CN111138723B - 一种3d打印梯度抗菌膜的制备方法、产品及其应用 - Google Patents

一种3d打印梯度抗菌膜的制备方法、产品及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种3D打印梯度抗菌膜的制备方法、产品及其应用，属于微生物领域，包括以下步骤：取海藻酸和果胶，加入甘油和蒸馏水，搅拌均匀，制得若干组混合液I；取壳聚糖溶于乙酸溶液，制得若干组具有浓度梯度的混合液II；将具有浓度梯度的若干组混合液II一一对应添加至若干组混合液I中，搅拌均匀成胶体状态，制得若干组3D打印原料；将若干组3D打印原料分别通过3D打印制得若干个薄膜片，将若干个薄膜片按壳聚糖质量分数大小依次无间隙地拼接在一起；用CaCl2浸泡，烘干后制得3D打印梯度抗菌膜，本发明的3D打印梯度抗菌膜可以用于观察微生物菌株运动轨迹。

Description

一种3D打印梯度抗菌膜的制备方法、产品及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种3D打印梯度抗菌膜的制备方法、产品及其应用。
背景技术
对外界环境感知并指导自身的运动是生物最基本的技能之一。越来越多的实验数据表明了，微生物菌株能够主动的对外界的刺激，如光、电、化合物、氧气等做出反应。它们沿着化合物浓度的梯度的方向进行迁移的行为被称为趋化现象。
以往研究微生物菌株运动的行为是在菌悬液中，微生物菌株通过生物对流的方式来实现其游动模式，亦或是沿着化合物浓度梯度方向进行迁移的运动。微生物菌株的运动是通过一根或一束大约10um长的鞭毛旋转产生的动力前进的。在液体培养基中，微生物菌株会在培养基表面富集，由于通常微生物菌株比重均较水略大，导致培养液形成“上重下轻”的密度分布。当这种不稳定性积累到一定程度时，上层流体会在某一个点突然向下掉落，并吸走附近的上层流体形成乡下的流道，从而引发生物对流。但生物对流引起的微生物菌株运动，是由于微生物菌株重力梯度的影响而造成的，且只能在液体培养基中，通过外面的宏观现象观察得到。当微生物菌株遇到对自身不利的化合物时，会远离其化合物。所以，现有技术中只能在液体培养基中用液体浓度梯度的化合物探究微生物菌株的趋向性运动，微生物菌株运动和流态化的液体培养基均会导致微生物菌株运动状态不易观察或观察效果不佳。
综上，针对现有技术的问题，一种易于观察微生物菌株运动状态的抗菌膜有待研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种3D打印梯度抗菌膜、制备方法及其应用，提高微生物菌株运动状态的可观察性。
本发明的技术方案是，一种3D打印梯度抗菌膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)取海藻酸和果胶，加入甘油和蒸馏水，搅拌均匀，制得浓度均一致的若干组混合液I；
(2)取壳聚糖溶于乙酸溶液，制得具有壳聚糖浓度梯度的若干组混合液II；
(3)将若干组混合液II一一对应添加至若干组混合液I中，搅拌均匀成胶体状态，制得具有壳聚糖浓度梯度的若干组3D打印原料；
(4)将若干组3D打印原料分别通过3D打印制得若干个薄膜片，将若干个薄膜片按壳聚糖浓度梯度从小到大依次无间隙地拼接，然后在CaCl2溶液中浸泡，取出后烘干，制得3D打印梯度抗菌膜。
优选的，步骤(1)中，海藻酸、果胶、甘油和蒸馏水的质量比为1-2:1-3:0.2-0.4:90-100。
优选的，步骤(2)中，所述乙酸溶液的质量分数为1-2％，混合液II的壳聚糖质量分数梯度范围为0-20％，相邻梯度的混合液II的壳聚糖质量分数差值为4-5％。所述壳聚糖的质量分数可以为0，因为该抗菌膜是由若干组具有壳聚糖梯度的膜拼接而成，所以有一组壳聚糖的质量分数为零，并不影响整个抗菌膜具有浓度梯度的性质。
优选的，步骤(3)中，3D打印参数为：打印速度为30-50mm/s，喷嘴孔径为0.5-0.7mm，填充率80-100％，壁厚1.0-1.4mm。具体3D打印的参数依据所需膜的厚度及尺寸根据现有技术做适应性调整即可。
优选的，步骤(4)中，CaCl2溶液的质量分数为1-3％，浸泡时间为3-5min，烘干温度为30-40℃，烘干时间为2-3h。CaCl2溶液的浸泡作以使薄膜性质更稳定。
优选的，3D打印梯度抗菌膜在观察微生物菌株运动状态上的应用，包括以下步骤：
(1)取待检菌体的培养物，溶于质量分数为0.7-0.9％的NaCl溶液，配制成浊度为10-20麦氏单位的浓菌悬液；
(2)称取琼脂粉，溶于质量分数为0.7-0.9％的NaCl溶液，制得半固体培养基；
(3)将半固体培养基在120-125℃下高温灭菌15-20min，然后再紫外灭菌20-30min；
(4)在无菌操作条件下，将步骤(3)制得的半固体培养基冷却至50-60℃，倒入培养皿中，然后接种浓菌悬液，混合均匀；
(5)将3D打印抗菌梯度膜放入步骤(4)制得的培养皿中，制得实验组，并重复步骤(1)-(4)制得无3D打印抗菌梯度膜的空白组；
(6)将步骤(5)制得的实验组和空白组均置于35-37℃条件下培养，每隔3-4h观察一次培养基的浊度变化；
(7)用相差显微镜观察实验组和空白组中浊度变化区域的直径，以空白组为参照观察微生物菌株细胞的运动形态。
优选的，步骤(2)中，半固体培养基中琼脂粉的质量分数为0.2-0.7％。
优选的，步骤(4)中，半固体培养基和浓菌悬液的体积比为200-400：1-3。
现有技术暂未用3D打印技术来探究微生物菌株的运动行为在3D打印领域和微生物领域，以往研究微生物菌株趋向性的行为主要有：趋化性、趋光性、趋地性、趋磁性、趋氧性等。本方案采用的是趋糖性，微生物菌株对氨基酸以及糖的趋化性是由位于细胞表面的受体蛋白调节的，并由细胞内分子传递信号最终影响微生物菌株的运动。趋向性行为的输出信号是微生物菌株的运动方向，表明运动状态的决定者是微生物菌株自带的螺旋桨一鞭毛。
在本发明中采用半固体培养基且通过做梯度膜的形式来研究微生物菌株的运动行为，摒弃的以往只能在液体培养基中用液体浓度梯度的化合物探究微生物菌株的趋向性运动。由于具有多聚阳离子的壳聚糖会与微生物菌株细胞膜上的负电荷相吸引，而导致胞内蛋白酶的泄露，我们用壳聚糖做抗菌梯度膜，研究微生物菌株的趋向性，在现有技术中是没有的，微生物菌株本能的状态会远离对自身有害的物质，在半固体培养基中加入对微生物菌株不利的梯度膜，进而观察微生物菌株的运动行为。
通过3D打印做膜，可以实现对膜的厚度、大小、形状等得到精确化的控制，是用传统的流延法、电纺法制膜所不能比拟的。3D打印通过熔融挤出技术，将备至好的打印材料，通过预先设置好的模型参数，按照原有的路径进行打印，可以实现数量、大小、形状的均一化，高效省时。置换不同的梯度打印材料和打印路径，可以实现其膜的梯度化。若用相同的材料以流延法制膜首先，制膜的过程耗时、大小形状的不可控；其次，是形状单一无变化；最后，无法实现膜的梯度化。在本发明中以海藻酸钠和果胶为打印基材，通过加入不同浓度梯度的壳聚糖，是打印基材实现其抗菌梯度。由于壳聚糖具有多聚阳离子，会与微生物菌株细胞膜上的负电荷相吸引，但微生物菌株本能的反应会远离对自身不利的化合物，通过3D打印制得的梯度膜，研究其对微生物菌株运动行为影响，进而观察微生物菌株的运动状态。
本发明的有益效果是：
(1)本发明制备的具有浓度梯度的3D打印抗菌膜，基于微生物对外界环境刺激的反应原理，通过菌株对不同浓度变化的壳聚糖的趋化响应，进而观察其运动状态；
(2)本发明采用的壳聚糖具有的多聚阳离子与微生物菌株细胞膜上负电荷的相互作用，使细胞内的蛋白酶和其他成分泄漏，从而达到抗菌、杀菌作用，进而壳聚糖浓度梯度越高，则其阳离子吸附的微生物菌株越多，逃离的微生物菌株会越少，会抑制微生物菌株的运动，在宏观上变现为浊度较为清晰，进而观察微生物菌株的运动轨迹；
(3)本方案用3D打印梯度抗菌膜来探究微生物菌株的运动行为，通过研究微生物菌株趋糖性，微生物菌株对氨基酸以及糖类化合物的趋化性是由位于细胞表面的受体蛋白调节的，并由细胞内分子传递信号最终影响微生物菌株的运动，用具有抑菌作用的壳聚糖来探究微生物菌株的趋向性，进而观察微生物菌株的运动状态。
附图说明
图1为3D打印梯度抗菌膜；
图2为大肠杆菌在半固体培养基中，实验组与空白组的浊度直径变化；
图3为酵母菌在半固体培养基中，实验组与空白组的浊度直径变化。
具体实施方式
下面进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
(1)取海藻酸和果胶，加入甘油和蒸馏水，搅拌均匀，制得五组混合液I，海藻酸、果胶、甘油和蒸馏水的质量比为1：3：0.4：300；
(2)取壳聚糖溶于质量分数为2％的乙酸溶液，制得若干组具有质量分数梯度的混合液II，若干组所述混合液II的壳聚糖质量分数梯度范围为0-20％，相邻质量分数梯度的混合液II的壳聚糖质量分数的差值为5％，具体为0、5％、10％、15％、20％；
(3)将步骤(2)制得的若干组混合液II一一对应添加至若干组混合液I中，搅拌均匀成胶体状态，制得若干组3D打印原料；
(4)将若干组3D打印原料分别通过3D打印制得若干个薄膜片，将若干个所述薄膜片按壳聚糖质量分数梯度从小到大依次无间隙地拼接在一起；将拼接好的梯度抗菌膜放置在3％的CaCl2溶液中浸泡交联5min，烘干后制得一张可观察细菌运动状态的3D打印梯度抗菌膜；
3D打印参数的设置：选择一个小正方体模型，在cura软件上设置参数为1.0*1.5*0.2cm大小的模型，打印速度为50mm/s，喷嘴孔径为0.7mm，填充率100％，壁厚1.0-1.4mm；
具体打印步骤为：将步骤(3)中配制好的3D打印材料放入料筒，旋紧铝盖，完成填料工作；将气管一头插入快插头，另外一头连接调压阀的出气端；打开气阀，此时材料在气压的推力下进入挤出机的大套筒部位(铝块)。通过预先设定好的程序控制电机转动，电机通过联轴器和轴承带动螺杆转动，精确控制材料的挤出；在选择(3)中我们预先设置好的模型参数，点击“打印”键，3D打印机(ZD-2000A；深圳占东实业有限公司)就会按照预先设置的模型路径完成打印过程。
应用方法：
(1)取大肠杆菌的培养物，溶于质量分数为0.9％的NaCl溶液，配制成浊度为20麦氏单位的浓菌悬液；
(2)称取琼脂粉，溶于质量分数为0.9％的NaCl溶液，制得半固体培养基，半固体培养基中琼脂粉的质量分数为培养基的0.7％；
(3)将半固体培养基在135℃下高温灭菌20min，然后再紫外灭菌30min；
(4)在无菌操作条件下，将步骤(3)制得的半固体培养基冷却至60℃，倒入培养皿中，然后接种100ul步骤(1)制得的浓菌悬液，混合均匀，半固体培养基和浓菌悬液的体积比为400：3；
(5)将3D打印抗菌梯度膜放入步骤(4)制得的培养皿中，制得实验组，并重复步骤(1)-(4)制得无3D打印抗菌梯度膜的空白组；
(6)将步骤(5)制得的实验组和空白组均置于37℃条件下培养，每隔4h观察一次培养基中膜的不同浓度梯度的浊度变化，梯度膜中其细菌浊度变化的直径为10mm，无梯度膜的空白组的变化直径为4mm；
(7)用相差显微镜观察实验组和空白组中浊度变化区域的直径，以空白组为参照并观察细菌细胞的运动形态。
如图2所示，上方的图形代表大肠杆菌在梯度浓度膜中扩散的范围。由于，大肠杆菌为革兰氏阴性菌，其细胞壁中的肽聚糖层薄，为结构结构疏松的二维平面，当与含有不同浓度梯度的壳聚糖膜接触式，大肠杆菌膜上接收到的信号会有远离其梯度膜的趋势，在半固体培养基上用显微镜观察表现出其浊度直径较大且变化速度较快；下方图形代表大肠杆菌在没有浓度梯度膜的情况下的运动状态，由于微生物菌株的趋糖性会有向四周营养物质扩散的趋势，但其扩散速度慢，表现为浊度直径变化速度慢且直径较小。
实施例2
(1)取海藻酸和果胶，加入甘油和蒸馏水，搅拌均匀，制得六组混合液I，海藻酸、果胶、甘油和蒸馏水的质量比为1：1：0.2：300；
(2)取壳聚糖溶于质量分数为1％的乙酸溶液，制得若干组具有质量分数梯度的混合液II，若干组所述混合液II的壳聚糖质量分数梯度范围为0-20％，相邻质量分数梯度的混合液II的壳聚糖质量分数的差值为4％，具体为0、4％、8％、12％、16％、20％；
(3)将步骤(2)制得的若干组混合液II一一对应添加至若干组混合液I中，搅拌均匀成胶体状态，制得若干组3D打印原料；
(4)将若干组3D打印原料分别通过3D打印制得若干个薄膜片，将若干个所述薄膜片按壳聚糖质量分数大小,从小到大依次无间隙地拼接在一起；将拼接好的梯度抗菌膜放置在1％的CaCl2溶液中浸泡交联3min，烘干后制得一张可观察细菌运动状态的3D打印梯度抗菌膜。
3D打印参数的设置：选择一个小正方体模型，在cura软件上设置参数为1.0*1.5*0.2cm大小的模型，打印速度为30mm/s,喷嘴孔径为0.5mm，填充率80％，壁厚1.0mm；
具体打印步骤为与实施例1一致。
应用方法：
(1)取金黄色葡萄球菌的培养物，溶于质量分数为0.7％的NaCl溶液，配制成浊度为10麦氏单位的浓菌悬液；
(2)称取琼脂粉，溶于质量分数为0.7％的NaCl溶液，制得半固体培养基，半固体培养基中琼脂粉的质量分数为培养基的0.2％；
(3)将半固体培养基在121℃下高温灭菌15min，然后再紫外灭菌20min；
(4)在无菌操作条件下，将步骤(3)制得的半固体培养基冷却至50℃，倒入培养皿中，然后接种50ul步骤(1)制得的浓菌悬液，混合均匀，半固体培养基和浓菌悬液的体积比为200：1；
(5)将3D打印抗菌梯度膜放入步骤(4)制得的培养皿中，制得实验组，并重复步骤(1)-(4)制得无3D打印抗菌梯度膜的空白组；
(6)将步骤(5)制得的实验组和空白组均置于35℃条件下培养，每隔4h观察一次培养基中膜的不同浓度梯度的浊度变化，梯度膜中其细菌浊度变化的直径为5mm，无梯度膜的空白组的变化直径为2mm；
(7)用相差显微镜观察实验组和空白组中浊度变化区域的直径，以空白组为参照并观察细菌细胞的运动形态。
金黄色葡萄球菌在浓度梯度膜上的浊度直径变化较大肠杆菌的变化较小，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，其细胞壁肽聚糖层较厚，为牢固的三维网状结构。细胞膜表面上的化学受体对接收浓度梯度壳聚糖刺激的信号较弱，故微生物菌株鞭毛运动缓慢，向四周运动的的范围较小，在显微镜下表现为浊度直径小，且变化速度慢。
实施例3
(1)取海藻酸和果胶，加入甘油和蒸馏水，搅拌均匀，制得五组混合液I，海藻酸、果胶、甘油和蒸馏水的质量比为1：2：0.3：300；
(2)取壳聚糖溶于质量分数为1.4％的乙酸溶液，制得若干组具有质量分数梯度的混合液II，若干组所述混合液II的壳聚糖质量分数梯度范围为0-20％，相邻质量分数梯度的混合液II的壳聚糖质量分数的差值为5％，具体为0、5％、10％、15％、20％；
(3)将步骤(2)制得的若干组混合液II一一对应添加至若干组混合液I中，搅拌均匀成胶体状态，制得若干组3D打印原料；
(4)将若干组3D打印原料分别通过3D打印制得若干个薄膜片，将若干个所述薄膜片按壳聚糖质量分数梯度从小到大依次无间隙地拼接在一起；将拼接好的梯度抗菌膜放置在3％的CaCl2溶液中浸泡交联4min，烘干后制得一张可观察细菌运动状态的3D打印梯度抗菌膜；
3D打印参数的设置：选择一个小正方体模型，在cura软件上设置参数为1.0*1.5*0.2cm大小的模型，打印速度为35mm/s，喷嘴孔径为0.6mm，填充率90％，壁厚1.2mm；
具体打印步骤为与实施例1一致。
应用方法：
(1)取酵母菌的培养物，溶于质量分数为0.8％的NaCl溶液，配制成浊度为15麦氏单位的浓菌悬液；
(2)称取琼脂粉，溶于质量分数为0.8％的NaCl溶液，制得半固体培养基，半固体培养基中琼脂粉的质量分数为培养基的0.5％；
(3)将半固体培养基在128℃下高温灭菌17min，然后再紫外灭菌25min；
(4)在无菌操作条件下，将步骤(3)制得的半固体培养基冷却至56℃，倒入培养皿中，然后接种70ul步骤(1)制得的浓菌悬液，混合均匀，半固体培养基和浓菌悬液的体积比为150：1；
(5)将3D打印抗菌梯度膜放入步骤(4)制得的培养皿中，制得实验组，并重复步骤(1)-(4)制得无3D打印抗菌梯度膜的空白组；
(6)将步骤(5)制得的实验组和空白组均置于36℃条件下培养，每隔3h用显微镜观察一次培养基不同浓度梯度膜的浊度变化，梯度膜中其酵母菌浊度变化的直径为6mm，无梯度膜的空白组的变化直径为3mm；
(7)用相差显微镜观察实验组和空白组中浊度变化区域的直径，以空白组为参照并观察细菌细胞的运动形态。
如图3所示，酵母菌在浓度梯度膜的浊度直径变化较空白组的变化较大。酵母菌为真核微生物，真菌细胞膜上专一性化学受体在接收到梯度壳聚糖的刺激后，并未像大肠杆菌那样反应剧烈向四周快速扩散，当糖被接收到壳聚糖的刺激信号后，会向其细胞内的胞蛋白传递信息，胞内蛋白通过控制鞭毛的运动状态，从而使微生物菌株向四周扩散。刺激信号从胞外到传递给鞭毛，比微生物菌株的传递速度较慢，因此其浊度直径较大肠杆菌小，且变化速度也相对较慢。
本文采用3D打印具有浓度梯度的抗菌膜和微生物对外界环境刺激的反应相结合的方法，研究了不同菌株(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌)对不同浓度变化的壳聚糖的趋化响应。大肠杆菌与金黄色葡萄球菌分别是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的代表，酵母菌是真核微生物的代表，酵母菌可以对比3D打印的浓度梯度膜对细菌和真菌运动行为的差异性影响。
通过大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母菌对不同浓度变化的壳聚糖的趋化响应，其结果表明大肠杆菌的运动轨迹较其他两种菌更为明显，因为革兰氏阴性菌的细胞壁是结构疏松的二维平面，对具有多聚阳离子的壳聚糖的刺激反应更为剧烈，细菌逃离梯度膜的趋势也就更明显，因此运动的轨迹较大，也更明显。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种3D打印梯度抗菌膜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)取海藻酸和果胶，加入甘油和蒸馏水，搅拌均匀，制得浓度均一致的若干组混合液I；
(2)取壳聚糖溶于乙酸溶液，制得具有壳聚糖浓度梯度的若干组混合液II；
(3)将若干组混合液II一一对应添加至若干组混合液I中，搅拌均匀成胶体状态，制得具有壳聚糖浓度梯度的若干组3D打印原料；
(4)将若干组3D打印原料分别通过3D打印制得若干个薄膜片，将若干个薄膜片按壳聚糖浓度梯度从小到大依次无间隙地拼接，然后在CaCl2溶液中浸泡，取出后烘干，制得3D打印梯度抗菌膜。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，海藻酸、果胶、甘油和蒸馏水的质量比为1-2:1-3:0.2-0.4:90-100。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，乙酸溶液的质量分数为1-2％，混合液II的壳聚糖质量分数梯度范围为0-20％，相邻梯度混合液II的壳聚糖质量分数差值为4-5％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，CaCl2溶液的质量分数为1-3％，浸泡时间为3-5min，烘干温度为30-40℃，烘干时间为2-3h。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法制得的3D打印梯度抗菌膜。
6.根据权利要求5所述的3D打印梯度抗菌膜在观察微生物菌株运动状态上的应用。
7.根据权利要求6所述的3D打印梯度抗菌膜在观察微生物菌株运动状态上的应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取待检菌体的培养物，溶于质量分数为0.7-0.9％的NaCl溶液，配制成浊度为10-20麦氏单位的浓菌悬液；
(2)称取琼脂粉，溶于质量分数为0.7-0.9％的NaCl溶液，制得半固体培养基；
(3)将半固体培养基在120-125℃下高温灭菌15-20min，然后再紫外灭菌20-30min；
(4)在无菌操作条件下，将步骤(3)制得的半固体培养基冷却至50-60℃，倒入培养皿中，然后接种浓菌悬液，混合均匀；
(5)将3D打印抗菌梯度膜放入步骤(4)制得的培养皿中，制得实验组，并重复步骤(1)-(4)制得无3D打印抗菌梯度膜的空白组；
(6)将步骤(5)制得的实验组和空白组均置于35-37℃条件下培养，每隔3-4h观察一次培养基的浊度变化；
(7)用相差显微镜观察实验组和空白组中浊度变化区域的直径，以空白组为参照观察微生物菌株细胞的运动形态。
8.根据权利要求7所述的3D打印梯度抗菌膜在观察微生物菌株运动状态上的应用，其特征在于，步骤(2)中，半固体培养基中琼脂粉的质量分数为0.2-0.7％。
9.根据权利要求7所述的3D打印梯度抗菌膜在观察微生物菌株运动状态上的应用，其特征在于，步骤(4)中，半固体培养基和浓菌悬液的体积比为200-400：1-3。
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