CN111088189A - 一种快速富集窖泥不产异嗅物质功能菌群的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速富集窖泥不产异嗅物质功能菌群的方法及其应用，属于酿造微生物技术领域。本发明使用经测试筛选的质量较优的老窖泥为种泥，采用特定培养基对所选定的优质窖泥进行逐级扩大培养。所获得的菌群是以瘤胃梭菌群为主体的产己酸菌群，且该菌群不生成泥臭味物质4‑甲基苯酚。本发明方法所获得的混合菌群可用于无窖泥体系的固态酒醅发酵过程，能显著提升酒醅的有益风味物质含量，避免了窖泥中不良风味物质的生成，从而提升原酒的品质。混合菌群也可用于人工窖泥的培养过程以及日常的维护保养窖泥过程中，以增加窖池中的产己酸主体菌群，促进窖泥老熟，防止窖泥老化、板结，同时有效降低泥臭味物质4‑甲基苯酚的产生。

Description

一种快速富集窖泥不产异嗅物质功能菌群的方法及其应用

技术领域

本发明公开了一种快速富集窖泥不产异嗅物质功能菌群的方法及其应用，属于酿造微生物技术领域。

背景技术

在浓香型白酒生产中，窖池是浓香型白酒酿造的基础，而窖泥质量很大程度上决定了白酒的品质。近年来对不同质量差异窖泥的研究表明，质量较优的窖泥的微生物类群主要集中在梭菌纲、拟杆菌纲和产甲烷菌群，且梭菌纲中的产己酸菌属(Caproiciproducens)的相对丰度占比较高，一般可达到20％左右，这些产己酸菌属是窖泥中利用乳酸代谢生成己酸的优势菌群。同时对窖泥的理化测试分析表明，质量较优的窖泥在感官上呈现青灰色且具有较浓的酯香味，具有近中性的pH值(5.0～7.0)，较低的乳酸含量(<30g/kg)和较高的己酸含量(>6g/kg)。参考文献如下：

Hu,X.L.,Du,H.,Ren,C.,Xu,Y.,2016.Illuminating anaerobic microbialcommunity and cooccurrence patterns across a quality gradient in Chineseliquor fermentation pit muds.Appl.Environ.Microbiol.82,2506-2515.

Tao,Y.,Li,J.,Rui,J.,Xu,Z.,Zhou,Y.,Hu,X.,Wang,X.,Liu,M.,Li,D.,Li,X.,2014.Prokaryotic communities in pit mud from different-aged cellars used forthe production of Chinese Strong-flavored liquor.Appl.Environ.Microbiol.80,2254-2260.。

目前已报道的有关窖泥功能菌株产己酸菌属的应用，大部分基于单菌株的应用，例如以乳酸为底物生成己酸的瘤胃梭菌Clostridium sp.CPC-11、Clostridium sp.CPB-6菌株，以乳酸为底物生成丁酸的毛螺旋菌科Clostridium XIVa属细菌Clostridiumsp.BPY5。但这些菌株的分离过程较为复杂，需要反复多次的稀释涂布分离。此外，这些单菌株在厌氧培养过程中容易污染杂菌，且在酿造体系应用中，单个菌株与窖泥复杂的本土微生物存在较为强烈的竞争作用，可能在某些情况下无法真正发挥作用。专利CN 105385644中虽然采用了降解乳酸合成己酸的的混合菌剂进行窖池养护应用，但是混合菌剂由酪丁酸梭菌、生孢梭菌和克氏梭菌组成，这些菌株一般在正常窖泥中的相对丰度占比较低，即所提供的混合菌剂并非是窖泥的主体降解乳酸生成己酸的菌群。

窖泥在长期使用过程中，一方面贡献了大量的有益风味物质，如己酸、己酸乙酯等，但其产生的泥臭味却显著降低了浓香型原酒的品质。徐岩课题组已确认产生窖泥臭的化合物是4-甲基苯酚，明确了窖泥是4-甲基苯酚的主要来源，而窖泥中产4-甲基苯酚的主要微生物来源为部分梭菌纲的微生物。如何减轻窖泥中异嗅物质4-甲基苯酚的生成已成为酿酒行业关注的焦点。从开放式的酿造环境中直接剔除已存在的产4-甲基苯酚菌株难度较大，而用不产4-甲基苯酚的菌群抢占产PC菌群的生态位则为可行有效的措施之一。因此本领域需要开发出能快速富集窖泥中不产4-甲基苯酚而且产有益风味物质的功能菌群的技术，即富集的功能菌群不仅能生成大量的有益风味物质，且不生成导致泥臭味的4-甲基苯酚。

发明内容

本发明提供了一种快速富集窖泥中不产4-甲基苯酚且产有益风味物质的功能菌群的方法，不需从窖泥中分离纯化单个功能菌株，避免其染菌而受到污染的情况。所获得的混合菌群为窖泥中产有益风味物质的主体菌群，且该菌群不产泥臭味物质4-甲基苯酚。

本发明的快速富集窖泥不产异嗅物质功能菌群的方法，主要是：将窖泥接种至复合培养基中进行逐级扩大培养；所述的复合培养基由黄水和MM培养基配方组成，黄水用量占比为20％～50％，MM培养基占比为50％～80％，使用前调节pH为5.0～6.0；每级种子液的扩培时间为1d～3d。

在一种实施方式中，用于接种的窖泥：选择的窖泥窖龄一般在20年以上，窖泥的pH值为5.0～7.0，且通过测定窖泥的己酸、乳酸含量，综合选择己酸含量高(大于6g/kg)、而乳酸(小于30g/kg)的窖泥作为后续种子窖泥。

在一种实施方式中，黄水无须灭菌，调节pH为5～6后直接使用。

在一种实施方式中，所述MM培养基成分(g/L):(NH₄)₂SO₄ 1.5-2.5，MgSO₄﹒7H₂O0.1-0.3，NaH₂PO₄﹒2H₂O 0.2～0.5，CaCl₂﹒2H₂O 0.05～0.2，K₂HPO₄ 0.2～1.0,酵母粉0.5～2，半胱氨酸0.1～0.3，微量营养液0.3～0.5mL/L。其中的微量营养液组成(mg/L)为:FeSO₄1500～2500，ZnCl₂ 20～100，MnCl₂·4H₂O 200～800，CuCl₂·H₂O 20～50，(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 20～100，CoCl₂·6H₂O 1500～2500，NiCl₂·6H₂0 20～100，Na₂SeO₃·5H₂0 50～200。

可选地，所述MM培养基成分(g/L)具体是:(NH₄)₂SO₄ 2.0，MgSO₄﹒7H₂O 0.2，NaH₂PO₄﹒2H₂O 0.5，CaCl₂﹒2H₂O 0.1，K₂HPO₄ 0.5,酵母粉1.0，半胱氨酸0.25，微量营养液0.3ml/L。

微量营养液组成(mg/L):FeSO₄ 2000，ZnCl₂ 50，MnCl₂·4H₂O 500，CuCl₂·H₂O 30，(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O 50，CoCl₂·6H₂O 2000，NiCl₂·6H₂O 50，Na₂SeO₃·5H₂O 100。

在一种实施方式中，所述逐级扩大培养包括，窖泥初级种子液和一级种子液在厌氧条件下培养，厌氧培养温度控制在30～37℃，初级种子液中的窖泥接种量为1～3％。后续种子液的接种量为10％。

在一种实施方式中，所述扩培是扩培3级以上。

采用上述逐级扩大培养的方法，获得的窖泥的主体菌群为利用乳酸生成己酸的产己酸菌属(Caproiciproducens)，该菌群的相对丰度可达到50％以上。对逐级扩大培养发酵液的代谢物测试表明，发酵液的主产物为己酸，放大培养过程中无4-甲基苯酚产生，即所获得的菌群并不生成异嗅物质4-甲基苯酚。

本发明还提供了上述从窖泥中富集出的功能菌群在白酒酿造体系中的应用，即提供了一种利用上述菌群的白酒酿造生产方法。

所述的白酒酿造生产方法，包括在白酒发酵过程中应用上述功能菌群。

在一种实施方式中，所述功能菌群应用在无窖泥体系的固态酒醅发酵过程中。

在一种实施方式中，所述白酒酿造生产方法，包括在酒醅入发酵容器前，加入一定量的利用本发明的快速富集窖泥不产异嗅物质功能菌群的方法富集得到的功能菌液置于容器底部，之后共同发酵。该方法能显著提升酒醅的有益风味物质含量，去除窖泥中的不良泥臭味物质成分，从而提升原酒的品质。

本发明还提供了一种人工窖泥的培养方法或者维护保养窖泥的方法，所述方法包括：在人工窖泥的培养过程中或者维护保养窖泥的过程中，加入一定量的利用本发明的快速富集窖泥不产异嗅物质功能菌群的方法富集得到的功能菌液。该方法，通过增加窖泥中的瘤胃主体菌群，一方面促进窖泥和酒醅中的乳酸转化为己酸，并生成其他有益风味物质，另一方面减轻窖泥的泥臭味物质4-甲基苯酚的生成，同时促进窖泥老熟，防止窖泥老化、板结。

本发明的有益效果：

1)采用本发明方法所富集的不产PC的窖泥功能菌群的主体微生物为产己酸菌属(Caproiciproducen)，高通量测序结果显示这些产己酸菌属的相对丰度占比达到50％以上，这些产己酸菌属可将发酵液中的乳酸完全转化为己酸，且该过程中不产生泥臭味物质4-甲基苯酚。所获得的菌群与菌株相比，抗干扰能力强，所产生的有益风味物质种类丰富(如含有辛酸乙酯、苯丙酸乙酯、己醇、丁醇等)，不局限于仅生成丁酸、己酸及其乙酯类物质。

2)可在半开放的操作环境中进行，操作成本较低，操作方式较为简单，尤其是培养基中使用的黄水无需灭菌或蒸煮，从而节约成本，降低操作难度。

3)富集窖泥的重要功能菌群，所需要的窖泥初始接种量非常少，减少对优质原始老窖泥的破坏。即通过降低优质老窖泥的接种量，进而保护优质窖泥资源。

4)可在较短的时间内培育得到不产PC的窖泥功能菌群。通过逐级放大培养，在7～10d内，即可得到100L以上的功能菌液，适于工业化应用。

5)采用该法得到的窖泥功能菌群可用于人工窖泥的培养过程中，也可用于日常的维护保养窖池工艺中，以增加窖池中的产己酸的主体功能菌群，促进窖泥老熟，防止窖泥老化、板结。

附图说明

图1富集的功能菌群的属水平菌群结构；

图2酒醅中添加菌液组与对照组的挥发性组分含量比较。图中的C1、C2、C3代表对照组发酵结束后的3个黄水平行样本；A1、A2、A3分别代表添加菌液组发酵结束时的3个黄水平行样本。

具体实施方式

实施例1富集窖泥功能菌群的方法

窖泥样本的选择：选择的窖泥窖龄一般在20年以上，取样池底窖泥，取样深度为0～3cm，采用厌氧取样袋取约100g左右新鲜窖泥，留取适量样本测定窖泥中的pH、己酸、乳酸含量，剩余样本置于-20℃冰箱储存备用。综合选择pH为5.0～7.0的窖泥，且选择己酸含量高、而乳酸含量低的窖泥作为后续种子窖泥。

本实施例中具体用到的窖泥参数如下表1：

表1 窖泥参数

(注：以上参数参照文献Tao,Y.,et al.Appl.Environ.Microbiol.80,2254-2260；Hu,X.L.,et al.Appl.Environ.Microbiol.82,2506-2515.)

培养基制备：复合培养基由黄水和MM培养基配方组成，黄水用量占比为20％，MM培养基占比为80％，使用前调节pH为5.5。黄水无须灭菌，调节pH为5.5后直接使用。

MM培养基115℃灭菌30分钟。其中MM培养基成分(g/L):(NH₄)₂SO₄ 2.0，MgSO₄﹒7H₂O0.2，NaH₂PO₄﹒2H₂O 0.5，CaCl₂﹒2H₂O 0.1，K₂HPO₄ 0.5,酵母粉1.0，半胱氨酸0.25，微量营养液0.3mL/L。MM培养基中的微量营养液组成(mg/L)为:FeSO₄ 2000，ZnCl₂ 50，MnCl₂﹒4H₂O500，CuCl₂﹒H₂O 30，(NH₄)6Mo₇O₂₄﹒4H₂O 50，CoCl₂﹒6H₂O 2000，NiCl₂﹒6H₂O 50，Na₂SeO₃﹒5H₂0100。

进行窖泥的逐级放大培养时，将选定的窖泥以3％的接种量接种至复合培养基中，于37℃厌氧培养48h后，后续按照10％的接种量接种至复合培养基中进行逐级放大培养，得到富集菌群。每级种子液的培养时间为48h。本实施例中，一共培养了4级，分别是30ml、100ml、500ml、2L，逐级扩培过程中发酵液的有机酸和PC含量测试结果如表1所示。

对最终得到的富集菌群，分析了富集的功能菌群的属水平菌群结构(图1)。从图1中可以看出，最终获得的窖泥主体菌群为代谢乳酸生成己酸的瘤胃梭菌科产己酸菌属(Caproiciproducens)，该菌群的相对丰度可达到50％以上(详见附图1)。这些高丰度的瘤胃梭菌是发酵液中利用乳酸生成己酸的主要贡献者。

采用本实施例方法使用的培养基能很好的富集窖泥样本中的产己酸菌群，并且富集的功能菌群在多次传代培养过程中4-甲基苯酚含量呈快速降低趋势(所检测到的微量4-甲基苯酚为培养基添加的黄水原料本身所含有)，即所获得的菌群并不生成异嗅物质4-甲基苯酚(表2)。

表2 逐级扩培体系有机酸和PC含量

实施例2富集窖泥功能菌群的方法得到的功能菌群的应用

将实施例1最终富集所获得的功能菌群可应用在无窖泥体系的固态酒醅发酵过程中，以下以5L广口瓶为发酵容器进行酒醅模拟发酵。

具体是：在酒醅入发酵容器前，直接加入100ml培养的功能菌液置于容器底部，之后迅速加入已蒸煮好的粮醅，然后密封后共同发酵。对照组仅加入粮醅进行发酵。将添加菌液组和对照组的酒醅发酵结束后的黄水指标进行测试，结果如表3所示，添加菌液组的己酸、丁酸、乙酸、对应的己酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯、以及丁醇、己醇、己酸异戊酯等风味组分含量均显著高于对照组，而不良风味物质4-甲基苯酚无明显变化。

此外，对其挥发性组分进行顶空固相微萃取结合GC-MS分析，结果如附图2所示，测试结果表明除了主要的丁醇、己醇、丁酸、己酸、及其对应的酯类物质含量高于对照组外，戊酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、苯丙酸乙酯等酯类物质，庚酸、辛酸、2-甲基丁酸等酸类物质等组分的含量均高于对照组，而同时窖泥臭味物质4-甲基苯酚含量无明显变化。因此该应用策略能显著提升酒醅的有益风味物质含量，去除窖泥中的不良泥臭味物质成分，从而提升原酒的品质。

表3 添加菌液组和对照组的酒醅发酵后产生黄水指标测试结果

此外，所获得的窖泥功能菌液也可用于人工窖泥的培养过程以及日常的维护保养窖泥过程中，通过增加窖泥中的产己酸主体菌群，一方面减轻窖泥的泥臭味物质4-甲基苯酚的生成，另一方面促进窖泥和酒醅中的乳酸转化为己酸，并生成其他有益风味物质，同时促进窖泥老熟，防止窖泥老化、板结。

对照实施例1：培养基组分对初始富集培养效果的影响

实施例1培养基成分中使用黄水，该原料不仅提供了充足的碳源、氮源、以及丰富的各种风味前体物质，同时在菌群富集培养也起到关键作用。

本对照实施例中，与实施例1相比，仅仅做了如下改动，其他步骤和参数也实施例1一致：

对照A：在功能菌液的第1级富集培养过程中，去除黄水，同时添加2％的乙醇原料。

对照B：在功能菌液的第1级富集培养过程中，采用通用的LB培养基(酵母粉10g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L)接种相同的窖泥3％进行培养。

发酵结果为：

(1)替换为乙醇原料后，发酵液的己酸产量低于实验组约3倍，具体如表4所示。

(2)采用通用的LB培养基会富集出大量产4-甲基苯酚的菌群，无法富集出主体的产己酸菌群。

上述对照实验表明，本实施例中的黄水与MM培养基组合的培养方式，可以对黄水进行有效利用，培养以产己酸菌属微生物为主体的复合菌群。

表4 培养基组分对富集效果的影响

对照实施例2：培养基组分对富集培养效果的影响

本对照实施例中，与实施例1相比，仅仅做了如下改动，其他步骤和参数也实施例1一致：

对照组：在功能菌液的第1级富集培养过程中，当缺失MM培养基组分时，即在扩大培养过程中使用的培养基仅采用20％的稀释黄水。

发酵结果表明：缺失MM培养基组分后，主要的代谢产物以丁酸为主，而不是己酸，具体如表5所示。表明复合培养基中的MM培养基成分在菌群富集培养中起重要作用。

表5 MM培养基组分对富集效果的验证

对照实施例3：传代时间对富集培养效果的影响

本对照实施例中，与实施例1相比，作如下改动，其他步骤和参数也实施例1一致：

对照A：延长传代培养时间，在发酵第1级培养4d时转接至第2级继续培养。

对照B：延长传代培养时间，在发酵第1级培养20d时转接至第二级继续培养。

发酵结果表明：

(1)将原代培养时间延长至4d时，转接后第2级培养发酵液的己酸产量与实验组无显著差异，略有下降。

(2)将原代培养时间延长至20d时，转接后第2级培养发酵液的主产物为丁酸，己酸产量显著下降，具体如表6所示。本发明中的富集和扩大培养过程中，传代的时间为1d～3d；可根据发酵液的产酸测试结果来确定最佳的转接时间点，当发酵液的己酸含量已显著升高时，应及时进行转接培养。

表6 传代时间对富集培养效果的验证

Claims (10)

1.一种快速富集窖泥功能菌群的方法，其特征在于，所述方法包括：将窖泥接种至复合培养基中进行逐级扩大培养；所述的复合培养基由黄水和MM培养基配方组成，黄水用量占比为20％～50％，MM培养基占比为50％～80％；每级种子液的扩培时间为1d～3d；

所述MM培养基成分，按g/L，含有:(NH₄)₂SO₄ 1.5-2.5，MgSO₄﹒7H₂O 0.1-0.3，NaH₂PO₄﹒2H₂O 0.2～0.5，CaCl₂﹒2H₂O 0.05～0.2，K₂HPO₄ 0.2～1.0,酵母粉0.5～2，半胱氨酸0.1～0.3，微量营养液0.3～0.5mL/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于接种的窖泥：pH值为5.0～7.0，己酸含量大于6g/kg、乳酸含量小于30g/kg。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，黄水无须灭菌，调节pH为5～6后直接使用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微量营养液组成，按照mg/L，含有:FeSO₄1500～2500，ZnCl₂ 20～100，MnCl₂·4H₂O 200～800，CuCl₂·H₂O 20～50，(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O20～100，CoCl₂·6H₂O 1500～2500，NiCl₂·6H₂0 20～100，Na₂SeO₃·5H₂0 50～200。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述扩培是扩培3级以上。

6.权利要求1所述方法制备得到的功能菌群。

7.权利要求1所述方法或者权利要求1所述方法制备得到的功能菌群在白酒酿造体系中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用包括在白酒发酵过程中应用所述功能菌群。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用是将所述功能菌群应用在无窖泥体系的固态酒醅发酵过程中。

10.一种人工窖泥的培养方法或者维护保养窖泥的方法，所述方法包括：在人工窖泥的培养过程中或者维护保养窖泥的过程中，加入一定量的利用权利要求1的快速富集窖泥功能菌群的方法富集得到的功能菌液。

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