DE69922804T2

DE69922804T2 - Verwendung von polymeren der hyaluronsäure zur mukosalen freigabe von impfstoffen und adjuvantien

Info

Publication number: DE69922804T2
Application number: DE69922804T
Authority: DE
Inventors: Derek O'hagan; Alessandra Pavesio
Original assignee: Fidia Farmaceutici SpA; Chiron Corp
Current assignee: Fidia Farmaceutici SpA; Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2019-05-29
Also published as: CA2332455A1; CA2332455C; DE69922804D1; EP1082135A1; WO1999062546A1; ATE285250T1; EP1082135B1; ES2235489T3; JP4610735B2; AU4410699A; AU755465B2; JP2010163432A; AU755465C; JP2002516876A

Description

Fachgebiet
Die Erfindung betrifft im Allgemeinen Bioadhäsionspolymersysteme. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung von Hyaluronsäurepolymeren zur mukosalen Freigabe von Impfstoffantigenen und Adjuvantien.
Hintergrund der Erfindung
Die Schleimhautimmunität stellt einen wichtigen Abwehrmechanismus gegen eine große Vielfalt von Pathogenen zur Verfügung. In dieser Hinsicht werden die Schleimhautoberflächen des Gastrointestinal-, des Respirations- und des Urogenitaltrakts kontinuierlich fremden Antigenen ausgesetzt, einschließlich potentiell infektiöser bakterieller, viraler und manchmal parasitärer Organismen. Die Immunantworten der Schleimhaut schützen gegen solche Herausforderungen und besitzen bestimmte und spezialisierte Kennzeichen.
Zum Beispiel ist das hauptsächliche Immunglobulin, das von dem Immunsystem der Schleimhaut hergestellt wird, sekretorisches IgA. Spezialisierte Zellen zur Aufnahme von Antigenen in den Peyer'-Plaques des Intestinaltrakts oder in den nasopharyngealen Lymphgeweben, Microfold- oder M-Zellen genannt, befördern ein Antigen zu den darunter gelegenen Schleimhaut assoziierten Lymphgeweben (MALT). In anderen Gebieten des Schleimhautepitheliums wie z.B. das Pseudo-stratified-Luftröhren-Epithelium dienen dentritische Zellen als Antigen präsentierende Zellen und wandern zu den lokalen Lymphknoten oder zum MALT. Die Antigenprozessierung und -präsentation geschieht im MALT, wobei die Aktivierung von Antigen-spezifischen IgA-B-Zellen erfolgt. Die anschließende Wanderung und die Re-Zirkulation der aktivierten IgA-B-Zellen zu anderen Komponenten des Immunsystems der Schleimhaut wie z.B. des Respirations-, des Gastrointestinal- und des Genitaltrakts stellen die disseminierten lokalen IgA-Antworten der Schleimhaut im gesamten „Common Mucosal System" bereit. Daher ist das Immunsystem der Schleimhaut auf einzigartige Weise dafür geeignet, auf die Arten von Antigen-Herausforderung, auf die Schleimhautoberflächen stoßen, zu reagieren, und es kann die effektivste Art der Immunantwort gegen besondere Pathogene zur Verfügung stellen. Dementsprechend stellen Mechanismen zur Abgabe von Antigenen, die auf das Immunsystem der Schleimhaut zielen, ein attraktives Mittel für die Erzielung einer Immunität zur Verfügung.
Es wurden Versuche unternommen, Bioadhäsionspolymere für die mukosale Abgabe von Arzneistoffen zu verwenden. Bioadhäsions sind synthetisch und natürlich vorkommende Materialien, die an biologische Substrate für ausgedehnte Zeiträume haften können. Zum Beispiel zeigen Carbopol und Polycarbophil, beides synthetische, vernetzte Derivate der Poly(Acrylsäure), in vitro ausgezeichnete Adhäsionseigenschaften. Eine solche Leistung dieser Biokadhäsionsstoffe wurde jedoch in vivo nicht erreicht. Zusätzlich können solche Bioadhäsionsstoffe örtliche Irritationen erzeugen. Daher sind nur wenige Abgabesysteme für Bioadhäsionsstoffe im Handel erhältlich.
Die Aufmerksamkeit wurde daher auf die Entwicklung von Abgabesystemen für Bioadhäsionsstoff gerichtet, die auf natürlich vorkommenden Substanzen wie z.B. Lecithinen und Fimbrialproteinen beruhen. Diese Bioadhäsionsstoffe haften an den Zelloberflächen der Schleimhaut über Rezeptor vermittelte Mechanismen. Ein anderer natürlich vorkommender Bioadhäsionsstoff ist die Hyaluronsäure, auch als Hyaluronan bekannt. Die Hyaluronsäure ist ein natürlich vorkommendes Mucopolysaccharid, das aus D-Glucuronsäure- und N-Acetyl-D-Glucosamin-Komponenten besteht. Hyaluronsäure wird in der extrazellulären Gewebematrix von Vertebraten gefunden, einschließlich des Bindegewebes, so wie in der Gelenkschmiere und im wässrigen Humor des Auges. Von der Hyaluronsäure wurde nachgewiesen, dass sie sowohl in vivo als auch in vitro ein Bioadhäsionsstoff ist.
Veresterte Derivate der Hyaluronsäure wurden verwendet, um Microsphären herzustellen, die biologisch verträglich und biologisch abbaubar sind. Vergl. z.B.
Cortivo et al., Biomaterials (1991) 12: 727–730; Europäische Veröffentlichung Nr.: 517,565. Diese Microsphären wurden zur Abgabe zahlreicher Substanzen an die Schleimhaut verwendet. Vergl z.B. Internationale Veröffentlichung Nr.: WO 96/29998. Richardson et al., Int J Pharm (1995) 115: 9–15, beschreibten zum Beispiel die vaginale Abgabe von Calcitonin in Ratten. Zusätzlich beschreiben Illum et al., J Controlled Rel (1994) 29: 133–141 und die Europäische Veröffentlichung Nr.: 517,565 die Verwendung von Microsphären aus Hyaluronsäureester zur internasalen Abgabe von Insulin in Schafen.
Die Verwendung von Hyaluronsäure-Derivaten zur Abgabe von Impfantigenen wurde jedoch bisher noch nicht beschrieben.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein effektives Verfahren für das Hervorrufen einer Immunantwort in einem Säuger zur Verfügung, wobei eine Immunisierung über die Schleimhaut und Hyaluronsäure-Abgabetechniken verwendet werden. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die mukosale Abgabe von Hyaluronsäure-Derivaten wie z.B. von veresterten Hyaluronsäurepolymeren und mit sich selbst vernetzten Hyaluronsäure-Polymeren in Kombination mit einem Antigen des Interesses und gegebenenfalls einem Hilfsstoff dazu führt, dass die Immunogenität des mitverabreichten Antigens verstärkt wird. Während es nicht erwünscht ist, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird vermutet, dass die Bioadhäsionsstoffeigenschaften des Hyaluronsäurepolymers die mukoziliäre Clearance-Rate von den Nasenhöhle herabsetzt und daher eine längere Kontaktzeit zwischen dem Antigen und der absorbierenden Membran zulässt. Zusätzlich findet eine vorübergehende Erweiterung der Tight-Junctions zwischen den Zellen des Epitheliums der Schleimhaut statt, was einen effizienteren Transport des Antigens des Interesses erlaubt. Die Verwendung von Hyaluronsäurepolymeren stellt einen sicheren und effektiven Ansatz zur Verstärkung der Immunogenität für eine große Vielfalt von Antigenen zur Verfügung.
Dementsprechend ist die Erfindung in einer Ausführungsform auf eine Zusammensetzung gerichtet, die ein Hyaluronsäureester-Polymer und ein ausgewähltes Antigen umfasst, wobei das Antigen in einer Menge von näherungsweise 0,1% bis etwa 40% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer vorkommt.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Hyaluronsäureester aus einer Gruppe ausgewählt, die aus Hyaluronsäure besteht, deren freie Carboxylgruppen zu etwa 75% bis etwa 100% mit einem oder mehreren Alkylresten verestert sind, und einem vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, in dem die Carboxylgruppen des Hyaluronsäurepolymers zu etwa 0,5% bis etwa 20% mit Hydroxylgruppen des gleichen oder eines anderen Hyaluronsäuremoleküls vernetzt sind.
In einer anderen Ausführungsform ist die Erfindung auf eine Zusammensetzung gerichtet, die (a) eine Microsphäre umfasst, bestehend aus einem Hyaluronsäureester, ausgewählt aus der Gruppe, die aus einer Hyaluronsäure besteht, deren freie Carboxylgruppen zu etwa 75% bis etwa 100% mit einem oder mehreren Alkylresten verestert sind, und einem vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, umfassend interne Ester, in dem die Carboxylgruppen des Hyaluronsäurepolymers zu etwa 0,5% bis etwa 20% mit den Hydroxylgruppen des gleichen oder eines unterschiedlichen Hyaluronsäuremoleküls vernetzt sind; (b) ein ausgewähltes Antigen, eingeschlossen in der oder angelagert an die Microsphäre, wobei das Antigen in einer Menge von näherungsweise 2% bis etwa 25% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer vorkommt; und (c) einen immunologischen Hilfsstoff.
In noch weiteren Ausführungsformen ist die vorliegende Erfindung auf Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln gerichtet, welche das Kombinieren der vorstehenden Zusammensetzungen mit einem pharmazeutisch verträglichen Schleimhaut-Excipient umfasst, sowie Verfahren zur Immunisierung, welche die Schleimhaut-Abgabe von therapeutisch effizienten Mengen der Arzneimittel an ein Wirbeltier umfasst.
Für diese und andere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird der Fachmann angesichts dieser Offenbarung leicht Verwendung finden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt anti-HA-IgG-Titer in Schweinen, die intramuskulär nur HA (leere Balken), intranasal HA und die Hilfssubstanz LT-K63 (gefüllte Balken) und intranasal HA mit HYAFF-Micropartikeln und LT-K63 (schraffierte Balken) verabreicht bekamen.
2 zeigt anti-HA-IgA-Titer in Schweinen, die intramuskulär nur HA (leere Balken), intranasal HA und die Hilfssubstanz LT-K63 (gefüllte Balken) und intranasal HA mit HYAFF-Micropartikeln und LT-K63 (schraffierte Balken) verabreicht bekamen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung wird, falls es nicht anders angezeigt ist, konventionelle Verfahren der Chemie, der Biochemie, der Molekularbiologie, der Immunologie und der Pharmakologie innerhalb des Fachwissens verwenden. Solche Techniken sind ausführlich in der Literatur beschrieben. Vergl. z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990), Methods In Enzymology (S. Colowick und N. Kaplan, Hrsg., Academic Press, Inc.); und Handbook of Experimental Immunology, Bd. I-IV (D.M. Weir und C.C. Blackwell, Hrsg., 1986, Blackwell Scientific Publications); und Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, 1989).
Alle Veröffentlichungen, Patente und Patentanmeldungen, die hierin zitiert werden, entweder vorstehend oder nachstehend, sind hiermit durch Bezugname in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
Wie sie in dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen verwendet werden, schließen die singulären Formen „ein/eine" und „der/die/das" Bezüge zur Mehrzahl ein, außer der Inhalt schreibt deutlich etwas anderes vor. Daher schließt zum Beispiel der Bezug zu „einem Antigen" ein Gemisch aus zwei oder mehreren Antigenen ein.
I. Definitionen
In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Ausdrücke verwendet und sie sollen definiert werden, wie nachstehend angezeigt ist. Die Ausdrücke „Hyaluronsäure" und „Hyaluronan" werden hierin verwendet, um ein auf dem Fachgebiet bekanntes, saures Polysaccharid zu bezeichnen, das ein unverzweigtes, langkettiges Molekül ist, das aus sich wiederholenden, monomeren Einheiten von D-Glucuronsäure aufgebaut ist, die über eine β1-3-glucosidische Bindung an N-Acetyl-D-Glucosamin (Struktur 1, nachstehend) verbunden ist; wobei eine β1-3-glucosidische Bindung die einzelnen Einheiten verbindet.
Ein „Hyaluronsäure-Derivat" ist ein Molekül, das von Hyaluronsäure abgeleitet ist, und bezeichnet jede von verschiedenen Substanzen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie z.B. veresterte Hyaluronsäure-Moleküle, wobei etwa 75% – 100% der freien Carboxylgruppen mit einer Alkylgruppe verestert sind, die gemeinsam hierin als „HYAFF" bezeichnet werden. Der Ausdruck schließt auch „gemischte" Hyaluronsäureester ein, wobei die Carboxylgruppen mit mehr als einer Alkylgruppe verestert sind. Solche „gemischten" Ester werden nachfolgend ausführlicher beschrieben. Des weiteren bezieht sich der Ausdruck „Hyaluronsäure-Derivat" auch auf selbstvernetzte Derivate der Hyaluronsäure, die hierin als „ACP" bezeichnet werden, die interne Ester einschließen und in denen etwa 0,5% bis etwa 20% der Carboxylgruppen des Hyaluronsäurepolymers mit Hydroxylgruppen des selben oder eines anderen Hyaluronsäuremoleküls vernetzt sind. Solche Moleküle sind nachfolgend ausführlicher beschrieben.
Der Ausdruck „Microsphäre", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Hyaluronsäurepartikel mit einem Durchmesser von etwa 100 nm bis etwa 150 μm, stärker bevorzugt mit einem Durchmesser von etwa 200 nm bis etwa 30 μm und am stärksten bevorzugt mit einem Durchmesser von etwa 500 nm bis etwa 10 μm. Die Größe der Microsphäre wird ohne weiteres durch Techniken, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie z.B. Photonen-Korrelationsspektroskopie, Laser-Diffraktometrie und/oder Scanner-Elektronenmikroskopie bestimmt. Für die Verwendung hierin werden Microsphären aus Hyaluronsäurepolymeren und Derivaten davon erzeugt, die nicht toxisch und biologisch abbaubar sind, wie nachfolgend ausführlicher beschrieben.
Der Ausdruck „Alkyl", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine verzweigte oder nicht verzweigte gesättigte Kohlenwasserstoffgruppe mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen wie z.B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Octyl, Decyl, Tetradecyl, Hexadecyl, Eicosyl, Tetracosyl und dergleichen sowie Cycloalkylgruppen wie z.B. Cyclopentyl, Cyclohexyl, Benzyl und dergleichen.
Mit „mukosaler" Abgabe ist die Abgabe eines Antigens an eine Schleimhautoberfläche einschließlich der nasalen, pulmonalen, vaginalen, rektalen, urethralen und sublingualen oder bukkalen Abgabe gemeint.
Mit „Antigen" ist ein Molekül gemeint, das ein Epitop oder mehrere Epitope enthält, die das Immunsystem des Wirts stimulieren, um eine zelluläre, Antigenspezifische Immunantwort hervorzurufen, wenn das Antigen präsentiert wird, oder eine humorale Antikörperantwort. Normalerweise wird ein Epitop etwa zwischen 3 – 15, im Allgemeinen zwischen 5 – 15 Aminosäuren einschließen.
Für die Zielsetzungen der vorliegenden Erfindung können Antigene von jedem der verschiedenen bekannten Viren, Bakterien, Parasiten und Pilze abgeleitet werden. Der Ausdruck beinhaltet ebenfalls jedes der verschiedenen Tumorantigene. Des weiteren bezieht sich ein „Antigen" für die Zielsetzungen der vorliegenden Erfindung auf ein Protein, das Modifikationen der nativen Sequenz einschließt, wie z.B. Deletionen, Additionen und Substitutionen (im Allgemeinen konservativ in der Natur), solange das Protein die Fähigkeit behält, eine immunologische Antwort hervorzurufen. Diese Modifikationen können vorsätzlich wie z.B. durch ortsgerichtete Mutagenese oder zufällig sein wie z.B. durch Mutationen der Wirte, welche die Antigene herstellen.
Eine „immunologische Antwort" auf ein Antigen oder auf eine Zusammensetzung wird in einem Individuum als eine humorale und/oder eine zelluläre Immunantwort auf Moleküle, die in der Zusammensetzung des Interesses vorhanden sind, entwickelt. Für die Zielsetzungen der vorliegenden Erfindung bezieht sich eine „humorale Immunantwort" auf eine Immunantwort, die durch Antikörpermoleküle vermittelt wird, während eine „zelluläre Immunantwort" durch T-Lymphozyten und/oder andere weiße Blutzellen vermittelt wird. Ein wichtiger Aspekt der zellulären Immunität beinhaltet eine Antigen-spezifische Antwort durch cytolytische T-Zellen („CTLs"). CTLs sind spezifisch für Peptidantigene, die in Verbindung mit Proteinen präsentiert werden, die durch den Haupt-Histokompatibilitätskomplex (MHC) kodiert und auf den Oberflächen von Zellen exprimiert werden. CTLs helfen, die intrazelluläre Zerstörung von intrazellulären Mikroben oder die Lyse von Zellen, die mit solchen Mikroben infiziert sind, zu induzieren und zu fördern. Ein anderer Aspekt der zellulären Immunität beinhaltet eine Antigen-spezifische Antwort durch T-Helfer-Zellen. T-Helfer-Zellen funktionieren, indem sie helfen, die Funktion und den Fokus der Aktivität von unspezifischen Effektorzellen gegen Zellen zu stimulieren und die Aktivität von unspezifischen Effektorzellen auf Zellen zu konzentrieren, wobei diese Zellen Peptid-Antigene in Verbindung mit MHC-Molekülen auf ihrer Oberfläche zeigen. Eine „zelluläre Immunantwort" bezieht sich ebenfalls auf die Herstellung von Cytokinen, Chemokinen und anderen solchen Molekülen, die von aktivierten T-Zellen und/oder weißen Blutzellen hergestellt werden, einschließlich solchen, die von CD4+ und CD8+ T-Zellen abgeleitet sind.
Eine Zusammensetzung oder ein Impfstoff, die/der eine zelluläre Immunantwort hervorruft, kann dazu dienen, ein Wirbeltier durch die Präsentation des Antigens in Verbindung mit MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche zu sensibilisieren. Die zellvermittelte Immunantwort ist auf Zellen, die das Antigen auf ihrer Oberfläche präsentieren, gerichtet oder in ihre Nähe. Zusätzlich können Antigen-spezifische T-Lymphocyten hergestellt werden, um für die Zukunft den Schutz eines immunisierten Wirts zu erlauben.
Die Fähigkeit eines bestimmten Antigens oder einer Zusammensetzung, eine zellvermittelte immunologische Antwort zu stimulieren, kann durch eine Anzahl von Untersuchungen wie z.B. durch Lymphoproliferations- (Lymphocyten-Aktivierungs)-Untersuchungen, cytotoxische Zelluntersuchungen mit CTLs oder durch Untersuchung der T-Lymphocyten, die für das Antigen spezifisch sind, in einem sensibilisierten Individuum bestimmt werden. Solche Untersuchungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Vergl. z.B. Erickson et al., J Immunol (1993) 151: 4189–4199; Doe et al., Eur J Immunal (1994) 24: 2369–2376; und die folgenden Beispiele.
Daher kann eine immunologische Antwort, wie sie hierin verwendet wird, eine sein, welche die Herstellung von CTLs stimuliert und/oder die Herstellung oder die Aktivierung von T-Helfer-Zellen. Das Antigen des Interesses kann ebenfalls eine Antikörper-vermittelte Immunantwort hervorrufen. Daher kann eine immunologische Antwort eine oder mehrere der nachfolgenden Effekte einschließen: die Herstellung von Antikörpern durch B-Zellen; und/oder die Aktivierung T-Suppressorzellen und/oder T-yσ-Zellen, die spezifisch gegen ein Antigen oder gegen Antigene gerichtet sind, die in der Zusammensetzung oder im Impfstoff des Interesses vorhanden sind. Diese Antworten können zur Neutralisierung von Infektionen dienen und/oder ein Antikörper-Komplement oder eine Antikörper-abhängige Zellcytotoxizität (ADCC) vermitteln, um Schutz eines immunisierten Wirts bereitzustellen. Solche Antworten können unter Verwendung von Standard-Immununtersuchungen und Neutralisationsuntersuchungen bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind.
Eine Impfstoffzusammensetzung, die ein ausgewähltes Antigen in Kombination mit einem Hyaluronsäurepolymer enthält, wie hierin beschrieben wird, zeigt eine „verstärkte Immunogenität", wenn sie eine größere Fähigkeit besitzt, eine Immunantwort hervorzurufen, als die Immunantwort, die durch eine äquivalente Menge des Antigens ohne das Hyaluronsäurepolymer hervorgerufen wird. Daher kann eine Impfstoffzusammensetzung eine „verstärkte Immunogenität" zeigen, da das Antigen leichter von dem Wirbeltier absorbiert wird oder da das Antigen stärker immunogen ist oder da eine niedrigere Dosis des Antigens notwendig ist, um eine Immunantwort des Individuums, dem es verabreicht wurde, hervorzurufen. Solch eine verstärkte Immunogenität kann durch das Verabreichen der Polymer/Antigen-Zusammensetzung und Antigen-Kontrollen an Tiere und durch den Vergleich der Antikörpertiter gegeneinander unter Verwendung von Standarduntersuchungen wie z.B. Radioimmununtersuchungen und ELISAs, bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind.
Die Begriffe „effektive Menge" oder „pharmakologisch effektive Menge" eines Wirkstoffs, wie hierin angegeben wird, bezieht sich auf eine nicht toxische, aber ausreichende Menge des Wirkstoffes, um die gewünschte Immunantwort und den entsprechenden therapeutischen Effekt bereitzustellen. Wie nachstehend verdeutlicht wird, wird die genaue Menge, die benötigt wird, von Individuum zu Individuum variieren, abhängig von der Art, dem Alter und der allgemeinen Verfassung des Individuums, der Schwere des Zustandes, der behandelt werden soll, und dem bestimmten Antigen des Interesses, der Art der Abgabe und dergleichen. Eine geeignete „effektive" Menge kann in jedem individuellen Fall durch den Fachmann unter Verwendung von Routineuntersuchungen bestimmt werden.
Der Ausdruck „Behandlung", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich sowohl auf (i) die Verhinderung der Infektion oder Reinfektion wie bei einem traditionellen Impfstoff, (ii) die Verminderung oder Eliminierung der Symptome und (iii) die deutliche oder vollständige Eliminierung des fraglichen Pathogens. Die Behandlung kann prophylaktisch (vor der Infektion) oder therapeutisch (nach der Infektion) durchgeführt werden.
Mit „pharmazeutisch verträglich" oder „pharmakologisch verträglich" ist ein Material gemeint, das nicht biologisch oder auf andere Weise unerwünscht ist, das heißt, das Material kann einem Individuum zusammen mit den Micropartikel-Formulierungen verabreicht werden, ohne dass unerwünschte biologische Effekte hervorgerufen werden oder dass Interaktionen mit einer der Komponenten der Zusammensetzung, in der es enthalten ist, in einer schädlichen Weise stattfinden.
Unter „Wirbeltier" ist jedes Mitglied der Unterabteilung Cordata gemeint, einschließlich, ohne Begrenzung darauf, des Menschen und anderer Primaten, einschließlich nichtmenschlicher Primaten wie z.B. Schimpansen und anderer Affen und Affenarten, Farmtiere wie z.B. Rinder, Schafe, Schweine, Ziegen und Pferde; Haustiere wie z.B. Hunde und Katzen, Labortiere einschließlich Nagetiere wie z.B. Mäuse, Ratten und Meerschweinchen; Vögel einschließlich Haus-, Wild- und Jagdvögel wie z.B. Hühner, Truthähne und andere Hühnervögel, Enten, Gänse und dergleichen. Der Ausdruck bezieht sich nicht auf ein bestimmtes Alter. Deshalb wird beabsichtigt, sowohl erwachsene als auch neugeborene Individuuen abzudecken. Es wird beabsichtigt, das vorstehend beschriebene System in jedem der vorstehenden Wirbeltierarten anzuwenden, da die Immunsysteme aller dieser Wirbeltiere auf ähnlicher Weise operieren.
II. Arten der Ausführung der Erfindung
Bevor die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben wird, sollte es selbstverständlich sein, dass die Erfindung nicht auf bestimmte Formulierungen oder Verfahrensparameter beschränkt ist, die natürlich variieren können. Es sollte ebenfalls selbstverständlich sein, dass die hierin verwendete Terminologie nur mit der Absicht der Beschreibung bestimmter Ausführungsformen der Erfindung verwendet wird, und nicht mit der Absicht der Einschränkung.
Obwohl eine Anzahl von Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu denen sind, die hierin beschrieben werden, bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Materialien und Verfahren hierin beschrieben.
Die vorliegende Erfindung verwendet Hyaluronsäure vermittelte Abgabetechniken, um eine Immunantwort gegen Pathogene zu erzeugen, die über die Schleimhaut übertragen werden. Das System ruft eine starke Immunantwort hervor, auch wenn das Antigen allein nur schwach immunogen ist. Obwohl die individuellen Komponenten der Impfstoffzusammensetzungen und Verfahren, die hierin beschrieben werden, bekannt waren, war es unerwartet und überraschend, dass solche Kombinationen die Effizienz der Antigene über Werte hinaus verstärken, die erreicht werden, wenn die Komponenten einzeln verwendet werden.
Obwohl die Erfindung in einem weiten Bereich anwendbar ist, um eine Immunantwort gegen die vorstehend erwähnten Pathogene bereitzustellen, wird die Erfindung hierin beispielhaft durch die Bezugnahme auf das Grippe(Influenza)-Virus gezeigt.
Das Verfahren der Erfindung stellt eine zellvermittelte Immunität und/oder humorale Antikörperantworten zur Verfügung. Dementsprechend werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung für jedes Antigen Verwendung finden, für das zelluläre und/oder humorale Immunantworten erwünscht sind, einschließlich Antigene, die von viralen, bakteriellen, Pilz und parasitären Pathogenen abgeleitet sind, welche Antikörper, Epitope für T-Helfer-Zellen und Epitope für cytotoxische T-Zellen induzieren können. Diese Antigene schließen solche ein, die von menschlichen und tierischen Viren codiert werden, sind aber nicht auf diese begrenzt, und können entweder strukturellen oder nichtstrukturellen Proteinen entsprechen.
Zum Beispiel wird die vorliegende Erfindung Verwendung für die Stimulation einer Immunantwort gegen eine große Vielfalt von Proteinen aus der Herpesvirusfamilie finden, einschließlich Proteine, die von Herpes-simplex-Virus (HSV)-Typen 1 und 2 wie z.B. HSV-1- und HSV-2-Glycoproteine gB, gD und gH abgeleitet sind; Antigene, die vom Varicella Zoster-Virus (VZV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Cytomegalievirus (CMV) einschließlich CMV-gB und -gH abgeleitet sind; und Antigene, die von anderen menschlichen Herpesviren wie z.B. HHV6 und HHV7 abgeleitet sind. (Vergl. z.B. Chee et al., Cytomegalieviruses (JK McDougall, Hrsg., Springer-Verlag, 1990) S. 125–169, für einen Übersichtsartikel über den Protein-Codierungsgehalt des Cytomegalievirus; McGeoch et al., J Gen Virol (1988) 69: 1531–1574, für eine Diskussion der verschiedenen HSV-1 codierten Proteine; US-Patent Nr. 5,171,568 für eine Diskussion der HSV-1- und HSV-2-gB- und gD-Proteine und der dafür codierenden Gene; Baer et al., Nature (1984) 310: 207–211, für die Identifizierung von Protein codierenden Sequenzen in einem EBV-Genom; und Davison und Scott, J Gen Virol (1986) 67: 1759–1816, für einen Übersichtsartikel über VZV.)
Antigene von der Hepatitis-Familie von Viren, einschließlich Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), das Delta-Hepatitis-Virus (HDV), Hepatitis-E-Virus (HEV) und Hepatitis-G-Virus (HGV) können ebenfalls ohne weiteres in den hierin beschriebenen Techniken verwendet werden. Zum Beispiel ist die virale genomische Sequenz von HCV bekannt und auch Verfahren, um die Sequenz zu erhalten. Vergl. z.B. die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 89/04669; WO 90/11089 und WO 90/14436. Das HCV-Genom codiert verschiedene virale Proteine, einschließlich E1 (auch als E bekannt) und E2 (auch als E2/NSI bekannt) und eines N-terminalen Nucleocapsid-Proteins (auch „Kern" genannt) (vergl. Houghton et al., Hepatology (1991) 14: 381–388, für eine Diskussion der HCV-Proteine, einschließlich E1 und E2). Jedes dieser Proteine sowie die antigenen Fragmente davon werden in den vorliegenden Verfahren Verwendung finden.
Gleichermaßen ist die Sequenz des δ-Antigens von HDV bekannt (vergl. z.B. US Patent Nr. 5,378,814) und dieses Antigen kann ebenfalls ohne weiteres in den vorliegenden Verfahren verwendet werden. Zusätzlich werden Antigene, die vom HBV abgeleitet sind, wie z.B. das Kern-Antigen, das Oberflächen-Antigen sAg sowie die Präoberflächensequenzen prä-S1 und prä-S2 (früher als prä-S bezeichnet) sowie Kombinationen der vorstehenden Antigene wie z.B. sAg/prä-S1, sAg/prä-S2, sAg/prä-S1/prä-S2 und präS1/prä-S2 hierin Verwendung finden. Vergl. z.B. „HBV Vaccines – from the laboratory to license: a case study" in Mackett M und Williamson JD, Human Vaccines and Vaccination, S 159–176, für eine Diskussion der HBV-Strukturen; und US-Patent Nr. 4,722,840, 5,098,704, 5,324,513, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden; Beames et al., J Virol (1995) 69: 6833–6838; Birnbaum et al., J Virol (1990) 64: 3319–3330; und Zhou et al., J Virol (1991) 65: 5457–5464.
Antigene, die von anderen Viren abgeleitet werden, werden ebenfalls in den in den Ansprüchen enthaltenen Verfahren Verwendung finden, wie z.B., ohne Begrenzung darauf, Proteine von Mitgliedern der Familien der Picornaviridae (z.B. Polioviren, etc.); der Caliciviridae; der Togaviridae (z.B. Rubella-Virus, Dengue-Virus, etc.); der Flaviviridae; der Coronaviridae; der Reoviridae; der Birnaviridae; der Rhabodoviridae (z.B. Tollwutvirus, etc.); Filoviridae, Paramyxoviridae (z.B. Mumpsvirus, Masernvirus, respiratorisches Synctial-Virus, etc.); Orthomyxoviridae (z.B. Grippevirus Typ A, B und C, etc.); Bunyaviridae, Arenaviridae; Retroviradae (z.B. HTLV-I, HTLV-II, HIV-1 (auch als HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc. bekannt), einschließlich, aber nicht begrenzt auf Antigene von den Isolaten HIV_IIIb, HIV_SF2, HIV_LAV, HIV_LAI, HIV_MN; HIV-1_CM235, HIV-1_US4; HIV-2; Affen-Immunschwächevirus (SIV)) und andere. Zusätzlich können Antigene auch vom menschlichen Papillomavirus (HPV) und den von Zecken übertragenen Enzephalitisviren abgeleitet sein. Vergl. z.B. Virology, 3. Ausgabe (WK Joklin, Hrsg. 1988); Fundamental Virology, 2. Ausgabe (BN Fields und DM Knipe, Hrsg., 1991) für eine Beschreibung dieser und anderer Viren.
Insbesondere sind die Hüllproteine gp120 von einem der vorstehend erwähnten HIV-Isolate, einschließlich der Mitglieder der verschiedenen genetischen Untertypen von HIV, bekannt und dokumentiert (vergl. z.B. Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); Myers et al., Human Retroviruses and AIDS, 1990, Los Alamos, New Mexico: Los Alamos National Laboratory; und Modrow et al., J Virol (1987) 61: 570–578, für einen Vergleich der Hüllsequenzen von einer Vielfalt von HIV-Isolaten) und die Antigene von jedem dieser Isolate werden Verwendung in den vorliegenden Verfahren finden. Des weiteren ist die Erfindung genauso für andere immunogene Proteine anwendbar, die von einem der verschiedenen HIV-Isolate abgeleitet sind, einschließlich einem der verschiedenen Hüllproteine wie z.B. gp160 und gp41, gag-Antigene wie z.B. p24gag und p55gag sowie Proteine, die von der pol-Region abgeleitet sind. Wie vorstehend erklärt wurde, ist das Grippevirus ein weiteres Beispiel eines Virus, für den die vorliegende Erfindung besonders nützlich sein wird.
Insbesondere sind die Hüll-Glycoproteine HA und NA von Influenza A von besonderem Interesse für die Erzeugung einer Immunantwort. Zahlreiche HA-Subtypen von Influenza A wurden identifiziert (Kawaoka et al., Virologie (1990) 179: 759–767; Webster et al., „Antigenic variation among typ A influenza viruses", S.127–168, in: P Palese und DW Kingsbury (Hrsg.), Genetics of influenza viruses, Springer-Verlag, New York). Daher können Proteine, die von jedem dieser Isolate abgeleitet sind, auch für die hierin beschriebenen Immunisierungstechniken verwendet werden.
Die Verfahren, die hierin beschrieben sind, werden auch eine Verwendung für zahlreiche bakterielle Antigene finden, wie z.B. solche, die von Organismen abgeleitet sind, die Diphtherie, Cholera, Tuberkulose, Tetanus, Keuchhusten, Meningitis und andere pathogene Zustände verursachen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Meningococcus A, B und C, Hämophilus influenza Typ B (HIB) und Helicobacter pylori. Beispiele parasitischer Antigene schließen solche ein, die von Organismen abgeleitet sind, die Malaria und die Lyme-Krankheit verursachen.
Des weiteren stellen die Verfahren, die hierin beschrieben sind, ein Mittel zur Behandlung einer Vielfalt von malignen Krebsarten zur Verfügung. Zum Beispiel kann das System der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, sowohl humorale als auch zellvermittelte Immunantworten auf bestimmte Proteine hervorzurufen, die für den in Frage kommenden Krebs spezifisch sind, wie z.B. ein aktiviertes Oncogen, ein fötales Antigen oder einen Aktivierungsmarker. Solche Tumorantigene schließen jede der verschiedenen MAGEs (Melanom assoziiertes Antigen E) einschließlich MAGE 1, 2, 3, 4, etc. (Boon T, Scientific American (März 1993): 82–89) ein; jede der verschiedenen Tyrosinasen; MART 1 (von T-Zellen erkanntes Melanom-Antigen); mutiertes ras; mutiertes p53; Melanom-Antigen p97; CEA (carcinoembryonales Antigen) und andere.
Es ist ohne weiteres erkennbar, dass die vorliegende Erfindung dafür verwendet werden kann, eine große Vielfalt von Krankheiten zu verhindern oder zu behandeln.
Das ausgewählte Antigen wird mit dem Hyaluronsäurepolymer für die nachfolgende Abgabe an die Schleimhaut kombiniert. Hyaluronsäurepolymere zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen sind z.B. von Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abano Terme, Italien) erhältlich. Für die hierin beschriebenen Verfahren nützliche Polymere schließen zum Beispiel veresterte und selbstvernetzte Derivate der Hyaluronsäure ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Diese Polymere sind in einer Vielfalt von unterschiedlichen Molekulargewichten erhältlich und das geeignete Molekulargewicht für die Verwendung mit einem gegebenen Antigen wird ohne weiteres von einem Fachmann bestimmt werden. So wird z.B. ein geeignetes Molekulargewicht für ein verestertes Derivat in der Größenordnung von etwa 2000 bis 300.000 sein, stärker bevorzugt von etwa 50.000 bis etwa 250.000, noch stärker bevorzugt von etwa 75.000 bis etwa 200.000 und am stärksten bevorzugt von etwa 100.000 bis etwa 150.000.
Besonders nützliche veresterte Formen der Hyaluronsäure sind solche, bei denen etwa 75–100% Carboxylgruppen mit einer Alkylgruppe wie z.B. einer Ethyl-, Propyl-, Pentyl-, Benzyl-, Dodecylgruppe und dergleichen verestert sind und die durch die Reaktion der freien Carboxylgruppen mit dem entsprechenden Alkohol erzeugt wurden. Solche Derivate werden besonders aufgrund ihrer biologischen Verträglichkeit und ihrer Fähigkeit, durch Hydrolyse der Esterbindungen biologisch abgebaut zu werden, bevorzugt. Reste, die nicht wie vorstehend mit einer Alkylgruppe verestert sind, können mit den Lipidketten/Alkylresten eines C_10–20-aliphatischen Alkohols umgesetzt werden, um „gemischte" Ester herzustellen. In dieser Ausführungsform sind vorzugsweise 75% der Carboxylgruppen z.B. mit Benzylgruppen verestert und mindestens etwa 5% der restlichen Gruppen sind mit aliphatischen Alkoholen verestert. Vergl. z.B. die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/07833.
Eine repräsentative Struktur einer veresterten Hyaluronsäure ist nachfolgend als Struktur 2 gezeigt, wobei R eine Alkylgruppe darstellt, wie vorstehend beschriebenen wurde.
Solche Derivate sind z.B. im US-Patent Nr. 4,851,521 und 4,965,353 und in der Europäischen Patentveröffentlichung Nr. 517,565 beschrieben und sind z.B. von Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abano Terme, Italien) erhältlich. Repräsentative Formulierungen schließen solche ein, die als HYAFF7 (Ethylester), HYAFF9 (Propylester), HYAFF11 (Benzylester), HYAFF21 (Pentylester), HYAFF73 (Dodecylester) und dergleichen bekannt sind, die zu etwa 100% verestert sind; und HYAFF11 p50 (Benzylester), HYAFF7p75 (Ethylester) und HYAFF11p75 (Benzylester), etc., die zu etwa 50 bis 75% verestert sind.
Diese Derivate werden ohne weiteres durch die Umsetzung der freien Carboxylgruppen, die in der Hyaluronsäure vorhanden sind, mit einem Alkohol in der Anwesenheit von katalysierenden Substanzen wie z.B. starken anorganischen Säuren oder Ionenaustauschern des Säuretyps hergestellt oder durch einen veräthernden Wirkstoff, der die gewünschten Alkoholreste in Gegenwart von anorganischen oder organischen Basen einbringen kann. Zum Beispiel kann ein quartäres Ammoniumsalz der Hyaluronsäure mit einem veräthernden Wirkstoff wie z.B. einem aprotischen organischen Lösungsmittel behandelt werden, wie in der Europäischen Veröffentlichung Nr. 216,453 beschrieben wurde. Vergl. auch die Europäische Veröffentlichung Nr. 433,133 und US-Patent Nr. 4,851,521 und 4,965,353, die hierin durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen wurden.
Der Grad und der Typ der Veresterung können unterschiedlich sein und sind großenteils eine Frage der Wahl, zum Teil abhängig von dem mitverabreichten Antigen, dem Grad der gewünschten Bioadhäsion sowie von der gewünschten Abgaberate, wie nachfolgend ausführlicher beschrieben wird. Ein geeigneter prozentualer Anteil und der Typ der Veresterung wird leicht basierend auf der Natur des Antigens und der in Frage kommenden Krankheit durch den Fachmann bestimmt.
Wie vorstehend beschrieben wurde, werden die als ACP bekannten Derivate der Hyaluronsäure hierin auch für die Abgabe von Impfstoffantigenen Verwendung finden. Im Allgemeinen werden ACPs zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung solche sein, in denen etwa 0,5 bis etwa 20%, vorzugsweise etwa 3% bis etwa 10% und am stärksten bevorzugt etwa 4% bis etwa 5% der Carboxylgruppen des Hyaluronsäurepolymers mit Hydroxylgruppen des gleichen oder eines anderen Hyaluronsäuremoleküls vernetzt sind. Der Rest des Moleküls kann als Salz vorliegen. Eine bevorzugte Form eines ACP zur Verwendung hierin ist eine viskose, Gel-ähnliche Zusammensetzung. Vergl. z.B. die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/07883.
ACP-Derivate werden hergestellt, indem zunächst Hyaluronsäure, die entweder freie Carboxylgruppen oder in Salz überführte Carboxylgruppen besitzt, durch einen Wirkstoff aktiviert wird, der die Carboxylfunktion aktiviert. Typische Wirkstoffe schließen Carbodiimide, Dicyclohexylcarbodiimide, Benzylisopropylcarbodiimide, Benzylethylcarbodiimide, Ethoxyacetylen, Halogenderivate von aliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffen und dergleichen ein. Hilfsmittel können vorhanden sein, welche die Erzeugung von aktivierten Zwischenformen von Derivaten fördern, und/oder eine tertiäre organische oder anorganische Base wie z.B. Triethylamin.
Die Aktivierung wird in einem organischen, aprotischen Lösungsmittel wie z.B. DMSO durchgeführt und das Gemisch wird Hitze oder Bestrahlung (besonders UV-Licht) ausgesetzt. Auf diese Weise werden unstabile Zwischenformen erzeugt, die spontan zerfallen, entweder nach der Zugabe von katalysierenden Mitteln und/oder nach einer Erhöhung der Temperatur, wobei innere Esterbindungen mit Hydoxylen des gleichen oder von anderen Hyaluronsäuremolekülen erzeugt werden. Vergl. z.B. die Europäische Veröffentlichung Nr. 341,745 und die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/07883 für Verfahren zur Herstellung dieser Derivate.
Die vorstehend beschriebenen Derivate der Hyaluronsäure können als Microsphären zur Verfügung gestellt werden, entweder mit einem adsorbierten oder physikalisch aufgenommenen (eingeschlossenen) Antigen, wobei jede von verschiedenen Techniken verwendet werden kann, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel können die Microsphären unter Verwendung von Lösungsmittelverdampfung und Extraktionstechniken hergestellt werden. Im Allgemeinen umfassen diese Verfahren die Herstellung einer Emulsion von zwei nicht mischbaren Flüssigkeiten, welche die diskontinuierlichen und kontinuierlichen Phasen genannt werden. Die diskontinuierliche Phase schließt Mikrotropfen der Polymer/Lösungsmittellösung ein, die das Antigen enthält (falls es eingeschlossen sein soll). Die diskontinuierliche Phase wird anschließend mit einer kontinuierlichen wässrigen Phase gemischt, die einen Partikelstabilisator/grenzflächenaktivierendes Mittel enthält. Nachdem die Emulsion stabilisiert ist, wird die diskontinuierliche Phase durch Verdampfung oder durch Extraktion entfernt. Vergl. z.B. Benedetti et al., J Controlled Rel (1990) 13: 33–41; Ghezzo et al., Int J Pharm (1992) 87: 21–29; Illum et al., J Controlled Rel (1994) 29: 133–141, die Europäische Veröffentlichung Nr. 517,565.
Insbesondere wird ein geeignetes Derivat der Hyaluronsäure in einem Lösungsmittel gelöst, wobei das Lösungsmittel so ausgewählt wird, dass es chemisch nicht mit dem Polymer oder dem Antigen reagiert und dass es nicht mischbar in der kontinuierlichen Phase ist. Eine beliebige Anzahl von Lösungsmittel kann verwendet werden wie zum Beispiel ein aprotisches Lösungsmittel, einschließlich aber nicht beschränkt auf Dimethylsulfoxid (DMSO), 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol (HFIP) und dergleichen. Das Polymer wird in einer Konzentration von etwa 0,5% bis etwa 10% (w/v), vorzugsweise von etwa 1 % bis etwa 8% (w/v) und am stärksten bevorzugt von etwa 6% bis etwa 8% (w/v) zugegeben. Abhängig von dem verwendeten Antigen und der gewünschten Ladung wird eine Menge des Antigens zugegeben, die in eine Microsphäre mit ungefähr 0,1 % bis etwa 40% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer, vorzugsweise mit etwa 1 % bis etwa 25% (w/w) Antigen und noch stärker bevorzugt mit etwa 2% bis etwa 20% (w/w) Antigen resultiert. Dieses Gemisch erzeugt die diskontinuierliche Phase.
Ein Gemisch der kontinuierlichen Phase wird hergestellt, das ein zweites Lösungsmittel umfasst, im Allgemeinen ein hoch viskoses Öl wie z.B. schweres Mineralöl oder Paraffinöl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Ein Emulsionsstabilisator ist vorhanden wie z.B. ein nichtionisches grenzflächenaktivierendes Mittel, einschließlich zum Beispiel Mannid-Monooleat (Arlacel A^®), Dextran 70.000, Polyoxyethylenether (Triton^®), Polyglycolether (Tergitol^®) und dergleichen, wobei alle kommerziell ohne weiteres von z.B. Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, erhältlich sind. Das grenzflächenaktivierende Mittel wird in einer Konzentration von etwa 0,3% bis etwa 10%, vorzugsweise von etwa 0,5% bis etwa 8% und noch stärker bevorzugt von etwa 1 % bis etwa 5% vorhanden sein.
Um Microsphären herzustellen, wird die diskontinuierliche Phase anschließend zu der kontinuierlichen Phase in einem Verhältnis von etwa 1:16 zugegeben und eine Emulsion wird z.B. durch mechanisches Rühren bei etwa 700 bis 1000 UpM erzeugt. Organische Lösungsmittel werden dann verdampft oder extrahiert. Wenn diese verdampft werden, wird die Emulsionstemperatur unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels gehalten und sie wird stufenweise erhöht (wobei sie immer noch unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels gehalten wird), bis das Lösungsmittel verdampft ist. Vergl. z.B. das US-Patent Nr. 3,891,570 und Benedetti et al., J Controlled Rel (1990) 13: 33–41.
Wenn eine Extraktion erfolgt, wird ein geeignetes Extraktionslösungsmittel, das heißt, ein Lösungsmittel für das diskontinuierliche Phasenlösungsmittel, aber nicht für das Derivat der Hyaluronsäure, zu der Emulsion in einem Verhältnis von etwa 2:1 (v/v) zugegeben und die Lösung wird anschließend gerührt, bis die Microsphären erzeugt sind. Wenn zum Beispiel DMSO verwendet wird, kann es unter Verwendung von Ethylacetat oder Acetylacetat extrahiert werden. Andere geeignete Extraktionslösungsmittel können ohne weiteres von einem Fachmann bestimmt werden. Für eine weitere Beschreibung von Techniken der Lösungsmittelextraktion vergl. z.B. Illum et al., J Contolled Rel (1994) 29: 133–141; und Ghezzo et al., Int J Pharm (1992) 87: 21–29; und die Europäische Veröffentlichung Nr. 517,565.
Wenn das Lösungsmittel der Dispersionssphase entfernt ist, werden die suspendierten Microsphären von der Ölphase durch Zentrifugation getrennt. Die Microsphären können in einem geeigneten Lösungsmittel wie z.B. Hexan resuspendiert werden, um das im Überschuss vorhandene Mineralöl und das grenzflächenaktivierende Mittel zu entfernen, und die Lösung wird anschließend gefiltert. Dieser Prozess kann einige Male wiederholt werden, um die Entfernung des Lösungsmittels sicherzustellen. Die Microsphären werden dann luftgetrocknet oder unter Vakuum getrocknet.
In einer anderen Ausführungsform können Microsphären auch unter Verwendung der Zerstäubungstrocknung erzeugt werden, wie z.B. in Kyyronen et al., Int J Pharm (1992) 80: 161–169; Ghezzo et al., Int J Pharm (1992) 87: 21–29; und Masters K (1976), Spray Drying, 2. Ausgabe, Wiley, New York, beschrieben wurde. Besonders kleine Microsphären, die „Nanospären" genannt werden, können hergestellt werden, indem superkritische Antilösungsmittel (SAS) verwendet werden, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 96/29998 beschrieben wurde.
Die Rate der Freisetzung des Antigens von den Hyaluronsäure-Zusammensetzungen kann in Abhängigkeit vom Verfahren modifiziert werden, das dazu verwendet wurde, das Antigen mit den Microsphären zu verbinden. Wenn zum Beispiel das Antigen physikalisch in der Polymermatrix verteilt ist, wird die Freisetzung hauptsächlich durch die Diffusionsrate des Antigens durch das Polymernetz kontrolliert. Des weiteren schließen Microsphären mehr poröse Oberflächen ein, wenn die Lösungsmittel extrahiert und nicht verdampft werden, was zu einer schnelleren Freisetzung des eingeschlossenen Antigens führt.
Des weiteren vermindert die Veresterung von Carboxylgruppen die Bioadhäsion von Hyaluronsäure durch die verminderte Tendenz der Ester, Wasserstoffbrücken mit dem biologischen Substrat zu erzeugen. Zusätzlich wird die Hydrophobizität der Microsphären, die durch die verschiedenen Ester und Grade der Vernetzung vermittelt wird, das Ausmaß der Bioadhäsion beeinflussen, da das Schleimhautgewebe eine merkliche Hydrophobizität zu zeigen scheint, die eine wichtige Bedeutung für die biologische Klebestärke haben kann. Daher führt zum Beispiel ein höherer Grad der Veresterung im Allgemeinen zu einer langsameren und verminderten Freisetzung des eingeschlossenen Proteins, erzeugt aber eine Microsphäre mit verstärkten Bioadhäsionseigenschaften.
Zusätzlich werden biologische Faktoren wie z.B. die ziliare Schlagfrequenz sowie physikalische Faktoren wie z.B. Partikelgröße, Dichte und der Grad der Gruppierung und die Löslichkeit des Antigens in Wasser den Grad der Bioadhäsion und der biologischen Erosion beeinflussen. Vergl. z.B. Pritchard et al., Int J Pharm (1996) 129: 137–145.
Des weiteren werden Gemische von Microsphären mit verschiedenen Estern, mit verschiedenen Stärken der Veresterung sowie verschiedenen Graden der Vernetzung in den Formulierungen Verwendung finden, um die gewünschten Kinetiken der Bioadhäsion und der Freisetzung für ein gegebenes Antigen zu erzielen und um sowohl eine primäre als auch eine sekundäre Immunantwort bereitzustellen.
Sobald sie erzeugt wurde, kann die Adhäsionsfähigkeit einer bestimmten Hyaluronsäure/Antigen-Kombination unter Verwendung einer Anzahl von Verfahren bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Formulierung die geeigneten Bioadhäsionseigenschaften besitzt. Zum Beispiel können in-vitro-Ablösungsgewichtsstudien durchgeführt werden, die auf den Messungen der Oberflächenspannung basieren. Vergl. z.B. Smart et al., J Pharm Pharmacol (1984) 36: 295–299. In Kürze, Test-Microsphären werden an einem biologischen Substrat wie z.B. Epithelgewebe angewendet und Ablösungsgewichtsstudien werden durchgeführt, wobei ein Apparat verwendet wird, der das Gewicht bestimmt, das benötigt wird, um zwei Gewebeschnitte von dem zu testenden Bioadhäsionsstoff zu lösen, der zwischen ihnen eingebettet ist. Vergl. z.B. Pritchard et al., Int J Pharm (1996) 129: 137–145. In einer anderen Ausführungsform kann die mukoziliäre Transportrate als ein Bestimmungsfaktor der Adhäsionsfähigkeit verwendet werden, da je größer die Adhäsionsfähigkeit der Testsubstanz ist, desto langsamer ist die Transportrate. Solche Studien können z.B. durch Überwachung der Bewegung der Bioadhäsionsstoffe entlang eines Teils eines herausgeschnittenen Gaumens des Frosches (Rana pipiens) durchgeführt werden, wie vorstehend in Prichard et al. beschrieben wurde.
Auf ähnliche Weise kann die Rate der biologischen Erosion der Microsphären bestimmt werden, wobei Standardtechniken verwendet werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie z.B. in-vitro-Freisetzungsprofile, um zu bestimmen, ob die in Frage kommende Formulierung des Hyaluronsäure/Antigens eine adäquate Menge des Antigens dem Immunsystem für die gegebene Erkrankung zur Verfügung stellt. Zum Beispiel können Auflösungstest durchgeführt werden, in dem z.B. Microsphären in einem geeigneten Puffer wie z.B. einem Phosphatpuffer oder BSA unter kontinuierlichem Rühren dispergiert werden. Proben der Lösung werden nach festgelegten Zeitintervallen entnommen und auf das Antigen des Interesses untersucht, wobei z.B. ELISAs oder eine andere geeignete Analyse verwendet werden. Vergl. z.B. Ghezzo et al., Int J Pharm (1992) 87: 21–29.
Die Partikelgröße kann z.B. durch Laserlichtstreuung bestimmt werden, wobei zum Beispiel ein Spektrometer verwendet wird, das einen Helium-Neon-Laser enthält. Im Allgemeinen wird die Partikelgröße bei Raumtemperatur bestimmt und beinhaltet multiple Analysen der in Frage kommenden Probe (z.B. 5–10fach), um einen durchschnittlichen Wert für den Partikeldurchmesser zu erhalten. Die Partikelgröße kann auch ohne weiteres unter Verwendung eines Resterelektronenmikroskops (SEM) bestimmt werden. Um dies durchzuführen, werden trockene Microsphären mit einem Gemisch aus Gold/Palladium mit einem Zerstäuber bis zu einer Dicke von ungefähr 100 Angström beschichtet und werden anschließend unter Verwendung eines Resterelektronenmikroskops untersucht.
Wenn das Antigen in einer Microsphäre zur Verfügung gestellt wird, wird der Antigengehalt im Allgemeinen bestimmt, so dass eine geeignete Menge der Microsphären dem Individuum verabreicht werden kann, um eine adäquate Immunantwort hervorzurufen. Der Antigengehalt kann gemäß Verfahren bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, wie z.B. durch das Zerbrechen der Microsphären und durch Extraktion des eingeschlossenen Antigens. Zum Beispiel können Microsphären in einem Lösungsmittel wie z.B. DMSO gelöst werden oder z.B. in 0,1 M NaOH, die 5% (w/v) SDS enthält, dispergiert werden. Die Probe wird geschüttelt, gegebenenfalls zentrifugiert, und der Überstand wird auf das Antigen des Interesses unter Verwendung eines geeigneten Verfahrens untersucht. Vergl. z.B. Benedetti et al., J Controlled Rel (1990) 13: 33–41; und O'Hagan et al., Int J Pharm (1994) 103: 37–45.
In einer anderen Ausführungsform können die Derivate der Hyaluronsäure, entweder in Form von Microsphären oder nicht, direkt mit dem Antigen kombiniert werden, anstatt das Antigen in ihnen einzuschließen, wobei eines von verschiedenen Verfahren verwendet werden kann, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Das Antigen kann zum Beispiel eher von den Microsphären adsorbiert als in ihnen eingeschlossen werden, indem das Antigen mit dem Hyaluronsäurepolymer in einem geeigneten Puffer gemischt wird, in Abhängigkeit von dem verwendeten Hyaluronsäurepolymer für unterschiedliche Zeiträume inkubiert wird und falls gewünscht, kann die Formulierung für die spätere Verwendung gefriergetrocknet werden. So wird, wenn HYAFF oder gemischte Esterderivate verwendet werden, zum Beispiel das Antigen im Allgemeinen mit dem Hyaluronsäurepolymer in einer Menge inkubiert, die ungefähr 0,1% bis etwa 40% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer entspricht, stärker bevorzugt etwa 1 % bis etwa 25% (w/w) Antigen und noch stärker bevorzugt etwa 2% bis etwa 20% (w/w) Antigen. Der prozentuale Anteil des Antigens wird von der gewünschten Dosis und den zu behandelnden Bedingungen abhängig sein, wie nachfolgend ausführlicher diskutiert wird. Die Inkubation des Antigens mit dem Polymer wird für ungefähr 0 Stunden bis 48 Stunden oder länger, vorzugsweise etwa 0 Stunden bis etwa 24 Stunden, stärker bevorzugt etwa 1 Stunde bis etwa 10 Stunden und am stärksten bevorzugt etwa 2 Stunden bis etwa 4 Stunden dauern. Nach der Inkubation kann die Suspension gefriergetrocknet werden und die getrocknete Zusammensetzung kann in einem geeigneten Vehikel vor der Immunisierung suspendiert werden.
Wenn ACP verwendet wird, kann das ACP als ein Gel zur Verfügung gestellt werden, vergl. z.B. die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 97/07833 (erhältlich von Fidia Advanced Biopolymers Srl, Abano Terme, Italien). Das ACP-Gel wird 1:30 mit Kochsalzlösung verdünnt und mit dem Antigen gemischt und gegebenenfalls mit einer Hilfssubstanz (vergl. weiter unten). Die Lösung kann anschließend dem Individuum direkt verabreicht werden, z.B. intranasal, wie nachfolgend ausführlicher diskutiert wird.
Wenn das Antigen und die Derivate der Hyaluronsäure hergestellt wurden, wie vorstehend beschrieben wurde, werden die Zusammensetzungen zur nachfolgenden Abgabe an die Schleimhaut formuliert. Die Zusammensetzungen werden im Allgemeinen einen oder mehrere „pharmazeutisch verträgliche Excipienten oder Vehikel" einschließen, die für die Abgabe an die Schleimhaut geeignet sind, wie z.B. Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin, Polyethylenglykol, Hyaluronsäure, Ethanol, etc. Zusätzlich können Hilfsmittel wie z.B. befeuchtende oder emulgierende Mittel, den pH-Wert puffernde Substanzen und dergleichen in solchen Vehikeln vorhanden sein.
Zum Beispiel werden intranasale und pulmonale Formulierungen im Allgemeinen Vehikel einschließen, die weder zu Irritationen der nasalen Schleimhaut führen, noch die Wimpernfunktion im Wesentlichen beeinträchtigen. Verdünnungsmittel wie Wasser, wässrige Kochsalzlösung oder andere bekannte Substanzen können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die nasalen Formulierungen können auch Konservierungsstoffe wie z.B. Chlorbutanol und Benzalkoniumchlorid, jedoch ohne Beschränkung darauf, enthalten. Ein grenzflächenaktivierendes Mittel kann vorhanden sein, um die Absorption der vorliegenden Proteine durch die nasale Schleimhaut zu verstärken.
Für rektale und urethrale Zäpfchen wird die Zusammensetzung des Vehikels traditionelle Bindemittel und Träger wie z.B. Kakaobutter (Theobromaöl) oder andere Triglyceride, pflanzliche Öle, die durch Veresterung, Hydrogenierung und/oder Fraktionierung modifiziert sind, glycerinhaltige Gelatine, polyalkalische Glycole, Gemische von Polyethylenglycolen mit verschiedenen Molekulargewichten und Fettsäureester von Polyethylenglycol enthalten.
Für die vaginale Abgabe können die Hyaluronsäureformulierungen der vorliegenden Erfindung in Vaginalzäpfchengrundlagen eingeschlossen sein, wie z.B. solchen, die Gemische von Polyethylentriglyceriden einschließen, oder sie können in Ölen wie z.B. Maiskeimöl oder Sesamöl suspendiert sein und gegebenenfalls kolloidale Silicamasse enthalten. Vergl. z.B. Richardson et al., Int J Pharm (1995) 115: 9–15.
Für eine weitere Diskussion über geeignete Vehikel bei der Verwendung von bestimmten Arten der Abgabe vergl. z.B. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. Ausgabe, 1995. Ein Fachmann kann ohne weiteres das geeignete Vehikel für die Verwendung des bestimmten Antigens und den Ort der Abgabe bestimmen.
Hilfssubstanzen können verwendet werden, um die Effektivität der Arzneimittel zu verstärken. Die Hilfssubstanzen können zusammen mit den Hyaluronsäureformulierungen der vorliegenden Erfindung verabreicht werden, z.B. in der gleichen Zusammensetzung oder in getrennten Zusammensetzungen. In einer anderen Ausführungsform kann eine Hilfssubstanz vor oder nach den Hyaluronsäurezusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verabreicht werden. Solche Hilfssubstanzen schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf: (1) Aluminiumsalze (Alaun) wie z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Aluminiumsulfat, etc., (2) Formulierungen von Öl-in-Wasser-Emulsionen (mit oder ohne andere spezifische immunstimulierenden Hilfssubstanzen wie z.B. Muramylpeptide (vergl. unten) oder Komponenten von bakteriellen Zellwänden) wie z.B. (a) MF59 (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 90/14837), das 5% Squalen, 0,5% Tween 80 und 0,5% Span 85 enthält (und gegebenenfalls verschiedene Mengen von MTP-PE (vergl. unten) enthält, obwohl dies nicht notwendig ist) und das unter Verwendung eines Microfluidizers wie z.B der Microfluidizer Modell 110Y (Microfluidics, Newton, MA) in Submicron-Partikel formuliert ist, (b) SAF, das 10% Squalan, 0,4% Tween 80, 5% pluronisch blockiertes Polymer L121 und thr-MDP (vergl. weiter unten) enthält und das entweder mit Hilfe eines Microfluidizers in eine Submicron-Emulsion verwandelt oder mit Hilfe eines Vortex-Gerätes gemischt wurde, um eine Emulsion mit einer größeren Partikelgröße zu erzeugen, und (c) das Ribi^TM-Hilfssubstanzsystem (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton MT), das 2% Squalen, 0,2% Tween 80 und eine oder mehrere Komponenten von bakteriellen Zellwänden aus der Gruppe enthält, die aus Monophosphorlipid A (MPL), Trehalose-Dimycolat (TDM) und Zellwandgerüst (CWS) besteht, vorzugsweise MPL + CWS (Detox^TM); (3) Saponin-Hilfssubstanzen wie z.B. Stimulon^TM (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) können verwendet werden oder Partikel davon wie z.B. ISCOMs (immunstimulierende Komplexe) können erzeugt werden; (4) Komplettes Freundsche Adjuvans (CFA) und Inkomplettes Freundsche Adjuvans (IFA); (5) Cytokine wie z.B. Interleukine (IL-1, IL-2, etc.), Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (M-CSF), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), etc.; (6) entgiftete Mutanten eines bakteriellen ADP-ribosylierendes Toxins wie z.B. ein Cholera-Toxin (CT), ein Keuchhusten-Toxin (PT) oder ein hitzelabiles E. coli-Toxin (LT), besonders LT-K63 (in dem Lysin für die Wildtyp-Aminosäure in Position 63 ausgetauscht wurde), LT-R72 (in dem Arginin für die Wildtyp-Aminosäure in Position 72 ausgetauscht wurde), CT-S109 (in dem Serin für die Wildtyp-Aminosäure in Position 109 ausgetauscht wurde) und PT-K9/G129 (in dem Lysin für die Wildtyp-Aminosäure in Position 9 ausgetauscht wurde und Glycin in Position 129 ausgetauscht wurde) (vergl. z.B. die Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/13202 und WO 92/19265); und (7) andere Substanzen, die als immunstimulierendes Mittel wirken, um die Effektivität der Zusammensetzung zu verstärken.
Muramyl-Peptide schließen N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (nor-MDP), N-Acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (MTP-PE), etc. ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Die verschiedenen Komponenten der Zusammensetzung können in einem großen Bereich von Verhältnissen vorliegen. Zum Beispiel werden das Hyaluronsäure-Antigen und die Hilfssubstanzkomponenten im Allgemeinen in einem Volumenverhältnis von 1:50 bis 50:1, vorzugsweise von 1:10 bis 10:1, stärker bevorzugt von 1:3 bis 3:1 und am stärksten bevorzugt von etwa 1:1 verwendet. Andere Verhältnisse können jedoch für bestimmte Ziele eher geeignet sein, z.B. wenn ein bestimmtes Antigen sowohl schwierig in die Hyaluronsäure-Zusammensetzung aufgenommen wird als auch eine niedrige Immunogenität besitzt, wird in diesem Fall eine höhere relative Menge der Antigenkomponente benötigt.
Die Zusammensetzungen werden eine „therapeutisch effektive Menge" des Antigens des Interesses umfassen. Dies bedeutet, dass eine Menge des Antigens in die Zusammensetzungen eingeschlossen wird, damit ein Individuum eine ausreichende immunologische Antwort erzeugt, um Symptome zu verhindern, zu vermindern oder zu eliminieren. Die genaue Menge, die dazu benötigt wird, wird unterschiedlich sein, in Abhängigkeit von dem Individuum, das behandelt wird; von dem Alter und dem allgemeinen Zustand des Individuums, das behandelt werden soll, von der Fähigkeit des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren; von dem Grad des Schutzes, der erwünscht ist; von der Schwere des Zustandes, der behandelt wird; von dem bestimmten Antigen, das ausgewählt wurde, und von seiner Art der Abgabe und von anderen Faktoren. Eine geeignete effektive Menge kann ohne weiteres von einem Fachmann bestimmt werden. Daher wird eine „therapeutisch effektive Menge" in einen relativ großen Bereich fallen, der durch Routineversuche bestimmt werden kann. Für die Absichten der vorliegenden Erfindung wird eine effektive Dosis im Allgemeinen in einem Bereich von etwa 1 μg bis etwa 100 mg liegen, stärker bevorzugt von etwa 5 μg bis etwa 1 mg und am stärksten bevorzugt von etwa 10 μg bis etwa 500 μg des Antigens, das pro Dosis verabreicht wird.
Wenn die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung formuliert sind, werden sie über die Schleimhaut verabreicht, wobei Standardtechniken verwendet werden. Vergl. z.B. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19. Ausgabe, 1995, für Abgabetechniken über die Schleimhaut, einschließlich intranasale, pulmonale, vaginale und rektale Techniken, sowie die Europäische Veröffentlichung Nr. 517,565 und Illum et al., J Controlled Rel (1994) 29: 133–141, für Techniken der intranasalen Abgabe.
Dosisbehandlungen können als Zeitplan für eine einzelne Dosis oder als Zeitplan für multiple Dosen vorliegen. Ein Zeitplan für multiple Dosen ist einer, in dem ein hauptsächlicher Verlauf der Impfung aus 1–10 getrennten Dosen bestehen kann, auf die andere Dosen zu bestimmten nachfolgenden Zeitintervallen folgen, die ausgewählt wurden, die Immunantwort zu erhalten und/oder zu verstärken, zum Beispiel nach 1 – 4 Monaten als eine zweite Dosis und, falls notwendig, (eine) nachfolgende Dosis (Dosen) nach mehreren Monaten. Die Auffrischungsimpfung kann mit der gleichen Formulierung durchgeführt werden, die für die erste Immunantwort verwendet wurde, oder sie kann mit einer anderen Formulierung, die das Antigen enthält, durchgeführt werden. Das Dosierungsschema wird auch, zumindest teilweise, durch den Bedarf des Individuums bestimmt werden und wird von dem Urteil des behandelnden Arztes abhängig sein. Des weiteren werden die Impfstoffe, falls die Verhinderung der Erkrankung erwünscht ist, im Allgemeinen vor der ersten Infektion mit dem Pathogen des Interesses verabreicht werden. Falls eine Behandlung erwünscht ist, z.B. die Verminderung von Symptomen oder der erneuten Erkrankungen, wird der Impfstoff im Allgemeinen nach der ersten Infektion verabreicht werden.
Die Formulierungen können in vivo in einer Anzahl von Tiermodellen getestet werden, die für die Studie der Abgabe über die Schleimhaut entwickelt wurden. Zum Beispiel ist das Modell des Schlafes bei Bewusstsein ein auf dem Fachgebiet bekanntes Modell für die Untersuchung der nasalen Abgabe von Substanzen aufgrund der großen Nasenhöhle, der Erreichbarkeit der Drosselvenen für die Kanülenlegung und des milden Temperaments des Schafs unter experimentellen Bedingungen. Vergl. z.B. Longecker et al., J Pharm Sci (1987) 76: 351–355 und Illum et al., J Controlled Rel (1994) 29: 133–141. Dem Schaf kann daher eine Testsubstanz durch eine kurze Betäubung der Tiere, um ein Niesen während der Abgabe zu verhindern, und durch das Einführen eines oralen/nasalen Schlauchs mit dem in Frage kommenden Impfstoff in das Nasenloch des Schafs zu einer bestimmten Tiefe verabreicht werden. Der Impfstoff, im Allgemeinen in einer puderigen, gefriergetrockneten Form, wird anschließend in die Nasenhöhle geblasen. Blutproben werden anschließend über die mit einer Kanüle versehende Drosselvene vor und nach der Abgabe gesammelt. Die Blutproben können auf Antikörpertiter unter Verwendung von Standardtechniken, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, untersucht werden, wie vorstehend beschrieben wurde. Die zellulären Immunantworten können ebenfalls überwacht werden, wie vorstehend beschrieben wurde.
Wie ohne weiteres erkennbar ist, sind die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung nützlich für die Behandlung und/oder zur Verhinderung einer großen Vielfalt von Erkrankungen und Infektionen, die von Viren, Bakterien, Parasiten und Pilzen hervorgerufen werden, sowie zur Stimulation einer Immunantwort gegen eine Vielfalt von Tumorantigenen. Die Zusammensetzungen können nicht nur therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden, wie vorstehend beschrieben wurde, sondern die Zusammensetzungen können auch dazu verwendet werden, Antikörper herzustellen, sowohl polyclonale als auch monoclonale, z.B. für diagnostische Zwecke sowie für eine Immunreinigung des Antigens des Interesses. Wenn polyclonale Antikörper gewünscht werden, wird ein ausgewählter Säuger (z.B. eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege, ein Pferd, etc.) mit den Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung immunisiert. Dem Tier wird im Allgemeinen 2 – 6 Wochen später eine Auffrischungsimpfung mit einer oder mehreren Abgabeen des Antigens gegeben. Das polyclonale Antiserum wird anschließend von dem immunisierten Tier erhalten und wird gemäß bekannten Verfahren behandelt. Vergl. z.B. Jurgens et al. (1985), J Chrom 348: 363–370.
Monoclonale Antikörper werden im Allgemeinen unter Verwendung des Verfahrens von Köhler und Milstein, Nature (1975), 256: 496–96, hergestellt oder durch eine Modifikation davon. Im Allgemeinen wird eine Maus oder eine Ratte immunisiert, wie vorstehend beschrieben wurde. Anstatt dem Tier das Blut zu entnehmen, um Serum zu extrahieren, wird jedoch die Milz (und gegebenenfalls mehrere große Lymphknoten) entfernt und in einzelne Zellen zerteilt. Falls erwünscht, können die Milzzellen abgesucht werden (nachdem die nichtspezifischen adhärenten Zellen entfernt wurden), indem die Zellsuspension auf eine Platte oder in eine Vertiefung gegeben wird, die mit dem Proteinantigen beschichtet ist. B-Zellen, die das Membran gebundene Immunglobulin exprimieren, das für das Antigen spezifisch ist, werden an die Platte binden und nicht mit dem Rest der Suspension weggespült werden. Die resultierenden B-Zellen oder alle getrennten Milzzellen werden anschließend zur Fusion mit Myelomzellen induziert, um Hybridome zu bilden, und werden in einem Selektionsmedium (z.B. Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin-Medium, „HAT") kultiviert. Die resultierenden Hybridome werden durch eine begrenzende Verdünnungsreihe ausplattiert und werden auf die Herstellung des Antikörpers untersucht, der spezifisch das immunisierende Antigen bindet (und der keine nichtverwandten Antigene bindet). Die ausgewählten monoclonale Antikörper sekretierenden Hybridome werden anschließend entweder in vitro (z.B. in Gewebekulturflaschen oder in Hohlfaserreaktoren) oder in vivo kultiviert (als Aszites in Mäusen). Siehe z.B. M Schreier et al., Hybridoma Techniques (1980); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas (1981); Kennett et al., Monoclonal Antibodies (1980); vergl. ebenfalls US-Patent Nr. 4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500; 4,491,632; und 4,493,890. Gruppen von monoclonalen Antikörpern, die gegen das Antigen des Interesses hergestellt wurden, können auf verschiedene Eigenschaften abgesucht werden; das heißt auf den Isotyp, das Epitop, die Affinität, etc.
III. Experimentelle Bedingungen
Nachfolgend sind Beispiele für bestimmte Ausführungsformen für die Ausführung der vorliegenden Erfindung dargestellt. Die Beispiele werden nur für den Zweck der Veranschaulichung angeboten und dienen nicht der Absicht, den Umfang der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
Es wurden Anstrengungen unternommen, die Genauigkeit in Bezug auf die verwendete Zahlen (z.B. Mengen, Temperaturen, etc.) sicherzustellen, aber einige experimentelle Fehler und Abweichungen sollten selbstverständlich erlaubt sein.
Beispiel 1
Herstellung und Verwendung von HYAFF-Formulierungen einschließlich des Influenza-Antigens
Placebo (leere) Micropartikel des HYAFF11-Polymers, das etwa zu 100% mit Benzylalkohol verestert war, wurden von Fidia Advanced Biopolymer Srl (Abano Terme, Italien) geliefert. Die durchschnittliche Größe dieser Micropartikel betrug etwa 8 Micron (mit einem Anteil der Größenverteilung von weniger als 1 Micron und einem Anteil von größer als 10 Micron), wie durch ein Malvern Mastersizer Instrument bestimmt wurde.
Um eine Dosis von 10 μg des Influenza-Antigens H3N2 („HA") (Chiron Vaccines, Sienna, Italien) und 10 – 25 μg LT-K63 (Internationale Veröffentlichung Nr. WO 93/13202) zu erhalten, wurde eine 1%ige (w/w) Beladung der Micropartikel mit HA/LT-K63 angestrebt. Um dies zu erreichen, wurden 1 mg HA und 1 mg LT-K63 in 84 mM Na₂HPO₄, 11 mM KH₂PO₄, 82 mM NaCl mit 100 mg der leeren Microsphären in PBS bei 4°C für drei Stunden inkubiert. Die Suspension wurde anschließend bei – 80°C eingefroren und über Nacht gefriergetrocknet.
Die tatsächliche Antigen/Hilfssubstanz-Beladung wurde durch die Hydrolyse der Micropartikel und die Abschätzung des Gesamtproteingehalts durch Micro-BCA bestätigt, wie in Sharif und O'Hagan, Int J Pharm (1995), 115: 259–263 beschrieben wurde. Die tatsächliche Beladung variierte von etwa 0,8% bis 1,0% (w/w) von Antigen/LT-K63 zu Micropartikel.
Vor der Immunisierung wurden ungefähr 20 mg der getrockneten Micropartikel-Formulierung in normaler Kochsalzlösung vor der intranasalen Abgabe an Tiere suspendiert. Für Mäuse wurde die Formulierung in 50 μl Kochsalzlösung suspendiert, für Meerschweinchen wurde die Formulierung in 250 μl Kochsalzlösung suspendiert und für Zwergschweine wurde die Formulierung in 500 μl suspendiert.

Balb/C-Mäuse wurden in sechs Gruppen eingeteilt und die Formulierungen, die nachfolgend beschrieben werden, wurden unter Verwendung einer Mikropipette intranasal verabreicht. Die Tiere erhielten nach 28 Tagen eine Auffrischungsimpfung.

Gruppe 1	nur Antigen (HA) in Kochsalzlösung
Gruppe 2	HA zusammen mit 0,5 mg HYAFF-Placebo-Micropartikel
	gefriergetrocknet
Gruppe 3	HA mit LT-K63 (10 μg) in Kochsalzlösung
Gruppe 4	HA zusammen mit 0,5 mg HYAFF-Plazebo-Micropartikel und 10 μg LT-K63 gefriergetrocknet
Gruppe 5	HA mit LT-K63 (25 μg) in Kochsalzlösung

Gruppe 6

HA zusammen mit 0,5 mg HYAFF-Plazebo-Micropartikel und 25 μg LT-K63 gefriergetrocknet

Man entnahm den Tieren das Blut an Tag 42 und die anti-HA-Titer wurden durch einen ELISA bestimmt, indem die Gesamt-anti-HA-IgG-Titer in den Serumproben abgeschätzt wurden. Wie in Tabelle 1 gezeigt ist, hatten Tiere, denen das Antigen in Kombination mit HYAFF sowohl mit als auch ohne der Hilfssubstanz verabreicht wurde, höhere Antikörpertiter als solche, denen nur das Antigen verabreicht wurde. Tiere, denen das Antigen mit HYAFF und der Hilfssubstanz verabreicht wurde, hatten die höchsten Titer.
Beispiel 2
Herstellung und Verwendung von ACP-Formulierungen einschließlich des Influenza-Antigens
Ein Hyaluronsäure-Gel aus selbstvernetzten Polysacchariden (ACP) wurde von Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abao Terme, Italien) erhalten und wurde verwendet, wie es geliefert wurde. Zu dem Gel wurden 10 μg HA und 10 – 25 μg LT-K63 in einer wässrigen Lösung gegeben, um ein Gel-zu-Wasser Verhältnis von 1:30 herzustellen.
50 μl der viskosen Lösung wurden unter Verwendung einer Mikropipette intranasal drei Gruppen von Balb/C-Mäusen, jede bestehend aus 5 Tieren, verabreicht, wie nachfolgend in Tabelle 2 gezeigt wird. Die Formulierungen wurden innerhalb von 60 Minuten nach der Herstellung verabreicht. Die Tiere erhielten 28 Tage später eine Auffrischungsimpfung, das Blut wurde am Tag 42 entnommen und die anti-HA-Titer wurden mittels ELISA bestimmt. IgA-Titer von einer Nasenwaschung wurden ebenfalls untersucht.
Wie in Tabelle 2 gezeigt wird, hatten Tiere, die das Antigen in Kombination mit ACP und der Hilfssubstanz verabreicht bekommen hatten, höhere Antikörpertiter als solche, die nur das Antigen verabreicht bekamen.
Die vorstehende Studie wurde wiederholt, wobei drei Gruppen von Meerschweinchen mit jeweils fünf Tieren verwendet wurden. Das verwendete Verfahren wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass die Meerschweinchen 200 μl der Formulierung, die in Tabelle 3 gezeigt wird, verabreicht bekamen und dass sie zweimal eine Auffrischungsimpfung bekamen, eine an Tag 28 und eine an Tag 56. Wie in Tabelle 3 gezeigt wird, hatten Tiere, die das Antigen in Kombination mit ACP und der Hilfssubstanz verabreicht bekamen, höhere Antikörpertiter als solche, die nur das Antigen verabreicht bekamen.
Beispiel 3
Vergleich von HYAFF- und ACP-Formulierungen
Die Immunogenität des HA-Antigens in HYAFF und im ACP-Gel wurde in Zwergschweinen (Yucatan) ausgewertet. 12 Schweine wurden in drei Gruppen von je vier Tieren eingeteilt, wie in Tabelle 4 gezeigt wird. Um die geeignete Dosis zu erhalten, wurden den Schweinen unter Verwendung eines Teflon-Katheders der Stärke 16 500 μl der ACP-Formulierung oder 50 mg der HYAFF-Formulierung intranasal verabreicht. Als Kontrolle wurden an Schweine 500 μl des Antigens allein verabreicht. Die Schweine erhielten eine Auffrischungsimpfung nach 28 Tagen und das Serum wurde gesammelt und die anti-HA-Serum-IgG-Spiegel wurden untersucht, wobei ein ELISA verwendet wurde.
Wie der Tabelle 4 zu entnehmen ist, hatten beide Gruppen von Schweinen, die das Antigen mit HYAFF oder ACP verabreicht bekamen, höhere Titer als Schweine, die nur das Antigen verabreicht bekamen, wobei die Schweine, welche die HYAFF-Formulierungen verabreicht bekamen, die höchsten Titer hatten.
Beispiel 4
Vergleich von Formulierungen, die intramuskulär und intranasal abgegeben wurden
Die Fähigkeit von Formulierungen, die in Tabelle 5 genauer beschrieben werden und die entweder intramuskulär (i.m.) oder intranasal (i.n.) abgegeben wurden, um eine Immunantwort hervorzurufen, wurde in Zwergschweinen (Yucatan) ausgewertet. Insbesondere wurden 12 Schweine in drei Gruppen von je vier Schweinen eingeteilt, wie in Tabelle 5 gezeigt ist. Die Schweine wurden entweder mit 25 μg des HA-Antigens i.m. (Gruppe 1), mit 25 μg des HA-Antigens und 100 μg LT-K63 i.n. (Gruppe 2) oder mit 25 μg HA mit HYAFF-Microsphären und 100 μg LT-K63 i.n. (Gruppe 3) immunisiert. Die Schweine wurden in Woche 0 und 4 immunisiert. Seren und Ausscheidungen aus der Nase wurden an Tag 28, 42 und 56 gesammelt und die anti-HA-Serum-IgG-Spiegel und die anti-HA-IgA-Spiegel wurden untersucht, wobei ein ELISA verwendet wurde.
Wie in 1 und 2 gesehen werden kann, erzeugten Schweine, welche die HYAFF-Formulierung verabreicht bekamen, eine deutlich höhere Antwort als die Gruppen, die entweder eine i.m oder i.n. Abgabe bekamen, der HYAFF fehlte. Die HYAFF-Formulierung gab auch eine höhere HA-spezifische IgA-Antwort in der Nase. Die Titer der Hämagglutinierungsinhibition (HI) (vergl. Tabelle 5) waren ebenfalls die höchsten in der Gruppe von Tieren, die mit HYAFF immunisiert wurden.
Dieses Beispiel zeigt, dass die intranasale Abgabe oder die Abgabe eines Antigens mit HYAFF bessere Ergebnisse erzielt als die intramuskuläre Abgabe des Antigens allein.
Tabelle 5
Dementsprechend wurde die Verwendung von Derivaten der Hyaluronsäure zur Abgabe von Impfantigenen beschrieben. Obwohl die bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung detailliert beschrieben wurden, ist es selbstverständlich, dass naheliegende Variationen gemacht werden können, ohne dass vom Inhalt und Umfang der Erfindung abgewichen wird, wie sie in den beigefügten Ansprüchen definiert wird.

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein Hyaluronsäureester-Polymer und ein ausgewähltes Antigen, wobei das Antigen in einer Menge von näherungsweise 0,1 % bis etwa 40% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer vorkommt und sich von einem viralen, bakteriellen, Pilz- oder parasitären Pathogen ableitet.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei das Antigen in einer Menge von näherungsweise 2% bis etwa 25% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer vorkommt.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Hyaluronsäureester ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hyaluronsäure, deren freie Carboxylgruppen zu etwa 75% bis etwa 100% mit einem oder mehreren Alkylresten verestert sind, und einem vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, in dem die Carboxylgruppen des Hyaluronsäurepolymers zu etwa 0,5% bis etwa 20% mit Hydroxylgruppen des gleichen oder eines anderen Hyaluronsäuremoleküls vernetzt sind.
Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend eine immunologische Hilfssubstanz.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 4, wobei die Hilfssubstanz eine entgiftete Mutante eines bakteriellen ADP-ribosylierenden Toxins ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LT-K63 und LT-R72.
Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das ausgewählte Antigen ein virales Antigen ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, wobei das ausgewählte Antigen ein Influenza-Antigen ist.
Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Hyaluronsäureester in Form einer Microsphäre bereitgestellt wird.
Zusammensetzung umfassend (a) eine Microsphäre bestehend aus einem Hyaluronsäureester-Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Hyaluronsäure, deren freie Carboxylgruppen zu etwa 75% bis etwa 100% mit einem oder mehreren Alkylresten verestert sind, und einem vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, in dem die Carboxylgruppen des Hyaluronsäurepolymers zu etwa 0,5% bis etwa 20% mit den Hydroxylgruppen des gleichen oder eines unterschiedlichen Hyaluronsäuremoleküls vernetzt sind; (b) ein ausgewähltes Antigen, eingeschlossen in der oder angelagert an die Mikrosphäre, wobei das Antigen in einer Menge von näherungsweise 2% bis etwa 25% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer vorkommt; und (c) einen immunologischen Hilfsstoff.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das ausgewählte Antigen in die Mikrosphäre eingeschlossen ist.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 oder 9, wobei das ausgewählte Antigen an die Mikrosphäre angelagert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das das Kombinieren der Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche mit einem pharmazeutisch verträglichen Schleimhaut-Arzneistoffträger umfasst.
Verwendung eines Hyaluronsäurepolymers und eines Antigens für die Herstellung eines Medikaments zur Schleimhaut-Abgabe, wobei das Medikament das Polymer und das Antigen umfasst, wobei das Antigen in einer Menge von näherungsweise 0,1 % bis etwa 40% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer vorkommt und von einem viralen, bakteriellen, Pilz- oder parasitären Pathogen abgeleitet ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Medikament die weiteren Eigenschaften einer der Zusammensetzungen gemäß einem der Ansprüche 2 bis 8 aufweist.
Verwendung einer Mikrosphäre, eines Antigens und eines immunologischen Hilfsstoffs für die Herstellung eines Medikaments zur Schleimhaut-Immunisierung, wobei (a) die Mikrosphäre ein Hyaluronsäureester-Polymer umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Hyaluronsäure, deren freie Carboxylgruppen zu etwa 75% bis etwa 100% mit einem oder mehreren Alkylresten verestert sind, und einem vernetzten Derivat der Hyaluronsäure, in dem etwa 0,5% bis etwa 20% der Carboxylgruppen des Hyaluronsäurepolymers mit Hyrdoxylgruppen des gleichen oder eines anderen Hyaluronsäuremoleküls vernetzt sind; (b) das Antigen eingeschlossen in oder angelagert an die Mikrosphäre ist, und (c) das Antigen in einer Menge von näherungsweise 2% bis etwa 25% (w/w) Antigen zu Hyaluronsäurepolymer vorkommt.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Schleimhaut-Abgabe intranasal ist.