CN101156070A - 用于分离微生物的方法和装置 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于一种基于微生物附着到粒子表面的能力将所述微生物分离的方法。

Description

用于分离微生物的方法和装置
本发明涉及微生物的分离。
很多微生物在生长的同时合成生物膜(biofilm)。除了细菌之外，真菌、藻类、原生动物同样形成生物膜。
因此，在很多领域生物膜是普遍存在的，由于生物膜，而存在卫生危害，它们有时会引起相对大的损害。
当生物膜生长时，首先是细菌附着到载体上然后在载体上群集化(或拓殖)。细菌繁殖从而快速形成由细胞体的细胞层构成的膜，该细胞层分泌胞外多糖厚层，其起到免受环境介质侵入的保护作用(COSTERTON et al.，Science，vol.284(5418)，p：1318-22，1999)。生物膜形成的动力学可以分成5个步骤(图1)：
-表面的调节：存在于液相中的有机或矿物分子被吸附在表面上，从而形成“调节膜(film conditionnant)”。
-黏附或可逆附着：存在的微生物通过重力作用、布朗运动或者通过趋化性(如果具有鞭毛)而靠近表面。在该连接(或固定)的第一步骤，仅仅涉及纯粹的物理现象以及发生微弱的物理化学相互作用，微生物仍能很容易地脱离出来。
-附着：这个更慢的步骤涉及与更强能量的相互作用以及微生物代谢和微生物的细胞附属物(鞭毛、纤毛，...)。附着是一个活跃且特异的现象。特别是由于胞外多糖(EPS)的合成，第一批移生菌(colonisateurs)将不可逆地连接到表面上。这个过程相对缓慢，并依赖于环境因素和所存在的微生物。
生物膜的成熟(生长和表面挂膜)：附着到表面之后，细菌繁殖并且重新集聚以形成被聚合物围绕的微菌落。该聚合物基质(或多糖-蛋白质复合物)将起如同胶合剂的作用，并加强细菌彼此间的联系以及与表面的联系以最终形成生物膜，并达到平衡状态。该生物膜通常以构成限制点的三维结构生长。该微环境将是浮游生物生长方式相关的多种生理修饰和分子修饰的场所。如果条件允许，以这种方式形成的生物膜将占据提供给它的所有表面。尽管某些种类的微生物不合成EPS或者只有很少的聚合物同样能够在表面上附着并形成生物膜，生物膜的成熟一般均与EPS的生成相关。
脱落：生物膜是永久动态平衡的结构并根据载体、微生物和环境而变化。前述变化可以表现为细胞或者聚集体的脱落。
根据本发明，利用微生物的附着和固定性能来分离微生物。
本发明的原理包括在或多或少液态的培养基的粗提取物中加入粒子，尤其是磁性的或者可磁化小珠，使得这些小珠与培养基接触足够长的一段时间而使微生物附着到粒子表面，以便通过任何适当的方法，尤其是通过磁铁将粒子从培养基中分离出来，并且将所述粒子在合适的固体培养基上铺开，以便实现用粒子捕获的微生物的生长。
因此，本发明的目的在于从含有微生物的培养基中分离至少一种微生物的方法，包括以下步骤：
a)在所述培养基的提取物中加入给定数量的磁性或可磁化粒子，
b)孵育粒子和培养基一段足够长的时间使微生物附着到所述粒子的表面上；
c)从培养基中分离所述粒子；
d)在与微生物的生长相容的载体上铺开所述粒子；
e)在载体上孵育所述粒子一段足够长的时间以使对应于所分离微生物的菌落生长。
根据本发明的一个具体实施方式，该方法可以包括预培养含有待分离微生物的培养基提取物的预先步骤。为此，将提取物置于与微生物的成活力相容的温度中。我们非常清楚，除了通常温度下生存的生物外，还存在着在温度、气体分压(氧气、氮气、二氧化碳气体等)、卫生、pH(酸、碱)的极端条件、氧化还原条件和/或需氧或厌氧条件下生活的微生物。因此，本领域技术人员能够使生长温度适合于所培养的微生物的需要。最常用的生长温度可以是在20至50摄氏温度之间，优选在30至40℃之间。这一预培养步骤的目的是使培养基富含微生物，在根据(不同)微生物可变化的一段时间内实现该步骤，该时间可以是20分钟至7到10天，优选在1至48小时之间，可选地在搅拌条件下进行。
根据本发明的另一个具体实施例，本发明的方法包括在本发明方法的步骤c)和步骤d)之间增加的补充步骤，包括将步骤c)获得的小珠任意浸入冲洗溶液(有利地含水冲洗溶液)中，能够除去先前的培养基并除去(存在于浸润小珠的液体中的)未附着的微生物。这一步骤允许选择粘附最强的由此最不可逆附着的微生物。这一步骤还可以是用于检验微生物附着性能的快速处理或延长处理的时机(在冲洗溶液中的预防性或治疗性处理)。
本领域技术人员能够很容易确定加入培养基的小珠的数量。
根据本发明，步骤b)的孵育进行一段时间，根据(不同)微生物，该时间可以是几秒至几小时，优选在15秒至45分钟。
在孵育时间之后，微生物能够附着到粒子(小珠)上。
根据本发明，粒子和培养基在步骤c)的分离可以根据本领域技术人员已知的任何方法来实现。例如，通过离心并除去培养基，或者进一步地，优选根据本发明，利用产生能够吸引粒子的磁场或电场的系统，尤其是磁铁来提取粒子。根据这一优选的具体实施方式，粒子通过磁铁提取，磁铁有利地浸入提取物中。
根据有利的具体实施方式，产生能够吸引粒子的磁场或电场的系统，尤其是磁铁，可以用任何系统尤其是可移动的保护层或者罩(capot)来保护，该保护层或者罩可以由任何材料例如塑料制成，其不干扰磁波或电波。更优选地，所述罩是用后即丢弃的。于是可以重新利用该磁铁。
根据本发明的另一个具体实施方式，本发明方法包括清洗产生磁场或电场的系统的补充步骤以便除去存在于浸湿液体中的未附着的微生物或者粘附性较弱的微生物。在这个补充步骤的过程中，将系统浸入清洗溶液，该清洗溶液可以是例如无菌培养基。本领域技术人员明了，该步骤基本上不超过几秒钟，至多几分钟，这是除去系统表面上的未附着微生物所需的时间。
根据本发明，通过在微生物培养装置(例如含有适合于微生物生长的培养基的皮式(Pétri)培养皿)的表面上放置所述粒子，可以将所述粒子在与微生物的生长相容的载体上铺开。
根据一个具体实施方式，通过从塑料罩中取出磁铁同时使塑料罩靠近微生物培养装置的表面，可以实现前述放置。
根据本发明另一个实施方式，使用放置在培养装置的表面下方的另一块磁体，可以放置小珠(bille，钢珠)。
为了铺开并分散小珠，可以使用本领域技术人员已知的任何系统，例如手动分布机。根据一个具体实施方式，使用放置在微生物培养装置表面下方的旋转磁铁。
通过由旋转微生物培养装置产生的液体涡流可以完成小珠的分散。
一旦粒子(小珠)被分散，培养装置放置在孵育箱中一段足够长的时间来使微生物在装置表面上生长。这里，本领域技术人员使孵育时间和温度适合于期望分离的微生物。这个时间可以包括几个小时至几天，优选在4小时至48小时之间。孵育温度可以是在30至40℃。
本发明的其他优点在附图中表现出来，附图中：
图1示出微生物提取的传统方法(A)与本发明方法(B)的比较；
图2示出提取步骤和粒子的冲洗步骤；
图3示出粒子在皮式培养皿表面上的放置；
图4示出借助于旋转磁铁粒子在皮式培养皿表面上的分散。

Claims (12)

1.从含有微生物的培养基中分离至少一种微生物的方法，包括以下步骤：
a)在所述培养基的提取物中加入给定数量的磁性或者可磁化粒子；
b)孵育所述粒子和所述培养基一段足够长的时间以使所述微生物生长并附着到所述粒子的表面上，
c)从所述培养基中分离所述粒子；
d)在与所述微生物生长相容的一种载体上铺开所述粒子；
e)在一种载体上孵育所述粒子一段足够长的时间使对应于所分离的微生物的菌落生长。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括使含有期望分离的所述微生物的所述培养基的提取物预培养的预先步骤，可选地在搅拌下进行。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述提取物置于与所述微生物的成活力相容的温度，尤其在20至50摄氏温度，优选在30至40摄氏温度。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述预培养步骤的持续时间在20分钟至10天之间，优选在1小时至48小时之间。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括在步骤c)和d)之间的补充步骤，所述补充步骤包括将所述步骤c)获得的小珠随意浸入优选含水的冲洗溶液中。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，进行步骤b)孵育一段时间，取决于微生物，所述时间为几秒至几小时，优选在15秒至45分钟。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤c)粒子和培养基的分离通过离心并除去培养基，或者进一步通过使用产生能够吸收粒子的磁场或电场的系统来实现。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，在所述步骤c)粒子和培养基的分离通过磁铁来实现。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述磁铁被浸入提取物中。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述产生能够吸引所述粒子的磁场或电场的系统尤其通过可移动保护层或者罩来保护。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述可移动保护层或者罩是一次性使用的。
12.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其特征在于，包括清洗所述产生磁场或电场的系统的补充步骤。
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