BR112018012444B1 - Método para produzir ácido orto-aminobenzoico - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere à produção de ácido o-aminobenzoico proveniente de substratos fermentáveis com o uso de células de levedura.

Description

[0001] A presente invenção se refere à produção de ácido o-aminobenzoico proveniente de substratos fermentáveis com o uso de células de levedura.

[0002] Atualmente, não há nenhuma fonte renovável ou biologicamente derivada de o-aminobenzoato ou do ácido correspondente comercialmente disponível. O o-aminobenzoato é um intermediário natural da via de ácido de chiquimato e um precursor para a biossíntese do aminoácido aromático L- triptofano. Uma conversão química de o-aminobenzoato em anilina foi descrita no documento WO 2015/124687.

[0003] Os métodos de produção atuais de anilina dependem de síntese química de matérias-primas derivadas de petróleo. Tais matérias-primas derivadas de petróleo não são renováveis, ao contrário de matérias-primas que são renováveis, como o recurso renovável "biomassa". A síntese química de anilina é um processo de múltiplas etapas. As diversas etapas de reação envolvidas na produção de anilina resultam em altos custos de produção. Ademais, a síntese convencional, isto é, química, de anilina é associada a intermediários, solventes e produtos de refugo perigosos que podem ter impactos substanciais no ambiente. Reações laterais não específicas no anel aromático resultam na redução do rendimento do produto, aumentando ainda mais, desse modo, os custos de produção. As matérias-primas derivadas de petróleo são influenciadas pelas oscilações de custo resultantes do preço global de petróleo.

[0004] O documento WO 2015/124687 revela um conceito de produzir o-aminobenzoato e anilina biologicamente derivados. Duas etapas de conversão são aplicadas: (1) a produção fermentativa de o-aminobenzoato e (2) a conversão catalítica subsequente de ácido o-aminobenzoico em anilina. O conceito de processo geral compreende as seguintes etapas de processamento: a) produzir o-aminobenzoato por fermentação de uma matéria-prima que compreende pelo menos um substrato de carbono fermentável com o uso de uma célula hospedeira bacteriana recombinante que é capaz de converter a dita matéria-prima que compreende pelo menos um substrato de carbono fermentável em o- aminobenzoato biologicamente, em que o dito o- aminobenzoato compreende ânion de antranilato (sucedido por remoção celular), b) converter o dito o-aminobenzoato do dito ânion de antranilato no caldo aquoso de fermentação livre de célula em ácido antranílico por protonação ácida, c) recuperar o dito ácido antranílico por precipitação ou por dissolução em um solvente orgânico, e d) converter o dito ácido antranílico em anilina por descarboxilação térmica em um solvente orgânico.

[0005] As bactérias recombinantes usadas no dito processo pertencem à família Corynebacterium ou Pseudomonas. Ambas as bactérias produzem o-aminobenzoato a pH 7, sob condições óxicas, e tipicamente durante a fase exponencial. Essas características das bactérias descritas no documento WO 2015/124687 levam a diversos problemas: (i) Devido à produção fermentativa de o-aminobenzoato a pH 7 (etapa a), uma base, por exemplo, NaOH, precisa ser adicionada a fim de garantir um pH neutro estável. Durante a etapa b) subsequente, um ácido, por exemplo, HCl, precisa ser adicionado a fim de converter o-aminobenzoato em ácido o-aminobenzoico. Portanto, como um subproduto, por exemplo, NaCl é formado. O uso de NaOH, HCl e o tratamento de água servida da solução de sal de NaCl resultante leva a custos elevados de produção de ácido o-aminobenzoico produzido pelo processo biotecnológico descrito na técnica anterior. (ii) Ademais, o-aminobenzoato é tóxico para células microbianas. Se as células microbianas mostrarem resistência aumentada a o-aminobenzoato, muitos dos mecanismos subjacentes à dita resistência exigem gasto de energia. Então, uma certa proporção do substrato fermentável é consumida para metabolismo de manutenção, resultando em rendimentos menores de o- aminobenzoato. Por esse motivo, os títulos altos de o-aminobenzoato que são necessários para um rendimento de espaço-tempo razoável do processo diminuem concomitantemente o rendimento de produto. (iii) Já que a fermentação é realizada sob condições óxicas, o vaso de fermentação precisa ser aerado e agitado, sendo que ambos levam a investimento e custos de operação elevados para a unidade de fermentação. (iv) Ademais, o-aminobenzoato é tipicamente produzido durante a fase exponencial e associado a crescimento microbiano. Esse fato diminui ainda mais o rendimento geral de produção de o-aminobenzoato.

[0006] Embora a produção biotecnológica de o- aminobenzoato a partir de fontes renováveis como um precursor para a produção de anilina ofereça benefícios potenciais, todos os fatores descritos acima diminuem os benefícios potenciais desse processo se bactérias forem usadas na fermentação.

[0007] Portanto, há uma necessidade de métodos alternativos para produzir o-aminobenzoato e anilina a partir de fontes renováveis.

[0008] Esse problema é solucionado pelas modalidades definidas nas reivindicações e na descrição.

[0009] Em uma primeira modalidade, a presente invenção se refere a um método para produzir ácido o-aminobenzoico que compreende as etapas de a) fermentar pelo menos um substrato fermentável em um vaso de fermentação com o uso de um célula de levedura capaz de converter pelo menos um substrato fermentável em ácido o-aminobenzoico; e b) separar o ácido o-aminobenzoico produzido do caldo de fermentação.

Célula de levedura capaz de converter um substrato fermentável em ácido o-aminobenzoico

[0010] Uma célula de levedura capaz de converter um substrato fermentável em ácido o-aminobenzoico é uma célula de levedura que converte pelo menos uma parte do substrato fermentável em ácido o-aminobenzoico e libera pelo menos uma parte do ácido o-aminobenzoico produzido no caldo de fermentação. Já que o ácido o-aminobenzoico é um intermediário na via bioquímica que leva à produção do aminoácido aromático triptofano, células de levedura do tipo selvagem normalmente não liberam ácido o- aminobenzoico. Portanto, a célula de levedura capaz de converter pelo menos um substrato fermentável em ácido o- aminobenzoico é, preferencialmente, uma célula de levedura cujas vias bioquímicas são modificadas de tal modo que nem todo o ácido o-aminobenzoico produzido seja utilizado em reações bioquímicas adicionais, porém se acumule na célula e seja finalmente liberado no caldo de fermentação.

[0011] Em princípio, há duas abordagens para obter tal célula. (i) O fluxo de carbono através da via que resulta no ácido o-aminobenzoico pode ser aumentado para que a taxa de produção de o-aminobenzoico exceda a taxa de consumo por reações a jusante que levam à síntese de triptofano. (ii) A capacidade das vias que convertem ácido o-aminobenzoico em metabólitos ou produtos subsequentes, por exemplo, triptofano, pode ser diminuída para que até mesmo a taxa de produção de ácido o-aminobenzoico encontrado em cepas do tipo selvagem cause o acúmulo desse composto. Em uma modalidade preferencial da invenção, pelo menos uma via bioquímica que consume ácido o-aminobenzoico é completamente bloqueada. Resultados particularmente vantajosos são obtidos se ambas as abordagens forem combinadas para que a célula de levedura tenha uma taxa de produção aumentada de ácido o-aminobenzoico em comparação à célula do tipo selvagem e, ao mesmo tempo, um consumo diminuído de ácido o-aminobenzoico.

[0012] Métodos para obter células de levedura com as propriedades descritas acima são bem conhecidos na técnica. Células adequadas podem ser simplesmente selecionadas por triagem por mutantes que liberam ácido o-aminobenzoico no meio. A frequência de mutantes em tal experimento pode ser aumentada por meios comuns, como radiação por ionização ou agentes mutagênicos químicos. No entanto, já que esse processo depende do acaso, o direcionamento de enzimas- chave das vias relevantes por engenharia genética é mais preferencial. Com o uso de métodos comuns de engenharia genética, a expressão de genes e atividade enzimática pode ser aumentada, diminuída ou até mesmo eliminada, como desejado.

[0013] Espécies de levedura preferenciais a serem usadas no método da presente invenção são Ashbya gossypii, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces bailii e Saccharomyces cerevisiae. Mais preferencialmente, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

[0014] Preferencialmente, a célula de levedura capaz de converter um substrato fermentável em ácido o-aminobenzoico compreende uma modificação de atividade de antranilato fosforibosiltransferase que diminui a dita atividade enzimática. Com essa modificação, o fluxo de o- aminobenzoato para N-(5-fosfo-D-ribosil)-antranilato é diminuído ou completamente eliminado. Portanto, a dita modificação leva ao acúmulo de o-aminobenzoato.

[0015] O termo atividade de antranilato fosforibosiltransferase se refere a uma atividade enzimática que catalisa a conversão de o-aminobenzoato em N-(5-fosfo-D-ribosil)-antranilato. Em levedura, a atividade de antranilato fosforibosiltransferase é mediada por Trp4 (YDR354W).

[0016] A diminuição de atividade de antranilato fosforibosiltransferase descrita acima pode ser alcançada de três maneiras principais: (i) A regulação da expressão do gene trp4 em levedura pode ser modificada para que a transcrição do gene seja diminuída ou eliminada. (ii) A sequência de ácidos nucleicos do gene trp4 pode ser modificada para que a enzima codificada pelo gene modificado tenha uma atividade específica menor. (iii) O gene trp4 pode ser substituído por gene derivado de um organismo diferente de levedura e que codifica uma enzima com uma atividade específica menor de antranilato fosforibosiltransferase do que Trp4.

[0017] Em uma modalidade especialmente preferencial da presente invenção, a célula de levedura não tem nenhuma atividade de antranilato fosforibosiltransferase residual. Preferencialmente, isso é alcançado eliminando a expressão do gene trp4 na célula de levedura ou modificando a sequência de ácidos nucleicos do gene trp4 de tal modo que uma proteína sem atividade de antranilato fosforibosiltransferase seja obtida. Uma cepa resultante de tal modificação também é conhecida na técnica como "cepa knock-out". Evidentemente, tal cepa é auxotrófica para L- triptofano.

Ácido O-aminobenzoico

[0018] O termo “ácido o-aminobenzoico" como denominado no presente pedido se refere a ácido 2-aminobenzoico. Esse composto também é conhecido como ácido antranílico. A pessoa versada na técnica sabe que um ácido pode estar presente em sua forma protonada como substância neutra ou desprotonada como um ânion. Em solução aquosa, uma parte do ácido é protonada e uma parte está presente como ânion. A razão entre ácido protonado e ânion depende do pH da solução e da constante de dissociação Ka do ácido em questão. A menos que seja indicado de outro modo, o termo "ácido o-aminobenzoico", como usado neste pedido, sempre se refere tanto ao ácido protonado quanto ao ânion correspondente.

Caldo de fermentação

[0019] No início da fermentação, o caldo de fermentação compreende as células de levedura recombinantes e pelo menos um substrato fermentável. Preferencialmente, o caldo de fermentação compreende adicionalmente pelo menos um composto selecionado a partir do grupo que consiste em sistemas de tampão, nutrientes inorgânicos, aminoácidos, vitaminas e outros compostos orgânicos essenciais para crescimento e/ou manutenção da célula de levedura recombinante. O caldo de fermentação é à base de água. Após um tempo suficiente de fermentação, o caldo de fermentação também compreende ácido o-aminobenzoico, o produto de fermentação desejado.

Substrato Fermentável

[0020] Um substrato fermentável como compreendido pelo presente pedido é qualquer composto orgânico ou mistura de compostos orgânicos que podem ser utilizados pela célula de levedura recombinante para produzir ácido o-aminobenzoico na presença ou ausência de oxigênio. Já que uma modalidade preferencial do método da presente invenção se refere à produção de ácido o-aminobenzoico sob condições anóxicas, o substrato fermentável é preferencialmente um composto orgânico ou mistura de compostos orgânicos que podem ser convertidos sob condições anóxicas em ácido o- aminobenzoico. Os substratos fermentáveis preferenciais servem adicionalmente como fontes de energia e carbono para o crescimento das células de levedura recombinantes. Os substratos fermentáveis preferenciais são beterraba processada, cana-de-açúcar, plantas contendo amido e lignocelulose. Também são preferenciais como substrato fermentável glicerol e compostos C1, preferencialmente CO, e açúcares fermentáveis.

[0021] Os açúcares fermentáveis preferenciais são C-5 monossacarídeos, C-6 monossacarídeos, dissacarídeos e trissacarídeos. Os C-5 monossacarídeos preferenciais são xilose e arabinose. Os C-6 monossacarídeos preferenciais são glicose, frutose e manose. Um dissacarídeo preferencial é sacarose e um trissacarídeo preferencial é cestose. As plantas contendo amido preferenciais são milho, trigo e centeio. A lignocelulose é preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em palha, madeira e bagaço.

Caldo de fermentação, outros constituintes

[0022] Além do substrato fermentável, o caldo de fermentação também compreende nutrientes inorgânicos, aminoácidos, vitaminas e outros compostos orgânicos que são necessários para o crescimento e/ou metabolismo de manutenção da célula de levedura recombinante. A pessoa versada na técnica conhece os tipos e quantidades de nutrientes inorgânicos que devem ser fornecidos ao meio a fim de alcançar a concentração de biomassa desejada. Diferentes cepas de levedura podem diferir quanto à sua necessidade de vitaminas, aminoácidos e outros compostos orgânicos. Se essas informações não são dadas pelo fornecer da cepa, é possível obtê-las por experimentos de crescimento simples que são comuns para a pessoa versada na técnica.

[0023] A modificação genética da célula de levedura que a torna capaz de acumular e liberar ácido o-aminobenzoico pode interromper ou diminuir o fluxo de carbono por vias bioquímicas, o que fornece compostos orgânicos essenciais para o crescimento e/ou a manutenção da célula de levedura recombinante. As células de levedura recombinantes com tais modificações genéticas têm, portanto, auxotrofias particulares. A composição do meio deve considerar tais auxotrofias. Se a célula de levedura não tiver nenhuma atividade de antranilato fosforibosiltransferase como em uma modalidade preferencial da presente invenção, é auxotrófica para L-triptofano e esse aminoácido tem que ser adicionado ao caldo de fermentação.

[0024] Preferencialmente, o caldo de fermentação compreende adicionalmente pelo menos um sistema de tampão. O sistema de tampão compreende um ácido fraco e sua base conjugada ou vice versa. Como um efeito do tampão, a adição de um ácido ou base forte ao caldo de fermentação altera seu valor de pH consideravelmente menos do que na ausência de um tampão. Para cada faixa de pH desejada, há pelo menos um sistema de tampão adequado. Tais tampões são conhecidos pela pessoa versada na técnica. Um tampão preferencial é um tampão de citrato.

[0025] No entanto, em uma aplicação industrial do método da presente invenção, será preferencial ajustar o pH adicionando um ácido ou uma base ao caldo de fermentação já que substâncias de tampão causam um custo adicional.

Vaso de fermentação

[0026] O termo "vaso de fermentação" se refere a qualquer vaso que possa ser usado para conduzir a fermentação do substrato fermentável para ácido o- aminobenzoico. Preferencialmente, o dito vaso de fermentação compreende meios para medir parâmetros de processo relevantes, como temperatura, pH, concentração de substrato, concentração de produto, oxigênio dissolvido e densidade celular do caldo de fermentação. Preferencialmente, o vaso de fermentação compreende adicionalmente meios para ajustar pelo menos um dentre os ditos parâmetros de processo.

[0027] Em geral, a pessoa versada na técnica sabe como projetar vasos de fermentação que são adequados para um dado processo de fermentação. Particularmente, o projeto do vaso de fermentação deve ser adaptado ao modo desejado do processo de fermentação (fermentação por batelada, batelada alimentada ou contínua). Vasos de fermentação incluem reatores de tanque agitado, reatores de membrana, reatores de fluxo pistonado ou reatores de laço (Bioprozesstechnik, Horst Chmiel, ISBN-10: 3827424763, Spektrum Akademischer Verlag). Os vasos de reator preferenciais para fermentação aeróbica e anaeróbica são reatores de tanque agitado ou reatores de laço (especialmente do tipo airlift).

[0028] A presente invenção se refere a um processo integrado de produzir ácido o-aminobenzoico na etapa de método a) e separar o ácido o-aminobenzoico produzido na etapa de método b). Os presentes pedidos revelam diversos modos de realizar a etapa de método b). Alguns desses exigem vasos de fermentação especializados. Tais vasos particularmente preferenciais são descritos mais abaixo em conjunto com a etapa de separação b).

Cultura em batelada/batelada alimentada/contínua

[0029] Há três modos principais de realizar uma fermentação: fermentação em batelada, batelada alimentada e contínua.

[0030] Em uma fermentação em batelada, um caldo de fermentação que compreende células de levedura recombinantes, pelo menos um substrato fermentável e demais componentes exigidos como descrito acima é preparado. O caldo de fermentação é, então, incubado em um vaso de fermentação sob condições que são adequadas para que as células de levedura recombinantes produzam ácido o- aminobenzoico. Uma fermentação em batelada também pode envolver o crescimento da biomassa. No entanto, é possível, em princípio, incubar as células de levedura recombinantes sob condições que não permitem o crescimento já que a formação de produto nas células de levedura recombinantes da presente invenção não é associada a crescimento. Durante a fermentação, nenhum outro substrato fermentável é adicionado. No entanto, pode ser vantajoso adicionar ácidos ou bases inorgânicos ao caldo de fermentação a fim de manter ou alcançar um valor de pH desejado. Após a concentração do substrato fermentável decair para abaixo de um nível definido, uma certa quantidade de ácido o- aminobenzoico é produzida ou a taxa de produção de ácido o- aminobenzoico decai para abaixo de um nível definido, a fermentação é interrompida e o ácido o-aminobenzoico é separado do caldo de fermentação.

[0031] Em uma fermentação em batelada alimentada, um caldo de fermentação que compreende células de levedura recombinantes, pelo menos um substrato fermentável e demais componentes exigidos como descrito acima é preparado. O caldo de fermentação é, então, incubado em um vaso de fermentação sob condições que são adequadas para que as células de levedura recombinantes produzam ácido o- aminobenzoico. Uma fermentação em batelada alimentada também pode envolver o crescimento da biomassa. Após o início da fermentação, outro substrato fermentável é adicionado pelo menos uma vez ao caldo de fermentação. Então, uma fermentação em batelada alimentada típica é caracterizada por um período de crescimento e/ou formação de produto de biomassa até que a concentração do substrato fermentável decaia para abaixo de um certo limite. Quando isso acontece, outro substrato fermentável é adicionado e a fermentação continua. Esse processo pode ser repetido diversas vezes. No método da presente invenção, é preferencialmente repetido pelo menos uma vez, pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes ou pelo menos quatro vezes. Após o número desejado de repetições, o ácido o- aminobenzoico é separado do caldo de fermentação. Os compostos diferentes do substrato fermentável, particularmente ácidos ou bases inorgânicos, podem ser adicionados tão frequentemente quanto desejado.

[0032] Em uma fermentação contínua, o substrato fermentável é adicionado continuamente ao caldo de fermentação. Tipicamente, o caldo de fermentação que compreende células de levedura e opcionalmente ácido o- aminobenzoico é removido de modo contínuo do vaso de fermentação e substituído por caldo de fermentação fresco. Em uma fermentação contínua típica, as concentrações de biomassa, produto fermentável e ácido o-aminobenzoico estão em um estado estável. As células de levedura em tal sistema nunca alcançam sua fase estacionária de crescimento porque as células são removidas de modo contínuo e a adição de caldo de fermentação fresco e substrato fermentável mantém as condições que permitem a proliferação celular. Se as células são removidas da corrente de produto e realimentadas ao vaso de fermentação operado de modo contínuo, o consumo de substrato para proliferação celular pode ser reduzido.

[0033] A capacidade de fermentação total pode ser dividida entre diversos fermentadores, e tanques de separação podem ser usados para permitir um fornecimento contínuo de material de fermentação à seção a jusante que compreende etapas.

Condições anóxicas

[0034] "Condições anóxicas", como denominadas no presente pedido, são condições caracterizadas por saturação de oxigênio menor do caldo de fermentação do que estaria presente sem consumo de oxigênio no meio na pressão parcial de oxigênio presente no vaso de fermentação. Condições anóxicas prevalecem no caldo de fermentação se o consumo de oxigênio das células de levedura exceder a taxa de transporte de oxigênio do ar para o caldo de fermentação. Esse desequilíbrio entre o fornecimento e consumo de oxigênio resulta em uma concentração de oxigênio decrescente no caldo de fermentação. Já que a levedura é capaz de viver e até mesmo crescer anaerobicamente, condições anóxicas no caldo de fermentação são aceitáveis. Portanto, o vaso de fermentação não precisa ser necessariamente equipado com dispositivos de aeração resultantes em um aparelho mais simples e menos dispendioso.

[0035] Para garantir um crescimento suficiente sob condições anóxicas, pelo menos quantidades muitos pequenas de oxigênio devem ser fornecidas para suportar reações enzimáticas que são essenciais para o crescimento e dependem da presença de oxigênio, por exemplo, mono- oxigenases envolvidas em biossíntese de ergostirol.

[0036] Preferencialmente, o termo "condições anóxicas" se refere a 5 a 90 %, mais preferencialmente 5 a 80 %, ainda mais preferencialmente 5 a 60 % e com máxima preferência 5 a 40 % da saturação de oxigênio que estaria presente no caldo de fermentação sob pressão atmosférica parcial de oxigênio na dada temperatura sem consumo de oxigênio.

Produção durante fase estacionária de crescimento

[0037] Constatou-se, surpreendentemente, no estudo subjacente à presente invenção que a produção de ácido o- aminobenzoico por levedura não é associada a crescimento. Portanto, em uma modalidade preferencial do método da presente invenção, uma quantidade considerável do ácido o- aminobenzoico produzido na etapa de método a) é produzida durante a fase estacionária de crescimento. Essa característica de levedura é preferencialmente utilizada em fermentações em batelada ou batelada alimentada, a qual pode ser adaptada para durar ao longo da fase estacionária de crescimento das células. Além disso, a habilidade da levedura de produzir ácido o-aminobenzoico durante a fase estacionária de crescimento torna possível reciclar células de levedura separadas da fermentação para fermentações adicionais. Em geral, o desacoplamento de crescimento de biomassa e formação de produto em células de levedura leva a uma utilização mais econômica do substrato, porque menos substrato é consumido para o acúmulo de biomassa e, então, uma maior proporção é canalizada na produção de ácido o- aminobenzoico.

[0038] O termo “fase estacionária de crescimento”, como denominada no presente pedido, se refere a uma fase durante o cultivo caracterizada por uma estabilidade na biomassa, isto é, nem aumento nem diminuição da biomassa, a qual pode ser causada por condições de fermentação ou é baseada em limites de capacidade de nutriente(s) e/ou espaço. É precedida por uma fase de crescimento. Preferencialmente, a biomassa durante a fase estacionária de crescimento não é alterada por proliferação celular ou morte celular em mais que 30 %, mais preferencialmente não mais que 20 % e com máxima preferência não mais que 10 % por 5 horas.

pH do processo

[0039] A levedura é capaz de crescer a valores de pH abaixo de 7,0. Desse modo, a etapa de método a) é preferencialmente realizada a um pH ácido, isto é, um pH de menos de 7,0. É preferencial realizar a etapa de método a) no pH mais baixo possível, o qual é próximo ao ponto isoelétrico de ácido aminobenzoico e ainda permite o crescimento das células de levedura ou pelo menos produção o-aminobenzoica durante a fase estacionária de crescimento. Já que a proporção de ácido o-aminobenzoico que está presente na forma neutra protonada aumenta com o pH decrescente, a solubilidade de ácido o-aminobenzoico diminui com o pH com um mínimo de solubilidade no ponto isoelétrico de ácido o-aminobenzoico. Concentrações menores de ácido o-aminobenzoico dissolvido no caldo de fermentação significam menos toxicidade para as células de levedura. Ademais, uma maior proporção de ácido o-aminobenzoico neutro protonado com baixa solubilidade em água facilita sua separação do caldo de fermentação na etapa de método b).

[0040] O valor de pH durante a etapa de método a) está na faixa preferencialmente de 2,0 a 6,0, ainda mais preferencialmente de 2,5 a 5,5, ainda mais preferencialmente de 3,0 a 5,5 e com máxima preferência de 3,5 a 4,0.

[0041] Em uma modalidade preferencial do método da presente invenção, cristais de ácido o-aminobenzoico são adicionados ao caldo de fermentação como sementes de cristal a fim de facilitar a cristalização. Preferencialmente, os cristais são adicionados na última metade, último terço ou último quarto de uma fermentação em batelada. Também preferencialmente, os cristais são adicionados na última metade, último terço ou último quarto de uma fermentação em batelada alimentada. Os cristais de ácido o-aminobenzoico podem ser obtidos a partir de fornecedores comerciais ou podem ser um produto de um ciclo de produção anterior do método da presente invenção.

[0042] Separação de ácido o-aminobenzoico do caldo de fermentação

[0043] Qualquer método para a separação de partículas sólidas de uma fase líquida pode ser usado na etapa de método b). Os métodos preferenciais são filtração, sedimentação, hidrociclones e centrifugação. Já que o ácido o-aminobenzoico protonado é mais bem solúvel em solventes orgânicos, como dodecanol, undecilamina, diciclo- hexilamina, 2,6-dietilanilina, octiléster de ácido butânico, dodeciléster de ácido acético, dimetilftalato, benzil-hexiléter, dietilelgilcol di-n-butiléter, do que em água, a extração de ácido o-aminobenzoico com um ou mais dos solventes mencionados anteriormente é outra modalidade preferencial da etapa de método b).

[0044] Devido ao fato de que a solubilidade de ácido o- aminobenzoico em água diminui com o pH, é preferencial realizar a separação a um pH abaixo de 7,0. Preferencialmente, na etapa de método b), o pH está abaixo de 6,0, mais preferencialmente abaixo de 5,0 e com máxima preferência entre 3,4 e 4,0. Se o valor de pH for diminuído antes ou durante a etapa de método b), o uso de ácidos minerais fortes, como HCl ou H3PO4, é preferencial. Como mostrado na Figura 7, a solubilidade de ácido orto- aminobenzoico (oAB) em água é particularmente baixo na faixa entre pH 3,0 e pH 4,0. Então, essa faixa também é preferencial.

[0045] O caldo de fermentação pode ser acidificado em qualquer ponto no tempo antes ou durante a etapa de separação b). No entanto, devido à tolerância a ácido inerente de células de levedura, é preferencial realizar o processo de fermentação completo, incluindo as etapas de método a) e b), a um pH entre 3,0 e 5,0, mais preferencialmente entre pH 3,0 e 4,0 e com máxima preferência entre pH 3,4 e 4,0.

[0046] Em uma modalidade preferencial da invenção, o pH é estabilizado na faixa definida acima por adição subestequiométrica de um tampão alcalino. Em uma modalidade mais preferencial, o pH é estabilizado na faixa definida acima sem o uso de um sistema de tampão.

[0047] Se a fermentação na etapa de método a) for realizada a um pH entre 3,0 e 4,0, é preferencial que a etapa de método b) seja realizada no mesmo pH sem acidificação adicional devido ao fato de que a solubilidade de ácido o-aminobenzoico em água nessa faixa de pH é suficientemente baixa.

[0048] No caldo de fermentação, dois tipos de partículas estão presentes: cristais de ácido o-aminobenzoico e células de levedura.

[0049] Em uma modalidade preferencial, o ácido o- aminobenzoico cristalizado é separado do caldo de fermentação sem separar as células de levedura do caldo de fermentação. Com máxima preferência, isso é alcançado por métodos que utilizam a densidade diferente de células de levedura e ácido o-aminobenzoico cristalizado. A velocidade de rotação do agitador no vaso de fermentação pode ser ajustada para que apenas as células de levedura sejam mantidas em suspensão enquanto o oAB cristalizado que tem uma maior densidade do que as células de levedura se sedimenta no fundo do vaso de fermentação. O oAB sólido sedimentado pode ser, então, removido e processado adicionalmente, por exemplo, por filtração e secagem. Desse modo, a separação de oAB de células de levedura e caldo de fermentação pode ser realizada sem remover o caldo de fermentação do vaso de fermentação.

[0050] A densidade da levedura está na faixa de 1,08-1,1 g/cm3 dependendo do ciclo celular. A densidade de oAB em batelada é de 1,41 g/cm3. O tamanho de partícula também é um parâmetro influente. As células de levedura têm uma distribuição de tamanho que corresponde a um comprimento característico abaixo de 10 micrômetros. Uma distribuição de tamanho típica para células de levedura pode ser encontrada na literatura (P. Jorgensen et al. Science 297: 395, 2002).

[0051] Diferenças em tamanho e densidade levam à diferença em velocidade de sedimentação/flutuação como pode ser representado para o caso simplificado da lei de Stokes por meio da seguinte equação:

[0052] Para um sistema agitado, a velocidade mínima de rotação para suspender uma partícula também depende do tamanho e da densidade da partícula como representado com a equação de Zwietering; de acordo com a qual a razão entre a velocidade de rotação para suspender duas partículas com diferentes densidades e tamanhos pode ser representada como em

[0053] Um processo preferencial para separar oAB do caldo de fermentação na etapa de método b) é baseado nesses fenômenos. Uma representação esquemática dessa modalidade é retratada na Figura 3. Aos cristais de oAB nascentes no fermentador é dado tempo suficiente para crescer até tamanhos acima de um dado tamanho, preferencialmente acima de 100 mícrons, com máxima preferência acima de 500 mícrons. O tamanho é selecionado definindo o raio de corte do filtro usado na filtração F a jusante do fermentador. Alcançar tais tamanhos facilita (i) sua separação das células e (ii) a desidratação do oAB para processamento adicional.

[0054] O filtrado pode ser reciclado para o vaso de fermentação, para permitir um maior tempo de permanência e introduzir um efeito de elutriação. A velocidade de rotação do agitador é ajustada para que seja maior que a velocidade mínima para manter as células de levedura suspensas enquanto estiverem abaixo da velocidade mínima para manter os cristais com o tamanho de corte selecionado suspensos. As razões de velocidades mínimas de suspensão para várias combinações de tamanho e densidade são dadas na Tabela 1, a qual mostra que uma ampla faixa de velocidades de rotação existe para satisfazer esse critério. Tabela 1

[0055] Esse processo de recuperação pode ser realizado em paralelo com a fermentação ou em uma etapa de coleta subsequente à fermentação. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a dita etapa de coleta é conduzida a valores inferiores de pH, preferencialmente abaixo de 5,0, mais preferencialmente entre pH 3,0 e 4,0, com máxima preferência entre pH 3,4 e 4,0 para maximizar a recuperação de cristais de oAB. A fermentação e a coleta podem ser operadas em modos de operação contínuo, em semibatelada ou em batelada. Em uma modalidade especialmente preferencial da invenção, o método de separação descrito acima é usado em combinação com um modo de fermentação contínuo.

[0056] Se a fermentação for realizada como um processo de batelada ou batelada alimentada, é preferencial isolar o oAB sólido formado durante o processo de fermentação como descrito acima e isolar o oAB solúvel remanescente no caldo de fermentação no final da fermentação por adsorção e dessorção como descrito mais abaixo no pedido.

[0057] Em outra modalidade preferencial da presente invenção, tanto o ácido o-aminobenzoico quanto as células de levedura são separados do caldo de fermentação em uma etapa única ou em duas etapas separadas. Se as células de levedura e o ácido o-aminobenzoico forem separados do caldo de fermentação em uma etapa, é preferencial adicionar uma etapa adicional para separar o ácido o-aminobenzoico de células de levedura ao método. Nessa modalidade, a separação é realizada fora do vaso de fermentação, isto é, o caldo de fermentação contendo células de levedura e oAB é removido do vaso de fermentação e submetido à separação de oAB das células de levedura e dos constituintes líquidos do caldo de fermentação.

[0058] Para esse propósito, qualquer operação de unidade baseada em diferenças em movimento de partícula em fluxo, campo gravitacional ou centrífugo, pode ser implementada. Por exemplo, a filtração em cubas de sedimentação, centrífugas, hidrociclones, etc. também pode ser projetada, como, por exemplo, em Perry's Chemical Engineers' Handbook, Oitava Edição.

[0059] A Figura 4 mostra o processo esquematicamente. O caldo de fermentação que compreende células de levedura e oAB é removido do processo de fermentação B e submetido a uma separação D que emprega pelo menos um dos meios descritos acima. A fim de recuperar mais oAB que é dissolvido no caldo de fermentação e não pode separado pelos meios e métodos descritos acima, o caldo de fermentação pode ser submetido a uma etapa adicional de adsorção e dessorção E. Alternativamente, o caldo de fermentação resultante da separação D pode ser alimentado de volta para o vaso de fermentação.

[0060] Mesmo no mínimo de solubilidade de oAB a um pH entre pH 3,0 e pH 4,0, aproximadamente 5 g/l de oAB permanecem dissolvidos no caldo de fermentação. O oAB sólido é apenas formado se maiores concentrações de oAB estiverem presentes. Então, métodos de separação sólido/líquido não podem ser usados para recuperar oAB a concentrações abaixo de 5,0 g/l, levando, então, a uma perda potencial de oAB em caldo de fermentação descartado. A fim de recuperar o oAB dissolvido, a adsorção a uma fase sólida adequada sucedida por dessorção é um método de isolamento que pode ser usado por si só ou em combinação com outros métodos em várias modalidades da presente invenção.

[0061] Em qualquer modalidade da etapa de método b) que resulta na separação de células de levedura do caldo de fermentação por separação líquido/sólido ou sólido/sólido/líquido, é preferencial retornar pelo menos uma parte das células de levedura separadas ao caldo de fermentação separado ou adicioná-la a caldo de fermentação fresco. Já que as células de levedura são capazes de produzir o-aminobenzoico desacoplado do crescimento de biomassa, células de levedura existentes podem ser usadas em fermentações adicionais sem a necessidade de consumir substrato para a produção de nova biomassa.

[0062] Em uma modalidade preferencial adicional da etapa de método b) da presente invenção, a separação de oAB das células de levedura e do caldo de fermentação na etapa de método b) é realizada por extração com um solvente adequado. Esse processo também é denominado extração de líquido de oAB.

[0063] Os solventes adequados são aqueles que não são solúveis em água, têm uma grande diferença de densidade com água e têm um ponto de fusão abaixo de 25 °C. Preferencialmente, um solvente adequado tem adicionalmente um ponto de ebulição maior que o da anilina. Os solventes preferenciais são dodecanol, undecilamina, diciclo- hexilamina, 2,6-dietilamina, octiléster de ácido butânico, dodeciléster de ácido acético, éter benzil hexílico, dietileno glicol, éter di-n-butílico. O dodecanol é especialmente preferencial.

[0064] Em uma modalidade preferencial do processo de extração, a extração é realizada adicionando-se o solvente ao vaso de fermentação. O solvente pode ser continuamente adicionado e removido do vaso de fermentação para que uma quantidade constante de solvente esteja sempre presente. Já que o solvente que porta oAB dissolvido é continuamente substituído por solvente fresco, o solvente que está presente no vaso de fermentação nunca é saturado com oAB, mantendo, desse modo, os níveis de oAB na fase aquosa baixos. Isso mitiga o problema de toxicidade de oAB em relação às células de levedura. No entanto, as células de levedura precisam ser capazes de tolerar o solvente usado. Essa modalidade é particularmente adequada para um processo de fermentação contínua.

[0065] Esse processo é esquematicamente mostrado na Figura 5. O solvente que porta oAB é removido da fermentação B pela corrente 19 e é submetido a descarboxilação G. Opcionalmente, em um processo contínuo ou de batelada alimentada, o caldo de fermentação sem solvente é removido da fermentação pela corrente 7 e submetido à separação líquido/sólido a fim de obter caldo de fermentação puro. O dito caldo de fermentação puro é preferencialmente submetido à adsorção e dessorção E a fim de recuperar oAB que permanece dissolvido na fase aquosa.

[0066] Em outra modalidade preferencial do processo de extração, o solvente é adicionado ao caldo de fermentação que foi removido do vaso de fermentação. As células de levedura podem ser removidas do caldo de fermentação antes de o solvente ser adicionado. No entanto, é igualmente preferencial realizar a extração de líquido de oAB com o caldo de fermentação, incluindo as células de levedura.

[0067] Uma modalidade preferencial desse processo é esquematicamente mostrada na Figura 6. O caldo de fermentação contendo células de levedura e oAB é removido da fermentação B. A biomassa (corrente 17) é separada da fase líquida e a fase líquida é submetida à extração de líquido L. A fase aquosa resultante da extração de líquido, isto é, o caldo de fermentação sem células e com uma quantidade residual de oAB dissolvido, é preferencialmente submetida à adsorção e dessorção E a fim de recuperar o oAB residual. Deve-se notar que a separação de biomassa D também pode ser omitida para que todo o caldo de fermentação seja submetido à extração de líquido.

[0068] O uso de levedura em vez de bactérias aeróbicas para a produção de ácido o-aminobenzoico de substratos fermentáveis tem diversas vantagens: (i) A levedura sobrevive e até mesmo se prolifera sob condições anóxicas. Então, as concentrações diminuídas de oxigênio durante o processo de fermentação não diminuem o rendimento de produto para que os meios para aeração do caldo de fermentação possam ser omitidos ou reduzidos. Isso diminui o custo e a complexidade do vaso de fermentação. (ii) A levedura sobrevive e até mesmo se prolifera sob condições ácidas. Isso diminui a solubilidade do ácido o- aminobenzoico em água para que as células sejam expostas a concentrações menores de ácido o-aminobenzoico dissolvido do que a um pH neutro. Isso mitiga o problema de toxicidade de produto. Além disso, a quantidade de base que tem que ser adicionada a fim de manter o pH do caldo de fermentação estável é menor, diminuindo, desse modo, a quantidade de sal produzido no processo. (iii) Se o método for realizado a um pH ácido que é apenas possível com levedura, a etapa de separação b) é facilitada. Já que a solubilidade do ácido o-aminobenzoico diminui com o pH, menos ou até mesmo nenhum ácido deve ser adicionado antes da etapa de método b), diminuindo ainda mais, desse modo, a quantidade de sal produzido pelo método. Ademais, se concentrações de produto suficientes forem alcançadas, ácido o-aminobenzoico cristalizado se forma durante a etapa de fermentação a) e pode ser removido do caldo de fermentação enquanto a etapa de fermentação a) continua. Isso permite as fermentações baseadas em integração de levedura em diversos conceitos de processo vantajosos descritos mais abaixo neste pedido. (iv) Constatou-se surpreendentemente que a formação de ácido o-aminobenzoico por levedura não é associada a crescimento de biomassa e, desse modo, continua com taxas aceitáveis durante a fase estacionária de crescimento. Conceitos de processo que envolvem o uso de células de levedura durante a fase estacionária de crescimento têm a vantagem de que uma menor proporção do substrato fermentável é direcionada para crescimento de biomassa em comparação a conceitos de processo que usam células apenas na fase de crescimento exponencial. Essa é uma vantagem particular do método da presente invenção sobre métodos baseados em bactérias conhecidos pela técnica anterior.

[0069] Em uma modalidade preferencial, a presente invenção se refere ao processamento adicional do ácido o- aminobenzoico produzido de acordo com o método descrito acima à anilina. Então, a presente invenção se refere a um método para produzir ácido o-aminobenzoico ou anilina, em que ácido o-aminobenzoico é produzido como estabelecido acima neste pedido e a conversão de ácido o-aminobenzoico em anilina é conduzida pelas etapas de método adicionais definidas abaixo.

[0070] Preferencialmente, o ácido o-aminobenzoico é convertido em anilina por métodos puramente químicos, isto é, sem o uso de microrganismos ou enzimas como catalisadores. Um método químico preferencial é a descarboxilação térmica do ácido o-aminobenzoico.

[0071] A descarboxilação térmica é preferencialmente realizada na presença de um catalisador. Um catalisador é um catalisador de zeólito, em que o dito catalisador de zeólito com máxima preferência é zeólito H-Y (por exemplo, como obtido junto à Zeolyst International, número de catálogo CBV600). O catalisador ácido zeólito H-Y (SiO2/Al2O3 pode estar entre 5 e 7, preferencialmente é 5,5) tem um caráter ácido particularmente alto e tem um maior tamanho de poro (0,7-0,8 nm) do que, por exemplo, ZSM5-27 (por exemplo, como obtido junto à Clariant SuedChemie, número de catálogo MFI-27, SiO2/Al2O3 = 27), que também possui um caráter ácido forte, porém tem um tamanho de poro menor (0,5 nm) para que as moléculas de ácido o- aminobenzoico não possam penetrá-lo de modo eficaz e consequentemente não tenham fácil acesso aos sítios ativos do catalisador ácido, reduzindo, desse modo, sua eficácia.

[0072] Preferencialmente, a descarboxilação térmica é realizada em um solvente orgânico. O ácido o-aminobenzoico, por exemplo, na forma de cristais, com ou sem umidade residual, é termicamente descarboxilado, preferencialmente ao alimentar um reator de descarboxilação com o ácido. A descarboxilação térmica pode ser realizada a uma temperatura entre 150 °C e 250 °C, preferencialmente entre 160 °C e 220 °C, mais preferencialmente entre 180 °C e 200 °C. A descarboxilação térmica pode ser realizada por tempo suficiente para reagir o ácido o-aminobenzoico à anilina. Preferencialmente, a descarboxilação térmica é realizada por 0,5 horas a 3 horas.

[0073] A descarboxilação térmica pode ser realizada na presença de um catalisador ácido a fim de acelerar a descarboxilação térmica.

[0074] A descarboxilação térmica pode ser realizada em um solvente como água, anilina ou em 1-dodecanol, preferencialmente em 1-dodecanol, ou em uma mistura de 1- dodecanol e anilina.

[0075] Ademais, a descarboxilação térmica pode ser realizada em um reator, em que a pressão no reator pode ser selecionada como uma função de quanto da fase líquida se permite evaporar durante a reação e sair do reator com o dióxido de carbono (CO2) que é um produto da descarboxilação.

[0076] Em uma modalidade adicional do método de acordo com a invenção, a descarboxilação térmica é sucedida por uma etapa adicional para purificar a anilina, preferencialmente por destilação.

[0077] Em outra modalidade, a presente invenção se refere a uma célula de levedura recombinante que compreende uma modificação de atividade de antranilato fosforibosiltransferase que diminui a dita atividade enzimática.

[0078] Espécies de levedura preferenciais a serem usadas no método da presente invenção são Ashbya gossypii, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrowia lipolytica, Zygosaccharomyces bailii e Saccharomyces cerevisiae. Mais preferencialmente, a levedura é Saccharomyces cerevisiae.

[0079] O termo atividade de antranilato fosforibosiltransferase se refere a uma atividade enzimática que catalisa a conversão de o-aminobenzoato em N-(5-fosfo-D-ribosil)-antranilato. Em uma modalidade preferencial da presente invenção, a atividade de antranilato fosforibosiltransferase é mediada por Trp4 (YDR354W).

[0080] A diminuição de atividade de antranilato fosforibosiltransferase descrita acima pode ser alcançada de três maneiras principais: (i) A regulação da expressão do gene trp4 em levedura pode ser modificada para que a transcrição do gene seja diminuída ou eliminada. (ii) A sequência de ácidos nucleicos do gene trp4 pode ser modificada para que a enzima codificada pelo gene modificado tenha uma atividade específica menor. (iii) O gene trp4 pode ser substituído por gene derivado de um organismo diferente de levedura e que tem uma atividade específica menor de antranilato fosforibosiltransferase do que Trp4.

[0081] Em uma modalidade especialmente preferencial da presente invenção, a célula de levedura não tem nenhuma atividade de antranilato fosforibosiltransferase residual. Preferencialmente, isso é alcançado eliminando a expressão do gene trp4 na célula de levedura ou modificando a sequência de ácidos nucleicos do gene trp4 de tal modo que uma proteína sem atividade de antranilato fosforibosiltransferase seja obtida. Uma cepa resultante de tal modificação também é conhecida na técnica como "cepa knock-out". Evidentemente, tal cepa é auxotrófica para L- triptofano.

[0082] A célula de levedura recombinante pode compreender outras modificações genéticas que aumentam a disponibilidade de precursores para a síntese de ácido o- aminobenzoico.

[0083] Ainda em outra modalidade, a presente invenção se refere ao uso da célula de levedura recombinante para produzir ácido o-aminobenzoico de pelo menos um substrato fermentável.

[0084] Em uma modalidade particularmente preferencial da presente invenção, a célula de levedura recombinante é usada no método descrito acima. Breve descrição das figuras Figura 1: Resultados de uma fermentação aeróbica em batelada alimentada com levedura como descrito no exemplo 1. Figura 2: Resultados de uma fermentação anaeróbica em batelada com levedura como descrito no exemplo 1. Figura 3: Representação esquemática da separação de oAB sólido no vaso de fermentação. A: esterilização; B: fermentação; C: compressão de ar; D: separação de biomassa; E1 e E2: adsorção e dessorção; F: filtração; G: descarboxilação; H: destilação; I: filtração; J: cristalização. 1: fonte de carbono (por exemplo, açúcar); 2: fontes de nitrogênio (por exemplo, NH3); 3: solução tampão (por exemplo, NaOH); 4: ar; 5A e 5B: pontos de alimentação para HCl, podem ser usados alternativamente ou combinados; 6: ar de escape; 7: suspensão de biomassa; 8: suspensão de cristais de oAB; 9: eluente, por exemplo, NaOH diluído; 10: HCl; 11: água servida; 12: água servida; 13: CO2; 14: resíduo; 15: resíduo; 16: produto de anilina; 17: biomassa Figura 4: Representação esquemática da separação de oAB sólido do caldo de fermentação fora do vaso de fermentação. A: esterilização; B: fermentação; C: compressão de ar; D: separação sólido/sólido/líquido; E1 e E2: adsorção e dessorção; F: filtração; G: descarboxilação; H: destilação; I: filtração; J: cristalização. 1: fonte de carbono (por exemplo, açúcar); 2: fontes de nitrogênio (por exemplo, NH3); 3: solução tampão (por exemplo, NaOH); 4: ar; 5 A e 5B e 5C: pontos de alimentação para HCl, podem ser usados alternativamente ou combinados; 6: ar de escape; 7: caldo de fermentação (biomassa, água, oAB); 8: suspensão de cristais de oAB; 9: eluente, por exemplo, NaOH diluído; 10: HCl; 11: água servida; 12: água servida; 13: CO2; 14: resíduo; 15: resíduo; 16: produto de anilina; 17: biomassa Figura 5: Representação esquemática da extração de líquido de oAB realizada no interior do vaso de fermentação. A: esterilização; B: fermentação; C: compressão de ar; D: separação de biomassa; E1 e E2: adsorção e dessorção; G: descarboxilação; H: destilação; I: filtração; J: cristalização. 1: fonte de carbono (por exemplo, açúcar); 2: fontes de nitrogênio (por exemplo, NH3); 3: solução tampão (por exemplo, NaOH); 4: ar; 5A e 5B: pontos de alimentação para HCl, podem ser usados alternativamente ou combinados 6: ar de escape; 7: suspensão de biomassa; 9: eluente, por exemplo, NaOH diluído; 10: HCl; 11: água servida; 12: água servida; 13: CO2; 16: produto de anilina; 17: biomassa; 18: solvente; 19: solução de oAB em solvente para alimentar a reação; 20: purga de solvente; 21: composição de solvente. Figura 6: Representação esquemática da extração de líquido de oAB realizada fora do vaso de fermentação. A: esterilização; B: fermentação; C: compressão de ar; D: separação de biomassa; E1 e E2: adsorção e dessorção; G: descarboxilação; H: destilação; I: filtração; J: cristalização; L: extração de líquido. 1: fonte de carbono (por exemplo, açúcar); 2: fontes de nitrogênio (por exemplo, NH3); 3: solução tampão (por exemplo, NaOH); 4: ar; 5A e 5B e 5C e 5D e 5E: pontos de alimentação para HCl, podem ser usados alternativamente ou combinados 6: ar de escape; 7: caldo de fermentação (biomassa, água, oAB); 9: eluente, por exemplo, NaOH diluído; 10: HCl; 11: água servida; 12: água servida; 13: CO2; 16: produto de anilina; 17: biomassa; 18: alimentação de solvente para o extrator; 19: solução de oAB em solvente para alimentar a reação; 20: purga de solvente; 21: composição de solvente Figura 7: Diagrama mostrando a solubilidade de oAB em água dependendo do pH. É possível notar que a solubilidade alcança seu mínimo entre pH 3 e pH 4.

[0085] Os exemplos a seguir são apenas destinados a ilustrar a invenção. Não devem limitar o escopo das reivindicações de modo algum.

Exemplos Exemplo 1 (inventivo): Produção de ácido o-aminobenzoico com levedura Cepas, meios e condições de crescimento.

[0086] A cepa knock out TRP4 de Saccharomyces cerevisiae foi adquirida junto à GE Healthcare Dharmacon Inc. Se não for determinado de outro modo, todos os produtos químicos foram adquiridos junto à Sigma-Aldrich (Sternheim). Saccharomyces cerevisiae foi cultivada sob condições estéreis a 30 °C em caldo de YPD (peptona bacteriológica, 20 g/l, extrato de levedura, 10 g/l, glicose, 20 g/l) suplementado com G418 (200 μg/ml) ou Base de Nitrogênio de levedura definida (YNB) sem Meio Mineral de Aminoácidos (sulfato de amônio, 5,0 g/l, biotina, 2,0 μg/l, pantotenato de cálcio, 400 μg/l, ácido fólico, 2,0 μg/l, inositol, 2,0 mg/l, ácido nicotínico, 400 μg/l, ácido p-aminobenzoico, 200 μg/l, HCl de piridoxina, 400 μg/l, riboflavina, 200 μg/l, HCL de tiamina, 400 μg/l, ácido cítrico, 0,1 g/l, ácido bórico, 500 μg/l, sulfato de cobre, 40 μg/l, iodeto de potássio, 100 μg/l, cloreto férrico, 200 μg/l, sulfato de magnésio, 400 μg/l, molibdato de sódio, 200 μg/l, sulfato de zinco, 400 μg/l, fosfato de potássio monobásico, 1,0 g/l, sulfato de magnésio, 0,5 g/l, cloreto de sódio, 0,1 g/l, cloreto de cálcio, 0,1 g/l) suplementado com Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements sem Triptofano (adenina, 18 mg/l, mio-inositol, 76 mg/l, ácido p- aminobenzoico, 8 mg/l, uracila, 76 mg/l, L-leucina, 380 mg/l, L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-cisteína, L- histidina, L-isoleucina, L-lisina, L-metionina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-tirosina, Lvalina, 76 mg/l, cada), G418 (200 μg/ml), α-D-glicose (20 g/l), e quantidades limitadas de L-triptofano (5 mg/l para condições aeróbicas e 1,5 mg/l para condições anaeróbicas, respectivamente). A cepa foi caracterizada em fermentadores de batelada (alimentada) (OmniFerm, HiTec Zang, Herzogenrath, Alemanha) com um volume de cultivo de 1 l. Pré-culturas foram inoculadas de um estoque de glicerol [15 % (v/v) de glicerol] armazenado a -80 °C. A série de sementes compreende uma cultura de YPD de 3 ml em um tubo de teste em agitação constante a 200 rpm por 12 h (pré- cultura I), uma cultura de YPD de 50 ml em um frasco Erlenmeyer de 1000 ml em um agitador rotativo em agitação constante a 200 rpm por 8 h (pré-cultura II) e uma cultura de YNB de 50 ml YNB em um frasco Erlenmeyer de 1000 ml em um agitador rotativo em agitação constante a 200 rpm por 12 h (pré-cultura III). A pré-cultura II foi inoculada transferindo-se 1 ml da pré-cultura I para meio de YPD estéril fresco de pré-cultura II. A pré-cultura III foi inoculado a uma densidade óptica a 600 nm (OD600) de 1 transferindo-se uma quantidade adequada de células para um tubo de centrífuga cônico estéril. Após a centrifugação (1500 x g, 5 min, TA), as células foram suspensas em solução salina estéril de 1 ml (9 g/l de cloreto de sódio) e transferidas para o meio de YNB estéril da pré-cultura III. O procedimento para inoculação do fermentador a um OD600 de 1 da pré-cultura III era igual àquele descrito para a inoculação de pré-cultura III. Para o cultivo de levedura sob condições aeróbicas, uma velocidade de agitação inicial foi ajustada a 500 rpm e o ar foi fornecido a 0,2 l/min. Para condições anaeróbicas, uma velocidade de agitação constante de 300 rpm foi usada e N2 foi fornecido a 0,2 l/min. Os níveis de oxigênio e carbono no gás de escape dos fermentadores foram continuamente monitorados online com o uso de um analisador de efluente gasoso (HiSense, HiTec Zang, Herzogenrath, Alemanha). Para condições aeróbicas, oxigênio dissolvido foi mantido a >30 % de saturação de ar por ajuste automático da velocidade de agitação. Para cada condição, o pH foi medido (Easyferm Plus VP 225, Hamilton Hochst, Alemanha) e mantido a 4,0 por adição automática de (NH4)OH 1,0 M e HCl 1 M. Para cada condição, a temperatura foi mantida a 30 °C. Durante a fermentação, amostras de 1,5 ml foram obtidas. Um Eppendorf BioPhotometer (Eppendorf, Hamburgo) foi usado para medições de densidade óptica. Uma alíquota de 1 ml de cada amostra foi centrifugada por 5 min a 16000 x g (5415R; Eppendorf, Hamburgo). A concentração de glicose, o-aminobenzoato e etanol no sobrenadante foi determinada com um analisador de bioquímica CuBiAn XC (Optocell technology), HPLC-DAD (1100; Agilent Technologies, Santa Clara, EUA), e GC-FID (7890A Agilent Technologies, Santa Clara, EUA), respectivamente.

Cromatografia líquida de alta eficiência

[0087] Um sistema da Agilent 1100 série HPLC-DAD [com detector de arranjo de diodo; Agilent Technologies, Santa Clara (EUA)] foi usado para quantificar a concentração de o-aminobenzoato em sobrenadantes de cultura. Como fase estacionária, uma coluna de CLAE C18 Luna (4,6 x 250 mm; 3 pm; Phenomenex) foi usada a 20 °C com um sistema de solvente binário que consiste em metanol (solvente B) e água contendo ácido fórmico a 0,1 % (v/v) (solvente A). 10 μl de sobrenadante de cultura diluído foram aplicados. A separação foi alcançada pelo seguinte gradiente a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min: 0-1 min, 2 % de B; 1-2 min, 2-10 % de B; 2-12 min, 10-70 % de B; 12-23 min, 70-90 % de B; 2325 min, 90-98 % de B, 25-27 min, 98 % de B; 27-27,5 min, 98 %-2 % de B; 27,5-30 min, 2 % de B. A concentração de o- aminobenzoato foi determinada por integração de pico a 254 nm (tempo de retenção: 18,9 min) e comparada a uma curva de calibração externa.

Cromatografia gasosa

[0088] Um sistema Agilent 7890A GC [Agilent Technologies, Santa Clara (EUA)] foi usado para quantificar a concentração de etanol em sobrenadantes de cultura. Uma coluna Stabiwax-DB (30 m x 0,32 mm, ID 1 μm, Restek) foi usada. A separação foi alcançada pelo seguinte programa de forno: 0-3 min, 30 °C; 3-6 min, 40-150 °C; 6-8,4 min, 150220 °C. 1 μl de sobrenadante de cultura diluído foi aplicado. O injetor foi ajustado a 250 °C com um fluxo total de 787,43 ml/min e uma razão de divisão de 100:1, resultando em um fluxo de 7,7666 ml/min. Sinais foram detectados por meio de FID ajustado a 300 °C.

Resultados e Discussão

[0089] A cepa knock-out de levedura TRP4 de Saccharomyces cerevisiae produziu 320 mg/l de ácido o- aminobenzoico sob condições aeróbicas após 75 h de cultivo como determinado por CLAE-DAD (254 nm). Sob condições anaeróbicas, produziu 92 mg/l de ácido o-aminobenzoico após 73 h de cultivo. A produção não parece ser associada a crescimento já que um acúmulo constante de o-amonibenzoato durante o crescimento, bem como na fase estacionária, foi observado. Pressupondo um OD600 de 1 que é correlacionado a um peso seco de 0,45 g/l, a produtividade específica de ácido o-aminobenzoico na fase estacionária era de cerca de 1,0 e 1,3 mg gDW-1 h-1, sob condições aeróbicas e anaeróbicas, respectivamente. Como esperado, sob condições anaeróbicas, uma quantidade significativa de etanol foi produzida como determinado por GC-FID.

Claims (9)

1. Método para produzir ácido o-aminobenzoico caracterizado por compreender as etapas de a) fermentar um substrato fermentável em um vaso de fermentação com o uso da célula de levedura capaz de converter o substrato fermentável em ácido o- aminobenzoico, em que a fermentação completa é realizada a um pH entre 3,0 e 5,0; e b) separar o ácido o-aminobenzoico produzido do caldo de fermentação.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a separação de ácido o- aminobenzoico na etapa de método b) é realizada após a diminuição do pH do caldo de fermentação.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a separação do ácido o- aminobenzoico sólido produzido na etapa de método b) é realizada ajustando-se a velocidade de rotação de um agitador no vaso de fermentação.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a separação do ácido o- aminobenzoico sólido produzido na etapa de método b) é realizada por filtração, sedimentação, hidrociclones e centrifugação.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a separação do ácido o- aminobenzoico produzido na etapa de método b) é realizada por extração com um solvente adequado.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o ácido o-aminobenzoico é extraído do caldo de fermentação que foi removido do vaso de fermentação.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o solvente é adicionado ao caldo de fermentação no vaso de fermentação.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a fermentação na etapa de método a) é realizada sob condições anóxicas.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que uma parte do ácido o-aminobenzoico é produzida durante a fase estacionária de crescimento das células de levedura.