CN116083191A - 一种利用梭菌趋化性减控浓香型白酒发酵过程乳酸积累的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用梭菌趋化性减控浓香型白酒发酵过程乳酸积累的方法,属于发酵领域。本发明在浓香型白酒窖泥来源的梭菌中筛选了1株具有趋向性且能减控乳酸的酪丁酸梭菌ZY‑4,在可用于食品发酵体系的碳源、氮源中筛选出了5种作为趋化剂,即L‑半胱氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、蔗糖、乙酸。通过向酒醅中加入10mmol·kg‑1趋化剂可使酪丁酸梭菌ZY‑4利用趋向性主动迁移至酒醅中,对于植物乳杆菌强化的酒醅也能够发挥良好的减控作用。本发明的方法可以使梭菌利用趋向性将酒醅中积累的乳酸减控至合适的范围,这对工业化减控酒醅中的乳酸具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用梭菌趋化性减控浓香型白酒发酵过程乳酸积累的方法,属于发酵领域。
背景技术
白酒是一个有特殊风味的多组分体系,该体系中各风味物质按一定比例组成了香味协调、风味独特的白酒。浓香型白酒是以己酸乙酯为主体风味物质的多组分体系,其中乳酸乙酯对浓香型白酒的呈香呈味具有重要贡献。若乳酸乙酯含量过高使得乳酸乙酯与己酸乙酯的比例失调,会使酒体放香不足且带有酸涩味和闷甜感,改变白酒的风味,严重影响白酒的品质。乳酸是合成乳酸乙酯的前体物质,通过减控白酒酒醅中的乳酸而减少乳酸乙酯的合成,是降低白酒中乳酸乙酯含量的一种有效途径。另外,通过减控白酒酒醅中乳酸的积累,可以有效缓解酒醅中乳酸过量积累对酒醅酸度、微生物群落和发酵进程的影响。
目前减控酒醅中乳酸积累的方法主要有三种:1、调控大曲。通过调控大曲发酵的温度和时间、存曲时大曲储存的环境、入池发酵时大曲的用量,可以有效控制大曲中乳酸菌的量,从而减控发酵过程中中乳酸的积累。虽然调控大曲能在源头上减少乳酸菌的量从而达到“降乳”效果,但是改变大曲的理化指标和用量会影响其他微生物的积累,最终对发酵过程有一定的影响。2、调整发酵工艺。酒醅中乳酸的积累与发酵过程中该发酵工艺的营养条件和环境条件密切相关。通过改变原料的粉碎度、投水量、入池淀粉含量、糟醅用量、生产用水硬度、入池温度、入池酸度、含氧量等,可以在一定程度上“降乳”。但这样的调控方法会对发酵过程的其他方面造成影响,耗时耗力,效率较低。3、利用微生物。在发酵过程中加入能利用乳酸的微生物,如能以乳酸为碳源的微生物或能将乳酸代谢为其他有利于白酒呈香呈味的物质的微生物,不仅能有效减控酒醅中的乳酸,还具有经济效益,是具有前景的工业化减控酒醅中乳酸积累的方法。由此可见,利用微生物的生长代谢减控酒醅中乳酸的积累的方法是既具经济效益又能广泛应用的。
梭菌属(Clostridium)微生物是浓香型白酒发酵体系中常见的微生物,其中80%的梭菌属微生物具有鞭毛拥有运动能力,还有一部分梭菌属微生物能代谢乳酸产生丁酸、乙酸等对浓香型白酒风味有重要贡献的物质。在具有运动能力的梭菌中,有部分菌株受到酒醅中的化合物吸引,通过自身运动主动迁移到酒醅当中,此即梭菌的趋化性,也称趋向性。利用梭菌的趋向性,向酒醅中加入少量的趋化剂,吸引窖泥中的梭菌主动迁移到酒醅中代谢酒醅中的乳酸产生乙酸、丁酸等物质,成为减控酒醅中乳酸的一种新的途径。
发明内容
本发明提供了一种减少浓香型白酒酒醅中乳酸含量的方法,所述方法是在含趋化剂的窖泥、含酪酸梭菌的酒醅中进行浓香型白酒的发酵;所述酒醅被投入至含窖泥的窖池内发酵。
在一种实施方式中,所述酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)ZY-4公开于论文《窖泥梭菌扰动减控白酒发酵过程正丁醇生成》中,申请人承诺自申请日起20年内在合法途径下向公众发放该菌株。
在一种实施方式中,所述趋化剂为L-半胱氨酸、谷氨酸、蔗糖、乙酸或谷胱甘肽。
在一种实施方式中,所述趋化剂在酒醅中的终浓度≥10mmoL·kg-1。
在一种实施方式中,所述趋化剂在酒醅中的终浓度为10~20mmoL·kg-1。
在一种实施方式中,所述酒醅中含有终浓度为1×105~1×106CFU·g-1的植物乳杆菌(Lactobacillus planterum)。
在一种实施方式中,所述方法是在酒醅中添加所述趋化剂,并在窖泥中添加所述酪丁酸梭菌ZY-4进行发酵。
在一种实施方式中,所述酪丁酸梭菌ZY-4在酒醅中的浓度为1×105~1×106CFU·g-1。
本发明还提供所述方法在浓香型白酒生产中的应用。
本发明还提供了趋化剂和酪丁酸梭菌在减少浓香型酒醅中的乳酸含量方面的应用。
在一种实施方式中,所述应用是在含趋化剂的窖泥、含酪酸梭菌的酒醅环境下进行浓香型白酒的发酵。
有益效果:
本发明从浓香型白酒窖泥来源的梭菌中筛选了1株具有趋向性且能减控乳酸并增加丁酸的酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum)ZY-4,从可用于食品发酵体系的碳源、氮源中筛选出了L-半胱氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、蔗糖、乙酸5种趋化剂。通过向酒醅中加入10mM趋化剂可使酪丁酸梭菌ZY-4利用趋向性主动迁移至酒醅中,在L-半胱氨酸、谷胱甘肽、乙酸的趋化下乳酸的减控率可分别达47.40%、42.91%、34.80%,丁酸含量可分别提高170.39%、175.19%、202.76%。
本发明还验证了趋化剂和酪丁酸梭菌ZY-4共同减控植物乳杆菌JP3强化的酒醅中乳酸的效果,酪丁酸梭菌ZY-4在谷胱甘肽、蔗糖或乙酸的趋化作用下,能分别使酒醅中的乳酸减少48.60%、41.50%、40.46%。因此,向酒醅中加入少量趋化剂,可以使梭菌利用趋向性将酒醅中积累的乳酸减控至合适的范围,这对工业化减控酒醅中的乳酸具有重要意义。
附图说明
图1为趋化剂L-半胱氨酸对梭菌的趋化效果,图中(1)为无梭菌的空白对照,(2)为不具趋向性的菌在平板上的运动情况,(3)为具有趋向性梭菌的在平板上的运动情况。
图2为具有趋向性的梭菌在降乳培养基中的乳酸含量变化。
图3为不同趋化剂对具有趋向性的梭菌的趋化作用。
图4为梭菌利用趋向性对酒醅中的乳酸的减控效果,图中对照1为酒醅原始乳酸含量,对照2为有梭菌无趋化剂发酵后的酒醅中乳酸含量,(a)为酪丁酸梭菌ZY-4,(b)为柯加梭菌7D-18,(c)为快生梭菌7D-2。
图5为梭菌利用趋向性对植物乳杆菌JP3在酒醅体系中产生的乳酸的减控效果,图中对照1为植物乳杆菌JP3在酒醅体系中产生的乳酸,对照2为有梭菌无趋化剂发酵后的乳酸含量,(a)为酪丁酸梭菌ZY-4,(b)为糖霜梭菌ZD-F,(c)为柯加梭菌7D-18,(d)为快生梭菌7D-2。
图6为梭菌利用趋向性对白酒发酵过程中产生的乳酸的减控效果,图中对照1为白酒发酵过程中产生的乳酸,对照2为有梭菌无趋化剂发酵后的乳酸含量,(a)为酪丁酸梭菌ZY-4,(b)为糖霜梭菌ZD-F。
图7为不同浓度的趋化剂对酪丁酸梭菌的趋化作用。
具体实施方式
实施例中使用的菌株分离自浓香型白酒窖泥,其中,酪丁酸梭菌(Clostridiumtyrobutyricum)ZY-4公开于论文《窖泥梭菌扰动减控白酒发酵过程正丁醇生成》中;植物乳杆菌JP3公开于论文《洋河浓香型白酒酒醅中产酸细菌与有机酸合成的相关性研究》中。
乳酸含量检测方法:采用高效液相色谱检测乳酸含量,具体条件为:色谱柱:有机酸柱;柱温:40℃;流动相:10mmoL·L-1稀硫酸;洗脱速度:0.5mL·min-1;紫外检测器:检测波长210nm;进样体积:10μL;检测时间:30min。
减控率的计算:[(乳酸浓度1-乳酸浓度2)/乳酸浓度1]×100%;其中,乳酸浓度1(g·kg-1):不添加趋化剂和梭菌的对照组的乳酸浓度;乳酸浓度2(g·kg-1):既有趋化剂又有梭菌的实验组的乳酸浓度。
强化梭菌培养基(RCM培养基)(g·L-1):胰蛋白胨10.0,牛肉粉10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化钠5.0,醋酸钠3.0,L-半胱氨酸盐酸盐0.5。
降乳培养基(g·L-1):胰蛋白胨10.0,牛肉粉10.0,酵母粉3.0,葡萄糖5.0,可溶性淀粉1.0,氯化钠5.0,醋酸钠3.0,L-半胱氨酸盐酸盐0.5,乳酸5.0。
实施例1菌株的筛选
(1)具有趋向性的梭菌的筛选
将实验前期获得的分离自浓香型白酒窖泥的15株梭菌属微生物在RCM培养基中在37℃、厌氧的条件下培养24~36h至对数期。取培养好的菌液1ml,6000r·min-1离心5min,生理盐水清洗2次,最后加入1.0ml的生理盐水混匀,制成1×108CFU·mL-1菌悬液备用。将0.5mL菌悬液添加至15mL温度为30~40℃的半固体纯琼脂当中,混匀后倒入平板当中。待琼脂凝固后,在琼脂平板上放置含有趋化剂L-半胱氨酸的琼脂片(添加终浓度10mM L-半胱氨酸至浓度为2g·L-1的琼脂当中,待其凝固打孔制备)。37℃厌氧条件下放置12h后观察菌株自主迁移的情况。
由于趋化剂琼脂片在琼脂平板上以不同浓度梯度进行扩散,具有趋向性的梭菌会向趋化剂迁移并在适宜的趋化剂浓度处形成菌环。结果表明,酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)ZY-4、糖霜梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)ZD-F、柯加梭菌(C.kogasensis)7D-18、快生梭菌(C.celerecresens)7D-2、楔形梭菌(C.sphenoides)W4-7、煎盘梭菌(C.sartagoforme)W6-38、小肠梭菌(C.intestinale)W3-5、丁酸梭菌(C.butyricum)W6-55、匙形梭菌(C.cochleatum)ZB-438、解淀粉梭菌(C.amylolyticum)W1-7在趋化剂的作用下在平板上形成菌环,即具有趋向性。
(2)能减控乳酸的梭菌的筛选
分别向降乳培养基中加入105~106CFU·mL-1步骤(1)筛选出的具有趋向性的梭菌属微生物,37℃厌氧培养3~4d,取1mL发酵液,8000r·min-1离心6min,用0.22μm水系滤膜过滤上清液后取1mL样品待测,用高效液相色谱法测定发酵液和降乳培养基的乳酸浓度,筛选出能利用乳酸的菌株。
结果如图2所示,糖霜梭菌(C.saccharoperbutylacetonicum)ZD-F、柯加梭菌(C.kogasensis)7D-18、酪丁酸梭菌(C.tyrobutyricum)ZY-4、快生梭菌(C.celerecresens)7D-2具有减控降乳培养基中乳酸的能力。
实施例2:趋化剂的选择
按照实施例1步骤(1)的方法分别制备柯加梭菌7D-18、酪丁酸梭菌ZY-4、快生梭菌7D-2、糖霜梭菌ZD-F的菌悬液,并按实施例1步骤(1)的方法制备分别混有各菌株菌悬液的半固体琼脂平板。分别在半固体琼脂平板中加入含有终浓度为10mM的趋化剂(L-半胱氨酸、甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷胱甘肽、蔗糖、乳糖、乙酸、丁酸或可溶性淀粉)的琼脂片。37℃厌氧条件下放置12h后观察菌株自主迁移的情况。
结果如图3所示,终浓度为10mM的L-半胱氨酸、谷氨酸、蔗糖、乙酸、谷胱甘肽均对4株梭菌具有趋化作用。
实施例3:梭菌利用趋向性减少酒醅中的乳酸含量
在50mL离心管内壁附着一层4~6mm的灭菌后的窖泥,分别向其中加入酪丁酸梭菌ZY-4、柯加梭菌7D-18、快生梭菌7D-2,使各菌株的终浓度为1×105~1×106CFU·g-1。称取20.0g酒醅,分别加入趋化剂L-半胱氨酸、谷氨酸、蔗糖、乙酸、谷胱甘肽,并使趋化剂在酒醅中的终浓度为10mM。将离心管密封并置于37℃恒温培养箱中,厌氧培养4~5d。发酵结束后,制备酒醅浸提液,即称取5.0g酒醅,加入15mL超纯水,冰浴超声30min,4℃下10000r·min-1离心5min,用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤上清液后取1mL样品待测,通过高效液相色谱法分析酒醅浸提液的乳酸、乙酸和丁酸的含量,分析不同趋化剂趋化梭菌减控酒醅中乳酸的效果。分别以原始酒醅按上述相同条件发酵为对照1,以不添加趋化剂、仅加入梭菌为对照2。
结果如图4所示,酪丁酸梭菌ZY-4在五种趋化剂的趋化作用下,减控酒醅中的乳酸的效果均比无趋化剂作用的效果好,在L-半胱氨酸、谷胱甘肽、乙酸的趋化下,乳酸减控率可分别达47.40%、42.91%、34.80%,丁酸含量相比于对照2分别提高170.39%、175.19%、202.76%。
实施例4:梭菌利用趋向性减控乳酸菌在酒醅体系中产生的乳酸
在50mL离心管内壁附着一层4~6mm的灭菌后的窖泥,分别向其中加入酪丁酸梭菌ZY-4、柯加梭菌7D-18、糖霜梭菌ZD-F、快生梭菌7D-2,使其浓度为1×105~1×106CFU·g-1。称取20.0g酒醅,向其中添加在酒醅中终浓度为1×105~1×106CFU·g-1的植物乳杆菌(Lactobacillus planterum)JP3,分别加入趋化剂L-半胱氨酸、谷氨酸、蔗糖、乙酸、谷胱甘肽,并使趋化剂在酒醅中的终浓度为10mM。将离心管密封并置于37℃恒温培养箱中,厌氧培养4~5d。发酵结束后,制备酒醅浸提液,即称取5.0g酒醅,加入15mL超纯水,冰浴超声30min,4℃下10000r·min-1离心5min,用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤上清液后取1mL样品待测,通过高效液相色谱法分析酒醅浸提液的乳酸、乙酸和丁酸的含量,分析不同趋化剂趋化梭菌减控酒醅中乳酸的效果。参照上述相同步骤建立对照组,区别在于,对照组1不添加趋化剂和酪酸梭菌,对照组2仅不添加趋化剂。
植物乳杆菌是浓香型白酒发酵过程中酒醅中的优势细菌之一。将植物乳杆菌JP3强化至酒醅体系中,结果如图5所示,五种趋化剂均能趋化酪丁酸梭菌ZY-4减控植物乳杆菌JP3在发酵过程中产生的乳酸,减控率为34.92%~48.60%。以谷胱甘肽、蔗糖或乙酸为趋化剂时,酪丁酸梭菌ZY-4利用趋向性减控植物乳杆菌JP3在发酵过程中产生的乳酸的效果较显著,能分别减控48.60%、41.50%、40.46%的乳酸。
实施例5:梭菌利用趋向性减控白酒发酵过程中积累的乳酸
在50mL离心管内壁附着一层4~6mm的灭菌后的窖泥,分别向其中加入酪丁酸梭菌ZY-4、糖霜梭菌ZD-F,使其浓度为1×105~1×106CFU·g-1。称取20.0g酒醅,向其中添加占酒醅质量1/16(w/w)的中温大曲,混合后分别加入实施例2中选择的趋化剂,并使趋化剂在酒醅中的终浓度为10mM。将离心管密封并置于37℃恒温培养箱中,厌氧培养4~5d。发酵结束后,制备酒醅浸提液,即称取5.0g酒醅,加入15mL超纯水,冰浴超声30min,4℃下10000r·min-1离心5min,用孔径为0.22μm的水系滤膜过滤上清液后取1mL样品待测,通过高效液相色谱法分析酒醅浸提液的乳酸、乙酸和丁酸的含量,分析不同趋化剂趋化梭菌减控乳酸的效果。参照上述相同步骤建立对照组,区别在于,对照组1不添加趋化剂和酪酸梭菌,对照组2仅不添加趋化剂。
大曲中含多种微生物,是保证浓香型白酒发酵过程正常进行的糖化发酵剂。将酒醅和大曲按一定比例拌和均匀,模拟浓香型白酒窖池内的正常发酵。结果表明(图6),酪丁酸梭菌ZY-4在L-半胱氨酸、乙酸、谷氨酸或谷胱甘肽的趋化下,能减控浓香型白酒发酵过程中积累的乳酸的12.42%~29.91%,并利用乳酸生成丁酸,使丁酸含量相比对照2提高175.53~587.50%。以L-半胱氨酸为趋化剂时,酪丁酸梭菌ZY-4利用趋化性减控白酒发酵过程中积累的乳酸的效果较显著,减控率为29.91%,丁酸含量较对照2提高263.57%。
对比例:不同剂量的趋化剂对菌体趋化作用的影响
具体实施方式同实施例1中的步骤(1),区别在于,调整趋化剂L-半胱氨酸的用量分别为5mM、10mM、20mM,结果如图7所示,梭菌在10mM L-半胱氨酸的趋化作用下形成的菌环(直径为22.29±0.6mm)比在5mM L-半胱氨酸的趋化作用下形成的菌环(直径为15.14±1.3mm)大,且与在20mM L-半胱氨酸的趋化作用下形成的菌环(直径为22.89±1.1mm)的大小无显著差异,故选择趋化剂浓度为10mM。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种减少浓香型白酒酒醅中乳酸含量的方法,其特征在于,向窖泥中加入趋化剂,并向酒醅中加入酪丁酸梭菌(Clostridium tyrobutyricum),再进行浓香型白酒的发酵;所述趋化剂包括但不限于L-半胱氨酸、谷氨酸、蔗糖、乙酸、谷胱甘肽中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酪丁酸梭菌为酪丁酸梭菌ZY-4。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于,所述趋化剂为L-半胱氨酸、谷氨酸、蔗糖、乙酸或谷胱甘肽。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述趋化剂在酒醅中的终浓度≥10mmoL·kg-1。
5.根据权利要求2或4所述的方法,其特征在于,所述酪丁酸梭菌ZY-4在酒醅中的浓度为1×105~1×106CFU·g-1。
6.权利要求1~5任一所述方法在浓香型白酒生产中的应用。
7.趋化剂和酪丁酸梭菌在减少浓香型酒醅中的乳酸并增加丁酸方面的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述应用是在含趋化剂的窖泥、含酪丁酸梭菌的酒醅中进行浓香型白酒的发酵;所述趋化剂为L-半胱氨酸、谷氨酸、蔗糖、乙酸或谷胱甘肽。
9.根据权利要求7或8所述的应用,其特征在于,所述酪丁酸梭菌为酪丁酸梭菌ZY-4。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,所述酪丁酸梭菌ZY-4在酒醅中的浓度为1×105~1×106CFU·g-1。
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