DE69830156T2

DE69830156T2 - Zusammensetzungen zur immunverstärkung von impfstoffen

Info

Publication number: DE69830156T2
Application number: DE69830156T
Authority: DE
Inventors: Julio Cesar Aguilar Rubido; Verena Lucila Muzio Gonzalez; Maria de Jes s LEAL ANGULO; Gerardo Enrique Guillen Nieto; Eduardo Penton Arias; Gloria Veliz Rios; Dagmara Pichardo Diaz; Antonieta Herrera Buch; Enrique Habana del E. IGLESIAS PEREZ; Luis Javier Cruz Ricondo; Tania Carmenate Portilla; Cirse Guanabacoa MESA PARDILLO; Maydel Lawton HECHAVARRIA GAY; Maylin Diaz Martinez; Juan Joel Playa MADRAZO PINOL
Original assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Current assignee: Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia CIGB
Priority date: 1997-03-06
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2006-01-26
Anticipated expiration: 2018-03-06
Also published as: CA2283344A1; WO1998039032A1; EP0971737A1; CN1161154C; EP0971737B1; ES2241122T3; HK1026626A1; AR009866A1; AU6607798A; BR9808832A; DE69830156D1; ZA981897B; ATE295182T1; MY132817A; CN1252002A; CU22629A1; US6355414B1

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, insbesondere die Entwicklung von neuen immunologischen Potenzierungszubereitungen, die eine Erhöhung der Intensität und Qualität der Immunantwort auf Impfstoffantigene ermöglicht.
Das technische Ziel der vorgeschlagenen Erfindung ist die Entwicklung von Zubereitungen, die in der Lage sind, das Ausmaß der Immunantwort des Körpers auf Impfstoffantigene zu erhöhen und/oder zu modulieren.
Stand der Technik
Adjuvantien sind Substanzen, die die Immunantwort auf Antigene, welche auf mucosalem oder systemischem Weg eingeimpft werden, erhöhen oder optimieren. Die Adjuvantien oder ihre Zubereitungen werden mit dem Antigen kombiniert, wobei die gewünschte Art der Reaktion erzeugt oder potenziert wird, die Zahl der Impfungen abnimmt und die Menge des Antigens, die benötigt wird, um einen Schutz zu erhalten und aufrechtzuerhalten, reduziert wird (McElrath, M.C., 1995, Seminars in Cancer Biology 6: 375-385).
Adjuvantien wurden aufgrund der Notwendigkeit entwickelt, die durch den Fortschritt der modernen Biotechnologie mit der Produktion von reinen löslichen rekombinanten und synthetischen Antigenen erwächst. Im Allgemeinen sind diese Antigene unbedenklich, weisen jedoch im Vergleich zu denjenigen des ursprünglichen Organismus eine reduzierte Immunogenität auf. Eine wichtige Funktion von Adjuvantien oder ihren Zubereitungen besteht darin, die Komplexi tät des Antigens, das dem Immunsystem gegenübertritt, in unbedenklicher Weise zu erhöhen und dadurch seine Immunogenität zu erhöhen (Alving, R.C. 1992 AIDS Res. Hum. Retroviruses 8 (8): 1427-1430).
Zur Zeit ist die Suche nach neuen Adjuvantien und immunologischen Stimulatoren sowie die Entwicklung neuer Methoden zur Abgabe von Antigenen und Pharmaka eine der Hauptlinien der Forschung in der Welt im pharmazeutischen Bereich, insbesondere bei Impfstoffen. Die Entwicklung der Adjuvantien für die mucosale Verwendung ist eine derzeitige Notwendigkeit im Impfstoffbereich (Report of the Expert Panel VI: Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996, Vaccine 14: 644-664).
Die Adjuvantien können in mucosale und systemische Adjuvantien eingeteilt werden, in Anbetracht der Tatsache, dass die physiologischen Merkmale bei der Aufnahme und Verarbeitung des Antigens auf beiden Impfwegen verschiedene Vorgänge der Adjuvanswirkung erzeugen. Der mucosale Weg erfordert gemäß den Merkmalen des Antigens Bindungs- oder Beschichtungsvorgänge mit speziellen Liganden, die die Antigene zu den M-Zellen senden. Die Adjuvanswirkung für mucosale Antigene wird durch Strategien erhalten, die dem Antigen helfen, die auf diesem Weg liegenden Barrieren zu überqueren. Die physikalischen Merkmale des Antigens können seine Phagocytose begünstigen. Sobald das Antigen assimiliert wurde, kann das Adjuvans die Antwort nach einem der bekannten Mechanismen beeinflussen: die Adsorption des Antigens, den Ablagerungseffekt, die Cytokininduktion, die Aktivierung des Komplementsystems, die Rekrutierung verschiedener Zellpopulationen des Immunsystems, die Abgabe von Antigen an verschiedene antigenpräsentierende Zellen, die Regulation der Expression durch Klasse I oder Klasse II und die Stimulation der Produktion von verschiedenen Untertypen von Antikörpern (McElrath, M.C., 1995, Seminars in Cancer Biology 6: 375-385).
Einige der immunologischen Stimulatoren, die als Muramyldipeptid (MDP), Monophosphoryllipid A (MPL) und das Lipoidamin Avridin bekannt sind, und diejenigen, die als Toxine von V. cholerae (CT) und E. coli (HLT) bekannt sind, sind anerkannte Adjuvantien für Antigene, die über den mucosalen Weg verabreicht werden (Walker, R.I., 1994, Vaccine 12 (5): 387-400).
MDP und MPL wurden in liposomalen Zubereitungen für die therapeutische und prophylaktische Verwendung untersucht, doch sind die Toxine und ihre Untereinheiten (insbesondere CT und CTE) die gebräuchlichsten mucosalen Adjuvantien.
Die Fähigkeit von CT, als orales Adjuvans zu wirken, wurde durch eine große Zahl von Forschern bestätigt (McGhee, J.R. et al., 1992; Vaccine 10 (2): 75-88). Das Choleratoxin erfüllt nicht die klassische Definition eines Adjuvans, da es eine Immunantwort gegen sich selbst stimuliert, und seine Adjuvanswirkung hängt von seiner Immunogenität ab (Elson, C.O., 1987, Fed. Proc. 46: 1778). Die immunmodulierenden Wirkungen von CT und HLT, die ihre starke Adjuvanswirkung erklären, beinhalten die Verstärkung der Präsentation des Antigens durch mehrere Typen von B-Zellen, die Verstärkung bei der Differenzierung von B-Zellen zum IgA-Isotyp, die Wechselwirkung mit T-Zellen und die Produktion von Cytokinen (Lintermans, P., 1995, Advanced Drug Delivery Reviews 18: 73-89).
Unter praktischen Gesichtspunkten ist die Verwendung des Holotoxins beim Menschen aufgrund seiner Toxizität nicht möglich. Eine bessere Strategie ist die Detoxifizierung von CT durch Abtrennen der Untereinheit A oder durch Mutationen des Gens, das das Toxin codiert. CT sowie CTB (nichttoxische Untereinheit) können die Immunantwort auf mehrere Antigene potenzieren, die aufgrund von spezifischen Wechselwirkungen mit M-Zellen kovalent gebunden sind (Holmgren, J., et al., 1993, Vaccine 11: 1179-1184).
Die Antigenabgabesysteme haben einen ausreichend hohen Grad der Entwicklung erreicht, so dass sie einen starken Einfluss auf die Immunisierung haben. Es wird erwartet, dass die festen teilchenförmigen Systeme für die parenterale oder nichtparenterale Verabreichung zu den ersten lizenzierten Produkten gehören sollten (Li Wan Po et al., 1995, Advanced Drug Delivery Reviews 18: 101-109).
Durch die Möglichkeiten, die die Antigenabgabesysteme bei der Partikulierung von löslichen Antigenen bieten, und unter Ausnutzung der physiologischen Merkmale des mucosalen Wegs wurden diese Systeme getestet und zeigten Adjuvanswirkung. In der Literatur wurden sie klassifiziert als: a) synthetisch/inaktiviert und b) lebend (Report of the Expert Panel VII: Vaccine Delivery Systems 1996, Vaccine 14: 644-664).
In Bezug auf die erste Gruppe wurden die künstlichen polymeren Teilchen mit verschiedenen Ergebnissen untersucht, darunter: die copolymeren Mikrosphären von Milch- und Glycolsäure, auch alternative Polymere als Polyphosphazene, Celluloseacetat-Polymere, Iminocarbonate, Ethylen-Vinylacetat-Polymere, Proteinoid-Mikrosphären, Dextran-Polyanhydrid und Nanosphären; Teilchen, die aus natürlichen Materialien erzeugt werden: Alginate, Gelatinen und Samen von Pflanzen sowie auch Liposomen und ihre Varianten: Proteoliposomen, Virosomen und ISCOMs (Li Wan Po et al., 1995, Advanced Drug Delivery Reviews 18: 101-109).
Die Größe der Teilchen gehört zu den wichtigen Faktoren bei der Antigenabgabe. Im Falle des mucosalen Immunisierungswegs wurde berichtet, dass Teilchen mit einem Durchmesser von mehr als 10 μm nicht resorbiert werden (Eldridge J.H., 1990, J. Control. Release 11: 205-214). Bei Experimenten mit Ratten wurde beobachtet, dass nach einer oralen Verabreichung nur Teilchen von 5 μm tief in die Peyerschen Plaques eindrangen und solche mit einem Durchmesser von 1 μm in die Lymphknoten und die Leber eindrangen und in den Blutstrom übergingen (Jani, P. et al., 1990, J. Pharm. Pharmacol. 42: 821-826; Alpar, H.O. et al., 1989, J. Pharm. Pharmacol. 41: 194-196).
Die Extrapolation dieser Ergebnisse auf den Menschen ist noch nicht definiert, und zuweilen ist die Adsorption durch den Magen-Darm-Trakt für die Adjuvanswirkung nicht erforderlich, obwohl bewiesen wurde, dass bei einer Adsorption des Diphtherie-Toxoids an Pflanzensamen von bis zu 2 mm Durchmesser die Immunantwort potenziert wurde (Mirchamski, H. et al., 1994, Vaccine 12: 1167-1172).
Die Bestimmung der optimalen Größe der Systeme für gesteuerte Freisetzung auf dem oralen, rektalen oder vaginalen Weg wird gerade untersucht (Li Wan Po et al., 1995, Advanced Drug Delivery Reviews 18: 101-109).
Ein weiterer Faktor, der die Teilchen beeinflusst, ist das Hydrophobie-Hydrophilie-Gleichgewicht, das so modifiziert werden kann, dass man eine Modulation der Immunantwort erhält (Jani, P. et al., 1990, J. Pharm. Pharmacol. 42: 821-826).
Vor kurzem wurde die Verwendung von Impfstoffen in Form von Proteincochleaten, die 1975 beschrieben wurde, patentiert (Papahadjopoulos D. et al., 1975, Biochem. Biophys. Acta 394: 483). Cochleate sind Komplexe von Liposomen und zweiwertigen Kationen (hauptsächlich Calcium), die durch die Calcium-Phospholipid-Wechselwirkung die Bildung einer spiralig aufgerollten Liposomenstruktur ermöglichen, was eine Immunisierung auf verschiedenen Wegen erlaubt (Gould Foguerite, S., WO 95/09648). Mit dieser Struktur werden die Immunantwort von Antikörpern sowie die zellvermittelten Reaktionen stimuliert (Gould Foguerite, S., 1994, AIDS Res. Hum. Retroviruses 10 (Suppl. 2): 599-5103).
Die Resorption und Passage der Antigene durch spezialisierte Zellen des Epithels, das mit dem lymphoiden Follikel assoziiert ist, die M-Zellen (Microfold), ist ein entscheidender Schritt bei der Erzeugung einer Immunantwort durch das einschichtige Darmepithel, was von allen Autoren allgemein anerkannt wird. Durch diesen Vorgang werden die Antigene zur Basalmembrantasche der M-Zellen geschickt, was den ersten Kontakt des (praktisch unzersetzten) Antigens mit B- und T-Zellen und Makrophagen darstellt. Die Hauptfunktion der Tasche besteht darin, den Organismus mit einer Umgebung zu versehen, die vor dem modulierenden Einfluss von externen humoralen Faktoren geschützt ist (Neutra, R.M., 1996, Annu. Rev. Immunol. 14: 275-300).
In den Atemwegen variiert das Epithel von mehrreihig zu einschichtig. In den Bronchien, der Zone mit einschichtigem Epithel, sind die interzellulären Zwischenräume durch enge Bindungen versiegelt, und der Hauptmechanismus für den Eintritt der Antigene ist ein Eintritt durch die M-Zellen. Das vorwiegende Epithel an den Mandeln ist das mehrschichtige Epithel. Hier ist der Resorptionsmechanismus des Antigens eng mit einem Netz von Makrophagen und mobilen dendritischen Zellen aus dem Knochenmark von bis zu 700 Zellen pro mm² verbunden. Diese Zellen sind in der Lage, zum organisierten lymphoiden Gewebe, das mit der Schleimhaut assoziiert ist (O-MALT), oder zu einem Lymphknoten zu wandern, wo sie das prozessierte Antigen, das auf der Oberfläche der Mandeln phagozytiert wurde, präsentieren. Unter normalen Bedingungen bildet dies den Hauptmechanismus für die Präsentation der Antigene durch MHC-Klasse II der Atemwege (Neutra, R.M., 1996, Annu. Rev. Immunol. 14: 275-300).
Der Unterschied in der Resorption des Antigens im Mundschleimhaut- und Nasenrachenbereich erlaubt es uns, zu verstehen, warum die Impfung mit einem Adjuvans über beide Wege nicht notwendigerweise zu denselben Ergebnissen führt. Daher ist es nicht offensichtlich, ob ein Adjuvans, das über den oralen Weg effektiv ist, auch auf dem Nasenrachenweg effektiv sein wird oder nicht. Die Adjuvantien können an verschiedenen Schleimhautstellen unterschiedliche Wirkungen haben, da verschiedene Schleimhautoberflächen unterschiedliche Mikroumgebungen haben. Der Fortschritt in der Kenntnis der Physiologie der Schleimhäute und der Wirkungsweise der Adjuvantien kann die Entwicklung von effektiveren Schleimhautimpfstoffen unterstützen, und die Merkmale des Antigens, wie Größe, Anwesenheit von Schleimhautliganden, elektrische Ladung, Lipophilie und T-Abhängigkeit, können ebenfalls die Immunantwort beeinflussen (Report of the Expert Panel VI: Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996, Vaccine 14: 644-664).
Gleichzeitig beeinflussen auch andere Elemente des Organismus, wie die hormonellen Fluktuationen während des Menstruationscyclus, die Assimilation des Antigens in der Vagina. Diese Tatsache zeigt die enge Zusammenarbeit zwischen den dendritischen und epithelialen Zellen und erklärt die Variation der Effektivität der Impfstoffe auf dem vaginalen Weg (Parr, E.L., Parr, M.B., 1992, Vaccine Res. 1: 221-25).
Im Falle des Wegs über das einschichtige Epithel des Darms ist die Abgabe von nichtlebenden Impfstoffen an die M-Zellen schwierig, in Anbetracht der Tatsache, dass die ungeschützten Makromoleküle leicht verdaut oder von den Sekreten und der Motilität des Magen-Darm-Trakts mitgeschleppt werden. In Bezug auf die Komponenten der apikalen Membran der M-Zellen, die als Rezeptoren dienen können, stehen nur wenig Informationen zur Verfügung. Die Liposomen und die Mikroteilchen können durch hydrophobe Wechselwirkungen an den Schleimhautoberflächen haften, aber der Eintritt der Antigene in die M-Zellen ist ineffizient, da sie schnell in den Schleimhautgelen eingefangen werden, und viele schaffen es nicht, die Schleimhaut zu erreichen. Bei Makromolekülen oder Teilchen, die mit Liganden konjugieren oder überzogen werden, wie CTB, gibt es den beschränkenden Faktor des Zugangs zu den Rezeptoren (Neutra, R.M., 1996, Cell 86: 345-348).
Neuere Experimente bei Mäusen unter Verwendung von CTB-beschichteten kolloidalen Goldteilchen von 28,8 nm zeigten, dass diese in der Lage waren, an M-Zellen des mit dem Schleimhautfollikel assoziierten Epithels anzuhaften und selektiv in diese einzudringen, aber nicht in der Lage waren, in die Enterocyten des sogenannten "Bürstensaums" einzudringen. Größere Teilchen von ungefähr 1,13 μm, die ebenfalls mit CTB beschichtet waren, waren nicht in der Lage, an M-Zellen anzuhaften, während CTB-FITC-Teilchen von ungefähr 6,4 nm an beiden Zelltypen anhafteten und in diese eindrangen. Dieses Experiment bewies die Rolle der Glycokalyx beim Anhaften und Eindringen der Antigene durch die M-Zellen. Die B-Untereinheit des Cholera-Toxins weist Rezeptoren sowohl bei den Enterocyten als auch bei den M-Zellen auf. Die Verwendung der an Teilchen gebundenen Liganden kann zu einem spezifischen Anhaften an M-Zellen führen, aber nur in einem Größenbereich, der durch die Glycokalyx beschränkt ist. Teilchen von 1 μm oder mehr erfordern Liganden, die spezifisch gegen Komponenten der M-Zellen gerichtet sind. Die Identifikation dieser Komponenten wird noch untersucht (Frei, A. et al., 1996, J. Exp. Med. 184: 1045-1059).
Eine Gruppe von pathogenen Bakterien ist in der Lage, die Schwierigkeiten der effizienten Assimilation von nichtlebenden Systemen aufgrund des Fehlens von Rezeptoren an den M-Zellen zu überwinden. Diese Bakterien nutzen diesen Mechanismus aus, um Schleimhautgewebe zu infizieren und sich systemisch auszubreiten, bevor sie vom Immunsystem aufgehalten werden. Die bakteriellen Pathogene, die an der Oberfläche der M-Zellen haften, lösen die Signaltransduktionsereignisse auf dem Epithelniveau aus, die ihr Eindringen begünstigen. Das am besten bekannte ist dasjenige von abgeschwächten Bakterienstämmen von S. typhi ty21a, für das eine Wechselwirkung des Lectin-Typs mit den Rezeptoren des Polysaccharid-Typs der Zellmembran von M-Zellen stattfindet. Ebenfalls sicher und effektiv sind die abgeschwächten lebenden Stämme von V. cholerae und des Poliovirus für die orale Immunisierung. Die genetisch. manipulierten Stämme dieser Mikroorganismen wurden zuerst beim Menschen als Träger von heterologen Antigenen verwendet (Mekalanos, J.J., 1992, Adv. Exper. Med. Biol., New York Plenum Press: 43-50).
Die Biologie dieser lebenden Überträger führt neue Schwierigkeiten ein. Die Impfstämme von V. cholerae, die keine Gene für das Toxin aufweisen, können dennoch Durchfall erzeugen, anscheinend weil die Epithelzellen als Reaktion auf das Anhaften der Bakterien Cytokine freisetzen (Mekalanos, J.J., 1992, Adv. Exper. Med. Biol., New York Plenum Press: 43-50). Die Hauptschwierigkeit bei der Verwendung der genetisch manipulierten Stämme von 5. typhi und 5. typhimurium besteht darin, eine ausreichende Abschwächung, die Sicherheit bietet, und dennoch eine Haftung an den M-Zellen sowie ihre Proliferation in der Schleimhaut, um ihre Immunogenität aufrechtzuerhalten, zu erhalten. Die abgeschwächten Stämme von Shigella werden ebenfalls von den M-Zellen internalisiert, haben aber ihre Fähigkeit verloren, sich von Zelle zu Zelle auszubreiten. Dieses Phänomen ist die Basis der Abschwächung, aber es gibt immer noch die Freisetzung von lokalen Cytokinen und chemotaktischen Faktoren, die eine Zerstörung der normalen Funktion der Epithelbarriere verursachen können (Sansonetti, P.J., 1991, Rev. Infect. Dis. 13: 285-292).
In dieser Studie findet man auch Viren. Die Tatsache, dass sich das Poliovirus Typ 1 und der abgeschwächte Sabin-Stamm den Transport durch die M-Zellen zu Nutze machen, um die Epithelbarriere zu durchqueren, macht sie zu wichtigen Kandidaten für orale Impfstoffe, um fremde Antigene in den Menschen zu schicken. Das Vacciniavirus und andere Pockenviren werden von der Schleimhautoberfläche assimiliert, aber ihre Wechselwirkung mit den M-Zellen ist noch unbekannt (Report of the Expert Panel VI: Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996, Vaccine 14: 644-664).
Viele komplexe Kohlenhydrate natürlichen Ursprungs stimulieren die Zellen des Immunsystems und des Retikulum-Endothel-Systems (Davis, S.E., 1975, Am. Chem. Soc. Sympos. Series 15, Jeanes A., Hodge J. (Hrsg.), Am. Chem: Soc., Washington DC). Dazu gehören Polymere von Pflanzen und Pilzen, wie Glucane, Dextrane und Lentinane, die alle Glucosepolymere sind, und die Mannane, zu denen die Glucomannane und die Galactomannane gehören. Ebenso findet man die Levane und Xylane (Tizard, I.R., et al., 1989, Mol. Biother. 1: 290-296). Zu der Wirkung vieler dieser Polyglycane auf die Makrophagen (die Glucan- und Mannanrezeptoren aufweisen) gehören die Induktion von Phagocytose und die Sekretion von Cytokinen, Leukotrienen und Prostaglandinen. Lentinan, ein in essbaren Pilzen häufiges Glucan, stimuliert die Zell- und Antikörperreaktion bei Schaf-Erythrocyten, während Levan eine mitogene Wirkung auf B-Zellen hat und ein Makrophagenaktivator ist (Simon, P.M., 1994, Exp. Opin. Invest. Drugs 3 (3): 223-239).
Acemannan ist ein Mannan, das aus Mannose mit O-Acetylierungen bei ungefähr 8 von 10 Resten besteht. Es wird als Hauptkomponente der Schleimsubstanz oder des Gels der Blätter von Aloe barbadensis Miller extrahiert, einer Arzneipflanze, die während der gesamten Geschichte verwendet wurde. Verschiedene in-vitro-Tests weisen darauf hin, dass Mannane die Monocyten und Makrophagen aktivieren, die die Produktion von Interferon-γ, Tumornekrosefaktor α, Monocyten-Granulocyten-koloniestimulierenden Faktor, IL-1β und IL-6 induzieren (Peng, S.Y. et al., 1991, Mol. Biother. 3: 79-87). Acemannan potenziert die Bildung von cytotoxischen T-Lymphocyten (CTL) (Womble, D. et al., 1988, Int. J. Immuno-Pharmacol. 10: 967-974), die cytotoxische Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK) (Marshall, G.D. et al., 1993, J. Immunol. (Teil II) 150: Abstr. 1381) und in vitro auch geringfügig die humane Alloreaktion.
Die Erhöhung der cytotoxischen Wirkung und die Sekretion von γ-Interferon unterstützt die antivirale und antitumorale therapeutische Verwendung von Acemannan. Seine antiretrovirale Aktivität wurde im Fall von Katzenleukämie bei Tieren nachgewiesen (Sheets, M.A. et al., 1991, Mol. Biother. 3: 41-45). Klinische Tests bei AIDS- und Krebspatienten sind im Gange.
Vor kurzem wurden Patente in Bezug auf die Verwendung von Acemannan als Adjuvans für Impfstoffe angemeldet (McAnalley, B.H., EP 0 619 117 A2 , Nordgren, R.M. WO 93/14195), aber in keinem der beiden Fälle wird die Verwendung von Acemannan auf dem Nasenrachen-Weg geschützt. In beiden Patenten werden die Antigene auf dem systemischen Weg eingeimpft (subkutan und intramuskulär). In Bezug auf den mucosalen Weg zeigt das erste Patent schlechte Ergebnisse bei der oralen Verwendung einer Acemannanzubereitung. Das zweite Patent erweitert die Verwendung auf Augentropfen. Die mit einer oralen Acemannanzubereitung erhaltenen Ergebnisse (im ersten Patent gezeigt) können im Vergleich zu denjenigen, die auf dem systemischen Impfungsweg erhalten wurden, als schlecht angesehen werden. Wie bereits erklärt, können die Adjuvantien aufgrund der Physiologie der Assimilation des Antigens und der unterschiedlichen Umgebung auf jedem Weg, die die Aktivität des immunologischen Potentiators beeinflussen können, an den verschiedenen Schleimhautstellen verschiedene Wirkungen haben (Report of the Expert Panel VI: Concerted efforts in the field of mucosal immunology 1996, Vaccine 14: 644-664).
Neben den Unterschieden zwischen den mucosalen Wegen wurden auch verschiedene Ergebnisse erhalten, wenn dasselbe Adjuvans systemisch oder transmucosal verwendet wird. Dies gilt für das am meisten verwendete systemische Adjuvans, Aluminiumhydroxid. Dieses Adjuvans ist nicht effektiver als phosphatgepufferte Kochsalzlösung, wenn Mäuse auf dem oralen und nasalen Weg mit Antigenen geimpft werden, für die es das herkömmliche Adjuvans für die systemische Verwendung darstellt, wie zum Beispiel das Tetanus-Toxoid (Alpar H.O. et al., 1992, Int. J. of Pharm. 88: 335-344). Daher ist es nicht offensichtlich, ob ein systemisches Adjuvans notwendigerweise auch ein mucosales Adjuvans ist.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung berichten wir zum ersten Mal über eine Impfstoffzubereitung für die Nasenrachen-Verabreichung, die als Hauptkomponenten das Oberflächenantigen des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) und Acemannan in ausreichenden Anteilen aufweist.
Diese Zubereitung ist aufgrund der Eigenschaften, die aus ihrer mucosalen Verabreichung resultieren, eine Neuheit. Dies sind die Erzeugung einer systemischen Immunität von ähnlicher Intensität und höherer Qualität für gleiche Antigendosen, als man sie mit herkömmlichen Impfstoffzubereitungen erhält, bei denen Aluminiumhydroxid als Adjuvans verwendet wird. Außerdem wird eine starke Reaktion in der Schleimhaut erzeugt, was bei systemischen Impfungen mit HBsAg nicht erhalten wird.
Wir haben auch nachgewiesen, dass die Immunantwort bei systemischer Verwendung der Zubereitung von HBsAg mit Acemannan im Vergleich zu herkömmlichen Impfstoffzubereitungen, bei denen Aluminiumhydroxid als Adjuvans verwendet wird, sowohl quantitativ als auch qualitativ erheblich erhöht war.
Dies ist das erste Mal, dass die Verwendung des HBsAg als Antigenabgabesystem auf dem Nasenrachen-Weg in Kombination mit unspezifischen immunaktivierenden Polysacchariden beschrieben wird. Mit diesem System wurde für die auf seiner Oberfläche präsentierten Epitope eine gegenüber anderen Adjuvantien proportional erhöhte Reaktion erhalten. Dieses Ergebnis ermöglicht die Zubereitung von kombinierten Impfstoffen unter Verwendung des HBsAg als transmucosales Antigenabgabesystem. Es unterstützt auch die Verwendung dieser Strategie für die Kombination von löslichem Antigen/teilchenförmigem Antigen und seine Verwendung zusammen mit Polysacchariden, die diese Merkmale aufweisen, für transmucosale Impfungswege. Es wurde hier verallgemeinert, dass flüssige Zubereitungen mit teilchenförmigen Antigenabgabesystemen zusammen mit dem Acemannan, die über den Nasenrachen-Weg eingeimpft werden, präferentiell die Immunantwort in Bezug auf das lösliche Antigen potenzierten, bis das Ausmaß der auf dem systemischen Weg mit anderen Adjuvantien erhaltenen serologischen Reaktion überschritten war. Die Erhöhung der Qualität der Reaktion unter Erhöhung der Konzentration an Antikörpern der Unterklasse IgG2a bei Balb/c-Mäusen wird nachgewiesen. Dieser Aspekt bildet eine qualitative Überlegenheit in Bezug auf Aluminiumhydroxid und ermöglicht die Gestaltung von Impfstoffen, die antitumoral sind und gegen Mikroorganismen wirken, in Fällen, bei denen die Induktion der Th1-Reaktionen erforderlich sind. Vor kurzem wurde beobachtet, dass die von Th2-Zellen erzeugten Cytokine solche sind, die mit der mucosalen Immunität zusammenhängen, und dass die T-Zellen in den Schleimhaut-Lymphknoten mit höherer Wahrscheinlichkeit Typ-Th2-Cytokine erzeugen (Meeusen, E.N.T., 1996, Immunology Today 17 (9): 421-424), was den Wert dieses Ergebnisses bestätigt.
In der vorliegenden Erfindung wird auch die modulierende Aktivität von kombinierten Zubereitungen von Antigen-Acemannan beschrieben. Wir berichten zum ersten Mal über die spezielle Potentiatorwirkung der Th1-Reaktion in Bezug auf andere häufig verwendete Adjuvantien über den Nasenrachen- und systemischen Weg für teilchenförmige und lösliche Antigene. Für letztere ist die humorale Reaktion von ähnlicher Intensität wie die mit Aluminiumhydroxid erhaltene, ist jedoch qualitativ verschieden, und daher wird ein immunologischer modulierender Effekt berichtet. Diese Ergebnisse unterstützen seine Einführung in Impfstoffzubereitungen für die Immunprophylaxe und Immuntherapie von Krankheiten, die von intrazellulären Pathogenen verursacht werden, und Krebs.
Zur Zeit sind die Wirkmechanismen von Acemannan und anderer immunologisch stimulierender Polysaccharide nicht vollständig klar. Ein vorgeschlagener Mechanismus beinhaltet die Makrophagen und dendritischen Zellen, die spezifische Rezeptoren für Antigenstandards aufweisen, welche auf der Oberfläche der Pathogene vorhanden sind, wobei solche, die gefährlich sind, und solche, die nicht gefährlich sind, voneinander unterschieden werden. Dementsprechend gibt es an der Stelle der systemischen Impfung eine starke Monocytämie. Die antigene Assimilation auf dem Nasenrachen-Niveau und insbesondere am Waldeyer-Ring gemäß dem Assimilationsmechanismus für mehrschichtiges Epithelgewebe kann dadurch potenziert werden, dass Makrophagen und dendritische Zellen, die man in diesem Bereich findet, aktiviert und eine erhöhte Zahl vom immunkompetenten Zellen auf diese Zone hingezogen werden.
Ein wichtiger Anteil des Trockengewichts des Gelblatts der Aloe-Pflanze besteht aus Calciumoxalat-Kristallen (Carpenter, H.R., P.N. 5 118 673). Diese waren aufgrund ihres häufigen Vorkommens in Nierensteinen, einer häufigen Pathologie, Gegenstand neuerer Studien (Lieske, J.C. et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 19; 91 (15): 6987-91). Seit 1993 werden bestimmte Makromoleküle beschrieben, die von dem Kristall adsorbiert werden können (Stapleton, A.M. et al., 1993, Kidney Int. 44(4): 817-24). Vor kurzem wurden andere Proteine gefunden: Nephrocalcin, Tamm-Horsfall-Protein, Uropontin und renales Lytostatin (Berland, Y. et al., 1993, Nephrologie 14(4): 183-7).
Von unserer Gruppe durchgeführte Experimente bewiesen die Adsorption des HBsAg am Calciumoxalatkristall sowie die Copräzipitation der DNA mit diesem Salz, wobei man aufgrund der Merkmale des Salzes Teilchen mit reduzierter Größe erhält, und die Vorgänge der Inhibition der Agglutination der Kristalle, die in einem polysaccharidreichen Medium, wie Acemannan, vorkommen.
Für die systemische Impfung mit HBsAg lieferte die Kombination der Komponenten des Aloe-Gels auch bessere Ergebnisse, als man sie mit den getrennten Elementen erhielt.
Die Partikulierung der Antigene durch kolloidale Salze sowie Konjugationen mit partikulierten Antigenen oder deren Einschluss oder Assoziation mit Abgabesystemen für Antigene bildet einen ersten Schritt bei der Antigenverarbeitung in dieser Erfindung, und der zweite Schritt ist die Zugabe des Polysaccharids, das das Immunsystem aktiviert.
Wegen seiner viskosen Konsistenz ist Acemannan ein aktiver Träger, der die Zeit erhöht, während der das antigene Teilchen an der Impfungsstelle bleibt. Weitere Aktivitäten, wie die Induktion der Cytokine, die Aktivierung von Mechanismen für die Aufnahme von Antigenen durch die M-Zelle, die Rekrutierung verschiedener Zellpopulationen aus dem Immunsystem und die Erhöhung der antigenpräsentierenden Aktivität, werden nicht verworfen.
Die Zubereitung, die das Ziel dieser Erfindung bildet, weist gemäß der Größe der zu immunisierenden Spezies eine Menge an Impfsubstanz auf, die in der Lage ist, den Nasenrachenbereich bis zur Subglottis zu bedecken. Die Dosis kann für ihre Auftragung in 2 Teile unterteilt werden, oder sie kann auf einmal eingeführt werden. Die Konzentration des Polysaccharids, die eine optimale immunologische Reaktion und gleichzeitig eine ausreichende Viskosität für eine bessere Antigenretention in der Schleimhaut garantiert, liegt im Bereich von 1 mg/ml bis 12 mg/ml. Zu den Anforderungen an die Antigene gehört ihr teilchenförmiger Charakter, da bewiesen wurde, dass diese nasale Zubereitung mit demselben Antigen in löslicher Form oder ohne den Ligandeneffekt, den man spezielle in der Schleimhaut findet, nicht so effektiv ist. Daher garantiert das positive Ergebnis mit einem bestimmten Typ von Antigen nicht ein gutes Ergebnis für einen anderen Typ, und aus diesem Grund bilden die Merkmale des Antigens, teilchenförmig zu sein oder Ligandaktivität mit Epithelzellen aufzuweisen, eine starke Anforderung an das Antigen, die mit den vorgestellten Verfahren mit teilchenförmigen Antigenen erreicht werden.
Die Zubereitungen, die das Ziel dieser Erfindung bilden, ermöglichen es, hohe Konzentrationen von Serumantikörpern und eine vollständigere Reaktion in Bezug auf die Immunglobulin-Isotypen und -Unterklassen zu erhalten, welche eine größere Menge und Qualität haben, als man sie erhält, wenn man mit dem löslichen Antigen impft oder ein anderes Adjuvans verwendet.
Die Immunreaktionen, die serologisch durch die mucosale Verabreichung dieser Zubereitungen erhalten werden, sind mit denjenigen vergleichbar, die man mit systemischen Impfungen unter Verwendung von herkömmlichen Adjuvantien erhält, sind jedoch auf dem mucosalen Niveau viel stärker.
Die geringe Reaktogenität an der Schleimhaut in Bezug auf Adjuvantien des Toxintyps und abgeschwächte Mikroorganismen erlauben zusammen mit geringeren Kosten, der unabhängigen T-Antwort für das Adjuvans und seiner modulierenden Aktivität gegenüber einer Th1-Reaktion die Erzeugung von Reaktionen höherer Qualität. Wenn man eine größere Immunogenität der Antigene erreicht, können die Zahl der Impfungen sowie die Menge des Antigens pro Dosis reduziert werden.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1
Das Acemannan-Polysaccharid wird aus dem wässrigen Vollextrakt der Blätter von Aloe barbadensis Miller erhalten. Die Blätter werden von einer 2 bis 3 Jahre alten Pflanze gesammelt und 2 bis 3 Tage lang bei 4 °C in einem dunklen Raum aufbewahrt. Später werden das Ende und die Ränder der Blätter beseitigt. Die Blätter werden zerkleinert und gemahlen, während man gelegentlich eine minimale Menge steriles Wasser hinzufügt, um den Vorgang zu erleichtern. Der Schleim (oder das innerhalb des Blattes befindliche Gel) wurde ebenfalls verwendet, um Acemannan zu erhalten.
Die Blätter oder das Gel wurden nach dem Mahlen mit 10 000 U/min zentrifugiert, wobei alle unlöslichen Reste entfernt wurden, die hauptsächlich vom Epidermis- und Fasergewebe des Blattes stammten. Der lyophilisierte Überstand wurde Vollextrakt (TE) genannt. Der TE wurde, wenn möglich, für eine spätere Fällung mit 80%igem Ethanol unter langsamem Rühren resuspendiert. Die Fällungstemperatur betrug 4 °C. Nach 24 Stunden wurde die Lösung 20 min lang mit 10 000 U/min zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Der Niederschlag wurde in sterilem destilliertem Wasser resuspendiert und lyophilisiert. Dieses Produkt wird Ethanolpräzipitat genannt.
Um das Acemannan mit einem hohen Grad der Reinheit zu erhalten, wurde Ausschlusschromatographie an Sepharose CL-4B gewählt. Eine phosphatgepuf ferte Kochsalzlösung (PBS) oder 0,2 M NaCl wurden für den Durchlauf sowie zum Resuspendieren der Probe verwendet. 1 zeigt das Chromatogramm einer HPLC-Chromatographie in einer Filtrationsgelsäule TSK G6000PW vor der Gelfiltration in Sepharose CL-4B. In diesem Chromatogramm ist der Punkt, der dem Elutionsvolumen des Dextran Blue (DB) von MW = 2000 kDa entspricht, hervorgehoben, und am Ende ist ein Punkt, der dem Gesamtelutionsvolumen (TEV) entspricht. Der erste Peak (M) mit einem höheren Molekulargewicht als das DB lieferte beim Anthron-Kolorimetrie-Verfahren ein positives Ergebnis (Trevelyan, W.E. und Harrison, J.S., 1952, Biochem. J. 23: 1824).
Die Analyse der beiden Peaks durch Infrarotspektroskopie zeigte die Anwesenheit von Banden, die charakteristisch für Acemannan sind, am ersten Peak der Chromatographie (M). Dieses Maximum in der Nähe von 1250 bzw. 1750 cm^–1 bezeichnet die Anwesenheit von Acetylierungen, die sich auf den nativen Zustand dieses Polysaccharids beziehen. Diese Banden wurden an dem Peak, der dem Gesamtelutionsvolumen (TEV) der Säule entsprach, nicht beobachtet.
Beispiel 2
Mit dem Ziel, die immunologisch potenzierende Wirkung des Extrakts aus dem Blatt von Aloe barbadensis Miller auf das Oberflächenantigen des Hepatitis-B-(HBsAg)-Virus zu bewerten, wurden Immunisierungspläne auf dem intraperitonealen Weg bei 6 bis 8 Wochen alten männlichen Balb/c-Mäusen durchgeführt. Der Vergleich erfolgte unter Verwendung des Impfstoffs Heberbiovac-HB (hergestellt von CIGB, Kuba), dessen Antigen in Aluminiumhydroxid adsorbiert ist, als Referenz. Die verwendeten Immunisierungspläne sind für jeden Fall angegeben (Figur 2a und 2b).
Der Nachweis der Immunantwort auf das HBsAg erfolgte durch Gesamt-Anti-HBsAg-ELISA, der für die Qualitätskontrolle des Impfstoffs aufgestellt wurde. Die Antikörpertiter sind in internationalen Einheiten pro Liter ausgedrückt. Die statistische Analyse der Ergebnisse wurde nach dem Student-Test durchgeführt: Ein p von < 0,05 galt als signifikanter Unterschied.
Es gab signifikante Unterschiede in den Plänen zwischen beiden Gruppen. Mit diesem Beispiel wurde gezeigt, dass es möglich ist, die Immunantwort auf HBsAg in Bezug auf das Aluminiumhydroxid nach einer oder zwei intraperitonealen Impfungen erheblich zu potenzieren.
Beispiel 3
Mit dem Ziel, zwei der Komponenten des Extrakts auf ihre Möglichkeiten zu bewerten, die Immunantwort zu potenzieren, wurden Acemannan und Calciumoxalat ausgewählt. Das Aluminiumhydroxid und der TE wurden als Kontrollen verwendet. Die getesteten Mengen und die Ergebnisse nach experimentellen Gruppen sind in der Tabelle in 3 gezeigt.
Diesem Immunogenitätstest gingen Experimente zur Adsorption des HBsAg am Calciumoxalat voraus, bei denen bewiesen wurde, dass dies möglich ist. Die Adsorption des Calciumoxalats (vorhanden in Form eines kolloidalen Sols im TE der Aloe) könnte bei der Potenzierung der Immunantwort eine synergistische Wirkung mit dem Acemannan erzeugen.
Eine Blutentnahme wurde nach 28 Tagen durch retroorbitales Einstechen durchgeführt. Die Bewertung der Ergebnisse erfolgte durch den bereits erwähnten Anti-Gesamt-HBsAg-ELISA.
Gruppe 6, die die Kombination von Acemannan und Calciumoxalat enthielt, wies eine erheblich höhere Antikörperreaktion auf als die übrigen Gruppen.
Ein Synergismus zwischen dem Calciumoxalat und dem Acemannan wurde nachgewiesen, mit dem es möglich war, die immunologisch potenzierende Wirkung des Gesamtextrakts zu rekonstituieren und zu übertreffen. In diesem Fall wird gezeigt, dass die Partikulierung des HBsAg auf dem Calciumoxalat-Sol die Präsentation dieses Antigens gegenüber dem Immunsystem begünstigt.
Beispiel 4
Um die immunologisch potenzierende Wirkung des Acemannans über den mucosalen Weg zu bestimmen, wurden Immunogenitätstests bei 7 bis 10 Wochen alten Balb/c-Mäusen durchgeführt, wobei man das Oberflächenantigenmodell des Hepatitis-B-Virus (HBsAg) verwendete. Die Impfung erfolgte über den Nasenrachenweg in Volumina von 50 μl bei anästhetisierten Mäusen. Die Blutentnahme wurde durch retroorbitales Einstechen 28 Tage nach dem Start des Plans durchgeführt. Die Bestimmung des Titers erfolgte durch Anti-Gesamt-HBsAg-ELISA. Die statistische Analyse wurde nach dem Student-Test durchgeführt: Ein p von < 0,05 galt als signifikanter Unterschied.
Unterschiedliche Dosen des Acemannans wurden getestet, und die verwendete Kontrolle war HBsAg in PBS. Das Antigen wurde in nur einer Konzentration verwendet: 5 μg/Dosis. Die Ergebnisse sind in der Tabelle von 4 gezeigt.
Eine starke immunologisch potenzierende Wirkung wurden in den Gruppen nachgewiesen, bei denen Acemannan hinzugefügt wurde. Alle Gruppen waren der Kontrolle von HBsAg in PBS signifikant überlegen. Die übermäßige Zunahme erzeugte eine inhibitorische Wirkung (Gruppe 5). Dies könnte auf eine Erhöhung der resultierenden Viskosität zurückzuführen sein.
Beispiel 5
Mit dem Ziel, die immunologisch potenzierende Aktivität von Acemannan für HBsAg mit einem anderen mucosalen Referenz-Adjuvans zu vergleichen, wurde ein Immunisierungsplan durchgeführt, um es mit einer Zubereitung von HBsAg und dem Cholera-Toxin (CT) zu vergleichen (5a-d). Mehrere Antigendosen wurden bewertet, und die systemische Impfung von HBsAg in Aluminiumoxid wurde ebenfalls als Kontrolle verwendet. Der Plan wurde bei 6-8 Wochen alten weiblichen Balb/c-Mäusen mit vier Impfungen an den Tagen 0, 14, 28 und 56 durchgeführt. Blutentnahmen wurden an den Tagen 26, 42 und 70 durchgeführt. Die Bewertung der Seren erfolgte mit dem herkömmlichen ELISA für den Nach weis von spezifischen Maus-IgG-Antikörpern. Die Seren wurden 14 Tage nach der zweiten, dritten und vierten Dosis analysiert.
Ein weiteres Ziel dieses Assays bestand darin, die Kinetik der humoralen Immunantwort in der Gruppen, die an dieser Studie beteiligt sind, zu vergleichen.
Eine statistische Analyse nach einer zweiten Dosis zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen der Aluminiumoxid-Kontrollgruppe (G4) und der nasalen Gruppe mit derselben Menge von Antigen und Acemannan (G1). Die Gruppe der Mäuse, die mit CT als Adjuvans über den Nasenrachen-Weg immunisiert wurden (G5), erzeugte eine höhere Antikörperreaktion als die Gruppe mit der geringeren Antigenmenge und unterschied sich nicht signifikant von derjenigen der Gruppe mit einer gleichen Menge an Impfstoff (G2) (5a).
Nach drei Immunisierungen gab es keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe von Mäusen, die intranasal und systemisch mit 2 μg immunisiert wurden (G1 und G4). Ebenso gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen der Gruppe von Mäusen, die mit CT als Adjuvans (G5) und der äquivalenten Zubereitung unter dem Assay (G2), beide mit 10 μg HBsAg, immunisiert wurden (5b).
Angesichts der starken Erhöhung des Titers von der zweiten zur dritten Dosis untersuchten wir, ob diese Erhöhung bei den verschiedenen Gruppen, die nach einer vierten Dosis, die einen Monat nach der dritten Impfung angewendet wurde, getestet wurden, derselben Steigung folgte. Die Ergebnisse sind in 5c gezeigt.
Unter Verwendung von Acemannan als Adjuvans ist es möglich, nach einer vierten Dosis eine Antwort zu erhalten, die stärker ist als diejenige, die man mit CT in Serum erhielt, wie ein Vergleich zwischen G2 und G5 beweist.
Die Kinetik der Antwort zeigt eine stetige Zunahme, die nach der dritten und vierten Dosis die durch CT erzeugte Antwort übersteigt. Die durch intranasale Impfung mit 2 μg Ag pro Dosis erzeugten Antikörperkonzentrationen (G1) waren signifikant höher als diejenigen, die mit derselben Menge Antigen erhalten wurden, die mit Aluminiumoxid auf dem systemischen Weg verabreicht wurde (G4). Dies ist der erste Beweis dafür, dass es möglich ist, durch die Impfung mit inaktiven teilchenförmigen Antigenen auf dem Nasenrachen-Weg mit Polysacchariden als Adjuvantien Antworten zu erzielen, die die durch systemische Impfungen unter Verwendung von Aluminiumoxid erzeugte Antwort in Bezug auf Quantität und Qualität übersteigen können. Außerdem wird die Tatsache, dass nur über den Nasenrachen-Weg eine starke mucosale Antwort induziert wurde, zu einer realen Möglichkeit für die effiziente und potentiell unschädliche Impfung mit HBsAg beim Menschen. Dies ist ein spezieller Fall eines teilchenförmigen Antigens proteo-liposomaler Natur. Auf diesem Weg können auch andere Antigene verwendet werden, um eine systemische Antwort von gleicher Stärke und höherer Qualität zu erreichen. Aus diesem Ergebnis kann geschlossen werden, dass andere, von Hefe abgeleitete Antigene, die partikuliert werden, und zwar im Allgemeinen mit einer ähnlichen Größe wie HBsAg, mit guten Ergebnissen über den intranasalen Weg verwendet werden könnten.
IgA-Quantifizierung in der Vagina (70. Tag)
Es ist sehr wichtig, eine mucosale Antwort zu erhalten, wenn man in Betracht zieht, dass der Geschlechtsverkehr einer der Übertragungswege für Hepatitis B und andere Krankheiten ist.
Mit dem Ziel, die vaginale Anti-HBsAg-IgA-Antwort zu vergleichen, wurden Vaginalspülungen mit 100 ml PBS 70 Tage nach der ersten Impfung durchgeführt, und die Anti-IgA-Antikörperreaktion wurde mit herkömmlichem ELISA analysiert. Die Ergebnisse wurden in Bezug auf eine Vaginalspülung mit einem hohen Titer, die als positive Kontrolle diente, quantifiziert, und daher wurden relative Einheiten (RU) verwendet (5d).
In der Vaginalschleimhaut von Mäusen, die auf systemischem Weg mit Aluminiumoxid als Adjuvans immunisiert wurden (Gruppe 4), wurde keine Anti-HBsAg- IgA-Reaktion nachgewiesen. Dieses Ergebnis unterstreicht die Bedeutung einer mucosalen Immunisierung und insbesondere die Fähigkeit des Adjuvans, das in der Lage ist, stärkere Antworten in den Gruppen 2 und 3 zu erzeugen, obwohl die Antwort nicht statistisch signifikant war. Die Antikörperkonzentrationen, die mit 2 μg und dem Polysaccharid erreicht wurden, unterschieden sich statistisch nicht von denjenigen, die mit 10 μg und CT erreicht wurden.
Beispiel 6
Mit dem Ziel, die Möglichkeit einer Abgabe von Antigenen an Schleimhäute zu beweisen, wurde HBsAg verwendet, um lösliche Antigene durch chemische Konjugation an das multiantigene Peptid (MAP) Th-B zu binden, das vom universellen Th-Epitop (830-843) des Tetanus-Toxins und einem B-Peptid der HIV-gp-120-V3-Schleife gebildet wurde. Die intranasale Impfung wurde so durchgeführt, wie es zuvor beschrieben wurde, und die Blutentnahme erfolgte ebenfalls durch retroorbitale Punktion 42 Tage nach Beginn des Plans. Die Bestimmung der Titer erfolgte durch einen B-Peptid-spezifischen Anti-IgG-ELISA. Die Titer wurden in Bezug auf eine positive Kontrolle bestimmt, und daher wurden relative Einheiten (RU) verwendet (6).
In der Gruppe B gab es keine Serokonversion. In der Gruppe A gab es 100% Serokonversion, und die Anwesenheit von zwei Mäusen mit starker Antwort beeinflusst die graphische Sichtbarkeit der anderen beiden, die eine Serokonversion zeigten, aber mit einem niedrigen Titer.
Obwohl das MAP (40 μg) in der Gruppe B viel stärker repräsentiert war im Vergleich zu 20 μg des HBsAg-MAP-Konjugats (Gruppe A), gab es in Gruppe B keine Serumreaktion. Als Kriterien für eine Serokonversion wurde das Doppelte der Mittelwerte der optischen Dichten der negativen Kontrollen angenommen (Mäuse, die auf dem Nasenrachen-Weg mit 20 μg HBsAg immunisiert wurden). Dieses Ergebnis bewies, dass bei der Reaktion auf das Antigen eher die Partikulierung als die Gegenwart von Th-Epitopen eine wichtige Rolle spielt.
Wie aufgrund der Physiologie des Impfungswegs bekannt ist, ist die Partikulierung wichtig, aber andere bekannte mucosale Adjuvantien, wie CT, untergraben diese Notwendigkeit. Daher können wir in der Literatur zahlreiche Beispiele für eine immunologisch potenzierende Aktivität von CT für nichtpartikulierte Antigene finden, darunter einfache Peptide. Dieser Effekt findet bei dem Polysaccharid nur mit Hilfe der Partikulierung statt.
Beispiel 7
Das rekombinante Polypeptid des Opc-Proteins, eines der Proteine der äußeren Membran von Neisseria meningitidis, wurde in Liposomen eingebaut. Die Antwort wurde bei Mäusen auf dem Nasenrachen-Weg bewertet, indem man sie mit der Antwort verglich, die durch das lösliche Polypeptid erzeugt wurde.
Zunächst wurde die immunologisch potenzierende Wirkung auf das Liposom nachgewiesen. Zwei Gruppen von 10 Balb/c-Mäusen wurden immunisiert. Gruppe A wurde mit 20 μg in Liposomen eingekapseltem Protein immunisiert, und Gruppe B wurde mit 20 μg desselben Präparats immunisiert, wobei man Acemannan in einer endgültigen Konzentration von 6 mg/ml hinzufügte. Die humorale Reaktion wurde auf systemischem Niveau und in Lungenspülungen bewertet.
Die IgG-Konzentrationen wurden durch ELISA gemessen und als Logarithmen in willkürlichen Einheiten, die jedem Serum zugeordnet wurden, dargestellt. Gruppe B zeigte höhere Konzentrationen an Serum-IgG, und der Unterschied war statistisch signifikant (7a). Dieses Experiment zeigte die Fähigkeit von Acemannan, die Immunantwort auf liposomale Zubereitungen zu potenzieren.
Ein zweites Experiment wurde entworfen, um die potenzierende Wirkung des Polysaccharids auf das Opc-Protein in Liposomen (A) und auf das renaturierte Opc-Protein in 10 mg/ml Octylglucosid (B) zu vergleichen. Die Verwendung dieses Tensids erhöhte die Erkennung des Proteins durch vier spezifische monoklonale Antikörper für das natürliche Opc-Protein. Zwei dieser Antikörper erkennen konformatorische Epitope, und die anderen beiden lineare Epitope. Gemäß den Kriterien für die Erkennung durch monoklonale Antikörper präsentiert das mit Octylglucosid renaturierte Opc-Protein eine Konformation, die näher an der des natürlichen Proteins ist. Zwei Gruppen von 10 Balb/c-Mäusen wurden intranasal immunisiert. Die Antikörperkonzentrationen wurden in den Seren und den Lungenspülungen quantifiziert und als Logarithmen in willkürlichen Einheiten, die jeder Probe zugeordnet wurden, dargestellt (7b).
Es wurde beobachtet, dass die Kombination der Liposomen mit dem Polysaccharid in Serum sowie in den Schleimhautspülungen zu höheren Immunglobulintitern und einer geringeren Dispersion der Antwort führte. Acemannan potenziert die Antwort auf das Antigen signifikant, wenn dieses durch das Liposom dem Immunsystem präsentiert wird (Abgabesystem für partikulierte Antigene).
Beispiel 8
Mit dem Ziel, die Reaktion quantitativ zu analysieren, wurden die Konzentrationen von IgG1, 2a und 2b mit einem herkömmlichen ELISA quantifiziert, wobei man spezifische Anti-IgGi-, -2a- und -2b-Konjugate verwendete. In dem Experiment wurden die Reaktionen, die mit Acemannan als Adjuvans auf dem IN-Weg erhalten wurden (IN/Aloe), mit der Reaktion auf das Antigen, das auf dem intraperitonealen Weg in Polysaccharid und Calciumoxalat (IP/Aloe) eingeimpft wurde, und mit der Reaktion, die unter Verwendung von Aluminiumoxid-Adjuvans (IP/Alum.) als Kontrolle erhalten wurde, verglichen (8a).
Die Erhöhung der IgG2a-Antikörperkonzentrationen, die mit der untersuchten Immunstimulansgruppe assoziiert waren, erlaubt die Verwendung dieses Typs von Zubereitungen im Bereich der präventiven und therapeutischen Impfstoffe, die eine starke zelluläre Reaktion erfordern.
Gemäß dem zuvor gesagten ist es möglich, durch eine Erhöhung der Konzentration von IgG2a und IgG2b eine Erhöhung des Niveaus der Immunantwort auf das Oberflächenantigen zu erreichen.
Zu den Elementen, die bestimmend sein können, um eine schützende Immunantwort zu erhalten, gehören nicht nur diejenigen, die deren Intensität betreffen, sondern auch solche, die ihre Qualität betreffen, d.h. die Art der Reaktion, die als Ergebnis der Immunisierung erzeugt wird. In den letzten Jahren ist eines der Themen, die in der Immunologie häufiger behandelt werden, der Typ der Helfer-T-Lymphocyten-Reaktion (Th1/Th2). Viele Autoren haben gezeigt, dass die effektive Antwort für intrazelluläre Pathogene und Viren der Th1-Typ ist, der mit der cytotoxischen Antwort und mit einer Erhöhung in der IgG2a-Unterklasse gegenüber den anderen Unterklassen korreliert.
Mit dem Ziel, zu analysieren, ob es dieselbe Leistungsfähigkeit bei physikalisch unterschiedlichen Antigenen gibt, wurde ein Immunisierungsplan unter Verwendung eines multiepitopischen Polypeptids (TAB9) durchgeführt, das von Bereichen der V3-Schleife des humanen Immunschwächevirus (HIV) integriert wird. Die Quantifizierung von Anti-TAB9-Immunglobulinen erfolgte durch einen herkömmlichen ELISA-Test für die Bestimmung von IgG-Unterklassen. 10 μg des Proteins wurden auf dem intraperitonealen Weg mit verschiedenen Adjuvantien eingeimpft (8b).
Gemäß den gezeigten Ergebnissen wird eine Verschiebung des Th1/Th2-Gleichgewichts zum Th1-Reaktionstyp hin nachgewiesen. Die Konzentration von IgG2b ist bei der Acemannan/Oxalat-Kombination größer als die durch Verwendung von Quil A erzeugte. Dieses Ergebnis ist eine neue Erkenntnis für die Zubereitung sowie für das Polysaccharid und erlaubt seine Verwendung nicht nur zum Potenzieren von Reaktionen, sondern auch zum Modulieren der Reaktionen hin zu Th1, was ein Immunitätserfordernis für eine große Zahl von Pathogenen und Krebs ist.
Beschreibung der Figuren
1. HPLC-Chromatographie. AD: Dextran blau (2000 kDa), M: Probe, VET: Gesamtelutionsvolumen. Chromatographischer Prozessor BioCROM Version 2.3 (1994). Detektor: Brechungsindex (Knauer). Gel: TSK G6000PW (Fraktionie rungsbereich: 500 bis 50 000 kDa). Abmessungen: 7,5 × 600 mm. Fließgeschwindigkeit: 0,5 ml/min. Puffer: PBS. Aufgegebenes Probevolumen: 100 μl.
2a. Plan mit 2 Dosen (Tag 0, Tag 14) und Blutentnahme nach 28 Tagen.
2b. Plan mit einer Dosis und Blutentnahme nach 28 Tagen.
3. Plan mit einer intraperitonealen Dosis und Blutentnahme nach 28 Tagen.
4. Plan mit 0 und 14 und Blutentnahme nach 28 Tagen.
5a. Bewertung von Seren nach der zweiten Dosis.
5b. Bewertung von Seren nach der dritten Dosis.
5c. Bewertung von Seren nach einer vierten Dosis.
Figur d. Bewertung der Vaginalspülungen (Tag 70).
6. der verwendete Plan war 0, 14, 28, und die Extraktion erfolgte nach 42 Tagen. A: 20 μg HBsAg konjugiert mit A: MAP + Polysaccharid (6 mg/ml), B: 40 μg MAP + Polysaccharid (6 mg/ml).
7a. Plan mit drei Dosen: 0, 28, 56 und Blutentnahme nach 63 Tagen.
7b. Plan mit drei Dosen: 0, 28, 56 und Blutentnahme nach 63 Tagen.
8a. Plan mit drei Dosen: 0, 14, 28 und Blutentnahme nach 42 Tagen. Die Seren von jeder Variante wurden zu analytischen Zwecken gruppiert. Die Arbeitsverdünnung der Proben war 1:4000.
8b. Plan mit drei Dosen: 0, 14, 28 und Blutentnahme nach 42 Tagen. Das geometrische Mittel der Titer ist nach der Immunisierung mit dem multiepitopischen TAB9-Präparat mit verschiedenen Adjuvantien gezeigt.

Claims

Nasenrachen-Impfstoffzubereitung, die ein teilchenförmiges Antigen in löslichem Zustand und das Polysaccharid Acemannan als Adjuvans umfasst.
Nasenrachen-Impfstoffzubereitung gemäß Anspruch 1, wobei es sich bei dem Acemannan um eine Fraktion oder einen Gesamtextrakt aus Blättern von Aloe barbadensis Miller handelt.
Nasenrachen-Impfstoffzubereitung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Acemannan-Konzentration im Bereich von 1 bis 12 mg/ml liegt.
Nasenrachen-Impfstoffzubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei dem teilchenförmigen Antigen in löslichem Zustand um HBsAg (Hepatitis-B-Oberflächenantigen) handelt.
Nasenrachen-Impfstoffzubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei dem teilchenförmigen Antigen in löslichem Zustand um Hepatitis-B-Oberflächenantigen handelt, das chemisch mit dem multiantigenen Peptid Th-B konjugiert ist.
Nasenrachen-Impfstoffzubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei es sich bei dem teilchenförmigen Antigen in löslichem Zustand um Neisseria-meningitidis-Außenmembranprotein 5C handelt, das in Liposomen eingebaut ist.
Verwendung von Acemannan zur Herstellung einer Impfstoffzubereitung zum Impfen eines Menschen oder eines Tiers durch Nasenrachen-Verabreichung, wobei die Zubereitung ein teilchenförmiges Antigen in löslichem Zustand und das Polysaccharid Acemannan als Adjuvans umfasst.
Verwendung von Acemannan gemäß Anspruch 7, wobei die Impfstoffzubereitung zur prophylaktischen oder therapeutischen Behandlung einer Krankheit bei einem Menschen oder Tier dient.
Verfahren zur Herstellung einer Nasenrachen-Impfstoffzubereitung, die ein Antigen und ein Adjuvans umfasst, wobei ein teilchenförmiges Antigen in löslichem Zustand als Antigen und das Polysaccharid Acemannan als Adjuvans verwendet werden.