BRPI0609830A2 - processo de isolamento de pelo menos um microorganismo - Google Patents
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Abstract
PROCESSO DE ISOLAMENTO DE PELO MENOS UM MICROORGANISMO. A presente invenção trata de um novo método de isolamento de microorganismo baseado na capacidade do referido microorganismo de aderir á superfície das partículas.
Description
"PROCESSO DE ISOLAMENTO DE PELO MENOS UM MICROORGANISMO"
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se ao isolamento dos microorganismos.
Antecedentes da Invenção
Muitos microorganismos se desenvolvem sintetizando um biofilme. Além das bactérias, os fungos, as algas, os protozoários também se organizam em biofilmes.
Os biofilmes estão, portanto onipresentes em diversos campos para os quais eles apresentam riscos sanitários e causam às vezes danos relativamente graves.
Quando um biofilme se desenvolve, ocorre primeiramente a adesão das bactérias a um suporte e a seguir a colonização desse suporte. As bactérias ao se multiplicar formam rapidamente um filme constituído por camadas de corpos celulares que secretam um resíduo de exopolissacarídeos que os protege das agressões do meio circundante (Costerton et ai, Science, vol. 284(5418), p: 1318-22, 1999). A cinética de formação de um biofilme pode ser subdividida em 5 etapas (figura 1):
- Condicionamento da superfície: As moléculas orgânicas ou inorgânicas presentes na fase líquida vão absorver-se sobre a superfície, para formar nela um "filme condicionante".
- A aderência ou adesão reversível: Os microorganismos presentes se aproximam das superfícies por gravimetria, movimentos brownianos ou por quimiotaxia se possuírem flagelos. Durante essa primeira etapa de fixação, em que ocorrem apenas fenômenos puramente físicos e interações fisico-químicas fracas, os microorganismos podem ainda ser facilmente desprendidos.
- A adesão: Nessa etapa mais lenta ocorrem interações de maiorenergia bem como o metabolismo microbiano e os apêndices celulares do microorganismo (flagelos, pêlos, ...). A adesão é um fenômeno ativo e específico. Os primeiros colonizadores vão se ligar de modo irreversível à superfície graças, em particular, a síntese de exopolissacarídeos (EPS). Esse processo é relativamente lento e depende dos fatores ambientais e dos microorganismos em presença.
-A maturação do biofilme (desenvolvimento e colonização da superfície): Depois de ter aderido a uma superfície, as bactérias se multiplicam e se agrupam para formar micro-colônias cercadas de polímeros. Essa matriz de polímeros (ou glicocálix) vai agir como um "cimento" e reforçar a associação das bactérias entre si e com a superfície para finalmente formar um biofilme e atingir o estado de equilíbrio. O biofilme se desenvolve geralmente em uma estrutura tridimensional que constitui um local de confinamento. O micro-ambiente vai ser a sede de diversas modificações fisiológicas e moleculares em relação ao modo de crescimento planctônico. O biofilme assim formado vai ocupar toda a superfície que lhe é oferecida se as condições o permitirem. Geralmente, a maturação do biofilme está correlacionada com a produção de EPS mesmo que certas espécies de microorganismos não sintetizem ou sintetizem poucos polímeros que podem também aderir e formar biofilmes sobre superfícies.
- Desprendimento: Os biofilmes são estruturas em perpétuo equilíbrio dinâmico que evoluem em função do suporte, dos microorganismos e do ambiente. Essa evolução pode se traduzir por desprendimentos de células ou de agregados.
Descrição Detalhada da Invenção
De acordo com a presente invenção, as propriedades de adesão e de fixação dos microorganismos são utilizadas para permitir o isolamento desses microorganismos.O princípio da presente invenção consiste em adicionar em uma amostra bruta, mais ou menos líquida, um meio cuja contaminação por um microorganismo se deseja estudar, particularmente esferas, magnéticas ou magnetizáveis, em deixar as esferas em contato com o meio durante um tempo suficiente para a adesão dos microorganismos à superfície das partículas, em isolar as referidas partículas do meio por qualquer meio apropriado, particularmente pelo uso de um ímã e em distribuir as referidas partículas sobre um meio de cultura sólido adequado a fim de realizar uma cultura dos referidos microorganismos retidos com as partículas.
Assim, a presente invenção tem por objeto um processo de isolamento de pelo menos um microorganismo a partir de um meio que os contêm, que compreende as seguintes etapas:
(a) introdução em uma amostra do referido meio de uma quantidade dotada de partículas magnéticas ou magnetizáveis;
(b) incubação das partículas e do meio durante um tempo suficientepara a adesão dos microorganismos à superfície das referidas partículas;
(c) separação das referidas partículas do meio;
(d) distribuição das referidas partículas sobre um suporte compatível com o desenvolvimento dos microorganismos;
(e) incubação das referidas partículas sobre um suporte duranteum tempo suficiente ao desenvolvimento de colônias que correspondem ao microorganismo isolado.
De acordo com um modo de realização particular da presente invenção, o processo pode compreender uma etapa prévia de pré-cultura da amostra do referido meio que contém o microorganismo que se deseja isolar. Para isso, leva-se a referida amostra a uma temperatura compatível com a viabilidade dos microorganismos. Sabe-se perfeitamente que, além dos organismos que vivem às temperaturas clássicas (20 a 50 graus Celsius),existem microorganismos que vivem em condições extremas de temperaturas, de pressão parcial de gases (oxigênio, nitrogênio, gás carbônico, ...), de salinidade, de pH (ácido, básico), de condições de óxido-reduções e/ou de condições aeróbicas ou anaeróbicas. Conseqüentemente, o técnico no assunto adaptará a temperatura de cultura às exigências do organismo que cultiva. De modo mais habitual, as temperaturas de cultura podem estar compreendidas entre 20 e 50 graus Celsius, de preferência entre 30 e 40 graus Celsius. Essa etapa de pré-cultura, que tem por objetivo enriquecer o meio de cultura com microorganismos, pode ser efetuada durante um tempo muito variável em função dos microorganismos, que pode estar compreendido entre 20 minutos e 7 a 10 dias, de preferência entre 1 e 48 horas, eventualmente sob agitação.
De acordo com outro modo de realização particular da presente invenção, o processo pode compreender uma etapa adicional intercalada entre as etapas (c) e (d) do processo de acordo com a presente invenção, que consiste na imersão facultativa das esferas obtidas na esfera (c) em uma solução de enxágüe, vantajosamente aquosa, que permite eliminar o meio anterior e que permite eliminar os microorganismos não aderentes (presentes no líquido de absorção das esferas). Essa etapa permite selecionar os microorganismos mais aderentes e cuja adesão é a mais irreversível. Essa etapa pode ser também o momento oportuno para realizar tratamentos rápidos ou prolongados para testar as propriedades de adesão dos microorganismos (tratamentos preventivos ou curativos na solução de enxágüe).
O técnico no assunto sabe determinar sem dificuldade a quantidade de esferas que introduz no meio.
De acordo com a presente invenção, a incubação da etapa (b) prossegue durante um tempo que pode estar compreendido entre alguns segundos e algumas horas, de preferência entre 15 segundos e 45 minutos em função dos microorganismos.Depois desse tempo de incubação, os microorganismos puderam aderir nas partículas (esferas).
De acordo com a presente invenção, a separação das partículas e do meio na etapa (c) pode ser realizada por qualquer método conhecido do técnico no assunto. Por exemplo, é possível coletar essas partículas por centrifugação e eliminação o meio de cultura, ou ainda, e preferencialmente de acordo com a presente invenção, por meio de um sistema que gera um campo magnético ou elétrico capaz de atrair as partículas, particularmente um ímã. De acordo com essa forma de realização particularmente preferida, as partículas são coletadas por meio de um ímã, que está vantajosamente imerso na amostra.
De acordo com um modo de realização vantajoso, o sistema que gera um campo magnético ou elétrico capaz de atrair as partículas, particularmente um ímã, pode ser protegido por qualquer sistema, particularmente um revestimento removível ou uma tampa, produzido de qualquer material, por exemplo plástico, que não interfira com as ondas magnéticas ou elétricas. Mais vantajosamente ainda, a referida tampa é descartável após o uso. É possível nesse caso reutilizar esse ímã.
De acordo com outro modo de realização particular da presente invenção, o processo pode comportar uma etapa adicional de lavagem do sistema que gera um campo magnético ou elétrico a fim de eliminar os microorganismos não aderentes presentes no líquido de umedecimento, ou os microorganismos fracamente aderentes. Durante essa etapa adicional, referido sistema é imerso em uma solução de lavagem que pode ser, por exemplo, um meio de cultura estéril. O técnico no assunto compreende que essa etapa não dura, em princípio, mais de alguns segundos, no máximo alguns minutos, o tempo necessário à eliminação dos microorganismos não aderentes à superfície do sistema.
De acordo com a presente invenção, a distribuição das referidas partículas sobre um suporte compatível como o desenvolvimento dosmicroorganismos pode ser realizado por depósito das referidas partículas na superfície de um dispositivo de cultura de microorganismos, por exemplo, uma placa de Petri que contém um meio de cultura adequado ao desenvolvimento dos microorganismos.
De acordo com um modo de realização particular, o depósito pode ser realizado retirando o ímã da tampa plástica e aproximando, ao mesmo tempo, a tampa plástica da superfície do dispositivo de cultura de microorganismos.
De acordo com outro modo de realização da presente invenção, as esferas podem ser depositadas utilizando-se outro ímã situado sob a superfície do dispositivo de cultura.
Para distribuir e dispersar as esferas pode-se utilizar qualquer sistema conhecido do técnico no assunto como, por exemplo, um distribuidor manual. De acordo com um modo de realização particular, utiliza-se um ímã rotativo situado sob a superfície do dispositivo de cultura de microorganismos.
A dispersão das esferas pode também ser obtida por um vórtex líquido gerado pela rotação do dispositivo de cultura de microorganismo.
Depois da dispersão das partículas (esferas), o dispositivo de cultura é colocado em uma incubadora durante um tempo suficiente para o desenvolvimento dos microorganismos na superfície do dispositivo. Nesse caso, o técnico no assunto adaptará o tempo de incubação e a temperatura do microorganismo que deseja isolar. Esse tempo pode estar compreendido entre algumas horas e alguns dias, de preferência entre 4 horas e 48 horas. A temperatura de incubação pode estar compreendida entre 30 e 40 graus Celsius.
Breve Descrição das Figuras Outras vantagens da presente invenção aparecerão nas figuras anexas nas quais:• a figura 1 representa uma comparação dos métodos tradicionais de coleta dos microorganismos (A) e o método da presente invenção (B);
• a figura 2 representa as etapas de coleta e de enxágüe das partículas;
• a figura 3 representa o depósito das partículas na superfície da placa de Petri;
• a figura 4 representa a dispersão das partículas na superfície da placa de Petri por meio de um ímã rotativo.
Claims (12)
1. PROCESSO DE ISOLAMENTO DE PELO MENOS UM MICROORGANISMO, a partir de um meio que os contêm, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:(a) introdução em uma amostra do referido meio de umaquantidade dotada de partículas magnéticas ou magnetizáveis;(b) incubação das partículas e do meio durante um tempo suficiente para o desenvolvimento e a adesão dos microorganismos à superfície das referidas partículas; (c) separação das referidas partículas do meio;(d) distribuição das referidas partículas sobre um suporte compatível com o desenvolvimento dos microorganismos;(e) incubação das referidas partículas sobre um suporte durante um tempo suficiente ao desenvolvimento de colônias que correspondem aomicroorganismo isolado.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa prévia de pré-cultura da amostra do referido meio que contém o microorganismo que se deseja isolar, eventualmente sob agitação.
3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que se leva a referida amostra a uma temperatura compatível com a viabilidade dos microorganismos, particularmente a uma temperatura compreendida entre 20 e 50 graus Celsius, de preferência entre 30 e 40 graus Celsius.
4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que a etapa de pré-cultura tem um tempo de duração compreendido entre 20 minutos e 10 dias, de preferência entre 1 hora e 48 horas.
5. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa adicional entre as etapas (c) e (d), que consiste na imersão facultativa das esferas obtidas na etapa (c) em uma solução de enxágüe, vantajosamente aquosa.
6. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a incubação da etapa (b) é realizada durante um tempo que pode estar compreendido entre alguns segundos e algumas horas, de preferência entre 15 segundos e 45 minutos em função dos microorganismos.
7. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a separação das partículas e do meio na etapa (c) é realizada por centrifugação e eliminação do meio de cultura, ou ainda pelo uso de um sistema que gera um campo magnético ou elétrico capaz de atrair as partículas.
8. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a separação das partículas e do meio na etapa (c) é realizada por meio de um ímã.
9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o ímã está imerso na amostra.
10. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o sistema que gera um campo magnético ou elétrico capaz de atrair as partículas, está protegido, particularmente por um revestimento removível ou uma tampa.
11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o referido revestimento removível ou tampa é descartável.
12. PROCESSO, de acordo com uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que comporta uma etapa adicional de lavagem do sistema que gera um campo magnético ou elétrico.
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