CN111269842B - 枝孢菌p-2及其在加速新酒老熟中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种枝孢菌P‑2及其在加速新酒老熟中的应用。针对现有市场上还没有能够用于新酒老熟过程的微生物的问题，本发明提供了一种枝孢菌P‑2，所述枝孢菌P‑2的保藏编号为CGMCC No.18125，ITS序列如SEQ ID NO：1所示。本发明的枝孢菌P‑2能应用于加速新酒老熟过程，减少新酒中醛类物质相对含量、提高酒中酯类物质相对含量、提高产品风味品质，具有重要应用价值。

Description

枝孢菌P-2及其在加速新酒老熟中的应用

技术领域

本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一种枝孢菌P-2及其在加速新酒老熟中的应用。

背景技术

一般情况下，新酒相对刺激辛辣，口感粗糙，香气很杂，由于这些特点，新酒很难被人接受。因此，新酒都需要一个陈放的过程，在这段时间里面，新酒粗糙的口感会变得醇厚，柔和，酒体协调，这个变化称为老熟。对于传统的优质酒来说，采用的都是自然老熟的方法，由于在老熟的过程中发生了各种化学反应，例如氧化和酯化等反应，在反应的过程中生成香味化合物；另外一个原因是新酒中含有一些高级醇类的物质，这类物质会有刺激性的气味，所以经过时间的陈放，这类低沸点的物质会随着时间挥发掉，使得酒体最终气味香醇。所以，酒越陈越香这句话是有依据的。

通常酒的陈放时间会根据原料和发酵的工艺来决定，少则几年，多则几十年，总的来说，新酒的自然老熟都是一个漫长的过程，不仅占用容器库房，还浪费人力，延长生产周期，大大增加了酒的生产成本，不利于现代化生产的要求。故，运用现代化的科学技术来加速酒老熟的方法一直是研究的热点，根据目前的老熟方法，技术可以分为三大类：物理法、化学法和生物法。物理催陈是通过施加外加因素来促进酒的老熟过程，通常这些外源因素包括光、电、磁、微波、超声波、离子、高压等，虽然都有一定的作用，但是通过添加外源因素的方法，很大程度会改变自然老熟机理，所以会有人不认同这一做法，觉得这是将一种生酒变成了另一种“生酒”。化学催陈就是通过向酒中添加一些老熟的标志性物质或这些物质的前体物质，但是外源物质的添加在安全性的方面不及酒自然产生的，而且新酒中少量醛类等一些对人体有害的物质由于缺少时间的陈放，也不会因此而减少，所以也有很多人并不赞同这一做法。生物法就是通过一些微生物与酒本身的相互作用，来达到新酒老熟的效果。目前，一些已知的微生物特别是乳酸菌在酿造过程中对酒的风味物质和有机酸的积累有比较明显的效果，其中较常见的有干酪乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌，但是这些微生物只能在酿造过程中发生作用，而在老熟过程中却很难发现它们在白酒中的存在。

目前的生物法催陈多是在酒的生产过程进行直接干涉，不能保证酒的质量。专利CN110317705A公开了一种白酒加速老熟的方法，包括将新酒接入室外贮存容器中，接入陈酒，放入吸附柱，通入氧气，将老熟一段时间的白酒由室外贮存容器中导入室内贮存容器，控制室内温度。其可操作性不强且对酒品质不能保证。

也有利用外在设备对新酒进行催陈。专利CN108728323A公开了一种模拟自然醇化的新酒高效陈化装置及其应用方法，该方法设计了一种陈化装置，并使用纳米功能材料作为其栅杆及壳体下部的填料，缩短酒的催陈时间，该方法设备投资大，纳米功能材料昂贵且使用寿命短，投入和收效不成正比。

专利CN103305448A公开了一种使浓香型白酒新窖快速老熟的混合培养菌液和养护方法，该混合培养菌液主要含有5～20重量份的甲烷杆菌培养液、1～7重量份的己酸菌培养液和15～30重量份的液态老窖泥，是通过将将母糟、黄水、中高温大曲、酵母膏、醋酸钠和磷酸氢二钾放入发酵容器，用沸水进行热处理并封闭发酵容器；当发酵容器内的温度降至40℃时，向容器内添加甲烷杆菌培养液、己酸菌培养液、液态老窖泥和酒精，再用冷开水填满发酵容器并调节pH值到6.5～7.0，在33～37℃的温度下培养得到。该方法和酒直接接触，对酒的食用、品质有较大影响。

已有促进白酒老熟的技术主要为物理法、化学法，难以模拟白酒在藏酒洞中的生态储藏环境，无法达到传统洞藏所赋予的白酒老熟效果；另外，虽然藏酒洞对于白酒风味品质提升具有重要作用，但是需要数年乃至数十年的时间积累，才能获得品质上佳的陈年白酒。目前尚缺少对白酒陈酿过程中陶坛表面微生物的分离鉴定及其对白酒储藏过程中风味品质影响的研究，缺少关于利用藏酒洞环境微生物加速白酒老熟的技术应用。

目前，市场上还没有能够用于基酒老熟过程的微生物，也缺乏加速在加速新酒老熟的微生物方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有市场上还没有能够用于基酒老熟过程的微生物，也缺乏加速在加速新酒老熟的微生物方法的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种枝孢菌P-2。该枝孢菌P-2的保藏编号为CGMCC No.18125。保藏时间为：2019年8月26日，保藏地点为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

其中，上述枝孢菌P-2的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO:1枝孢菌P-2的ITS核苷酸序列

gcggaggaaaagaaaccaacagggattgctctagtaacggcgagtgaagcagcaatagctcaaatttgaaatctggcgtcttcgacgtccgagttgtaatttgtagaggatgcttctgagtggccaccgacctaagttccttggaacaggacgtcatagagggtgagaatcccgtatgcggtcggaaaggcgctctatacgtagctccttcgacgagtcgagttgtttgggaatgcagctctaaatgggaggtaaatttcttctaaagctaaatattggccagagaccgatagcgcacaagtagagtgatcgaaagatgaaaagcactttggaaagagagttaaaaagcacgtgaaattgttaaaagggaagggattgcaaccagacttgctcgcggtgttccgccggtcttctgaccggtctactcgccgcgttgcaggccagcatcgtctggtgccgctggataagacttgaggaatgtagctccctcgggagtgttatagcctcttgtgatgcagcgagcgccgggcgaggtccgcgctcggctaggatg。

本发明所述的枝孢菌P-2是从泸州老窖纯阳洞的洞壁中分离得到的。

其中，上述枝孢菌P-2的生长特征为：温度10～8℃，pH值4～7，避光。

其中，上述枝孢菌P-2的形态特征为：在PDA培养基上，生长菌落呈球状，孢子为黑色或褐色，分生孢子为球形，菌丝无色、无隔膜、偶见分枝，无锁状联合。

其中，上述枝孢菌P-2的稳定性特征为：在PDA培养基20℃培养96h，连续传代5代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，生物学性状稳定。

其中，上述枝孢菌P-2的降解性特征为：降解新酒中乙醛、1-戊醛、糠醛或2-甲基丙醛。

本发明还提供了上述枝孢菌P-2在加速新酒老熟中的应用。

进一步的，本发明提供了上述枝孢菌P-2在新酒老熟时，减少新酒中醛类物质、增加新酒中酯类物质的应用。

本发明还提供了一种上述枝孢菌P-2的应用方法，包括以下步骤：

a、在斜面培养基中培养枝孢菌P-2，20℃培养48～120h至长出浓密孢子；制备孢子悬浮液，并刮下斜面培养基表面生长的孢子，过滤后加入孢子悬浮液中，制备得到孢子液；

b、将步骤a得到的孢子液稀释至1×10⁵个/mL，接种至种子培养基中，20℃静置培养36～84h，得到枝孢菌P-2菌株种子液；

c、将步骤b中的枝孢菌P-2种子液转接至生长培养基中，20℃培养36～96h，离心，弃上清，得到枝孢菌P-2细胞，加入无菌水制备枝孢菌P-2细胞悬浮液，使悬浮液中的细胞数量为10⁷～10⁹个/mL；

d、将步骤c中得到的枝孢菌P-2细胞悬浮液转移至喷雾器中，喷洒至藏酒洞洞壁或贮酒陶坛表面。

其中，上述枝孢菌P-2的应用方法中，步骤a所述的孢子悬浮液的制备方法为：称取0.1g Tween80、0.9g NaCl溶于100mL重蒸水，充分混匀，于121℃灭菌20min，置于4℃冰箱备用。

其中，上述枝孢菌P-2的应用方法中，步骤a所述的斜面培养基为PDA培养基，步骤b所述的种子培养基为PDB培养基，步骤c所述的生长培养基为含8mg/L NaH2PO4的PDB培养基。

其中，上述枝孢菌P-2的应用方法中，步骤d所述的喷洒的浓度为：洞壁10¹⁰～10¹²个细胞/dm²，陶坛表面10⁶～10⁸个细胞/dm²。

本发明的有益效果为：

本发明首次从生态藏酒的角度，从藏酒洞中陈年白酒酒坛坛壁和墙壁表面的原生态微生物群落中分离获得了关键微生物菌株，命名为枝孢菌P-2，其具有减少新酒醛类物质相对含量、提高酒中酯类物质相对含量、提高产品风味品质、加速新酒老熟的作用，用于白酒老熟时，加速了新酒的老熟，缩短了新酒的老熟时间，提高了白酒的老熟效率。本发明首次采用微生物方法解决了白酒老熟时间长的问题，为加速白酒老熟提供了新的选择，具有重要的意义。

本发明提供的枝孢菌P-2已于2019年8月26日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC保藏，保藏编号为CGMCC No.18125，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，生物学分类命名为Cladosporiumherbarum。

附图说明

图1为实施例2所述枝孢菌P-2在PDA培养基上的形态特征。

图2为实施例2所述枝孢菌P-2在PDA培养基上的形态特征。

图3为本发明所述枝孢菌P-2基于ITS1 rRNA基因发育树图。

图4为发明所述枝孢菌P-2电泳图。

具体实施方式

本发明提供了一种枝孢菌P-2，保藏编号为CGMCC No.18125，保藏时间为2019年8月26日，保藏地点为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，生物学分类命名为Cladosporium herbarum。

本发明所述的枝孢菌P-2由泸州老窖纯阳洞的洞壁中分离得到。

本发明的枝孢菌P-2的ITS序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

本发明还提供了上述枝孢菌P-2在加速新酒老熟中的应用。

进一步的，本发明提供了上述枝孢菌P-2在新酒老熟时，减少新酒中醛类、增加新酒中酯类的应用。

本发明还提供了一种上述枝孢菌P-2的应用方法，包括以下步骤：

a、在斜面培养基中培养枝孢菌P-2，20℃培养48～120h至长出浓密孢子；制备孢子悬浮液，并刮下斜面培养基表面生长的孢子，过滤后加入孢子悬浮液中，制备得到孢子液；

b、将步骤a得到的孢子液稀释至1×10⁵个/mL，接种至种子培养基中，20℃静置培养36～84h，得到枝孢菌P-2菌株种子液；

c、将步骤b中的枝孢菌P-2种子液转接至生长培养基中，20℃培养36～96h，离心，弃上清，得到枝孢菌P-2细胞，加入无菌水制备枝孢菌P-2细胞悬浮液，使悬浮液中的细胞数量为10⁷～10⁹个/mL；

d、将步骤c中得到的枝孢菌P-2细胞悬浮液转移至喷雾器中，喷洒至藏酒洞洞壁或贮酒陶坛表面。

其中，上述枝孢菌P-2的应用方法中，步骤a所述的孢子悬浮液的制备方法为：称取0.1g Tween80、0.9g NaCl溶于100mL重蒸水，充分混匀，于121℃灭菌20min，置于4℃冰箱备用。

其中，上述枝孢菌P-2的应用方法中，步骤a所述的斜面培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)，成分(g/L)：马铃薯粉6.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g。

步骤b所述的种子培养基为马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB培养基)，成分(g/L)：马铃薯浸粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖15g，氯化钠5g，步骤c所述的生长培养基为含8mg/L NaH₂PO₄的PDB培养基，成分(g/L)：马铃薯浸粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖15g，氯化钠5g，NaH₂PO₄ 8mg。

步骤c所述的生长培养基为含8mg/L K₂HPO₄的PDB培养基。

其中，上述枝孢菌P-2的应用方法中，步骤d所述的喷洒的浓度为：洞壁10¹⁰～10¹²个细胞/dm²，陶坛表面10⁶～10⁸个细胞/dm²。

下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1本发明枝孢菌P-2的分离

于泸州老窖纯阳洞的洞壁上刮取10g壁样，加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中，在涡旋振荡器上充分振荡10min，使样品充分散开。将上清液进行10倍梯度稀释，稀释度为10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7，用移液枪吸取0.2mL样液，采用平板涂布法，将样液均匀涂布于PDA培养基上，将涂布好的平板倒置于20℃恒温培养箱中培养72h。挑选培养基上生长良好的菌株通过多次划线分离培养分离出单个菌落，然后将其接种到PDA斜面培养基上，20℃培养48～96h待菌株长成，保藏于4℃冰箱备用。

实施例2本发明枝孢菌P-2的鉴定

步骤1：枝孢菌P-2的形态学鉴定

对分离得到的菌株，按照《真菌鉴定手册》(魏景超主编，上海科学技术出版社，1979)的方法，采用PDA平板和显微镜对菌落、菌丝、孢子等结构进行观察。结果显示，菌株在PDA培养基上20℃培养48～96h，为圆形的黑褐色霉状物，表面湿润，菌丝为有隔菌丝，无足细胞，部分菌丝体具不规则状晶体物，菌丝顶端产生分枝或不分枝的分生孢子。参照《真菌鉴定手册》，筛选菌株初步认为是枝孢菌(Cladosporium sp.)

步骤2：枝孢菌P-2的分子生物学鉴定

使用真菌基因组试剂盒(购自Takara，Code No.9765)提取枝孢菌P-2(Cladosporium herbarumP-2)的基因组DNA。采用真菌ITS rRNA基因通用引物进行PCR扩增，引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。

SEQ ID NO：2真菌ITS1 rRNA通用引物核苷酸序列：

tccgtaggtgaacctgcgg。

SEQ ID NO：3真菌ITS4 rRNA通用引物核苷酸序列：

tcctccgcttattgatatgc。

PCR反应体系为：步骤2所得的模板DNA 10ng，PCR Premix 12.5μl，ITS1 rRNA通用引物(20pmol/μl)1.0μl，ITS4 rRNA通用引物(20pmol/μl)1.0μl，ddH₂O补足总体积25μl。

PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，50～58℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，取出产物。

序列测定工作由扩增后的PCR产物送样测序，测序由上海生工生物科技有限公司完成。

根据其形态特征、生理生化指标以及ITS1rDNA基因序列在NCBI中blast比对结果显示它与Cladosporium herbarum有99.81％的相似度，故可鉴定菌株P-2为枝孢菌(Cladosporium herbarum P-2)。

实施例3本发明枝孢菌P-2对新酒中1-戊醛、2-甲基丙醛、糠醛等醛类物质的降解特性

(1)将分离得到的枝孢菌P-2接种到PDB液体培养基中(接种量为5％)，并且在培养基中分别添加0.005g/L乙醛、0.025g/L 1-戊醛、0.030g/L 2-甲基丙醛、0.55g/L糠醛等醛类物质，于20℃培养36h得到发酵原液；对照为不加菌、同样操作的各样品得发酵原液对照样；

(2)采用顶空固相微萃取-气质联用(HS-SPME-GC-MS)对各发酵原液和发酵原液对照液中醛类进行测定。设定固相微萃取-气质联用条件：在20m L样品瓶中依次加入2.00gNaCl、5mL试样、5μL内标和转子，60℃，400r/min搅拌平衡15min，萃取30min后作GC/MS分析。解析时间为7min；GC：不分流进样，载气为氦气，恒流模式，流速1.5mL/min，进样口240℃，柱温程序：初始温度50℃，恒温2min后以4℃/min升温至70℃，再以6℃/min升温至150℃，最后以10℃/min升温至200℃恒温3min；MS：电子轰击离子源(EI)，温度为230℃，电子能量70eV，传输线240℃。扫描范围30-380amu。化合物定性分析采用全扫描模式，定量测定为选择性离子监测模式(SIM)。

(3)根据步骤(2)的操作，得到检测结果为，发酵原液中所测醛类物质浓度：13mg/L1-戊醛、10mg/L 2-甲基丙醛、210mg/L糠醛，发酵原液对照样中所测醛类物质浓度：4.5mg/L乙醛、20.5mg/L 1-戊醛、23mg/L 2-甲基丙醛、410mg/L糠醛。

实施例4本发明枝孢菌P-2在浓香型白酒老熟中的应用

(1)将刚蒸馏出的白酒转移至洁净的陶坛中，其白酒的贮存量为陶坛体积(V/V)的4/5，之后用不透气的帆布密封陶坛的开口处且在帆布周围用泥头封头，并将装有白酒的陶坛运至藏酒洞进行自然老熟；

(2)在斜面培养基中培养枝孢菌P-2，20℃培养36h至长出浓密孢子。于已灭菌50mL三角瓶中加入孢子悬浮液，刮入斜面培养基表面生长的孢子，充分振摇后用灭菌的脱脂棉进行过滤，并用无菌水冲洗滤渣2次，最终使滤液体积达到10.0ml，孢子液即制成；

(3)将步骤(2)中得到的孢子液用无菌水稀释至1×10⁵个/mL，接种至PDB种子培养基中，20℃，100rpm震荡培养48h，得到枝孢菌P-2菌株种子液；

(4)取步骤(3)中枝孢菌P-2种子液转接至含8mg/L CaCO₃的PDB生长培养基中，20℃培养48h，将培养基离心，弃去上清液，获得相应的枝孢菌P-2细胞，加入无菌水以制备枝孢菌P-2细胞悬浮液，使其悬浮液中的细胞数量可达10⁷个/mL；

(5)将步骤(4)中得到的枝孢菌P-2细胞悬浮液转移至喷雾器中，并将其喷洒至藏酒洞的洞壁和贮藏酒的陶坛的表面，其喷洒于洞壁的细胞数量为10¹²个/m²，陶坛表面的细胞数量为10⁷个/dm²；

(6)两个月后取出步骤(5)中置于藏酒洞的陶坛，将其中的白酒分装至已灭菌的酒瓶中，瓶中的白酒即为加速老熟后得到的酒。

实施例5本发明枝孢菌P-2在清香型白酒老熟中的应用

该实施例仅在实施例4中将浓香型白酒基酒换成清香型白酒基酒。

实施例6本发明枝孢菌P-2在酱香型白酒老熟中的应用

该实施例仅在实施例4中将浓香型白酒基酒换成酱香型白酒基酒。

对比例1浓香型白酒自然老熟

(1)将刚蒸馏出的白酒转移至洁净的陶坛中，其白酒的贮存量为陶坛体积(V/V)的4/5，之后用不透气的帆布密封陶坛的开口处且在帆布周围用泥头封头，并将装有白酒的陶坛运至藏酒洞进行自然老熟；

(2)两个月后取出步骤(1)中置于藏酒洞的陶坛，将其中的白酒分装至已灭菌的酒瓶中，瓶中的白酒即为正常老熟后得到的酒。

对比例2清香型白酒自然老熟

该对比例仅在对比例1中将浓香型白酒基酒换成清香型白酒基酒。

对比例3酱香型白酒自然老熟

该对比例仅在对比例1中将浓香型白酒基酒换成酱香型白酒基酒。

实施例4-6与对比例1-3老熟后的酒中，能够降解新酒中乙醛、1-戊醛、糠醛、2-甲基丙醛等醛类物质等醛类物质含量、总酯含量如下表1所示，检测方法采用气相色谱质谱(GCMS)内标法。检测方法采用气相色谱质谱(GCMS)内标法(泸型酒蒸馏前后酒醅中挥发性物质的差异性分析.食品与发酵工业,2015,41:34-37)。

表1不同方法老熟的酒中醛类、酯类挥发性化合物含量(g/L)

*1糠醛在酱香酒中主要贡献焦香和烘焙香，在清香和浓香型酒中，会使酒体出现杂味和怪味，影响酒质。

*2总酯风味物质包括己酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸乙酯。

实施例4-6与对比例1-3老熟后的酒中，感官指标如下表2所示。

表2白酒感官品评标准

记分标准采用100分为满分，其中色泽10分，香气25分，口味50分，风格15分。

表3不同老熟方法得到的酒感官指标

由实施例和对比例可知，本发明分离鉴定了一种微生物枝孢菌P-2，其可有效用于白酒新酒老熟过程中，能够促进醛的降解，减少新酒醛类物质含量、增加酯类物质含量、提高产品风味品质、加速新酒老熟，为基酒老熟提供了一种全新的方法，适宜推广使用。

序列表

<110> 泸州老窖股份有限公司

江南大学

泸州品创科技有限公司

<120> 枝孢菌P-2及其在加速新酒老熟中的应用

<130> A200099K（序）

<141> 2020-03-11

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcggaggaaa agaaaccaac agggattgct ctagtaacgg cgagtgaagc agcaatagct 60

caaatttgaa atctggcgtc ttcgacgtcc gagttgtaat ttgtagagga tgcttctgag 120

tggccaccga cctaagttcc ttggaacagg acgtcataga gggtgagaat cccgtatgcg 180

gtcggaaagg cgctctatac gtagctcctt cgacgagtcg agttgtttgg gaatgcagct 240

ctaaatggga ggtaaatttc ttctaaagct aaatattggc cagagaccga tagcgcacaa 300

gtagagtgat cgaaagatga aaagcacttt ggaaagagag ttaaaaagca cgtgaaattg 360

ttaaaaggga agggattgca accagacttg ctcgcggtgt tccgccggtc ttctgaccgg 420

tctactcgcc gcgttgcagg ccagcatcgt ctggtgccgc tggataagac ttgaggaatg 480

tagctccctc gggagtgtta tagcctcttg tgatgcagcg agcgccgggc gaggtccgcg 540

ctcggctagg atg 553

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (4)

1.枝孢菌P-2，其特征在于：所述枝孢菌P-2的保藏编号为CGMCC No.18125。

2.权利要求1所述的枝孢菌P-2在加速新酒老熟中的应用。

3.权利要求1所述的枝孢菌P-2在新酒老熟时，减少新酒中醛类物质、增加新酒中酯类物质的应用。

4.权利要求1所述的枝孢菌P-2的应用方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、在斜面培养基中培养枝孢菌P-2，20℃培养48～120h至长出浓密孢子；制备孢子悬浮液，并刮下斜面培养基表面生长的孢子，过滤后加入孢子悬浮液中，制备得到孢子液；

b、将步骤a得到的孢子液稀释至1×10⁵个/mL，接种至种子培养基中，20℃静置培养36～84h，得到枝孢菌P-2菌株种子液；

c、将步骤b中的枝孢菌P-2种子液转接至生长培养基中，20℃培养36～96h，离心，弃上清，得到枝孢菌P-2细胞，加入无菌水制备枝孢菌P-2细胞悬浮液，使悬浮液中的细胞数量为10⁷～10⁹个/mL；

d、将步骤c中得到的枝孢菌P-2细胞悬浮液转移至喷雾器中，喷洒至藏酒洞洞壁或贮酒陶坛表面。

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