CN111500507A - 一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用 - Google Patents

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CN111500507A CN202010466226.6A CN202010466226A CN111500507A CN 111500507 A CN111500507 A CN 111500507A CN 202010466226 A CN202010466226 A CN 202010466226A CN 111500507 A CN111500507 A CN 111500507A
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Abstract

本发明涉及一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用，所述基于寡培养的窖泥菌群富集方法包括：将窖泥接种于富集培养基中进行培养，使窖泥菌群得到富集；所述富集培养基包括基础培养基和选择性碳源；所述基础培养基包括矿质元素物质、微量元素物质、B族维生素、酵母粉、蛋白胨、碳酸氢钠、硫化钠和水；所述选择性碳源包括短链脂肪酸和/或短链脂肪酸盐。该富集方法能够对多种未培养菌群进行可培养化富集，可以应用于甲烷菌或丁酸利用菌群菌液制备、甲烷菌群‑丁酸利用菌群共培养、丁酸利用菌或甲烷菌活力检测、人工窖泥制作及养护等，为窖泥功能微生物资源挖掘提供先导技术。

Description

一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用
技术领域
本发明属于白酒酿造技术领域，涉及一种窖泥菌群富集方法及其应用，尤其涉及一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用。
背景技术
我国白酒有十二大香型，按照酿造过程是否有窖泥，可以分为窖泥依赖型与非窖泥依赖型。窖泥依赖型酿造的白酒主要包括浓香型、酱香型、凤香型、芝麻香型、兼香型、特香型、药香型、馥郁香型八类，非窖泥依赖型酿造的白酒主要包括清香型、老白干香型、米香型、豉香型四类。
对于窖泥依赖型白酒酿造体系而言，窖泥中栖息的主要微生物为严格厌氧菌，包括了细菌和古菌两大类群微生物。其中细菌为主要的风味物质产生菌，如丁酸菌、己酸菌等短中链脂肪酸产生菌；目前发现的窖泥古菌均为甲烷菌，甲烷菌营养代谢类型较为单一，一般不利用糖类，仅以H2/CO2、乙酸、甲酸、甲醇等细菌发酵产生的终产物为底物，产生甲烷。按照营养类型，甲烷菌主要可以分为氢营养型、乙酸营养型和甲基营养型三种类型，其中氢营养型利用H2作为能源、CO2作为碳源进行甲烷的合成；乙酸营养型利用乙酸合成甲烷；甲基营养型利用甲醇合成甲烷。氢营养型甲烷菌和乙酸营养型甲烷菌在窖泥体系中具有重要作用，前者利用H2可以解除细菌的氢抑制作用，乙酸营养型甲烷菌可以利用发酵过程中的乙酸，降低窖泥酸度。
正常酿造使用的窖泥微生物菌群具有从复杂碳源降解到甲烷生成的稳定代谢互作网络，当窖泥中同时存在水解/发酵菌群、互营产乙酸菌群和甲烷菌群，且该三类菌群的代谢互作趋于稳定时，窖泥微环境酸碱度将维持偏中性，窖泥中的微生物群落结构将趋于稳定。反之，如果产酸菌群过量繁殖，导致乳酸、丁酸、己酸等有机酸过量，过量的酸无法通过窖泥微生物菌群代谢互作转化为甲烷，窖泥将迅速退化。对于水解发酵菌群，目前已有相关培养技术可以实现对丁酸菌、己酸菌的可培养化(CN105400652，CN201410593446.X)。然而对于互营菌和甲烷菌，却缺少有效的定向培养方法。窖泥中的互营菌由于对其营养需求未知，阻碍了对其进行可培养化。而对于甲烷菌，因其生长缓慢，在窖泥中富集较为缓慢，新建窖池需不间断连续酿造数年以上才可以获得一定数量的甲烷菌；另外一方面，甲烷菌属于严格厌氧菌，难以被培养，目前尚缺少对氢营养型和乙酸营养型甲烷菌进行分型培养的可培养技术。此外，目前研究发现窖泥中原核微生物至少在100种以上，未培养菌不仅仅局限于互营菌和甲烷菌，其他窖泥中广泛分布的细菌类型，如氨基酸杆菌属(Aminobacterium)、氢孢菌属(Hydrogenispora)、发酵单胞菌(Fermentimonas)等，即使在菌群水平至今也难被培养。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种窖泥菌群富集方法及其应用，尤其涉及一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用，该方法能够将窖泥中的多种未培养菌群尤其是甲烷菌和互营单胞菌进行有效富集。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法，所述基于寡培养的窖泥菌群富集方法包括：将窖泥接种于富集培养基中进行培养，使窖泥菌群得到富集；所述富集培养基包括基础培养基和选择性碳源；
所述基础培养基包括矿质元素物质、微量元素物质、B族维生素、酵母粉、蛋白胨、碳酸氢钠、硫化钠和水；
所述选择性碳源包括短链脂肪酸和/或短链脂肪酸盐。
本发明所涉及的方法通过在基础培养基中添加短链脂肪酸和/或短链脂肪酸盐，将窖泥接种于其中进行寡培养，寡培养方法使提供的营养物有限，有效避免了快速生长菌对其他缓慢生长菌的抑制作用，能够对多种未培养菌群进行可培养化富集，除了可以富集利用丁酸的互营菌及利用乙酸或甲酸的甲烷菌外，还可以富集窖泥中多种其他类型的细菌，得到的菌群可稳定产生甲烷，为维持窖泥微生物稳态的重要菌群。
优选地，所述短链脂肪酸包括甲酸、乙酸或丁酸中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如甲酸和乙酸的组合、甲酸和丁酸的组合、乙酸和丁酸的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述短链脂肪酸盐包括甲酸盐、乙酸盐或丁酸盐中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如甲酸盐和乙酸盐的组合、甲酸盐和丁酸盐的组合、乙酸盐和丁酸盐的组合等，其他任意的组合方式均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述短链脂肪酸盐包括短链脂肪酸钠盐和/或短链脂肪酸钾盐。
在本发明中，在利用乙酸(盐)、丁酸(盐)或甲酸(盐)的任意一种碳源或碳源组合时，均可以观察到富集出来的细菌菌群多样性不低于原始窖泥，能有效将互营菌和甲烷菌以及互营菌和甲烷菌以外的其他多种类型细菌富集出来，富集种类与初始窖泥微生物菌群结构有关。
优选地，所述甲酸和/或甲酸盐在所述富集培养基中的浓度为10-200mmol/L，例如100mmol/L、30mmol/L、50mmol/L、80mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、150mmol/L或200mmol/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述乙酸和/或乙酸盐在所述富集培养基中的浓度为8-160mmol/L，例如8mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、70mmol/L、100mmol/L、120mmol/L、140mmol/L或160mmol/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述丁酸和/或丁酸盐在所述富集培养基中的浓度为6-120mmol/L，例如6mmol/L、20mmol/L、50mmol/L、70mmol/L、100mmol/L或120mmol/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述酵母粉在所述富集培养基中的浓度为0.5-3g/L，例如0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L或3g/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述蛋白胨在所述富集培养基中的浓度为0.5-1.5g/L，例如0.5g/L、0.7g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L或1.5g/L等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
如上所述，本发明所涉及的富集培养基中碳源(即短链脂肪酸和/或短链脂肪酸盐)和氮源(即酵母粉和蛋白胨)的浓度是特定选择的，相对较低浓度的碳源和氮源有利于对甲烷菌、互营单胞菌以及其它未培养化细菌的富集。若碳源在培养基中的浓度高于上述数值范围则对目标菌群产生生长抑制作用，若浓度小于上述数值范围则不足以支持目标菌群的生长；若酵母粉或蛋白胨在培养基中的浓度高于上述数值范围则将促进丁酸菌和己酸菌的快速生长，若浓度小于上述数值范围则不能满足目标菌群的生长需求。
优选地，所述窖泥菌群包括甲烷菌和/或互营单胞菌。
优选地，所述甲烷菌包括氢营养型甲烷菌和/或乙酸营养型甲烷菌。
本发明所涉及的方法能够对甲烷菌进行分型培养，即能够培养出不同营养类型的甲烷菌，包括但不仅限于乙酸营养型甲烷菌和氢营养型甲烷菌。本发明利用碳源种类的不同对不同营养型的甲烷菌进行培养，所述碳源为乙酸(盐)或甲酸(盐)，其中乙酸(盐)被用于富集乙酸营养型甲烷菌，甲酸(盐)被用于富集氢营养型甲烷菌，其中利用甲酸(盐)富集氢营养型甲烷菌可以避免氢气和二氧化碳作为能源和碳源的难操作性，同时避免可燃性气体引起的生产安全风险。
优选地，所述窖泥的接种量为5-20％，例如5％、10％、15％或20％等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述窖泥包括窖龄不低于5年(例如5年、10年、15年或20年等)，pH值为6.0-7.0(例如6.0、6.2、6.5、6.7或7.0等)窖底泥。
优选地，所述培养在厌氧条件下进行。
优选地，所述培养在32-37℃下进行，例如32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
优选地，所述富集培养基的pH值为7.4-7.6，例如pH＝7.4、pH＝7.5或pH＝7.6等，上述范围内的任意具体点值均可选择，在此便不再详细赘述。
在本发明中，所述矿质元素物质包括KH2PO4、MgCl2·6H2O、NaCl、NH4Cl和CaCl2·2H2O。
优选地，所述矿质元素物质以溶质的形式存在于矿质元素溶液中，KH2PO4、MgCl2·6H2O、NaCl、NH4Cl和CaCl2·2H2O在矿质元素溶液中的浓度分别为5-10g/L、2-6.6g/L、4-8g/L、3-8g/L和0.5-3g/L。所述矿质元素溶液在所述富集培养基中的体积百分比为2.5-5.0％。
在本发明中，所述微量元素物质包括ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、H3BO3、CoCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、NiCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O和FeCl2·4H2O。
优选地，所述微量元素物质以溶质的形式存在于微量元素溶液中，ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、H3BO3、CoCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、NiCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O和FeCl2·4H2O在微量元素溶液中的浓度分别为0.05-0.2g/L、0.02-0.04g/L、0.1-0.5g/L、0.1-0.3g/L、0.01-0.05g/L、0.01-0.03g/L、0.01-0.03g/L和0.5-1.5g/L。所述微量元素溶液在所述富集培养基中的体积百分比为0.1-0.5％。
在本发明中，所述B族维生素包括烟酸、钴胺素、盐酸硫胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇和泛酸钙。
优选地，所述B族维生素以溶质的形式存在于B族维生素溶液中，烟酸、钴胺素、盐酸硫胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇和泛酸钙在B族维生素溶液中的浓度分别为10-20mg/L、10-20mg/L、5-10mg/L、5-10mg/L、4-10mg/L和1-5mg/L。所述B族维生素溶液在所述富集培养基中的体积百分比为0.2-1.0％。
另一方面，本发明提供一种如上所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法在甲烷菌和/或互营单胞菌菌群检测中的应用。该应用能够为窖泥质量评估提供菌活力指标。
示例性地，所述应用方法可以包括：先接种不同来源的窖泥，添加丁酸进行互营菌的富集，丁酸被利用表明窖泥中存在互营菌，丁酸利用程度越高，表明富集体系中存在的互营菌活菌越多；添加乙酸进行乙酸营养型甲烷菌的富集，检测甲烷产生情况，甲烷生成越快，表明富集体系中乙酸利用型甲烷菌被更快富集；添加甲酸进行甲酸营养型甲烷菌的富集，检测甲烷产生情况，甲烷生成越快，表明富集体系中甲酸酸利用型甲烷菌被更快富集。
再一方面，本发明提供一种如上所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法在人工窖泥制作中的应用。
示例性地，所述应用方法可以包括：利用丁酸作为互营菌的碳源，添加乙酸、甲酸作为甲烷菌生长的辅助碳源，经逐级放大培养后用于窖泥制作。
再一方面，本发明提供一种如上所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法在白酒酿造中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的富集方法通过在基础培养基中添加短链脂肪酸和/或短链脂肪酸盐作为碳源，并将窖泥接种于其中进行寡培养，寡培养方法使提供的营养物有限，有效避免了快速生长菌对其他缓慢生长菌的抑制作用，能够对多种未培养菌群进行可培养化富集，除了可以富集利用丁酸的互营菌及利用乙酸或甲酸的甲烷菌外，还可以富集窖泥中多种其他类型的细菌，得到的菌群可稳定产生甲烷，为维持窖泥微生物稳态的重要菌群。通过对碳源组合的调节，可以控制不同营养类型的甲烷菌以及互营菌的富集，也可以同时实现互营菌和甲烷菌的共培养。基于本发明，可以建立窖泥未培养微生物的纯培养菌株分离与鉴定技术，为窖泥功能微生物资源挖掘提供先导技术。
附图说明
图1是实施例1中乙酸和甲烷随培养时间的变化量曲线；
图2是实施例2中丁酸和乙酸随培养时间的变化量曲线；
图3是实施例3中丁酸、乙酸和甲酸随培养时间的变化量曲线；
图4是实施例3中甲烷随培养时间的变化量曲线；
图5是实施例4中两种样品的丁酸变化速率随培养时间的变化曲线；
图6是实施例4中两种样品的甲烷变化速率随培养时间的变化曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下面实验例中所说明的实验方法如无特别说明，均为常规方法。下面实验例中的所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例提供一种将窖泥中乙酸营养型甲烷菌群进行富集培养的方法，所述方法包括如下内容：
(1)窖泥样本的选择：选择含有乙酸营养型甲烷菌群的窖龄10年的窖底泥样品1和样品2，样品1窖泥的pH值为6.5，样品2窖泥的pH值为7.0。采用厌氧取样袋分别取样100g新鲜窖泥，进行菌群结构分析和接种富集培养。
(2)培养基的制备：所使用的富集培养基为基础培养基添加三水合乙酸钠组成，三水合乙酸钠的用量为8.6g/L。基础培养基成分为：矿质元素溶液5.0％(v/v)，微量元素溶液0.1％(v/v)，B族维生素溶液0.5％(v/v)，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，NaHCO3溶液7.0％(v/v)，Na2S·9H2O水溶液2.0％(v/v)。
其中，矿质元素溶液组成为：KH2PO4 10g/L，MgCl2·6H2O 6.6g/L，NaCl 8.0g/L，NH4Cl 8.0g/L，CaCl2·2H2O 1.0g/L，过滤除菌；微量元素溶液组成为：ZnSO4·7H2O 0.1g/L，MnCl2·4H2O 0.03g/L，H3BO3 0.3g/L，CoCl2·6H2O 0.2g/L，CaCl2·2H2O 0.01g/L，NiCl2·6H2O 0.02g/L，Na2MoO4·2H2O 0.03g/L，FeCl2·4H2O1.5g/L，过滤除菌；B族维生素溶液为(mg/L)：烟酸20mg/L，钴胺素20mg/L，盐酸硫胺10mg/L，对氨基苯甲酸10mg/L，盐酸吡哆醇10mg/L，泛酸钙5mg/L，过滤除菌；NaHCO3溶液母液为碳酸氢钠5.0g添加蒸馏水定容至100mL，过滤除菌；Na2S·9H2O水溶液母液为硫化钠3.0g添加蒸馏水定容至100mL，121℃单独灭菌20min。
灭菌前将pH调节至7.5，121℃灭菌20min。灭菌后将B族维生素溶液、NaHCO3溶液和Na2S·9H2O水溶液成分在厌氧条件下按比例添加至已灭菌的培养基其他混合组分内。
(3)培养方法：将50mL上述培养基分装到100mL盐水瓶中，将选定的种子窖泥以10％(m/v)接种量接种，在厌氧环境37℃下进行富集培养，并定时取样对富集体系中的乙酸盐含量及甲烷含量进行测定。
(4)甲烷气体分析方法：使用Agilent GC-6890N气相色谱仪对甲烷气体出峰面积进行测量。使用2.5mL气密性注射器抽取99.9％(v/v)纯度的甲烷标准气体，反复抽取三次进行置换。随后依次准确抽取甲烷标准气体100、200、300、400、500μL迅速注入进样口。根据保留时间，作为定性依据，本实施例中甲烷出峰时间为0.9min。记录响应值峰面积，建立相关系数不小于97％的线性回归方程，作为测定甲烷相对含量的标准曲线。气相色谱条件：安捷伦HP-5毛细管色谱柱，柱温40℃，恒温5min；进样器温度200℃，检测器温度250℃；柱流量，0.9mL/min；分流比，30:1；空气流量，400mL/min；氢气流量，40mL/min。
(5)乙酸测定方法：使用气相色谱仪对乙酸进行含量分析。样品处理方法：取1mL发酵液12000r/min离心5min，取200μL上清液，加入50μL内标溶液(12.5g/L叔戊酸，pH 2.5)，震荡混匀，取200μL进行检测。色谱柱为Agilent Econo Cap-Wax色谱柱。气相色谱条件：进样量1μL，分流比，30:1；进样器温度220℃，检测器温度250℃；空气流量450mL/min，载气氮气流量45mL/min，氢气流量40mL/min。
乙酸的消耗和甲烷生成为乙酸营养型甲烷菌群成功富集的判定依据。通过对样品1培养体系定时取样对富集体系中的乙酸含量和生成甲烷的相对百分含量进行测定，结果如图1所示，结果显示：在富集培养至第16天(d)时，乙酸消耗量为91％。同时，在乙酸消耗过程中，甲烷相对百分含量持续增长，达到峰值后开始下降，甲烷相对体积百分含量最高可达80％。
(6)菌群结构采用扩增子测序进行。本实施例选取16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增，扩增引物为515FmodF(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806RmodR(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')。对扩增的PCR产物进行建库，使用PE250策略在IlluminaMiseq平台进行测序。使用FLASH进行高质量碱基和pair-end双端reads拼接。短于50bp的序列通过使包含在QIIME软件中的Trimmomatic程序移除。之后，使用Usearch程序对97％相似水平下的操作分类单元(OTU)进行聚类统计分析。将OTU代表序列与Silva数据库进行比对，得到每个OTU所对应的物种分类信息。
结果如表1和表2所示，由数据可知(表1为样品1，表2为样品2)：以乙酸为碳源时，甲烷鬃菌属(Methanosaeta)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷囊菌属(Methanoculleus)可以得到富集。而因甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)为严格的氢营养型甲烷菌，在乙酸碳源培养条件下无法进行有效富集。样品1和样品2经富集后可以获得各异的甲烷菌种类与丰度，最终富集体系中甲烷菌类型和丰度与初始窖泥样品中的甲烷菌种类及其丰度有关。以乙酸碳源时，可以有效富集本实施例所用窖泥中的高丰度甲烷菌甲烷囊菌属及其他多种低丰度甲烷菌，可见本实施例所用富集方法能对于甲烷菌进行有效富集。
表1
Figure BDA0002512743060000101
Figure BDA0002512743060000111
表2
Figure BDA0002512743060000112
实施例2
本实施例提供一种将窖泥中互营单胞菌群进行富集培养的方法，所述方法包括如下内容：
(1)窖泥样本的选择：选择含有互营单胞菌群的窖龄5年的窖底泥样品，窖泥的pH值为6.0，丁酸含量小于5g/kg。采用厌氧取样袋分别取样100g新鲜窖泥，进行菌群结构分析和接种富集培养。
(2)培养基的制备：所使用的富集培养基为基础培养基添加丁酸钠组成，丁酸钠的浓度为55mmol/L，其他组分及其配置方法同实施例1。
(3)培养方法：将50mL上述培养基分装到100mL盐水瓶中，将选定的种子窖泥以10％(m/v)接种量接种，在厌氧环境37℃下进行富集培养，并定时取样对富集体系中的丁酸盐的消耗和乙酸的生成量进行测定。
(4)丁酸盐和乙酸的测定方法参照实施例1中乙酸的测定方法。
丁酸盐的消耗与乙酸的生成为判定互营菌得到富集的必要条件。结果如图2所示，结果显示：丁酸盐第9天(d)开始迅速降低，至第18天(d)时消耗完全；乙酸在丁酸盐快速消耗阶段具有增加趋势，表明消耗的丁酸盐被转化为了乙酸。
(5)菌群结构采用扩增子测序进行，测序与数据分析方法同实施例1。
结果如表3所示，本实施例方法可以对窖泥中互营单胞菌科(Syntrophomonadaceae)菌群进行有效富集。除互营单胞菌科外，结果还显示：该富集方法还可以对本实施例所用窖泥中的高丰度菌(丰度>1％)，包括Dysgonomonadaceae、理研菌科(Rikenellaceae)、互养菌科(Synergistaceae)、螺旋菌科(Heliobacteriaceae)、梭菌目第XIV簇(Family_XI_o__Clostridiales)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、厌氧绳菌属(Anaerolineaceae)和消化球菌科(Peptococcaceae)等7个科的微生物进行有效富集。窖泥高丰度(大于1％)科中，仅norank_o__DTU014、Cloacimonadaceae和Family_XIV三个科未能被有效富集，科水平的富集有效率为75％。对于在窖泥中丰度低于1％的菌，包括Family_XIII、毛螺菌科(Lachnospiraceae)、梭菌科_1(Clostridiaceae_1)、Gracilibacteraceae、脱硫弧菌科(Desulfovibrionaceae)、SRB2、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、纤维杆菌科(Fibrobacteraceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)等12种微生物也可被有效富集。综合表明：除利用丁酸的互营单胞菌外，其他多种类型的窖泥高丰度和低丰度细菌也能被本实施例方法有效富集。富集出来的其他类型细菌种类与窖泥初始菌群结构有关。
表3
Figure BDA0002512743060000121
Figure BDA0002512743060000131
实施例3
本实施例提供一种将窖泥中互营单胞菌群和甲烷菌群进行共富集培养的方法，所述方法包括如下内容：
(1)窖泥样本的选择：选择含有互营单胞菌群和甲烷菌群的窖龄5年的窖底泥，窖泥的pH值为6.5。采用厌氧取样袋分别取样100g新鲜窖泥，进行菌群结构分析和接种富集培养。
(2)培养基的制备：所使用的富集培养基为基础培养基添加丁酸钠和甲酸钠组成，丁酸钠的浓度为55mmol/L，甲酸钠的浓度为24mmol/L，其他组分及其配置方法同实施例1。
(3)培养方法：将50mL上述培养基分装到100mL盐水瓶中，将选定的种子窖泥以10％(m/v)接种量接种，在厌氧环境37℃下进行富集培养，并定时取样对富集体系中的丁酸盐消耗量、甲酸盐消耗量、乙酸生成量及甲烷生成量进行测定。
(4)丁酸盐消耗量、乙酸生成量及甲烷生成量的测定方法参照实施例1。甲酸盐测定：使用高效液相色谱仪对甲酸进行分析，将发酵上清液12000rpm离心10min，经0.22μm的滤膜进行过滤后，直接进样分析。色谱柱为BioRad 300mm Aminex HPX-87H(Richmond，CA，USA)。柱温设置为60℃，流动相使用5mM稀硫酸，流速为0.5mL/min，分析时间为15min。
结果如图3和图4所示，结果显示：在富集培养至2天(d)时，甲酸被完全消耗。丁酸自第6天(d)开始被利用，至第12天(d)时利用加速，至第18天(d)时消耗率达到84％，丁酸到乙酸的转化率达到118％，表明产生的乙酸除来源于丁酸转化外，培养基中其他碳源也能转化为乙酸。丁酸消耗过程中，甲烷相对体积分数持续增加，第8天(d)后开始检测到甲烷产生，第12天(d)后甲烷加速生成，至第18天(d)时，甲烷相对百分含量最高可达到74％左右。
(5)菌群结构采用扩增子测序进行，测序与数据分析方法同实施例1。
结果如表4-5所示(表4为互营菌和产甲烷菌共培养富集过程中甲烷菌群结构动态变化结果；表5是互营菌和产甲烷菌共培养富集过程中细菌菌群结构动态变化结果)：最终得到的主体甲烷菌群为氢营养型的甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)、甲烷囊状菌属(Methanoculleus)、甲烷杆菌属(Methanobacterium)和马氏甲烷菌属(Methanomassiliicoccus)。互营单胞菌属和未分类的互营单胞菌两类互营单胞菌科微生物随富集过程丰度不断增加。底物分析、产物分析和菌群结构分析表明，通过同时添加丁酸盐碳源和甲酸盐碳源的方式，可以较好地实现互营菌和氢营养型甲烷菌的同时富集培养。
表4
Figure BDA0002512743060000151
表5
Figure BDA0002512743060000152
Figure BDA0002512743060000161
实施例4
本实施例利用本发明所涉及的方法对窖泥中互营单胞菌群或甲烷菌群进行检测，从而为窖泥质量评估提供活菌指标，包括如下内容：
(1)选择含有互营单胞菌群的窖龄5年的窖底泥样品1和样品2，参照实施例2中的相关内容进行样本选择、培养基的制备(将丁酸钠替换成丁酸5g/L)和培养，并对丁酸的消耗量进行测定(每天取样，直至18天(d)，平行测定5次)，丁酸被利用表明窖泥中存在互营菌，丁酸利用程度越高，表明富集体系中存在的互营菌活力越高。
结果如表6和图5所示，可知：样品1中丁酸利用速率高于样品2，表明样品1具有较样品2更高的互营单胞菌群活力。
表6
Figure BDA0002512743060000162
(2)选择含有甲烷菌菌群的窖龄10年的窖底泥样品1和样品2，参照实施例1中的相关内容进行样本选择、培养基的制备(将三水合乙酸钠替换成乙酸4g/L)和培养，并对甲烷的生成量进行测定(每天取样，直至12天(d)，平行测定5次)，甲烷生成速率和浓度越高，表明富集体系中乙酸利用型甲烷菌丰度越高。
结果如表7和图6所示，可知：样品1甲烷产生的启动时间快于样品2，样品1甲烷生成最高速率也高于样品2。
表7
Figure BDA0002512743060000171
丁酸降解速率和甲烷生成速率这两项指标，可以用于分别判定丁酸利用菌群和甲烷菌的生长状态，用于确定菌液最佳收集时间，用于窖泥制作。丁酸快速消耗期和甲烷快速生成期为较优菌液收集时期。本实施例中，对于互营单胞菌群富集而言，最优菌液收集时期为丁酸快速降解期(对于样品1为6-12天之间，对于样品2为6-9天之间)；对于甲烷菌群富集而言，最优菌液收集时机为甲烷迅速生成期(对于样品1为6-10天，对于样品2为8-12天)。
高活力的丁酸利用菌群和甲烷菌菌群是成熟窖泥的标志，也是优质窖泥的判定依据。本实施例方法也可以作为优质窖泥判定技术的丁酸利用菌群和甲烷菌菌群活力检测方法。
实施例5
本实施例利用本发明所涉及的方法制作人工窖泥，包括如下内容：
(1)种子液制备：根据实施例3，制备互营单胞菌群、氢营养型甲烷菌群和其他未培养细菌菌群的种子液100mL；根据实施例1，制备乙酸营养型甲烷菌群的种子液100mL。将上述两种类型种子液混合，接种于含丁酸5g/L，乙酸2g/L和甲酸5g/L的1.5L富集培养基中(发酵罐容积为3L，其他组分及其配置方法同实施例1)，发酵罐厌氧环境以高纯氮维持(流量2L/min)，温度控制在37℃。为保证安全性，应尽量降低培菌过程中甲烷的生成，发酵罐需接尾气排放装置。7天后开始每天监测丁酸和甲酸浓度，第10天时，丁酸和甲酸均被完全消耗。
(2)第二级放大：以高纯氮将上述种子液1.5L泵入含有15L富集培养基的发酵罐中(发酵罐容积30L，丁酸、乙酸和甲酸含量分别为5g/L，2g/L，5g/L，其他组分及其配置方法同实施例1)，培养7天，丁酸和甲酸均被完全消耗。
(3)第三级放大：以高纯氮将上述种子15L液泵入含有120L富集培养基的发酵罐中(发酵罐容积200L，丁酸、乙酸和甲酸含量分别为5g/L，2g/L，5g/L，其他组分及其配置方法同实施例1)。7天后开始每天监测丁酸和甲酸浓度，第9天时，丁酸和甲酸均被完全消耗。
(4)人工窖泥制备：制备1000kg人工窖泥，所需组分为，黄泥500kg，窖皮泥200kg，老窖泥50kg，中温大曲粉50kg，酵母粉10kg，玉米浆10kg，上述富集种子液100kg，添加水分至水量35-40％，混合均匀后静止于发酵池，室温控制在30℃进行发酵，发酵时间50天用于建窖。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.一种基于寡培养的窖泥菌群富集方法，其特征在于，所述基于寡培养的窖泥菌群富集方法包括：将窖泥接种于富集培养基中进行培养，使窖泥菌群得到富集；所述富集培养基包括基础培养基和选择性碳源；
所述基础培养基包括矿质元素物质、微量元素物质、B族维生素、酵母粉、蛋白胨、碳酸氢钠、硫化钠和水；
所述选择性碳源包括短链脂肪酸和/或短链脂肪酸盐。
2.如权利要求1所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法，其特征在于，所述短链脂肪酸包括甲酸、乙酸或丁酸中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述短链脂肪酸盐包括甲酸盐、乙酸盐或丁酸盐中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述短链脂肪酸盐包括短链脂肪酸钠盐和/或短链脂肪酸钾盐。
3.如权利要求2所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法，其特征在于，所述甲酸和/或甲酸盐在所述富集培养基中的浓度为10-200mmol/L；
优选地，所述乙酸和/或乙酸盐在所述富集培养基中的浓度为8-160mmol/L；
优选地，所述丁酸和/或丁酸盐在所述富集培养基中的浓度为6-120mmol/L。
4.如权利要求1-3中任一项所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法，其特征在于，所述酵母粉在所述富集培养基中的浓度为0.5-3g/L；
优选地，所述蛋白胨在所述富集培养基中的浓度为0.5-1.5g/L。
5.如权利要求1-4中任一项所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法，其特征在于，所述窖泥菌群包括甲烷菌和/或互营单胞菌；
优选地，所述甲烷菌包括氢营养型甲烷菌和/或乙酸营养型甲烷菌。
6.如权利要求1-5中任一项所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法，其特征在于，所述窖泥的接种量为5-20％；
优选地，所述窖泥包括窖龄不低于5年，pH值为6.0-7.0窖底泥；
优选地，所述培养在厌氧条件下进行；
优选地，所述培养在32-37℃下进行；
优选地，所述富集培养基的pH值为7.4-7.6。
7.如权利要求1-6中任一项所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法，其特征在于，所述矿质元素物质包括KH2PO4、MgCl2·6H2O、NaCl、NH4Cl和CaCl2·2H2O；
优选地，所述微量元素物质包括ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、H3BO3、CoCl2·6H2O、CaCl2·2H2O、NiCl2·6H2O、Na2MoO4·2H2O和FeCl2·4H2O；
优选地，所述B族维生素包括烟酸、钴胺素、盐酸硫胺、对氨基苯甲酸、盐酸吡哆醇和泛酸钙。
8.如权利要求1-7中任一项所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法在甲烷菌和/或互营单胞菌菌群检测中的应用。
9.如权利要求1-7中任一项所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法在人工窖泥制作中的应用。
10.如权利要求1-7中任一项所述的基于寡培养的窖泥菌群富集方法在白酒酿造中的应用。
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