CN108715816A - 一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，包括将目标菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；将菌液离心、洗涤后，用磷酸盐缓冲液重悬，获得细菌悬液；配制培养基，其中培养基中含有趋化诱导物、M9盐溶液和琼脂，趋化诱导物的浓度为1~7.5mM；将培养基倒入培养皿中，得半固体平板；将滤纸放置在半固体平板中心，取细菌悬液接种至滤纸片上，在28~37℃培养36~48h；其中，趋化诱导物为使植物定植于土壤中，植物分泌的糖、氨基酸、有机酸以及次级代谢物。相对于现有技术，本发明实验现象明显直观，可比性高，可一次对多种有机物进行比较，操作简便，化学试剂消耗少。

Description

一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法
技术领域
本发明属于细菌的趋化性研究技术领域，更具体地，涉及一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法。
背景技术
细菌趋向性是指有运动能力的细菌对环境中的刺激物做出靠近吸引物（正趋化性）和远离排斥物（负趋化性）的行为。正趋化性使细菌趋进有较高有机物浓度的地方，这对细菌寻找能量来源、促进自身繁殖十分重要。
细菌利用复杂有效的趋化系统趋向有利条件，增加对环境的适应性。目前相关研究大部分集中于细菌趋化性在植物根际定殖中的可能作用，趋化性在植物和细菌的相互作用过程中起着重要作用。杨姗姗等研究认为细菌趋化性机制为有运动能力的细菌，其膜表面存在各种具有专一性的化学受体、细菌可以通过它们检测到胞外环境中化学物质浓度的变化，并通过胞内的信号传递系统将感应到的化学信息转变成细胞内的信号，进而由这种信号控制细菌鞭毛的运动方向，产生相对应的趋化性运动。植物分泌的糖、氨基酸、有机酸以及次级代谢物，都可能是与植物相互作用的细菌的趋化诱导物。
细菌趋化性在诸如原位生物除污、生物膜的形成、感染的发病机制、固氮化作用、微生物在地下环境和土壤中的迁移以及微生物采油等领域的研究中具有重要意义。
植物根系分泌物中含有大量的有机物质，不仅为根际微生物的繁殖提供营养物质，同时还可作为信号分子调控根际微生物的群体结构。植物促生根际细菌菌株成功定殖根表是其发挥作用的关键，当环境中营养物质存在一定浓度梯度时，细菌出于适应环境的本能而表现出趋化性。De Weert等报道荧光假单胞菌WCS365（Pseudomonas fluorescens）对有机酸有一定的趋化作用。Rudrappa等研究报道植物根系分泌的 L-苹果酸可特异性吸引枯草芽胞杆菌 FB17。在原位生物除污领域，Pooja Singh等和Zaval’skii等人分别研究认为细菌趋化性可用于加强细菌对金属污染和萘的代谢作用，从而达到对环境修复。Li等人研究发现嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的耐药菌株的趋化性比非耐药性菌株有所降低，该发现有助于未来开发更有效的治疗方法。在基因组学领域，Wang, J等研究发现hygrocin C改变了与细菌趋化性和鞭毛相关的几个基因的转录，因此hygrocin C可以作为一种生物膜抑制剂。微生物采油领域原油黏附性菌株对原油的黏附作用可在10min以内产生；该菌株具有趋化性，可促使菌体“趋化带”现象产生。添加适量的生物表面活性剂和化学表面活性剂能显著促进菌体向原油表面聚集，促进了“趋化带”的产生，从而达到对采油微生物激活调控的目的。
目前，已有较多验证微生物趋化性的试验方法。如凌宁使用类毛细管法来检测多粘类芽孢杆菌SQR21对西瓜根系分泌的不同有机酸的趋化性；Lebenko等采用改进的诱导物琼脂柱法检测苏云金芽孢杆菌S变体和R变体对不同无机物和有机物以及松柏科的树的松针或树叶提取物的趋化性；胡小加等采用平板趋化法研究巨大芽孢杆菌A6对油菜根系分泌的有机酸和糖类的趋化性。然而这些方法所得到的实验现象不明显、不理想，且难以比较。操作方法较为繁琐，容易因操作不当引起误差。
发明内容
为克服现有验证趋化性方法一个培养皿只能验证一种有机物，对于细菌对有机物之间趋化性大小可比性不大，实验条件难以控制一致的问题，本发明提供了一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法。
本发明提供了一种研究细菌趋化性，并能够筛选出对目标细菌产生正趋化效应的信号分子的方法，使其在不同领域研究细菌趋化性和调控细菌的生命代谢活动具有重要的意义和实用价值。
本发明的上述技术目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，包括以下步骤：
S1.将目标菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；
S2.将菌液离心、洗涤后，用磷酸盐缓冲液重悬，获得细菌悬液；
S3.配制培养基，然后灭菌；其中培养基中含有趋化诱导物、M9盐溶液和0.3~0.5%琼脂，趋化诱导物的浓度为1~7.5mM；
S4.将步骤S3中灭菌的培养基倒入分隔的培养皿中，得半固体平板；
S5.将滤纸放置在步骤S4所得半固体平板中心，取步骤S2的细菌悬液接种至滤纸片上，在28~37℃培养36~48h，至出现明显的趋化环；
其中，趋化诱导物为使植物定植于土壤中，植物分泌的糖、氨基酸、有机酸以及次级代谢物。
例如，以本发明研究目标菌株在苋菜根际定殖为例，查阅文献得知苋菜根际分泌的小分子有机物有葡萄糖、乳糖、苹果酸、4-氨基丁酸、富马酸、乳酸、对苯二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸。以上物质即趋化诱导物。
优选地，步骤S2中，离心转速是3000~5000rpm，离心的时间为8~15min，所述磷酸盐缓冲液的组成为1L去离子水中含0.24g KH2PO4、1.42g Na2HPO4、8.0g NaCl、0.2g KCl；所述重悬是按25mL菌液用5mL磷酸盐缓冲液重悬。
优选地，步骤S4中，待步骤S3中灭菌的培养基的温度降至40~50℃后，倒入均匀分隔的培养皿中，得半固体平板。
优选地，步骤S2中磷酸盐缓冲液经过灭菌后使用，灭菌的条件为121℃下灭菌30min。
优选地，步骤S3中，所述M9盐溶液需先配置5×M9盐溶液，组分为1L去离子水含30gNa2HPO4、15g KH2PO4、2.5g NaCl、5g NH4Cl，稀释5倍即得M9盐溶液。
优选地，M9盐溶液灭菌后使用，所述灭菌的条件为105℃下灭菌20min。
优选地，步骤S4中，倒入培养基的量使培养基厚度与培养皿分隔界的高度平齐。
优选地，步骤S4中，所述培养皿的分隔中分别倒入不同类型的趋化诱导物，不同类型的趋化诱导物包括糖、有机酸、氨基酸或空白，培养皿均分为4格，且分隔线相互垂直。
例如，采用以上培养皿，可在不同的培养皿中，分别单独配置趋化诱导物培养基，对比研究目标菌株的趋化情况。
优选地，步骤S5中，所述细菌悬液的接种量为2µL。
优选地，所述目标菌株为有鞭毛，具有游动性的菌株。
本发明采用的是琼脂浓度为0.3%~0.5%的培养基为半固体培养基。在该琼脂浓度下且恰当的趋化诱导物浓度条件下，细菌能够利用鞭毛自由运动，模拟了土壤环境。细菌对培养基中的诱导物做出反应，使其能够向对自身有利的小分子有机物（趋化诱导物）运动，躲避对自身无用或有害的物质。因此含使细菌产生正趋化的物质的培养基上就会生长细菌，形成趋化环；反之，则不会形成趋化环。而含有对某种细菌诱导趋化作用更大的有机物的培养基上长出的细菌会更多，趋化环更大。
相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：
（1）实验现象明显直观，可比性高。
（2）可一次对多种有机物进行比较，操作简便，化学试剂消耗少。
附图说明
图1、2、3为阴沟肠杆菌在含不同小分子有机物培养基上形成的趋化环。
图4、5、6为苏云金芽孢杆菌在含不同小分子有机物培养基上形成的趋化环。
图7、8、9为巨大芽孢杆菌在含不同小分子有机物培养基上形成的趋化环。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。
实施例1：
阴沟肠杆菌对小分子有机物的趋化性
阴沟肠杆菌属生防菌中的溶磷菌的一种。欲使其在苋菜根际定殖，先研究其趋化性。
将阴沟肠杆菌菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃摇床180rpm震荡培养3~8h。取25mL菌液4000rpm离心10min，倒去上清液。再用已灭菌的磷酸盐缓冲液洗涤、离心两次后用5mL磷酸盐缓冲液重悬备用。
查阅文献得知苋菜根际分泌的小分子有机物有葡萄糖、乳糖、苹果酸、4-氨基丁酸、富马酸、乳酸、对苯二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸。用M9盐溶液分别配制含上述小分子有机物5mM 并含0.4%琼脂的培养基，灭菌后冷却至40℃左右，倒入均匀分隔成四个扇形的培养皿中（四个分隔倒入含不同有机物的培养基，最好使同一培养基中的有机物的类型不同，比如一种糖、一种有机酸、一种氨基酸和空白搭配）。在无菌操作台至少放置30min后将一已灭菌的直径为8mm的圆形滤纸片放置在培养皿中心，取2µL菌液接种至滤纸片上。30℃培养48h。培养皿上生长出的趋化环，3次交叉测量其半径，求平均值，每个处理最终再取3个重复的平均值。实验现象如图1、2、3所示。
实施例2：
苏云金芽孢杆菌对小分子有机物的趋化性
将苏云金芽孢杆菌菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃摇床180rpm震荡培养8~12h。取25mL菌液4000rpm离心10min，倒去上清液。再用已灭菌的磷酸盐缓冲液洗涤、离心两次后用5mL磷酸盐缓冲液重悬备用。
查阅文献得知苋菜根际分泌的小分子有机物有葡萄糖、乳糖、苹果酸、4-氨基丁酸、富马酸、乳酸、对苯二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸。用M9盐溶液分别配制含上述小分子有机物5mM 并含0.4%琼脂的培养基，灭菌后冷却至40℃左右，倒入均匀分隔成四个扇形的培养皿中（四个分隔倒入含不同有机物的培养基，最好使同一培养基中的有机物的类型不同，比如一种糖、一种有机酸、一种氨基酸和空白搭配）。在无菌操作台至少放置30min后将一已灭菌的直径为8mm的圆形滤纸片放置在培养皿中心，取2µL菌液接种至滤纸片上。30℃培养48h。培养皿上生长出的趋化环，3次交叉测量其半径，求平均值，每个处理最终再取3个重复的平均值。实验现象如图4、5、6所示。
实施例3：
巨大芽孢杆菌对小分子有机物的趋化性
将巨大芽孢杆菌菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，在30℃摇床180rpm震荡培养2~8h。取25mL菌液4000rpm离心10min，倒去上清液。再用已灭菌的磷酸盐缓冲液洗涤、离心两次后用5mL磷酸盐缓冲液重悬备用。
查阅文献得知苋菜根际分泌的小分子有机物有葡萄糖、乳糖、苹果酸、4-氨基丁酸、富马酸、乳酸、对苯二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、亮氨酸。用M9盐溶液分别配制含上述小分子有机物5mM（分别单独配置上述小分子有机物各5mM）并含0.4%琼脂的培养基，灭菌后冷却至40℃左右，倒入均匀分隔成四个扇形的培养皿中（四个分隔倒入含不同有机物的培养基，最好使同一培养基中的有机物的类型不同，比如一种糖、一种有机酸、一种氨基酸和空白搭配）。在无菌操作台至少放置30min后将一已灭菌的直径为8mm的圆形滤纸片放置在培养皿中心，取2µL菌液接种至滤纸片上。30℃培养48h。培养皿上生长出的趋化环，3次交叉测量其半径，求平均值，每个处理最终再取3个重复的平均值。实验现象如图7、8、9所示。
表1 三种菌所形成的趋化环半径（mm）
由表1数据可见，对于阴沟肠杆菌，其对葡萄糖的趋化性最好，其次是苹果酸；苏云金芽孢杆菌对乳酸的趋化性最好，其次是富马酸；巨大芽孢杆菌对葡萄糖的趋化性最好，其次是丙氨酸。
本发明提供的方法对研究细菌趋化性，并能够筛选出对目标细菌产生正趋化效应的信号分子具有实用意义，且实验现象明显直观，可比性高。可一次对多种有机物进行比较，操作简便，化学试剂消耗少，对不同领域研究细菌趋化性和调控细菌的生命代谢活动具有重要的指导意义和实用价值。

Claims (10)

1.一种诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.将目标菌株接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；
S2.将菌液离心、洗涤后，用磷酸盐缓冲液重悬，获得细菌悬液；
S3.配制培养基，然后灭菌；其中培养基中含有趋化诱导物、M9盐溶液和0.3~0.5%琼脂，趋化诱导物的浓度为1~7.5mM；
S4.将步骤S3中灭菌的培养基倒入分隔的培养皿中，得半固体平板；
S5.将滤纸放置在步骤S4所得半固体平板中心，取步骤S2的细菌悬液接种至滤纸片上，在28~37℃培养36~48h，至出现明显的趋化环；
其中，趋化诱导物为使植物定植于土壤中，植物分泌的糖、氨基酸、有机酸以及次级代谢物。
2.根据权利要求1所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，步骤S2中，离心转速是3000~5000rpm，离心的时间为8~15min，所述磷酸盐缓冲液的组成为1L去离子水中含0.24g KH2PO4、1.42g Na2HPO4、8.0g NaCl、0.2g KCl；所述重悬是按25mL菌液用5mL磷酸盐缓冲液重悬。
3.根据权利要求1所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，步骤S4中，待步骤S3中灭菌的培养基的温度降至40~50℃后，倒入均匀分隔的培养皿中，得半固体平板。
4.根据权利要求2所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，步骤S2中磷酸盐缓冲液经过灭菌后使用，灭菌的条件为121℃下灭菌30min。
5.根据权利要求1所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，步骤S3中，所述M9盐溶液需先配置5×M9盐溶液，组分为1L去离子水含30g Na2HPO4、15gKH2PO4、2.5g NaCl、5g NH4Cl，稀释5倍即得M9盐溶液。
6.根据权利要求5所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，M9盐溶液灭菌后使用，所述灭菌的条件为105℃下灭菌20min。
7.根据权利要求1所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，步骤S4中，倒入培养基的量使培养基厚度与培养皿分隔界的高度平齐。
8.根据权利要求1或7所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，步骤S4中，所述培养皿的分隔中分别倒入不同类型的趋化诱导物，不同类型的趋化诱导物包括糖、有机酸、氨基酸或空白，培养皿均分为4格，且分隔线相互垂直。
9.根据权利要求1所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，步骤S5中，所述细菌悬液的接种量为2µL。
10.根据权利要求1或7所述的诱导目标菌株在半固体平板上形成趋化环的方法，其特征在于，所述目标菌株为有鞭毛，具有游动性的菌株。
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