CN112812997A - 快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用，属于酿造微生物技术和生物技术领域。采用本发明所提供的一种提高窖泥中糖利用型己酸菌群丰度和产己酸能力的方法，得到糖利用型己酸菌群及其菌液，己酸产量呈持续上升趋势，经过连续传代，己酸产量由1.3g/L提升至9.5g/L；在富集过程中，能利用葡萄糖的己酸菌属微生物的相对丰度逐渐升高，由12％提升至43％。本发明技术可以用于白酒酸度和酯香风味提升，也可以应用于以葡萄糖为碳源的己酸发酵。

Description

快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用

技术领域

本发明涉及快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法及应用，属于酿造微生物技术领域。

背景技术

白酒是世界六大蒸馏酒之一，在长期的发展进程中，形成了多种香型的白酒。其中，浓香型白酒以其窖香浓郁、绵柔甘冽、香味协调、入口甜、落口绵、尾净余长的特点深受广大消费者的喜爱。在浓香型白酒生产中，窖泥是浓香型白酒酿造的基础，而窖泥质量很大程度上决定了白酒的品质。近年来对窖泥的理化测试分析表明，质量较优的窖泥在感官上呈现青灰色且具有较浓的酯香味，具有近中性的pH值(5.0～7.0)，较低的乳酸含量(<30g/kg)和较高的己酸含量(>6g/kg)。参考文献如下：

Hu,X.L.,Du,H.,Ren,C.,Xu,Y.,2016.Illuminating anaerobic microbialcommunity and cooccurrence patterns across a quality gradient in Chineseliquor fermentation pit muds.Appl.Environ.Microbiol.82,2506-2515。

Tao,Y.,Li,J.,Rui,J.,Xu,Z.,Zhou,Y.,Hu,X.,Wang,X.,Liu,M.,Li,D.,Li,X.,2014.Prokaryotic communities in pit mud from different-aged cellars used forthe production of Chinese Strong-flavored liquor.Appl.Environ.Microbiol.80,2254-2260。

己酸乙酯是浓香型白酒的关键特征风味物质，也是“窖香”的重要来源物质之一，该物质由己酸和乙醇经酯化作用合成。己酸由窖泥中的厌氧菌合成，是白酒酿造过程中重要的化合物，其对维持酒体口感的协调具有重要作用。

己酸菌是具有产己酸功能的厌氧菌统称，是窖泥中的重要功能微生物，其丰度、种类与窖泥质量密切相关。老熟的窖泥相比新窖泥往往含有丰度更高的己酸菌，老窖池中产出的浓香型白酒品质也更加优良。然而，窖泥的自然老熟耗时较长，通常需要20年以上。因此，将人工富集培养的窖泥产己酸菌群应用于培养新窖泥，对于加速窖泥老熟具有重要意义。

长期以来，研究人员致力于从老熟的窖泥中对己酸菌进行富集与分离，试图得到一种能够改善窖泥品质的混菌发酵液；在过去的研究中，研究人员认为窖泥中的己酸菌主要是利用乙醇合成己酸，因此多使用以乙醇为基础碳源的培养基对窖泥中的己酸菌进行富集与筛选，获得乙醇利用型己酸菌混菌体系；但是目前以乙醇为基础碳源的通用培养基对窖泥中的己酸菌富集效率较低，传代的稳定性较差，并且乙醇利用型己酸菌混菌体系的产己酸能力不高。

现有技术中，有通过向稀释窖泥中添加黄水、白酒酒糟处理混合物或两者混合物，每天进行进出料对窖泥中己酸功能菌进行富集，当驯化至己酸产量稳定时，菌群中Caproiciproducens属的丰度为25％，此技术方法虽能对窖泥中的己酸菌进行富集，但是富集得到的己酸菌丰度仍较低(记载于公开号为CN111440838A专利申请文本中)。

有文献表明，采用乳酸为碳源能够从窖泥中富集到产己酸能力较强的混菌(ZhuX,Tao Y,Liang C,Li X,Wei N,Zhang W,Zhou Y,Yang Y,Bo T.2015.The synthesis ofn-caproate from lactate:a new efficient process for medium-chain carboxylatesproduction.Sci Rep 5.)，然而该方法需要连续进出料90天，富集耗时较长，效率不够高。

新窖泥菌群在酿造过程中会发生自发演替，使菌群结构稳定，稳定的菌群富含以己酸菌群为主体的产酸菌群，成为酿造优质浓香型白酒的重要基础。但酿造过程的菌群自然演替过程长达20～30年，但能生产优质浓香型白酒的窖池较为稀有，造成浓香型白酒优质品率较低，行业优质品率普遍在20～30％之间。因而，从优质窖泥“复刻”优质产酸菌群，用于固态发酵过程产风味物质强化，是提高浓香型白酒优质品率的重要手段。另外一方面，随着浓香型白酒机械化、自动化酿造技术改造的深入，无泥类浓香型白酒技术研发也需要不依赖于窖泥的产酸菌群培养技术。

构建特定功能菌群具有两种方法，其中一种为“自下而上”(bottom-up)构建方法，即分离获得纯培养微生物，再将纯培养微生物按照特定配比进行组合，构建出特定功能的菌群，该种菌群构建方法需要首先获得纯培养菌株。目前Caproiciproducens属下的大部分微生物尚未得到分离，且难于纯培养，显然，通过“自下而上”构建稳定产己酸菌群在现阶段存在较大的技术难题。另外一种构建特定功能菌群的方法为“自上而下”构建方法，即通过控制如底物类型与接种比例、培养温度、培养pH等环境因子，从自然环境中定向富集获得目标功能菌群。该方法无需先进行纯培养微生物分离，即可获得具有特定功能的菌群，相关理论参考文献如下：

Lawson CE,Harcombe WR,Hatzenpichler R,Lindemann SR,Loffler FE,O'Malley MA,Garcia Martin H,Pfleger BF,Raskin L,Venturelli OS,Weissbrodt DG,Noguera DR,McMahon KD.2019.Common principles and best practices forengineering microbiomes.Nature Reviews Microbiology 17:725-741。

尽管“自上而下”菌群构建在理论上可行，但对于特定菌群功能，如窖泥产己酸菌群的构建，目前尚未发现能将产己酸表型维持在一定水平之上的技术手段。

发明人在前期研究中，通过窖泥产酸菌群发酵，对窖泥混菌发酵模拟体系的碳源选择、处理方式进行了探索，发现窖泥混菌可以直接利用葡萄糖产生含量可观的己酸，且该现象在不同产地浓香型酒厂窖泥中普遍存在。以葡萄糖为碳源的产酸菌群底物利用效率、菌体生长速率、己酸产量要明显优于乙醇碳源。发酵后期窖泥产孢混菌相比发酵前期的营养菌体，具有更加稳定的产己酸能力；并且研究发现添加乙酸钠、丁酸钠的培养基下混菌的产量明显要高于不添加电子受体的培养基下的己酸产量。但是，发明人课题组同时也发现，不同来源的窖泥厌氧产酸菌群的己酸合成能力参差不齐，一次富集培养后存在丁酸产量高、己酸产量低、己酸产生滞后等问题。有研究表明，丁酸具有酸臭味，丁酸含量较高可能导致白酒的臭气较突出(谢方安.谈白酒香气成分和作用[J].酿酒,2006(05):52-55.)，因此丁酸产量较高的厌氧产酸菌群不适宜应用于实际生产之中。另外，采用此种方法所得到的混菌体系中的己酸菌的丰度仅为20％左右，由于己酸菌的丰度较低，厌氧产己酸菌群性能不稳定，产己酸表型易退化，由于己酸菌的丰度较低，无法将该混菌体系运用到窖泥质量改善应用中。因此，找到一种能够提高糖利用型己酸菌群丰度和产己酸能力，并且丁酸含量降低的方法仍然是一个亟待解决的问题。

发明内容

技术问题

本发明为了解决现有技术中窖泥产酸菌群培养中糖利用型己酸菌群丰度低、产己酸能力差及副产物丁酸含量高的技术问题。

技术方案

本发明的目的旨在提供一种能够提高窖泥中糖利用型己酸菌群丰度和产己酸能力的方法，该方法采用连续传代培养的策略，能够快速提高富集培养液中厌氧产己酸菌的丰度。

本发明采用葡萄糖作为主要碳源，以不同的短链脂肪酸盐作为辅底物，通过连续传代的策略，富集出窖泥中利用葡萄糖高产己酸的厌氧菌群。

本发明提供了一种快速富集窖泥中糖利用型己酸菌群的方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制富集培养基；(2)筛选合格窖泥：将窖泥接种于富集培养基进行培养，检测发酵终点富集培养液的己酸含量，判定己酸含量高于1.5g/L的富集培养体系所用的接种窖泥为合格窖泥；(3)将合格窖泥接种至富集培养基中进行逐级培养，每级种子液的培养时间为3d-5d；

所述富集培养基成分，按g/L，含有：葡萄糖10.0-30.0，酵母粉5.0-10.0，蛋白胨5.0-10.0，磷酸氢二钾0.5-1.0，磷酸二氢钾0.5-1.0，硫酸铵1.0-3.0，硫酸镁0.1-0.5，电子受体2.5-5.0，微量元素营养液：0.15-1.0mL/L，所述电子受体为：乙酸钠、丁酸钠中的一种或两种。

在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基成分(g/L)：葡萄糖15.0、酵母粉10.0、蛋白胨10.0、乙酸钠5.0、磷酸氢二钾1、磷酸二氢钾0.5、硫酸铵2.0、硫酸镁0.1、微量元素营养液：0.15-1.0mL/L；

在本发明的另外一种实施方式中，所述富集培养基成分(g/L)：葡萄糖15.0、酵母粉10.0、蛋白胨10.0、丁酸钠6.0、磷酸氢二钾1.0、磷酸二氢钾0.5、硫酸铵2.0、硫酸镁0.1、微量元素营养液：0.15-1.0mL/L；

在本发明的另外一种实施方式中，所述富集培养基成分(g/L)：葡萄糖15.0、酵母粉10.0、蛋白胨10.0、乙酸钠4.0、丁酸钠6.0、磷酸氢二钾1、磷酸二氢钾0.5、硫酸铵2.0、硫酸镁0.1、微量元素营养液：0.15-1.0mL/L；

上述三种实施方式中的微量元素营养液包括：10g/L的氯化钙、10g/L的氯化钴、10g/L的硫酸锌、10g/L的硫酸锰和15g/L的七水合硫酸亚铁。

在本发明的实施方式中，所述七水合硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙是按照体积分数为0.1％的比例添加，所述硫酸锌和氯化钴是按照体积分数为0.02％的比例添加。

在本发明的实施方式中，步骤(3)中逐级培养的培养温度为35～38℃，步骤(1)中的富集培养基pH值为5.5-6.5。

在本发明的一种实施方式中，所述逐级培养包括，将合格窖泥接种至富集培养基中在严格厌氧条件下培养得到一级种子液，将一级种子液接种至富集培养基中在严格厌氧条件下培养得到二级种子液，将二级种子液接种至富集培养基中在严格厌氧条件下培养得到三级种子液。

在本发明的实施方式中，步骤(2)中的窖泥的接种量为3％-10％(v/v)。

在本发明的实施方式中，步骤(3)中合格窖泥和每级种子液的接种量均为5％-10％(v/v)。

在本发明的实施方式中，步骤(3)中每级种子液的培养时间为4d。

在本发明的实施方式中，所述逐级培养是连续传代培养3～5代。

本发明还提供了一种利用上述方法制备得到的糖利用型己酸菌群。

本发明还提供了一种利用上述方法提高糖利用型己酸菌群传代稳定性中的应用。

本发明还提供了利用上述糖利用型厌氧产己酸菌群在人工窖泥制备中的应用。

本发明还提供了上述方法或者上述糖利用型己酸菌群在白酒酿造体系中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括在白酒发酵过程中添加所述糖利用型己酸菌群。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为，在白酒酿造体系中的人工窖泥的培养过程中或者维护保养窖泥的过程中的应用。

本发明还提供了一种人工窖泥的培养方法或者维护保养窖泥的方法，所述方法包括：在人工窖泥的培养过程中或者维护保养窖泥的过程中，加入一定量的利用上述方法得到的糖利用型己酸菌群体系。

本发明的有益效果：

(1)采用本发明所提供的一种快速从窖泥中富集糖利用型产己酸菌群的方法所得到的糖利用型己酸菌群菌液，己酸产量呈持续上升趋势，丁酸产量呈持续下降趋势，经过连续4次传代，己酸产量由1.3g/L提升至9.5g/L，丁酸产量由7.3g/L下降至3.6g/L；在富集过程中，己酸菌属的相对丰度逐渐升高，由12％提升至43％。同时，本发明实现了仅用16天即可实现对从窖泥中富集糖利用型产己酸菌群，相比现有技术中的20天从窖泥中富集方法，缩短了生产周期，具有广泛的应用价值。

(2)本发明所涉及的快速从窖泥中富集糖利用型产己酸菌群的方法通过使用葡萄糖为基础碳源，添加乙酸钠或(和)丁酸钠为必要的电子受体，可以良好地支持窖泥中己酸菌的生长，而以特定接种比例进行连续传代的策略使得己酸菌在富集菌液中的丰度进一步提高，成为富集菌液中的绝对优势微生物。

(3)采用本发明所提供的一种快速从窖泥中富集糖利用型产己酸菌群的方法获得的富集菌液，不仅可以应用于养窖、窖泥强化、人工窖泥的制作，也可以用于进一步筛选获得己酸菌纯菌株。这对认识和理解白酒酿造过程中重要功能菌的发酵作用，对白酒酿造技术的发展与进步具有重要的现实意义。同时，己酸作为一种中链脂肪酸，也是一种具有高附加值的工业产品，在医药、航天、畜牧业等领域具有广阔的应用前景。

(4)基于本发明提供的方法，可以改进现有的生物法合成己酸的技术，扩展目前己酸合成的底物来源，具有较好的工业应用前景。

(5)本发明所提供的一种提高窖泥中糖利用型己酸菌群丰度和产己酸能力的方法，对于快速获得高产厌氧产己酸菌群及己酸菌纯菌株具有重要意义，对窖泥强化，人工老窖制作具有重要的实用价值；同时，对利用低值含糖底物合成高值化学品己酸也具有应用价值。

附图说明

图1：原代(F1)培养时己酸含量与窖泥中己酸菌属(Caproiciproducens)微生物的相对丰度。

图2：葡萄糖为基础碳源时富集菌液传代过程(F1，F2，F3，F4，F5)丁酸、己酸含量变化。

图3：葡萄糖为基础碳源时富集菌液传代过程(F1，F2，F3，F4)物种相对丰度。

具体实施方式

下述实施例中涉及的PM1、PM2、PM3、PM4、PM5窖泥分别取自江苏省浓香型酒厂、安徽省浓香型酒厂、四川省浓香型酒厂、四川省浓香型酒厂、山东省浓香型酒厂。

下述实施例中涉及的溶液的配制方法如下：

10g/L氯化钙：分析天平称取1.0g氯化钙固体粉末溶解于100mL去离子水中。

10g/L氯化钴：分析天平称取1.0g氯化钴固体粉末溶解于100mL去离子水中。

10g/L硫酸锌：分析天平称取1.0g硫酸锌固体粉末溶解于100mL去离子水中。

10g/L硫酸锰：分析天平称取1.0g硫酸锰固体粉末溶解于100mL去离子水中。

15g/L七水合硫酸亚铁：分析天平称取1.5g七水合硫酸亚铁固体粉末溶解于100mL去离子水中。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

使用气相色谱仪Agilent GC-7890B对己酸含量进行测定。

样品处理方法：取1mL发酵液12000r/min离心5min，取200μL上清液，加入50μL内标溶液(12.5g/L叔戊酸，pH 2.5)，震荡混匀，取200μL进行检测。色谱柱为Alltech EconoCap-Wax色谱柱(30m×0.25μm×0.25μm)。气相色谱条件：进样量1μL，分流比，30:1；进样器温度220℃，检测器温度250℃；空气流量450mL/min，载气流量2mL/min，氢气流量40mL/min。

己酸菌群丰度的计算方法：

提取窖泥及富集菌群样本DNA进行扩增子测序，对下机数据进行质控后，按照97％的相似度阈值进行聚类，形成可操作分类单元(OTU)，采用Silva数据库(132版本)对OTU在界、门、纲、目、科、属、种的水平进行注释，获得所述样本中细菌群落物种组成及丰度信息。

己酸菌群丰度即Caproiciproducens属的相对丰度，为Caproiciproducens属的reads数与样本总reads数的百分比。

实施例1：合格窖泥的筛选

具体步骤如下：

1、窖泥样品的采集

从5口正常连续使用的窖池中分别采集多组新鲜窖泥，每组分别命名为PM1、PM2、PM3、PM4、PM5，每组按照五点取样法取样5～10个窖底窖泥样品，取样深度为1-3cm，采集的窖泥样品和产气袋一起装入密封袋中密封待用，产气袋将密封袋中的氧气吸收并释放二氧化碳，为采集的窖泥样本营造一个良好的厌氧环境，避免窖泥样本暴露在氧气中过久导致窖泥中厌氧菌失活。

2、配制厌氧产己酸菌群的富集培养基

使用分析天平分别称取葡萄糖15.0g、酵母粉10.0g、蛋白胨10.0g、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾0.5g、硫酸铵2.0g、硫酸镁0.1g至2L的烧杯中；向该烧杯中再分别加入10g/L的氯化钙、10g/L的氯化钴、10g/L的硫酸锌、10g/L的硫酸锰和15g/L的七水合硫酸亚铁；其中，所述七水合硫酸亚铁、硫酸锰、氯化钙是按照体积分数为0.1％的比例添加；所述硫酸锌和氯化钴是按照体积分数为0.02％的比例添加；然后将烧杯移入厌氧手套箱中待用；配制培养基所用的超纯水需经过除氧处理，具体除氧步骤如下：量筒量取1.5L超纯水并煮沸5-15分钟，将煮沸后的超纯水倒入2L大锥形瓶中并立即向其中通入氮气，氮吹20-30分钟，将除氧后的超纯水移入厌氧手套箱；将除氧后的超纯水加入称取好的培养基组分中并定容至1L，混合均匀后使用5mM的盐酸调节培养基pH值为5.5-6.5，115℃，灭菌30分钟获得厌氧产己酸菌群的富集培养基。

3、窖泥的厌氧接种

在厌氧手套箱中操作，将步骤1采集的窖泥样品PM1、PM2、PM3、PM4、PM5分别以3％-5％(v/v)的接种量，接种至含有步骤2获得的富集培养基的厌氧瓶中，使用5mL移液枪仔细吹打混匀。

4、厌氧产己酸菌群富集培养

(1)将步骤3获得的接种了窖泥的厌氧瓶置于37℃的厌氧手套箱中培养4天，4天后气相色谱检测每瓶发酵液中己酸含量。

结果如表1所示：

表1：窖泥发酵液4d时己酸含量

分别收集PM1、PM2、PM3、PM4、PM5窖泥样本1-2g，提取DNA，进行16S rRNA基因扩增子测序。测序选取16S rRNA基因的V4区进行PCR扩增，扩增引物为515FmodF(5'-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806RmodR(5'-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3')。对扩增的PCR产物进行建库，使用PE250策略在Illumina Miseq平台进行测序。使用FLASH进行高质量碱基和pair-end双端reads拼接。短于50bp的序列通过QIIME软件中的Trimmomatic程序移除。之后，使用Usearch程序对97％相似水平下的可操作分类单元(OTU)进行聚类统计分析。将OTU代表序列与Silva 128数据库进行比对，得到每个OTU所对应的物种在界、门、纲、目、科、属、种的分类信息，其中本发明富集得到的己酸菌为Caproiciproducens属。

(2)窖泥质量的判断

将发酵4d时己酸含量与窖泥中己酸菌属(Caproiciproducens)微生物的相对丰度作图，如图1，发现己酸含量与己酸菌属的丰度呈正相关，即己酸含量高低能够一定程度反映窖泥中己酸菌属的丰度高低，只有具有一定己酸菌属丰度的窖泥才可用于糖利用型厌氧产己酸菌的进一步富集；将己酸产量大于1.5g/L的窖泥认定为合格窖泥，分别获得接种了合格窖泥PM1、PM2、PM3、PM4、PM5的发酵液。

实施例2：糖利用型厌氧产己酸菌群的获得

本实施例选取实施例1筛选得到的合格窖泥PM2。

具体步骤如下：

1、将实施例1步骤4中得到的接种了PM2窖泥的发酵液，作为第一代富集培养液F1；

将第一代富集培养液F1以5％-10％(v/v)的接种量转接入新鲜的实施例1的步骤2中配制的富集培养基中，在37℃培养4天后获得第二代富集培养液F2；

将第二代富集培养液F2以5％-10％(v/v)的接种量转接入新鲜的实施例1的步骤2中配制的富集培养基中，在37℃培养4天后获得第三代富集培养液F3；

将第三代富集培养液F3以5％-10％(v/v)的接种量转接入新鲜的实施例1的步骤2中配制的富集培养基中，在37℃培养4天后获得第四代富集培养液F4；

将第四代富集培养液F4以5％-10％(v/v)的接种量转接入新鲜的实施例1的步骤2中配制的富集培养基中，在37℃培养4天后获得第五代富集培养液F5；

2、气相色谱监测富集过程中F1，F2，F3，F4，F5代的富集培养液中的糖利用型厌氧产己酸菌群的己酸产量如图2及表2所示；F1，F2，F3，F4，F5代的糖利用型厌氧产己酸菌群的己酸产量分别为：1.298±0.339g/L，5.446±1.363g/L，5.513±0.679g/L，7.541±0.823g/L，9.455±0.504g/L；丁酸产量分别为：7.334±1.042g/L，5.230±1.004g/L，3.850±0.511g/L，3.049±0.099g/L，3.620±0.343g/L。

表2：连续富集过程F1、F2、F3、F4、F5代己酸及丁酸含量及己酸与丁酸比值(己丁比)

	己酸(g/L)	丁酸(g/L)	己丁比
				F1	1.298±0.339	7.334±1.042	0.178±0.041
F2	5.446±1.363	5.230±1.004	1.101±0.464
				F3	5.513±0.679	3.850±0.511	1.460±0.331
F4	7.541±0.823	3.049±0.099	2.477±0.306
				F5	9.455±0.504	3.620±0.343	2.633±0.359

采用16S rRNA基因扩增子测序技术监测F1、F2、F3和F4代富集过程中糖利用型厌氧产己酸菌株的比例变化，结果如图3所示。

通过气相色谱及16S rRNA基因扩增子测序技术检测厌氧产己酸菌的富集效果。由图2可知，富集过程中，菌群的己酸产量呈持续上升趋势，经过连续四次传代，己酸产量由1.3g/L提升至9.5g/L。由图3可知，在富集过程中，糖利用型厌氧产己酸菌的相对丰度逐渐升高，由原始12％提升至43％。

按照上述相同的方法，分别取10～20个接种了合格窖泥PM1、PM2、PM3、PM4、PM5的发酵液，验证富集后己酸菌属的相对丰度的升高效果，结果显示，相对丰度均提高至58±2％。

因此，采用本方法得到的产己酸菌相对丰度，大于采用论文“浓香型白酒窖泥产酸菌群培养及新型己酸合成菌的鉴定与特性分析”中方法所公开的SC1样品及AH1样品中己酸菌的相对丰度38.85％及20.34％。

通过上述结果可知，采用本发明的富集方法，可以在16天内获得含高丰度厌氧产己酸菌体系，本实施例采用的特定比例连续传代的策略，对于提升培养体系中己酸菌的丰度及培养体系的己酸产量是十分有效的。

实施例3：糖利用型己酸菌群的应用

本实施例利用本发明所涉及的厌氧产己酸菌群发酵液进行窖池发酵强化操作，包括以下步骤：

(1)种子液2制备：根据实施例2中步骤(1)中得到的PM2窖泥的F4代富集培养液100mL作为种子液1，将处于对数生长期的种子液1(OD600＝2.77)以10％(v/v)的接种量接种于富集培养基中(发酵罐容积为3L，其他组分及其配制方法同实施例1的步骤2中配制方法)，通入流量为2L/min高纯氮气维持发酵罐内厌氧环境，发酵温度控制在37℃，得到种子液2。

(2)第二级放大：以高纯氮将步骤(1)得到种子液2以1.5L泵入含有15L富集培养基的20L发酵罐中，培养至对数生长期，此时的发酵液OD600＝2.85，得到二级发酵液。

(3)第三级放大：以高纯氮将上述二级发酵液15L种子液泵入含有150L富集培养基的200L发酵罐中，培养至己酸含量较高的稳定期。此时的发酵液OD600＝3.34，得到三级发酵液。

(4)灌窖：粮糟正常入窖发酵20天后，从窖池顶部将80L三级发酵液加入酒醅，再继续发酵40天生产浓香型白酒。

采用本发明方法制备的产己酸菌液灌窖后生产的浓香型白酒(3号窖池和4号窖池)，与未用产己酸菌液灌窖生产的浓香型白酒(1号窖池和2号窖池)的挥发性物质组分相比较，如表3所示。

表3：产酸菌群菌液灌窖强化后生产的浓香型白酒与未用产酸酸菌群菌液灌窖生产的浓香型白酒的主要挥发性风味物质含量变化比较

结果显示：主体香气成分己酸乙酯的含量显著提升，从720.15±14.7mg/L提升到1002.35±43.91mg/L，提高幅度39％，组间差异显著(t检验的p值<0.05)，表明以己酸菌属为主体的产酸菌群强化后，显著提升了主体香气己酸乙酯在原酒中的浓度；己酸浓度从93.51±1.28mg/L提高到139.42±10.45mg/L，提升幅度49％，组间差异显著(t检验的p值<0.05)；同时其他风味物质含量提升幅度分别为：丁酸乙酯(36％)，辛酸乙酯(27％)，己酸异戊酯(37％)，乙酸乙酯(22％)，正己醇(24％)，正丁醇(23％)，仲丁醇(71％)，2-甲基丁醇(17％)，丁酸(40％)，辛酸(99％)，乙酸(10％)。

主要风味物质测试结果表明，本发明方法制备的产酸菌液在改善浓香型白酒品质方面具有明显的效果。以己酸菌为主的产酸菌群能促进除己酸外的其他酸和醇含量提升的原因在于，本发明获得的产酸菌群代谢产物以己酸为主，但同时还能产生丁酸，以及微量的辛酸、丁醇、辛醇等短中链脂肪酸和微量的短中链醇类，这些酸和醇及酒醅来源的乙醇在酒醅所含脂肪酶作用下，产生了多元的酯类物质。本实施例表明，基于该厌氧产己酸菌液在灌窖、养窖、窖泥强化的方法具有实用价值。

实施例4：以丁酸钠为电子受体富集糖利用型厌氧产己酸菌群

具体实施方式如实施例1-2，区别在于，将富集培养基中的乙酸钠调整为丁酸钠，得到富集培养基1，该方法包括如下步骤：

1、配制厌氧产己酸菌群富集培养基1

乙酸钠调整为丁酸钠，其他配制方法与实施例1的步骤2中配制方法一致。

2、厌氧产己酸菌群富集培养

按照实施例1和实施例2的方法富集分别得到第一代富集培养液F1、第二代富集培养液F2、第三代富集培养液F3、第四代富集培养液F4。

气相色谱监测富集过程F1，F2，F3，F4代的富集培养液中的厌氧产己酸菌群的己酸产量和相对丰度。结果如下表所示：

表4：丁酸钠为辅底物时连续富集过程F1、F2、F3、F4代己酸含量

代次	己酸(g/L)
		F1	2.400±0.593
F2	4.628±0.953
		F3	5.323±0.372
F4	5.274±0.250

结果显示：由表4可知，将培养基中的乙酸钠替换为丁酸钠，随着传代，富集菌群的己酸产量逐渐增加并趋于稳定，该种培养基可较快的富集窖泥中的产己酸菌并且支持产己酸菌的良好生长与产酸。

通过上述结果可知，将培养基中的乙酸钠替换为丁酸钠同样可以起到有效富集窖泥中产己酸菌的效果。

实施例5：以乙酸钠和丁酸钠为电子受体富集糖利用型厌氧产己酸菌群

具体实施方式如实施例1-2，区别在于，将富集培养基中的乙酸钠调整为乙酸钠和丁酸钠，得到富集培养基2，该方法包括如下步骤：

1、配制厌氧产己酸菌群富集培养基2

乙酸钠调整为乙酸钠为4g/L和丁酸钠为6g/L，其他配制方法与实施例1的步骤2中配制方法一致。

2、厌氧产己酸菌群富集培养

按照实施例1和实施例2的方法分别富集得到第一代富集培养液F1、第二代富集培养液F2、第三代富集培养液F3、第四代富集培养液F4。

气相色谱监测富集过程F1，F2，F3，F4代的富集培养液中的厌氧产己酸菌群的己酸产量和相对丰度。结果如下表所示：

表5：乙酸钠加丁酸钠为辅底物时连续富集过程F1、F2、F3、F4代己酸含量

结果显示：由表5可知，将培养基中的乙酸钠替换为乙酸钠加丁酸钠，在传代过程中己酸产量虽有所波动，但是总体呈现上升的趋势，传代3次后，己酸产量提升了约1.8倍。

通过上述结果可知，将培养基中的乙酸钠替换为乙酸钠和丁酸钠，同样可以起到有效富集窖泥中产己酸菌的效果。

对比例1：培养基组分对初始富集培养效果的影响

具体实施方式同实施例2，区别在于，该方法中富集培养体系中不添加必要的电子受体乙酸钠，该方法包括如下步骤：

1、无乙酸盐的厌氧产己酸菌群富集培养基配制

除培养基中不添加乙酸钠外，其他配制方法与实施例1的步骤2中配制方法一致。

2、厌氧产己酸菌群富集培养

按照实施例1和实施例2的方法分别富集得到第一代富集培养液F1、第二代富集培养液F2、第三代富集培养液F3。

气相色谱监测富集过程F1，F2，F3代的富集培养液中的厌氧产己酸菌群的己酸产量和相对丰度。结果如下表所示：

表6：无乙酸钠厌氧产己酸菌群富集培养传代情况

结果显示：由表6可知，在无乙酸的情况下，厌氧产己酸菌群的己酸产量随传代进行持续下降。

通过上述结果可知，采用不添加乙酸钠的富集培养基，连续传代下己酸产量降低，说明无乙酸钠的富集培养基不能够有效的维持窖泥中厌氧产己酸菌的活性，乙酸钠是维持己酸菌群在富集过程和放大培养过程中保持菌群优势的不可缺少的组分之一。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种快速从窖泥中富集葡萄糖利用型产己酸菌群的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)配制富集培养基；(2)筛选合格窖泥：将窖泥接种于富集培养基进行培养，检测发酵终点富集培养液的己酸含量，判定己酸含量高于1.5g/L的富集培养体系所用的接种窖泥为合格窖泥；(3)将合格窖泥接种至富集培养基中进行逐级培养，每级种子液的培养时间为3d-5d；

所述富集培养基成分，按g/L，含有：葡萄糖10.0-30.0，酵母粉5.0-10.0，蛋白胨5.0-10.0，磷酸氢二钾0.5-1.0，磷酸二氢钾0.5-1.0，硫酸铵1.0-3.0，硫酸镁0.1-0.5，电子受体2.5-5.0，微量元素营养液：0.15-1.0mL/L；所述电子受体为：乙酸钠、丁酸钠中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中每级种子液按照体积分数为5％-10％的接种量接种至培养基中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中每级种子液的培养时间为4d。

4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，微量元素营养液包括：10g/L的氯化钙，10g/L的氯化钴，10g/L的硫酸锌，10g/L的硫酸锰和15g/L的七水合硫酸亚铁。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述逐级培养是连续传代培养3～5代。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中逐级培养的培养温度为35～38℃；步骤(1)中的富集培养基的pH为5.5-6.5。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中窖泥在富集培养基中的接种量为3％～10％。

8.权利要求1-7任一所述的方法制备得到的糖利用型己酸菌群菌液。

9.权利要求1-7任一所述的方法在提高糖利用型己酸菌群传代稳定性中的应用。

10.一种人工窖泥的培养方法或者维护保养窖泥的方法，其特征在于，所述方法包括：在人工窖泥的培养过程中或者维护保养窖泥的过程中，加入权利要求8所述的糖利用型己酸菌群菌液。

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