发明，颗粒可以具有相同的或不同的尺寸。
当颗粒具有相同的尺寸时，颗粒在分子相互作用期间的同时基本是制动的或加速的。当使用的颗粒具有不同的尺寸时，可以选择小颗粒的尺寸，例如，使得它们在分子相互作用一开始就被制动，并且大颗粒之后被制动。在这样的情况下，最小的颗粒在最大颗粒之前被制动。
当颗粒具有不同的尺寸时，小颗粒可以具有如10nm到1μm、如100到500nm的尺寸，而最大的颗粒可以具有如1μm到100μm、如1μm到10μm、如1μm到5μm的尺寸。
有益地，变化尺寸的颗粒可以允许分子相互作用的早期的且更灵敏的检测和/或分析。
根据本发明，可以使用多个具有不同磁化的相同尺寸的颗粒。
多个颗粒的行为差异可以有益地使分子相互作用的力度得以评估。与相互作用强时所有颗粒的全部固定相比，通过施加磁场可以引起最强磁化的颗粒的移动，磁力更强，但较弱磁化的颗粒不可以被设置成处于运动中。
根据本发明，所述至少一个颗粒优选是产生可检测的信号的颗粒。该信号的检测将依赖于颗粒的性质。例如，所述至少一个颗粒可以是荧光的、磷光的、放射活性的、化学发光的、反光的或有色的。
例如，在所述至少一个颗粒是荧光的情况下，所述颗粒发射的荧光可以例如目视和/或通过本领域技术人员已知的任何光学方法被检测。所述至少一个颗粒可以，例如，通过光源，例如激光束的方法被照明以跟踪它的移动。
根据本发明，照明可以是连续的或间歇的。例如，可以贯穿所述方法或例如在步骤a)或b)或c)、a)和c)、a)和b)或b)和c)的过程中使用照明。
例如，在所述至少一个颗粒是磷光的情况下，所述颗粒可以例如目视和/或通过本领域技术人员已知的任何光学方法被显示。
例如，在所述颗粒是放射活性的情况下，所述颗粒可以甚至通过光学不透明液体或培养基，以及通过光学不透明微稀释板，经由本领域技术人员已知的任何放射活性发射检测设备，特别是在自动射线照相胶片上显影的传统方法而被检测。然后，使敏感的胶片在微稀释盘下充分变平，然后在所述微稀释板的底部显影图像。
例如，在所述至少一个颗粒是化学发光的情况下，可以通过将化学试剂添加到介质中以允许所述颗粒发射光能来检测所述颗粒。此信号的检测可以是例如目视和/或通过本领域技术人员已知的任何方法，特别是通过使用对所发射的波长敏感的CCD(电荷偶联设备)相机，所述相机扫描微稀释板的孔。
例如，在所述至少一个颗粒是反光的情况下，所述颗粒可以例如目视或通过本领域技术人员已知的任何光学方法被检测。有益地，所述至少一个颗粒可以是，例如，通过光源，例如激光束被照明以跟踪它的移动。
例如，在所述至少两个颗粒是有色的情况下，所述颗粒可以例如目视和/或通过本领域技术人员已知的用于检测有色颗粒的任何光学方法被检测。
根据本发明，依赖于颗粒的大小和/或磁力，所述颗粒可以被有益地选择为不同的颜色。在此情况下，磁场的施加通过群集所述颗粒而导致有色点或环或有色斑点出现在表面上。这个特征有益地能够使群集被更易于目测。的确，例如在所述颗粒具有不同大小的情况下，大颗粒具有一种颜色而小颗粒具有另一种颜色，当施加磁场时，如果所述物质间的相互作用是弱的，小颗粒在溶液中保持固定，而大颗粒被群集。此群集通过出现有色点而是可看到的，在此情况下，所述有色点与大颗粒的颜色是相同的。如果没有物质间的分子相互作用存在于溶液中，小颗粒和大颗粒可以被群集并且颗粒的群集通过出现对应于重叠的两种颜色的有色点而是可看到的。最后，如果分子相互作用是相当强的，颗粒可以被完全制动并且因此可以是群集的并且看不到有色点。
换言之，可以评估群集，例如，通过测量由所述群集的颗粒形成的斑点。例如，当所述颗粒是有色的时，通过测量所述颗粒的颜色。此外，群集可以例如随着所获得的斑点的形式的变化，例如随着形状、直径或其拓扑学，例如盘或环的变化而被评估。
本领域技术人员将容易理解，对于本发明的实施方案，还可以根据溶液选择所述至少两个颗粒的可视性质。的确，所述至少两个颗粒的移动的测定均是所述至少两个颗粒的颜色和所述溶液的颜色之间的对比越大越容易。
在本发明中，磁场、电场或电磁场可以是导致所述至少两个颗粒在浸没在所述溶液中的所述表面上移动的任何场，例如电磁场或磁场。可以如通过磁铁或螺线管产生磁场、电场或电磁场。磁铁可以是如呈棒、尖状物、部分(part)等的形式或用于实施本发明的任何其他合适的形状。可以如通过本领域技术人员已知的任何方法施加所述场，例如通过脉冲、通过电磁场的逐渐增加、通过电磁场的变化或通过这些应用的组合。
电磁场的逐渐增加可以如通过沿直的或螺线管的轨迹移动使磁铁更靠近，或通过具有或不具有可变振幅的振荡和/或频率的振荡运动而获得。可以如通过靠近所述至少一个颗粒的磁性材料的旋转或移动的组合来获得更复杂的场变化。
因此，根据本发明，可以通过可以移动或可以不移动的场产生装置(fiield-generating means)来产生所述磁场。
当若干颗粒必须被设置成处于运动中时，场必须能够使所述颗粒群集在浸没于所述溶液中的所述表面上。
不管本发明的实施，可以有益地同时在多个隔室内实施本发明的方法。
在此情况下，对于使所述颗粒设置成在所述隔室中处于运动，可以有益地使用多个磁场，例如磁铁。可以将磁铁附着在如基材上，使得实施本发明方法的每一个隔室可以与基材的磁铁并列。施加到所述隔室的磁场从一个隔室到另一个是独立的。施加到所述隔室的磁场从一个隔室到其他的隔室可以是相同的或不同的，优选地是相同的。
根据本发明，可以施加磁场、电磁场或电场如持续1秒到15分钟或10秒到10分钟的时间。当然，本领域技术人员从此常规知识，将知晓如何根据所测试的物质和/或所施加的场强来调节时间。
在本发明中，隔室(compartment)指，例如，培养反应器、孔或管，例如微稀释板。微稀释板指如由美国国家标准协会(American NationalStandards Institute)和生物分子科学协会(Society for Biomolecular Sciences)定义的具有96、384和甚至1536个孔的板(微板)的类型。
构成所述隔室的材料可以是适合于本发明实施方案的任何材料，例如塑料，例如聚碳酸酯、聚苯乙烯等，玻璃、金属等。有益地，可以使用具有无底孔的聚苯乙烯微稀释板。通过在微稀释板的下面固定平表面来产生这些孔的底部。这个平表面可以由透明的材料制成，例如，塑料、玻璃等，或不透明材料如金属、陶瓷等。可以通过本领域技术人员已知的用于这样的附着的任何合适的方法来在微稀释板下面附着平表面，例如通过使用粘合剂胶粘、通过摩擦方法、通过塑料的熔融粘合如使用激光等。
根据本发明，多个隔室可以被群聚(group)在同一基材上，例如，在具有1到1536个孔，例如6、16、64、96个孔等的板上。
隔室可以是，例如，具有一个闭合端的室，如管、孔等，或具有两个开口的室。
根据第一个结构，隔室可以具有一个闭合端以形成平的底部。
根据第二个结构，隔室可以具有一个闭合端以形成半球形的底部。
根据本发明，可以在施加磁场、电磁场或电场后直接测定所述物质间的相互作用。例如，可以在施加场0.01秒到30分钟或1秒到3分钟后测定相互作用。
根据本发明，还可以通过比较施加磁场、电磁场或电场时的颗粒的群集来测定所述物质间的相互作用。例如，可以比较颗粒在不包含或仅包含上文提到的所述物质中的一种物质的溶液中的群集和颗粒在包含所述第一物质和所述第二物质的溶液中的群集。如果在不包含或仅包含所述物质中的一种物质的溶液中群集更多或更少，那么所述物质相互作用并且因此测定该相互作用。换言之，当施加所述场时，物质间的相互作用可以减弱或增强颗粒的群集并可以因此被测定。例如，如果相互作用导致物质聚集，介质可能变得粘性较弱并且颗粒的群集将被增强。例如，如果相互作用导致物质沉淀，表面可能，例如，被沉淀堆满并且颗粒的群集将被减弱。例如，如果相互作用导致物质交联，物质的网络将减慢颗粒并且颗粒的群集将被减弱。例如，如果相互作用导致形成物质的线性链，那么介质的粘度将被增加并且颗粒的群集将被减弱。
根据本发明，可以在如多个隔室内实施所述方法，每一个隔室包含：
-所述溶液，
-所述至少一个颗粒，和
-可以相互作用的所述物质。
根据本发明，所述方法还可以包括混合步骤b’。可以如通过搅拌其内存在所述物质的溶液来进行混合。其可以是如使用磁力搅拌器的混合或使用定轨摇床的混合。根据本发明，可以进行混合如1秒到15分钟或10秒到10分钟。
本发明还涉及本发明方法的以下用途：例如，识别存在于溶液中的物质，分析生物样品，进行生物测试，确定血型，进行免疫血液学测试或检测例如病毒、细菌、变形虫、酵母、癌症细胞、朊病毒、杀害虫剂、杀真菌剂、抗生素、激素或毒素的自然的或人类来源的污染物。本发明还涉及本发明方法的以下用途：例如，实施药物测试，进行对物质的科学研究，例如以如分子、胶体、纳米颗粒或微粒研究溶液对物质间相互作用的影响，例如在水溶液中、在有机溶液中、在气体中。本发明还涉及本发明方法的以下用途：例如，进行对对象或物质的科学研究，所述对象或物质参与如生物学、肿瘤学、内分泌学或感染性疾病，例如研究在水溶液中形成的水凝胶、气体中形成的气凝胶或在溶剂中或在烃中形成的凝胶。
例如，可以使用本发明的方法来分析生物样品，例如用于血清分型，确定个体的MHC或确定如样品中特定蛋白、抗体或受体的存在。还可以使用本发明的方法来识别溶液中的化学物质。
例如，当本发明的方法用于血清分型时，溶液是来源于个体，例如人类或动物的包含第一物质的血样品。
此外，本发明的方法可以用于测定受体和可能的配体间，抗体和蛋白、化学分子、另一种抗体和/或可以被抗体识别的任何分子间的相互作用。本发明的方法还可以用于检测细胞间的相互作用，例如真核细胞间或原核细胞间，或真核细胞和原核细胞间。本发明的方法还可以用于独立检测细菌、病毒、酵母和/或真核细胞间的相互作用。
本发明的方法还可以用于如检测趋化和细胞粘附的现象。
本发明的方法还可以用于如检测纳米颗粒、微粒或具有复杂形状的微量级或纳米级目标间的相互作用。
本发明的方法还可以用于如检测(i)第一物质与(ii)第二物质的相互作用，第一物质如人类或动物响应于由例如病毒、细菌、朊病毒、寄生虫或原生生物导致的感染以及响应于疾病所产生的抗体，疾病如癌症，自体免疫疾病如，例如，甲状腺机能亢进、多发性硬化，响应于迷醉，中毒，污染，服用禁药，例如杀害虫剂、毒药、杀昆虫剂、除草剂、致敏剂的摄取、吸入和注射所产生的抗体，以及还响应于移植，例如骨髓移植，器官移植如，肾、肺或肝，肢体如手、腿或脚所产生的抗体，并且还响应于人造器官、植入式导管、心脏起搏器、人造心脏或人造髋的植入所产生的抗体，第二物质如可以诱导产生所述第一物质的物质，例如负责产生上文提到的抗体的抗原。
根据本发明，溶液可以包括能够诱导产生待检测的所述第一物质的第二物质。
有益地，第二物质可以被附着于容器的表面上；所述第二物质的附着有益地允许检测所述第一和第二物质间的相互作用，不管它们的浓度如何，例如抗体和抗原间的相互作用，即使当它们以低数量存在时。
根据本发明，本发明的方法还可以包括(iii)第三物质的使用。
其可以是，例如，如之前定义的物质，例如可以识别所述第一和/或第二物质的至少一种的抗体。其可以是，例如，抗独特型抗体，例如特异性识别由人类或动物产生的抗体的抗体，例如抗兔抗体、抗羊抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体、或抗IgE抗体。
根据本发明，第三物质可以被预先附着于容器的表面以检测如所述第三物质与所述第一和/或第二物质的相互作用。
有益地，根据本发明，所述第三物质是抗独特型抗体，即，可以与，例如，如前所述的由人或动物响应于抗原和/或存在或已存在于人或动物内的抗原而产生的抗体的相互作用的抗-抗体抗体。
本发明因此有益地允许间接检测物质，例如存在或已存在于人或动物内的物质而无需开发与这个物质特异性地相互作用的抗体。
本发明因此有益地允许直接或间接地检测响应于感染、疾病、迷醉、中毒、污染、服用禁药、摄取、杀害虫剂或移植而产生的抗体的存在。而且，本发明因此使沉默的感染得以检测，沉默的感染即通过普通微生物学方法不可检测的感染，所述方法例如血液培养、活检培养、生理液的样品温育或灌注假定的感染部位，例如脑脊髓液、尿、唾液，通过如通过使用与特异性针对这些感染的抗体相互作用的抗独特型抗体检测。
在阅读下面的基于阐述目的提供的通过附图阐述的实施例时，更多优点将对本领域技术人员显现。
附图说明
-图1显示由作为亲和物质的呈现(SwH)或不呈现(SwE)对彼此的亲和力的抗体而获得的斑点的照片。磁化20秒后拍摄照片1A，磁化5分钟后拍摄照片1B。
-图2显示由抗血型决定簇抗体和红细胞作为亲和物质而获得的斑点的照片。
-图3显示由抗血型决定簇抗体和红细胞作为亲和物质而获得的斑点的图像。
实施例
实施例1：检测具有或不具有对彼此的亲和力的抗体的相互作用。
在这个实施例中，使用两条具有8个平底孔的带(参考：MSW002B，BioFilm Control，法国)，分别命名为SwH和SwE。在每一条带中，将通过如下而获得的70μl抗体溶液置于每一个孔内：分别将15μl抗人IgG抗体(参考BI2018，Paris Anticorps，法国)或抗大肠杆菌抗体(参考BP2298，Acris Antibodies，德国)混合在1.5ml PBS(8g/l NaCl(SigmaAldrich，美国)、200mg/l KCl(SigmaAldrich，美国)、1.44g/l Na2HPO4(Sigma Aldrich，美国)、240mg/l KH2PO4(SigmaAldrich，美国)中，然后将它们放置在稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内16小时。
制备分别命名为SIg0、SIgH和SigE的溶液，其包含200μl的用于探测人抗FY1抗红细胞抗体的试剂(IJB-IH Control3，参考108030357，InstitutJacques Boy，法国)、2μl顺磁微珠(Ton004N，BiofilmControl，法国)以及分别是15μl注射用水、200μl抗人IgG抗体(参考BI2018，ParisAnticorps，法国)或者200μl抗大肠杆菌抗体(参考BP2298，Acris AntibodiesGmbH，德国)。
然后从SwH和SwE带中移除抗体溶液，然后在每一个孔中放置并移除150μl PBS三次。
100μl的SIg0、SIgH和SIgE被分别放置于SwH和SwE带的D、E和F孔。然后将带放置在稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内20分钟，然后放置在磁化测试块(BKT-MSW002BioFilm Control，法国)中20秒。然后将带放置于文件扫描仪(Perfection V-750PRO，Epson，美国)中，使用所述扫描仪借助EpsonScan(Epson，美国)软件拍摄第一图像。第二次重复磁化/图像捕捉循环以便在磁化总共5分钟后获得第二图像。通过使用ImageJ软件(http://rsb.info.nih.gov.ij)和剪除由不同对比调整获得的图像从用扫描仪获得的彩色图像的红色组分中减去图像的绿色组分而得到最终的图像。相应的照片是图1中的图像。
获得各种直径的环，相应于在磁场中在它们迁移期间在孔底部的珠的聚积。环直径被认为是根据珠的磁移动性的减少法则的测量结果。
如预期，在抗红细胞抗体和抗人Ig抗体研究试剂(SwH带孔E)中存在的免疫球蛋白之间存在预期的亲和反应下，所观察到的环直径大于在磁化20秒后在用于抗红细胞抗体和抗大肠杆菌抗体(SwH带孔D和F)的研究试剂中存在的免疫球蛋白间不存在亲和反应时和在孔E(带SwH和SwE孔E)中磁化5分钟后时。
如图1孔E可见的，当两种亲和物质同时存在于溶液中并被吸附于孔内，此作用被放大，这(带SwH，孔E)，相对于图1，带SwH，孔D中显示的情况极大地减少珠的迁移，孔D中物质之一仅吸附存在于表面上。
而且，当两种亲和物质，即抗体，存在于溶液中时，如果其中一种物质已经被吸附在表面上，那么减少珠移动性的现象被进一步放大(孔E，带SwH相比于SwE)。
最后，当亲和物质没有被吸附在表面上时，亲和反应在溶液中的发生是通过观察形成的环的直径可检测的(带SwE，孔E，相比于孔D和F)。
实施例2：检测抗血型决定簇抗体和红细胞间的相互作用
在这个实施例中，使用三条具有8个SBS平底孔的带(参考：MSW002B，BioFilm Control，法国)，分别命名为SwA、SwB和SwAB。将70μl抗体溶液置于带的每一个孔内，抗体溶液分别为抗A(参考102010153，InstitutJacques Boy，法国)、抗B(102010253，Institut Jacques Boy，法国)以及抗AB(参考102010353，Institut Jacques Boy，法国)。
将带放置在稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内10分钟。
分别命名为hA、hB、hAB和hO的血液悬浮液通过以下制备：将1mlTS缓冲液，其包含8g/l NaCl(Sigma-Aldrich，美国)和1g/l胰化蛋白胨(Difco，美国)，分别用100μl的分别为A型、B型、AB型和O型的红细胞，(IJB-IH Control2，参考108020257，Institut Jacques Boy，法国)和6μl顺磁微珠(Ton005N，BiofilmControl，法国)和1μl蓝色食品着色剂(Vahiné，法国)稀释。
从孔中移除抗体溶液，之后分别在带SwA、SwB和SwAB的孔A和B，然后C和D，然后E和F，然后G和H中分别放置70μl的hA、hB、hC和hO的制备液。
将带放置于稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内10分钟，然后放置在磁化测试块(BKT-MSW002 BioFilm Control，法国)上1分钟。然后将它们放置在文件扫描仪(Perfection V-750PRO，Epson，美国)中，使用所述扫描仪借助EpsonScan(Epson，美国)软件拍摄图像。如在实施例1中一样获得图2中的最终图像。
如图2所示，在带SwA的孔C、D、G和H中，在带SwB的孔A，B，G和H中和在带SwAB的孔G和H中，观察到大约2mm±1mm的直径的暗盘的形成，其归因于结合于孔的抗体和红细胞间不存在亲和反应。在下列表1中概述了观察结果，其中不存在盘被命名为-并且存在盘被命名为+：
表1：图2的孔的观察结果
如在实施例中证明的，获得的结果清楚地显示抗体与相应红细胞的亲和力的检测。而且，这个实施例清楚地显示本发明的方法使血样品的血清型得以确定。
实施例3：抗红细胞抗体的抗决定簇抗体间的相互作用的检测。
在这个实施例中，使用两条具有8个平底孔的带(参考：MSW002B，BioFilm Control，法国)，被命名为SwD和SwK。将50μl的通过将15μl抗人IgG抗体(参考BI2018，Paris Anticorps，法国)混合在1.5ml TS缓冲液(8g/l NaCl(Sigma-Aldrich，美国)和1g/l胰化蛋白胨(Difco，美国)中而获得的溶液置于带的每一个孔内。然后在稳定于37℃的恒温炉(命名BC240，Firelabo，法国)内温育带16小时。
制备分别被命名为Sp和St的溶液，其包含150μl的分别为PBS和TS缓冲液和0.75μl的Ton005N。这些溶液是没有红细胞的对照溶液。
还制备分别被命名为Si、Sii和Siii的悬浮液，其包含150μl I、II和III型(参考ID-DiaCell I-II-III，Diamed，法国)的红细胞悬浮液和0.75μl的顺磁微珠(Ton005N，BiofilmControl，法国)。
红细胞表面上存在的抗原经供应商证实并根据下列表2分布：
表2：
悬浮液 红细胞 Duffy KEL
Si I型红细胞 + 0
Sii II型红细胞 + 0
Siii III型红细胞 0 +
+：存在抗原，0：不存在抗原。
还制备了分别被命名为SDi和SKi、SDii和SKii以及SDiii和SKiii的悬浮液，该悬浮液包含100μl的分别为I、II和III型的红细胞悬浮液(参考ID-DiaCell I-II-III，Diamed，法国)、50μ1分别为抗FY1(或抗Duffy)和抗KEL1(IJB-IH Control3，参考108030357，Institut Jacques Boy，法国)的血清、以及0.75μl顺磁微珠(Ton005N，BiofilmControl，法国)(见表3)。这些悬浮液是包含红细胞的阴性对照，所述红细胞的亲和位点被血清中包含的抗体所阻断，并且红细胞抗体复合物不再具有可以与固定于孔底部的抗体结合的游离亲和位点。
表3：
红细胞 血清
SDi I(D) 抗FY1(抗D)
SKi I(D) 抗KEL1(抗K)
SDii II(D) 抗FY1(抗D)
SKii II(D) 抗KEL1(抗K)
SDiii III(K) 抗FY1(抗D)
SKiii III(K) 抗KEL1(抗K)
然后从带SwD和SwK中移除抗人IgG抗体溶液，并放置和移除150μlTB缓冲液两次。在带SwD和SwK的每一个孔中，放置50μl抗红细胞抗体研究试剂，分别为抗FY1(或抗Duffy)和抗KEL1(IJB-IH Control3，参考108030357，Institut Jacques Boy，法国)。然后将带放置在稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内10分钟。
然后从带SwD和SwK中移除抗红细胞抗体研究试剂的溶液，并放置和移除150μl TB缓冲液两次。
放置70μl不同的悬浮液，如下列表4所表明的：
表4：不同悬浮液的放置的分布
A B C D E F G H
SwD Si Sii Siii Sp St SDi SDii SDiii
SwK Si Sii Siii Sp St SKi SKii SKiii
然后将带放置于稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内20分钟，然后放置在磁化测试块(BKT-MSW002BioFilm Control，法国)上30秒。然后将带放置在文件扫描仪(Perfection V-750PRO，Epson，美国)中，使用所述扫描仪借助EpsonScan(Epson，美国)软件拍摄图像。使用这个图像分析SwK带。重复磁化/图像捕捉循环第二次以便还在总磁化时间1分钟后获得图像以用于带SwD的分析。如实施例1一样获得最终图像并显示于图3。
图3显示在对照孔D和E中可见的完美界定的环，证明顺磁珠显著的移动性，在孔F、G和H中获得类似的环，证明在红细胞的存在下保持了显著的移动性，所述红细胞的亲和位点被血清中包含的抗体阻断。
可以证实在孔A、B和C中存在下列：
-与孔F、G和H的环可比较的环，表明归因于红细胞和结合于孔底部的抗体间不存在亲和结合导致的显著的移动性，
-或者扩散斑点，表明归因于结合于孔的抗体和红细胞间的亲和反应导致的顺磁珠的减少的移动性。
根据下列表5可见到环和斑点：
表5：获得的图像
A B C D E F G H
SwD 斑点 斑点 环 环 环 环 环 环
SwK 环 环 斑点 环 环 环 环 环
本发明的方法因此使两种物质间的分子相互作用得以检测。
实施例4：检测存在于血清中的抗菌抗体和来自细菌培养基的物质的相互作用
在这个实施例中，使用两条具有8个平底孔的带(参考：MSW002B，BioFilm Control，法国)，分别命名为SwH和SwE。在每一条带中，将70μl抗体溶液置于每一个孔内，所述溶液通过分别将15μl抗人IgG抗体(参考BI2018，Paris Anticorps，法国)和抗大肠杆菌抗体(参考BP2298，AcrisAntibodies，德国)混合在1.5ml的PBS(8g/l NaCl(SigmaAldrich，美国)、200mg/l KCl(Sigma Aldrich，美国)、1.44g/l Na2HPO4(Sigma Aldrich，美国)、240mg/l KH2PO4(SigmaAldrich，美国)中而获得(见表6)，然后将它们放置在稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内16小时。
表6：
然后从带SwH和SwE中移除所述IgG溶液，并放置和移除150μl TS缓冲液两次。将150μl分别来源于受葡萄球菌感染的患者的人血清(Staph+血清)和未受这种感染的对照的人血清(Staph-血清)分别放置在带SwH和SwE的孔A、B、C、D和E、F、G、H的每一个中(见表7)。然后将带放置在稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内10分钟。
表7：
Figure BDA00002836104400281
在带的孔内放置50μl的包含来自于葡萄球菌培养基的物质和顺磁微珠的用于检测葡萄球菌感染的试剂(参考：RDS-01R，BioFilm Control，法国)。
然后将带放置在稳定于37℃的恒温炉(参考BC240，Firelabo，法国)内20分钟，然后放置在磁化测试块(BKT-MSW002 BioFilm Control，法国)上10秒。然后将带放置在文件扫描仪(Perfection V-750PRO，Epson，美国)中，使用所述扫描仪借助EpsonScan(Epson，美国)软件捕捉图像。重复磁化/图像捕捉循环第二次以便还在磁化总共5分钟后还获得图像。如实施例1一样获得最终图像。
在存在于受感染的患者的血清中的免疫球蛋白和用于检测葡萄球菌的试剂中包含的物质之间存在预期的亲和反应下(孔A、B、C和D)，所观察到的环的直径比在未受感染的患者的血清中不存在亲和反应时(孔E、F、G和H)大。
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Claims (14)

1.一种用于检测溶液中的相互作用的方法，其包括下列步骤：
a.将至少一种第一物质和优选地至少一种能够与所述第一物质相互作用的第二物质引入溶液中，
b.将至少两个磁性颗粒或可磁化的颗粒引入步骤a)中获得的溶液中，所述颗粒停留在浸没于所述溶液内的表面上，
c.通过施加设计成使所述颗粒处于运动中的电场、磁场或电磁场来确定所述物质的相互作用，当所述颗粒在所述表面上的移动性发生改变时，检测所述物质间的所述相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个磁性颗粒或可磁化的颗粒独立地是带电的颗粒、磁性颗粒或可磁化的颗粒或覆盖至少一层磁性层或可磁化层的颗粒。
3.根据权利要求1或2的任一项所述的方法，其中使所述至少两个颗粒经历脉冲电磁场。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中移动性改变是在所述电场、磁场或电磁场的作用下所述颗粒的移动的加速。
5.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中移动性改变是在所述电场、磁场或电磁场的作用下所述颗粒的移动的减慢。
6.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中移动性改变是在所述电场、磁场或电磁场的作用下所述颗粒的轨迹的变化。
7.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述相互作用通过在所述电场、磁场或电磁场的作用下所述颗粒的群集来进行检测。
8.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述相互作用通过在所述电场、磁场或电磁场的作用下所述颗粒的不群集来进行检测。
9.根据权利要求1到3中任一项所述的方法，其中所述相互作用通过在所述电场、磁场或电磁场的作用下所述颗粒的分散来进行检测。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过发光源照明所述至少两个颗粒来检测它们的移动。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述至少两个颗粒是信号发生器。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述第一物质选自包括真核细胞、原核细胞、膜、病毒、蛋白质、抗体、抗原、化学分子的组。
13.根据权利要求1到11中任一项所述的方法，其中所述第二物质选自包括真核细胞、原核细胞、膜、病毒、蛋白质、抗体、抗原、化学分子的组。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法代替步骤a)包括，
在先步骤a’)将所述第一物质附着在容器的表面上，
a”)将溶液引入到所述容器内，和
a”’)引入至少一种能够与所述第一物质相互作用的第二物质。
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