CN114350568A - 窖泥主体产丙酸拟杆菌纲微生物Petrimonas sulfuriphila的分离与应用 - Google Patents

窖泥主体产丙酸拟杆菌纲微生物Petrimonas sulfuriphila的分离与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了窖泥主体产丙酸拟杆菌纲微生物Petrimonas sulfuriphila的分离与应用，属于酿造微生物技术领域。本发明筛选得到了一株Petrimonas sulfuriphila LBM11005，保藏编号为GDMCC NO.61648。本发明的菌株能够以葡萄糖、酵母裂解物为底物，发酵产生丙酸和乙酸，其中丙酸的产量可达1.46g/L。本发明的菌株与窖泥中主体己酸菌共培养还可以产更长碳链的奇数碳脂肪酸——戊酸和庚酸，浓度分别为1.44g/L和0.22g/L。将LBM11005菌株应用于窖泥混菌培养体系还可以提高体系的己酸降解与甲烷生成，促进窖泥降酸菌群的稳态维持。

Description

窖泥主体产丙酸拟杆菌纲微生物Petrimonas sulfuriphila 的分离与应用
技术领域
本发明涉及窖泥主体产丙酸拟杆菌纲微生物Petrimonas sulfuriphila的分离与应用，属于酿造微生物技术领域。
背景技术
窖泥是用于浓香型、酱香型、凤香型和芝麻香型等八种香型白酒生产的重要厌氧菌种子库，是我国特有厌氧微生物资源宝库。尤其对于浓香型白酒而言，窖泥的质量是决定其最终品质的关键因素。而窖泥微生物的多样性、复杂的代谢特征以及物种间的相互作用又是影响窖泥质量的关键所在。研究表明，窖泥微生物能产生复杂多样的代谢产物，形成包括丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸和辛酸等短中链脂肪酸。此外，窖泥中以己酸菌为代表的微生物在发酵过程中不断迁移到酒醅中，其代谢活动提高了酒醅的pH值，强化大曲的酯化能力，改善酒醅的风味特征。
高通量测序技术表明，定殖于窖泥中的微生物种类繁多，主要为严格厌氧菌。窖泥中的微生物群落在长期驯化中趋于稳定，其中拟杆菌纲是窖泥中仅次于梭菌纲的第二大纲。在优质窖泥中，拟杆菌纲微生物的相对丰度较高，表明其可能对窖泥生态系统的稳定性起重要作用。进一步地，窖泥中的优势拟杆菌纲微生物主要包括Petrimonas(5.99％～16.69％)和Proteiniphilum(2.8％～3.9％)。参考文献如下：
Fu J,Chen L,Yang S,Li Y,Zou L.,2021.Metagenome and analysis ofmetabolic potential of the microbial community in pit mud used for Chinesestrong-flavor liquor production.Food Research International.143:1-11.
Tao Y,Li J,Rui J,Xu Z,Zhou Y,Hu X,Wang X,Liu M,Li D,Li X.,2014.Prokaryotic Communities in Pit Mud from Different-Aged Cellars Used forthe Production of Chinese Strong-Flavored Liquor.Appl Environ Microbiol.80(7):2254-2260.
胡晓龙,王康丽,余苗,牛广杰,孟书剑,马安银,李红,樊建辉,何培新.基于高通量测序的浓香型窖泥原核微生物群落的窖池空间分布.中国酿造,2020,39(6):167-172.
对于充分认识微生物的具体生理代谢特征和生态学功能离不开纯培养菌株的获得。而受制于厌氧菌株筛选的困难性及缺少有效的纯培养化技术，目前对于窖泥微生物纯培养的菌株研究多集中于产丁酸、己酸等具有典型风味贡献性或其他非优势微生物中，对于窖泥主体拟杆菌纲微生物的纯培养菌株则鲜有研究，尚不明确其在窖泥微生物生态系统中的作用，也不清楚拟杆菌纲微生物在窖泥中的风味贡献。拟杆菌纲微生物为窖泥老熟的标志菌，尤其是在优质窖泥中具有较高的丰度。分离窖泥拟杆菌对于建立窖泥微生物强化技术和新型无泥酿造工艺均具有重要作用。
发明内容
本发明提供了一种增加窖泥富集体系中拟杆菌纲微生物相对丰度的方法，以为后续的筛菌提供良好的筛选源；所述方法是将窖泥接种至MCI培养基中，于35～37℃、厌氧条件下传代培养。
在一种实施方式中，窖泥接种量为5～10g/100mL。
在一种实施方式中，传代培养时间为4～5天。
在一种实施方式中，传代次数优选为1～2次。
在一种实施方式中，所述培养基每1L含有：酵母粉1g，蛋白胨1g，矿质元素母液50mL，金属元素母液1mL，VB溶液5mL，5％NaHCO3溶液70mL，3％Na2S溶液20mL，pH为7.4；所述矿质元素母液按g/L计含有：KH2PO4 10，MgCl2·6H2O 6.6，NaCl 8，NH4Cl 8，CaCl2 1；所述金属元素母液按g/L计含有：ZnSO4·7H2O 0.1，MnCl2 0.03，H3BO3 0.3，CoCl2·6H2O 0.2，CaCl20.01，NiCl2·6H2O 0.02，Na MoO 0.03，FeCl2·4H2O 1.5；所述VB溶液按mg/L计含有：烟酸20，钴胺素20，盐酸硫胺10，对氨基苯甲酸10，盐酸吡哆醇50，泛酸钙5。
本发明还提供了一株拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005，已于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61648，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明还提供了所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM110055在增加发酵体系中丙酸含量中的应用。
在一种实施方式中，所述拟杆菌以葡萄糖为碳源进行发酵。
在一种实施方式中，所述葡萄糖浓度为20g/L。
在一种实施方式中，所述发酵的条件为：温度为37℃，厌氧发酵120h，发酵初始pH为7.4。
本发明还提供了所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005和己酸菌共培养产短链脂肪酸中的应用。
在一种实施方式中，所述短链脂肪酸为奇数碳脂肪酸。
在一种实施方式中，所述奇数碳脂肪酸为戊酸、庚酸。
在一种实施方式中，所述己酸菌为Oscillospiraceae sp.LBM10036，保藏编号为GDMCC No.61202，已公开于公开号为CN113186121A的专利申请文件中。
在一种实施方式中，所述共培养体系以葡萄糖或乳酸为碳源。
在一种实施方式中，所述葡萄糖浓度为20g/L，所述乳酸浓度为10g/L。
在一种实施方式中，所述发酵的条件为：温度为37℃，厌氧发酵120h，发酵初始pH为7.4。
本发明还提供了所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005在维持窖泥稳态中的应用。
在一种实施方式中，所述应用是将所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphilaLBM11005按10％(v/v)的比例接种到MCI窖泥混菌体系中。
在一种实施方式中，所述应用主要表现为拟杆菌Petrimonas sulfuriphilaLBM11005加速窖泥体系甲烷生成和己酸降解。
本发明还提供了应用所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005制备的窖泥。
在一种实施方式中，所述窖泥是将所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphilaLBM11005的种子液与窖皮泥、老窖泥、黄泥、酵母粉、玉米浆、中温大曲粉混合后发酵一段时间制备而成。
在一种实施方式中，所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005的种子液经过逐级扩大培养。
在一种实施方式中，所述窖泥的制备方法为：
(1)一级种子液制备：将拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005以10％(v/v)的比例接种到PY培养基中，于35～37℃厌氧发酵30～36h，得到OD600为0.3～0.6的种子液；
(2)第二级扩大培养：将步骤(1)获得的种子液转移至新的PY培养基中，于35～37℃厌氧培养30～36h，得到OD600为0.3～0.6的二级种子液；
(3)第三级扩大培养：将步骤(2)得到的二级种子液转移至新的PY培养基中，37℃厌氧培养30～36h，得到OD600为0.3～0.6的三级种子液；
(4)人工窖泥制备：制备1000kg人工窖泥，所需组分为：窖皮泥100kg，老窖泥50kg，黄泥600kg，酵母粉10kg，玉米浆10kg，中温大曲粉50kg以及步骤(3)得到的拟杆菌三级种子液100kg，添加水分至水量30-40％(v/v)，混合均匀后静止于发酵池，30℃发酵60天得到人工窖泥。
有益效果：
(1)采用本发明的传代富集方法可显著提高窖泥中优势拟杆菌纲微生物的相对丰度，为后续的拟杆菌筛选提供了良好的生物材料。
(2)本发明提供的Petrimonas sulfuriphila LBM11005，是窖泥中的主体拟杆菌微生物，为强化该优势种在新窖泥和退化窖泥及建立无泥酿造工艺奠定了重要基础。
(3)本发明提供的Petrimonas sulfuriphila LBM11005，可以利用葡萄糖为碳源，或利用酵母裂解物为碳源，产生重要奇数碳脂肪酸——丙酸，为提高白酒中丙酸含量提供了微生物干预方法。
(4)本发明筛选得到的窖泥Petrimonas sulfuriphila LBM11005与窖泥主体己酸菌共培养，可增加发酵体系中包括戊酸、庚酸在内的奇数碳短中链脂肪酸的种类，为戊酸乙酯、庚酸乙酯等酯类风味化合物的合成提供前体物质，具有与己酸菌协同产风味物质，进而提高白酒风味品质的应用前景。
(5)本发明筛选得到的窖泥Petrimonas sulfuriphila LBM11005与窖泥富集体系共培养可以加速体系中甲烷的生成及己酸的降解，具有维持窖泥pH稳态的作用，在改良窖泥质量和制作人工窖泥中具有重要应用价值。
生物材料保藏
Petrimonas sulfuriphila LBM11005，分类学名称为Petrimonas sulfuriphila，于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61648，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：Petrimonas sulfuriphila LBM11005平板菌落形态(A)及细胞显微形态(B)。
图2：Petrimonas sulfuriphila LBM11005的生长情况。
图3：Petrimonas sulfuriphila LBM11005与窖泥富集体系共培养过程中甲烷比例。
具体实施方式
培养基：
(1)MCI培养基(每L)：酵母粉1g；蛋白胨1g；矿质元素母液50mL；金属元素母液1mL，VB溶液5mL，7％NaHCO3溶液50mL，3％Na2S溶液20mL，pH为7.4；其中，
矿质元素母液(g/L)：KH PO4 10，MgCl2·6H2O 6.6，NaCl 8，NH4Cl 8，CaCl2 1，pH为7.4；
金属元素母液(g/L)：ZnSO4·7H2O 0.1，MnCl2 0.03，H3BO3 0.3，CoCl2·6H2O 0.2，CaCl2 0.01，NiCl2·6H2O 0.02，Na MoO 0.03，FeCl2·4H2O 1.5；
VB溶液(mg/L)：烟酸20，钴胺素20，盐酸硫胺10，对氨基苯甲酸10，盐酸吡哆醇50，泛酸钙5。
(2)PY培养基(每L)：酵母粉10g，蛋白胨5g，Peptone 5g，盐溶液40mL，0.1％刃天青400μL，2.5％半胱氨酸溶液20mL，0.05％氯化血红素溶液10mL，0.5％维生素K1溶液200μL，pH为7.4；
其中，盐溶液(g/L)：NaHCO3 10，NaCl 2，K2HPO4 1，KH2PO4 1，MgSO4·7H2O 1，CaCl20.2。
(3)MGF培养基(每L)：酵母粉10g，蛋白胨10g，NH4Cl 0.5g，MgCl2·6H2O 0.5g，CaCl2·0.2g，金属元素母液500μL，磷酸盐母液5mL，GYTS母液5mL，微量元素母液350μL，0.1％刃天青400μL，7％碳酸氢钠溶液25ml，2.5％半胱氨酸溶液5mL，VA溶液100μL，VB溶液100μL，pH为7.4，根据需要添加20g/L葡萄糖作为碳源；其中，
磷酸盐母液(g/L)：K2HPO4 6，NaH2PO4·H2O 5；
GYTS母液(g/L)：NaCl 5，MgCl2·6H2O 4，CaCl2 0.75，NH4Cl 2.5，KH2PO4 2，KCl 5；
微量元素母液(mg/L)：H3BO3 50，FeSO4 2000，ZnCl2 50，MnCl2·4H2O 500，CuCl2·H2O 30，(NH4)6MoO24·4H2O 50，CoCl·6H2O 2000，NiCl·6H2O 50，Na2SeO3·5H2O 100，EDTA1000 1000，刃天青200，HCl(36％)1mL/L；
VA溶液(g/L)：钴氨素1，对氨基苯甲酸0.8，维生素H 0.2，烟酸2，泛酸钙1，盐酸吡哆醇3，硫胺素2。VB溶液，按mg/L，含有：叶酸200，核黄素500，硫辛酸500。
(4)MGF-Z培养基，以上述MGF培养基为基础，添加1.5g/L CH3COONa·3H2O，碳源为20g/L葡萄糖或10g/L乳酸，pH为7.4。
检测方法：
短中链脂肪酸的检测方法：使用气相色谱仪Agilent GC 7890B进行测定。样品处理方法：取细菌培养物12000rpm离心5min后，取200μL发酵上清液，加入50μL内标(12.5g/L叔戊酸，含5％体积比的浓盐酸，pH 2.5)，混匀离心后取200μL上清液进行气相色谱分析。色谱柱为CP-WAX 57CB(50m×0.25mm×0.2μm)。程序升温条件为：初始温度60℃，保持0.5min，以20℃/min升到180℃，保持5.5min。分流比为30:1，进样口温度为220℃，氢火焰离子检测器温度为220℃。
葡萄糖、乳酸含量的检测：使用高效液相色谱仪采安捷伦1260InfinityⅡ进行检测。样品处理方法：取细菌培养物12000rpm离心5min后，取300μL发酵上清液，0.22μm滤膜过膜后，在色谱柱为Aminex HPX-87H(300×7.8mm)、流动相为5mmol/L稀硫酸溶液、流速为0.6mL/min、柱温为60℃、检测器为示差检测器的条件下检测。
甲烷含量检测方法：使用气相色谱仪Agilent GC-6890N气相色谱仪进行测定。抽取500μL富集培养血清瓶中的气体，在色谱柱为安捷伦HP-5毛细管色谱柱，柱温40℃，恒温5min，进样器温度为200℃，检测器温度为250℃，柱流量为0.9mL/min，分流比为30:1，空气流量为400mL/min，氢气流量为40mL/min的条件下进行甲烷含量分析。
技术术语：
窖泥：本申请中提及的“窖泥”指生产浓香型或酱香型大曲酒所用发酵池内表面的一层发酵泥。窖泥中栖息着大量以梭菌纲、拟杆菌纲、甲烷杆菌纲等为主的微生物，与酒的风味成分形成密切相关。
窖皮泥：本申请中提及的“窖皮泥”又称为封窖泥，是在入窖糟醅全部进入窖池后用以封窖池的黄黏泥，起着保护糟醅水分和防止空气及空气中中杂菌进入窖池的作用。
富集：本申请中提及的“富集”主要指根据微生物生命活动的特点，指定特定的培养条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大增加。
共培养：本申请中提及的“共培养”是指将特定的、生物学分类上属于不同种类的微生物在统一培养条件下混合培养。
扩大培养：本申请中提及的“扩大培养”是指对特定的微生物菌种进行活化和逐级繁殖培养，从而为发酵生产提供相当数量代谢旺盛并满足一定生理要求的微生物细胞(种子液)的方法。以本申请的一种实施方式为例，将微生物的培养体积由3L放大至30L，再扩大至200L。
实施例1：窖泥中主体拟杆菌纲微生物的富集培养
(1)富集培养：厌氧条件下接种5～10％(w/v)的窖泥于MCI培养基中，37℃下厌氧培养4～5天，以10％(v/v)的比例接种至新鲜的MCI培养基中，重复此富集传代步骤4次。
(2)菌群结构分析：采用扩增子技术进行分析。本实施例选取通用引物515FmodF(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806RmodR(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')对原核生物16S rRNA基因的V4区进行扩增并建库。后使用PE250策略在Illumina Miseq平台进行测序，使用FLASH进行高质量碱基和pair-end双端reads拼接，按97％相似性对非重复序列进行可操作分类单元(OTU)的聚类分析，后与Silva数据库进行比对，获得物种注释信息。
采用本实施例的传代富集方法可有效提高体系中拟杆菌纲微生物的相对丰度，包括Petrimonas、Proteiniphilum、Anaerocella、Fermentimonas等。其中，Petrimonas和Proteiniphilum是窖泥样本及传代体系中的重要拟杆菌纲微生物，其相对丰度在低次数传代中显著增高，最大可分别是原始窖泥样本的2.31倍和2.84倍(表1)，以第一代和第二代为最优筛选源。
表1：窖泥传代过程中拟杆菌纲微生物相对丰度的动态变化
属 窖泥样本 第一代 第二代 第三代 第四代
Petrimonas 10.37％ 22.33％ 23.99％ 11.29％ 9.61％
Proteiniphilum 3.49％ 6.84％ 9.90％ 3.56％ 2.18％
Anaerocella 0.13％ 1.72％ 5.20％ 10.86％ 6.57％
Fermentimonas 2.22％ 4.39％ 3.85％ 0.66％ 1.03％
Norank_f_DysgoNomonadaceae 0.07％ 2.13％ 5.82％ 2.11％ 3.82％
Norank_f_Rikenellaceae 0.04％ 0.12％ 2.17％ 14.91％ 15.56％
Lentimicrobium 0.02％ 0.00％ 0.01％ 0.04％ 0.26％
实施例2：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005的分离与鉴定
(1)菌株分离
采用梯度稀释平板涂布的方法将获得的窖泥传代富集培养液涂布于添加2％的琼脂MCI固体培养基上，于37℃厌氧箱中培养7～10天。待菌落长出后，挑取单菌落于MCI液体培养基中培养。
(2)菌株16S rRNA的鉴定
取步骤(1)在MCI液体培养基中培养的菌液，利用细菌16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增并测序，确定菌株的分类地位。
所用扩增引物为：
27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT
PCR反应体系为：27F 0.5μL；1492R 0.5μL；高保真酶Primer Star 12.5μL；无菌水10.5μL；菌液1μL。
PCR反应条件为：预变性98℃2min，变性98℃10s，退火55℃30s，延伸72℃1min，30个循环，72℃10min。
(3)菌株纯化：
根据SEQ ID NO.1所示的16S rRNA测序结果，将PCR测序比对结果确定菌株分类学地位，将目标菌株培养液涂布于MCI固体培养基上，纯化获得单菌落。
经鉴定，获得的窖泥中主体拟杆菌纲的生物命名为Petrimonas sulfuriphilaLBM11005，菌落形态为白色光滑圆形(图1A)，显微镜下细胞为短杆状(图1B)，将该微生物于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61648。
实施例3：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005利用葡萄糖增加发酵体系丙酸产量
(1)将实施例2得到的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005以10％(v/v)的比例接种到PY培养基，37℃培养到30～36h，得到种子液，OD600为0.3～0.6。
(2)取步骤(1)得到的种子液，按10％(v/v)接种比例接种至对照组和实验组中，使初始OD600约为0.05。
具体实验组及对照组设定如下：
对照组：MGF培养基(不添加碳源葡萄糖)。
实验组：添加20g/L葡萄糖的MGF培养基。
对照组和实验组均设置3个重复，37℃培养120h。使用分光光度计测定OD600，pH计测定发酵液pH。并通过气相色谱和液相色谱分别测定短中链脂肪酸的含量及葡萄糖含量。
结果如图2和表2所示，拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005在对照组发酵36h后进入稳定期，OD600可达到1.17，在实验组发酵24h后进入稳定期，OD600可达到2.06(图2)。
经检测，拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005在葡萄糖为底物时的发酵为降pH发酵，约降低2个单位pH值(表2)。
经检测，拟杆菌可利用葡萄糖为底物，利用量为3.13g/L(表2)。
经检测，拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005的主要发酵产物为乙酸和丙酸。其中，乙酸产量在实验组与对照组中无显著差异。但实验组发酵末期的丙酸产量可达到1.46g/L，显著高于对照组(0.88g/L)(表2)。
表2：不同组的Petrimonas sulfuriphila LBM11005发酵终点pH、葡萄糖利用及产物合成情况
组别 发酵终点pH 葡萄糖利用量(g/L) 乙酸累积量(g/L) 丙酸累积量(g/L)
对照组 7.44±0.02 / 0.66±0.09 0.88±0.22
实验组 5.3±0.03 3.13±0.07 0.88±0.02 1.46±0.18
Petrimonas sulfuriphila LBM11005具有葡萄糖利用能力，且在以葡萄糖为底物进行发酵时，可以显著提高发酵体系中丙酸的产量。
实施例4：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005与窖泥主体己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036在葡萄糖共培养条件下产戊酸、庚酸
(1)将实施例2得到的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005以10％(v/v)的比例接种到PY培养基，37℃培养到30～36h，得到种子液。
(2)将己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036以10％(v/v)的比例接种到添加20g/L葡萄糖的MGF-Z培养基，37℃培养到12～24h，得到种子液。
(3)取步骤(1)、(2)所得种子液，测定种子液的OD600值。
(4)按照种子液OD600值将Petrimonas sulfuriphila LBM11005和Oscillospiraceae sp.LBM10036以7.5:2.5的比例，且种子液总接种量为10％(v/v)的总比例接种到添加20g/L葡萄糖的MGF-Z培养基中,以菌株单独发酵作为对照组。
具体对照组和实验组设置如下：
对照组1：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005单菌株发酵；
对照组2：己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036单菌株发酵；
共培养组：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005与己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036共培养发酵；
对照组和实验组均设置3个重复，均于37℃培养120h。使用分光光度计测定OD600，pH计测定发酵液pH，并通过气相色谱和液相色谱分别测定发酵终点短中链脂肪酸的含量及葡萄糖含量。具体结果如表3所示。
表3：以葡萄糖为碳源时不同组别发酵终点的生长、葡萄糖利用量及短链脂肪酸积累量
Figure BDA0003489465750000091
如表3所示，采用20g/L葡萄糖作为碳源时，拟杆菌Petrimonas sulfuriphilaLBM11005与己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036共培养实验组的OD600可达2.09，可共同利用14.5g/L的葡萄糖进行发酵。根据乙酸、丙酸及丁酸、己酸的含量判断，两株菌在共培养体系内成功存活。拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005与己酸菌Oscillospiraceaesp.LBM10036共培养实验组可产1.44g/L的戊酸和0.22g/L的庚酸。
实施例5：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005与窖泥主体己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036在含乳酸的共培养条件下产戊酸、庚酸
(1)将实施例2得到的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005以10％(v/v)的比例接种到PY培养基，37℃培养到30～36h，得到种子液。
(2)将己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036以10％(v/v)的比例接种到添加10g/L乳酸的MGF-Z培养基，37℃培养到12～24h，得到种子液。
(3)取步骤(1)、(2)所得种子液，测定种子液的OD600值。
(4)按照步骤(3)测定的种子液OD600值的比例将Petrimonas sulfuriphilaLBM11005和Oscillospiraceae sp.LBM10036以7.5:2.5的比例，且种子液总接种量为10％(v/v)的总比例接种到添加10g/L乳酸的MGF-Z中培养基中，以菌株单独发酵作为对照组。
对照组和实验组设置如下：
对照组1：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005单菌株发酵；
对照组2：己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036单菌株发酵；
实验组：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005与己酸菌Oscillospiraceaesp.LBM10036共培养发酵。
对照组和实验组均设置3个重复，37℃培养120h。使用分光光度计测定OD600，pH计测定发酵液pH，并通过气相色谱和液相色谱分别测定发酵终点短中链脂肪酸的含量及葡萄糖含量。具体结果如表4所示。
表4：乳酸为碳源时不同组别发酵终点的生长、葡萄糖利用量及短链脂肪酸积累量
Figure BDA0003489465750000092
Figure BDA0003489465750000101
如表4所示，采用10g/L乳酸作为碳源时，拟杆菌Petrimonas sulfuriphilaLBM11005与己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036共培养实验组的OD600显著高于各单菌培养时的OD600值。
经检测，各组在乳酸碳源下的发酵为升pH发酵，拟杆菌Petrimonas sulfuriphilaLBM11005不具有乳酸利用能力，共培养体系内的乳酸由己酸菌Oscillospiraceaesp.LBM10036消耗。
根据乙酸、丙酸及丁酸、己酸的含量判断，两株菌在共培养体系内成功存活。拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005与己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036共培养实验组可产0.3g/L的戊酸和0.06g/L的庚酸。
窖泥中具有多种葡萄糖利用的微生物，但在长发酵期浓香型酿造体系中，窖泥中葡萄糖可获取时间有限，而乳酸为长期存在的碳源。在窖泥原位体系中，Petrimonassulfuriphila LBM11005和己酸菌Oscillospiraceae sp.LBM10036都是窖泥中的主体微生物。由此共培养实验可以推断出在窖泥原位体系中，两株菌在代谢产物水平上产生相互作用，进而提高窖泥中短中链脂肪酸的种类，为风味物质的合成提供重要的前体物质，从而有利于生产出风味更佳的白酒。
实施例6：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005与窖泥微生物富集体系共培养加速甲烷生成与己酸的降解
(1)将实施例2得到的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005以10％(v/v)的比例接种到PY培养基，37℃培养到30～36h，得到种子液。
(2)将窖泥按5％～10％(w/v)的比例接种至MCI培养基中，得到窖泥混菌体系。
(3)取步骤(1)所得种子液按10％(v/v)的比例接种至步骤(2)所得的窖泥富集体系中，并设置对照组。
具体对照组和实验组设置如下：
对照组：将空白PY培养基按10％(v/v)的比例接种到MCI窖泥混菌体系中。
实验组：将Petrimonas sulfuriphila LBM11005按10％(v/v)的比例接种到MCI窖泥混菌体系中。
对照组和实验组均设置3个重复，37℃培养18d。期间，每2d对发酵体系利用气相色谱仪测定甲烷和己酸含量。
如图3所示，在添加Petrimonas sulfuriphila LBM11005种子液的实验组中在培养前10天甲烷比例高于对照组，此后甲烷先于对照组开始下降。结合降己酸表型来看，实验组在培养10天后体系中己酸已消耗完，对照组则在培养12天后己酸降解完。添加Petrimonas sulfuriphila LBM11005可以促进窖泥混菌培养体系中的甲烷生成与己酸降解，使混菌发酵不会由于酸的积累导致pH失衡从而影响混菌发酵和甲烷生成。
实施例7：拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005用于制作窖泥
通过逐级扩大培养制备拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005种子液，再将扩大培养获得的种子液用于制备窖泥，具体步骤如下：
(1)第一级种子液制备：将实施例2得到的拟杆菌Petrimonas sulfuriphilaLBM11005以10％(v/v)的比例接种到1.5L PY培养基中(发酵罐容积为3L)，发酵罐的厌氧环境以高纯氮维持(流量2L/min)，37℃发酵30～36h，得到一级种子液，此时OD600为0.3～0.6。
(2)第二级种子液制备：以高纯氮将步骤(1)所获得的种子液泵入含有15L PY培养基的发酵罐中(发酵罐容积30L)，37℃厌氧培养30～36h，得到二级种子液，此时OD600为0.3～0.6。
(3)第三级种子液制备：以高纯氮将步骤(2)得到的二级种子液泵入含有120L PY培养基的发酵罐中(发酵罐容积200L)，37℃厌氧培养30～36h，得到三级种子液，此时OD600为0.3～0.6。
(4)人工窖泥制备：制备1000kg人工窖泥，所需组分为：窖皮泥100kg，老窖泥50kg，黄泥600kg，酵母粉10kg，玉米浆10kg，中温大曲粉50kg以及上述步骤(3)得到的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005三级种子液100kg，添加水分至水量30-40％(v/v)，混合均匀后静止于发酵池，30℃发酵60天得到人工窖泥。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 窖泥主体产丙酸拟杆菌纲微生物Petrimonas sulfuriphila的分离与应用
<130> GBAA211686B
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1390
<212> DNA
<213> Petrimonas sulfuriphila
<400> 1
cagtcgaggg gcagcacatg agtagcaata cgatggtggc gaccggcgca cgggtgagta 60
acacgtatgc aacctacctt taacagggga ataacccgtt gaaaaacgga ctaatactcc 120
ataacacagg ggtcccgcat gggaatattt gttaaagatt tatcggttga agatgggcat 180
gcgttccatt agcttgttgg tgaggtaacg gctcaccaag gctacgatgg ataggggaac 240
tgagaggttt atcccccaca ctggaactga gacacggtcc agactcctac gggaggcagc 300
agtgaggaat attggtcaat ggaggcaact ctgaaccagc caagtcgcgt gaaggatgaa 360
ggtcttatgg attgtaaact tcttttgcaa gggaataaag tgggggacgt gtcctccttt 420
gcatgtacct tgcgaataag gatcggctaa ctccgtgcca gcagccgcgg taatacggag 480
gatccgagcg ttatccggat ttattgggtt taaagggtgc gcaggcggga tgttaagtcg 540
gcggtgaaat tttgcagctc aactgtaaaa gtgccttcga tactggcttt cttgagtgtg 600
gatgaagtag gcggaatttg tggtgtagcg gtgaaatgct tagatatcac gaggaactcc 660
gattgcgcag gcagcttact aaaccactac tgacgctcat gcacgaaggc gtggggatca 720
aacaggatta gataccctgg tagtccacgc agtaaacgat gattactagt tgtttgcgat 780
acaatgtaag cgactgagcg aaagcgttaa gtaatccacc tggggagtac gttcgcaaga 840
atgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcgga ggaacatgtg gtttaattcg 900
atgatacgcg aggaacctta cccgggcttg aaatgcggcg gaccggcaga gagatctgcc 960
ttcccttcgg ggccgccgtg taggtgctgc atggttgtcg tcagctcgtg ccgtgaggtg 1020
tcggcttaag tgccataacg agcgcaaccc tcatcattag ttactaacag gtcatgctga 1080
ggactctagt gagactgcca tcgtaagatg cgaggaaggt ggggatgacg tcaaatcagc 1140
acggccctta cgtccggggc gacacacgtg ttacaatggg tggtacaaag ggcagctacc 1200
tggcgacagg atgctaatct ccaaaaccac tctcagttcg gatcggagtc tgcaactcga 1260
ctccgtgaag ctggattcgc tagtaatcgc gcatcagcca cggcgcggtg aatacgttcc 1320
cgggccttgt acacaccgcc cgtcaagcca tggaagccgg gggtacctga agtccgtaac 1380
cgtcaaggag 1390

Claims (10)

1.一种增加窖泥富集体系中产丙酸特性的拟杆菌纲微生物相对丰度的方法，其特征在于，将窖泥接种至MCI培养基中，于35～37℃、厌氧条件下传代培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，窖泥接种量为5～10g/100mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述MCI培养基每1L含有：酵母粉1g，蛋白胨1g，矿质元素母液50mL，金属元素母液1mL，VB溶液5mL，5％NaHCO3溶液70mL，3％Na2S溶液20mL，pH为7.4；所述矿质元素母液按g/L计含有：KH PO4 10，MgCl2·6H2O 6.6，NaCl 8，NH4Cl 8，CaCl2 1；所述金属元素母液按g/L计含有：ZnSO4·7H2O0.1，MnCl2 0.03，H3BO30.3，CoCl2·6H2O 0.2，CaCl2 0.01，NiCl2·6H2O 0.02，Na MoO 0.03，FeCl2·4H2O 1.5；所述VB溶液按mg/L计含有：烟酸20，钴胺素20，盐酸硫胺10，对氨基苯甲酸10，盐酸吡哆醇50，泛酸钙5。
4.一株拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005，已于2021年5月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO.61648，保藏地址为广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
5.权利要求4所述的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005在增加发酵体系中丙酸含量中的应用。
6.权利要求4所述的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005在与己酸菌共培养产短链脂肪酸中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述短链脂肪酸为奇数碳脂肪酸。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述己酸菌为Oscillospiraceaesp.LBM10036，保藏编号为GDMCC No.61202。
9.权利要求4所述的拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005在维持窖泥稳态，加速窖泥体系甲烷生成，和/或加速窖泥体系己酸降解中的应用。
10.应用权利要求4所述拟杆菌Petrimonas sulfuriphila LBM11005制备的窖泥。
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