CN104560806A - 1-氨基环丙烷-1-羧酸作为细菌趋化物质的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种1-氨基环丙烷-1-羧酸作为细菌趋化物质的应用。本发明通过平板趋化分析、游动平板分析和毛细管趋化分析实验发现：1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）的一种新用途，即ACC对细菌具有正趋化作用，尤其是恶臭假单胞菌，因此可作为细菌趋化物质进行应用。

Description

1-氨基环丙烷-1-羧酸作为细菌趋化物质的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种1-氨基环丙烷-1-羧酸作为细菌趋化物质的应用。

背景技术

细菌运动趋向某些化学吸引物(正趋化)或避开某些危害物(负趋化)的移动行为，称为细菌的趋化性。使细菌产生正趋化的物质称为正趋化物质，反之，使细菌产生负趋化的物质称为负趋化物质。如凤眼莲(Eichhornia crassipes)根系分泌物组分中的氨基酸甲硫氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸对根际肠杆菌F2(Enterobacter sp. F2)有强烈的正趋化作用，是正趋化物质，而赖氨酸、精氨酸、苏氨酸、脯氨酸则对该细菌产生负趋化作用，是负趋化物质。

在许多植物根际发现有一类细菌能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物被称为促生根际菌(plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR)。PGPR的作用机理主要有固氮、解磷、解钾、抗生、产生植物激素和植物修复等。能够固氮的PGPR包括共生固氮菌如根瘤菌和自生固氮菌如固氮螺菌（Azospirillun）、固氮菌（Azotobacter）、芽孢杆菌（Bacillus）、肠杆菌(Enterobacter)和黄色杆菌（Xanthobacter）等。解磷是指能够使土壤中无效态磷转化为有效态磷，起解磷作用的有假单胞菌(Pseudomonas)、巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）和短小芽孢杆菌（B. pumillus）等解磷细菌。解钾是指能够使土壤中矿物态钾转化为有效形态的钾，起解钾作用的主要有扭脱芽胞杆菌(B. torquens)、胶质芽胞杆菌(B．mucilginos)、环状芽胞杆菌(B．circulans)等。起抗生作用的主要是抗生菌，通过定殖于植物根系，优先占领根际，产生抗生素、铁载体、诱导植物的系统抗性、产生HCN等，拮抗根际的病原菌和DRMO来保护促进植物生长发育，如假单胞菌、芽孢杆菌、链霉菌(Streptomyces)等。植物激素产生菌，其产生的植物激素有生长素（IAA）、细胞分裂素和赤霉素，以及降低植物的乙烯水平。乙烯产生于植物根部，可加快植物对生物或非生物环境条件变化的反应。高浓度的乙烯抑制植物根的生长，导致植物生产不正常。许多PGPR可分泌ACC脱氨酶（ACC，1-aminocyclopropane-1-carboxylate，1-氨基环丙烷-1-羧酸），ACC脱氨酶可降解ACC生成α-酮丁酸和氨，使得ACC不再被植物氧化生成乙烯，从而降低植物苗期根部及其周围乙烯的含量，刺激植物生长，提高植物对盐分、高温、干旱、水涝、病害和土壤污染物等的抗性，提高产量。产ACC脱氨酶抑制乙烯形成的菌主要是假单胞菌如恶臭假单胞杆菌(Pseudomonasputida)、洋葱假单胞菌(P. cepacia)，芽孢杆菌如环状芽胞杆菌、坚强芽孢杆菌（B. firmus）、短小芽孢杆菌、圆孢芽孢杆菌(B. globisporus)，甲基杆菌（Methylobacteriumfujisawaense），产碱杆菌（Variovorax paradoxus），肠杆菌如阴沟肠杆菌（E. cloacae）、阪崎肠杆菌（E. sakazakii），巴西固氮螺菌（A. brasilense），豆科植物根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)，大豆慢生根瘤菌和产酸克雷伯氏菌（Klebsiellaoxytoca）等。植物修复菌已报道的有放射农杆菌（Agrobacteriumradiobacter）、黄杆菌（Flavobacterium）、固氮螺菌、假单胞菌等。土壤生物修复菌的作用机制是富集重金属、降解和矿化有机污染物，如对三氯乙烯、芳香族化合物及除草剂的降解等。

将PGPR制成菌肥，可有效减少化肥和农药的使用量，减少农残，有助于实现农业的可持续发展。研究表明，许多PGPR菌一旦敲除其ACC脱氨酶基因，则就不能在植物根表形成菌膜，也就不再具有促生增产作用。PGPR菌能够与在其它植物根际细菌竞争中取得优势，是否是由于植物根系产生的ACC对PGPR菌有强的趋化作用，ACC是否为细菌趋化物质，目前尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种1-氨基环丙烷-1-羧酸作为细菌趋化物质的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）作为细菌趋化物质的应用。

1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）作为细菌正趋化物质的应用。

1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）作为恶臭假单胞菌正趋化物质的应用。

本发明通过实验发现了ACC的一种新用途：1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）对细菌具有正趋化作用，尤其是恶臭假单胞菌，因此可作为细菌趋化物质进行应用。

附图说明

图1为点滴法趋化性分析恶臭假单胞菌对细菌趋化缓冲液、琥珀酸、脯氨酸和苯丙氨酸的趋化反应；

图2为点滴法趋化性分析恶臭假单胞菌对亮氨酸、谷氨酰胺、柠檬酸和ACC的趋化反应。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

1.1 实验菌株

恶臭假单胞菌UW4（Pseudomonas putida UW4）：美国农业研究菌种保藏中心保藏（保藏编号为NRRL B-50193，保藏日为2008年6月9日）。美国农业研究菌种保藏中心位于伊利诺伊州皮契里亚，由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心，英文全称Agrieultutal Research Service Culture Colleetion，简称NRRL。

培养基

LB液体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，去离子水1000 mL。

LB固体培养基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，琼脂 20 g，去离子水1000 mL。

TSB液体培养基：大豆蛋白胨3 g，胰蛋白胨17 g，葡萄糖2.5 g，氯化钠5 g， 磷酸氢二钾2.5 g，加蒸馏水1000 ml，pH 7.1－7.5，121℃高压灭菌30 min。

TSB固体培养基：大豆蛋白胨3 g，胰蛋白胨17 g，葡萄糖2.5 g，氯化钠5 g ，磷酸氢二钾2.5 g，琼脂粉20 g，加蒸馏水1000 ml，121℃高压灭菌30 min。

DF液体培养基配制：

FeSO₄组分：FeSO₄·7H₂O 1 g溶于100 ml超纯水中，现用现配；

微量元素组分：MnSO₄·H₂O 11.19 mg，ZnSO₄·7H₂O 124.6 mg，H₃BO₃ 10 mg， CuSO₄·5H₂O 78.22 mg，MoO₃ 10 mg，溶于100 ml超纯水，过滤除菌，-4℃保存；

各取100 μl上述的FeSO₄组分和微量元素组分，加入(NH₄)₂SO₄ 2.0 g，葡萄糖2.0 g，葡糖酸2.0 g，柠檬酸2.0 g，KH₂PO₄ 4.0 g，Na₂HPO₄ 6.0 g，MgSO₄·7H₂O 0.2 g，超纯水1000 ml，pH 7.2，121℃灭菌30 min，即制成DF液体培养基。

ADF培养基：将DF液体培养基中所用的(NH₄)₂SO₄去除，使用ACC作氮源（ACC不能高温灭菌，提前配制，过滤器除菌），即按3.0 mmol/L的量添加ACC到经灭菌冷却后不含 (NH₄)₂SO₄的DF液体培养基中。

TB培养基：蛋白胨10 g，Nacl 5 g，超纯水1000 ml，121℃灭菌30 min。

甘油盐液体培养基：甘油5g(单独灭菌)，K₂HPO₄ 11.2g，KH₂PO₄ 4.8g，(NH₄)₂SO₄ 2.0g，MgSO₄·7H₂O 0.25 g，Fe₂(SO₄)₃ 0.5 g，超纯水1000ml，121℃灭菌30 min。

细菌趋化缓冲液（CMB）： K₂HPO₄ 14.03g，KH₂PO₄ 5.24g，EDTA 0.0372g，超纯水1000 ml，pH 7.0。121℃灭菌30 min。

细菌运动培养基： K₂HPO₄ 14.03g，KH₂PO₄ 5.24g，EDTA 0.0372g，琼脂糖3g，超纯水1000ml， pH 7.0。121℃灭菌30 min。

细菌趋化培养基：K₂HPO₄ 14.03 g，KH₂PO₄ 5.24 g，EDTA 0.0372g，琼脂糖2 g，超纯水1000 ml，pH 7.0。121℃灭菌30 min。

方法

2.1 菌体细胞制备

将保存在4℃TSB固体培养基上的恶臭假单胞菌UW4转接到LB固体培养基平板上，28℃培养2 d，挑取单菌落接入10 ml TB培养基中，28℃、150 rpm条件下培养过夜（12h），取1 ml 菌液于8000 rpm、4℃条件下离心5min，弃上清，用1ml无菌超纯水冲洗2次，最后悬浮于1ml超纯水中。取200 μl接种到250 ml甘油盐液体培养基中，在28℃、150 rpm条件下培养至OD₆₀₀约为1.2，4℃放置进行平板趋化分析、游动平板分析和毛细管趋化分析。在进行所有的趋化分析实验之前，需要用预冷4℃的细菌趋化缓冲液冲洗细菌并镜检其运动活性细胞超过90%。

点滴法平板趋化分析

取500 ml（2瓶250ml）上述培养好的菌悬液，8000 rpm、离心5 min，去上清，使用预冷4℃的细菌趋化缓冲液20 ml冲洗2次，取菌体沉淀悬浮于200 ml细菌趋化培养基中，混匀，倒平板，每板20ml，进行平板趋化实验。实验采用点滴实验法，将不同的趋化物质（即琥珀酸、脯氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺、柠檬酸和ACC）以固体形式加入平板中央，在2-6 h内观察趋化现象，结果见图1和2。同时以细菌趋化缓冲液作为对照。

由图1和2可以看出：细菌趋化缓冲液不能引起恶臭假单胞菌的趋化反应。琥珀酸、谷氨酰胺、柠檬酸及ACC能对恶臭假单胞菌引起趋化现象，而脯氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸的趋化作用不明显，没有形成清晰的趋化圈。

游动平板分析

取15ml上述培养好的菌悬液，8000 rpm、离心5min，去上清，使用预冷4℃的细菌趋化缓冲液10ml冲洗3次，去上清，取10μl菌体加入培养皿中央，每个培养皿内预先放有20ml含3 mmol·L^-1不同趋化物质（柠檬酸、ACC和谷氨酰胺）的细菌运动培养基，同时以不加趋化物质的细菌运动培养基作为对照。测定趋化圈半径和R值。R值为细菌在含趋化物质的培养皿中的运动圈半径与其在不含趋化物质的培养皿中的运动圈半径之比值。结果见表1。

由表1可以看出：ACC与柠檬酸和谷氨酰胺一样，都能引起恶臭假单胞菌的趋化反应，使其从接种点向四周运动，趋化半径取决于趋化物质对恶臭假单胞菌的趋化性能。表1中：*R值为不同处理组与对照组趋化圈半径之比，不同字母代表数据之间有显著差异（p<0.05）。

毛细管法趋化分析

取15 ml上述培养好的菌悬液，8000 rpm、离心5 min，去上清，使用预冷4℃的细菌趋化缓冲液10 ml冲洗2次，最后悬浮于10 ml细菌趋化缓冲液中，获得有运动性的细菌菌液。用长3 cm、内径约为0.2 mm，体积约为1μl的毛细管，将其一端浸入前述制备好的有运动性的细菌菌液中，使菌液慢慢上升充满毛细管，使用细菌趋化缓冲液缓慢冲洗，洗去毛细管外壁的细菌，然后将该充满运动细菌的毛细管放入盛有8 ml趋化待测液（即含不同浓度趋化物质的细菌趋化缓冲液）、直径约5.5 cm的小平板中，同时以8 ml细菌趋化缓冲液作为对照组，30℃放置2 h，去除毛细管，从平板趋化待测液中取1ml进行10^-1-10^-5稀释梯度计数。

趋化液平板计数后，如果平板趋化待测液中从毛细管出来的细菌数量高于对照组，即趋化组比对照组的比值R大于1，则说明这种趋化物质对该细菌具有正向趋化效应；反之，则具有负趋化效应。

上述点滴法平板趋化分析和游动平板分析方法只能定性地分析趋化物质对恶臭假单胞菌的作用，并不能测定趋化物质的趋化浓度和趋化范围；而毛细管法则可以直观表明趋化物质的趋化能力及最适趋化浓度。趋化结束后，通过对平板趋化待测液中细菌计数分析，判定趋化物质的趋化特性，结果见表2。

由表2可以看出：ACC、柠檬酸和谷氨酰胺都是趋化物质，都能在一定浓度下对恶臭假单胞菌有明显的正趋化作用。具有正趋化作用的这三种物质，其不同浓度对恶臭假单胞菌的趋化作用大小也各有不同，并且存在产生趋化作用的最适浓度。ACC能在各浓度下使恶臭假单胞菌产生正趋化效应，在5×10^-6 mol·L^-1的较低的浓度下便能使恶臭假单胞菌产生的趋化效果高出对照组（细菌趋化缓冲液）2倍，ACC的趋化最适浓度在10^-3 mol·L^-1左右；柠檬酸随着趋化浓度的降低，趋化作用越来越强，其最适趋化浓度为10^-5 mol·L^-1左右；谷氨酰胺在测试的各个浓度均能产生正趋化作用，其最适趋化浓度在10^-3-10^-5 mol·L^-1。

Claims (3)

1.1-氨基环丙烷-1-羧酸作为细菌趋化物质的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，1-氨基环丙烷-1-羧酸作为细菌正趋化物质的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，1-氨基环丙烷-1-羧酸作为恶臭假单胞菌正趋化物质的应用。