JP2002516876A

JP2002516876A - ワクチン抗原およびアジュバントの粘膜送達のためのヒアルロン酸ポリマーの使用

Info

Publication number: JP2002516876A
Application number: JP2000551801A
Authority: JP
Inventors: デレックオハガン，; アレッサンドラパベジオ，
Original assignee: カイロンコーポレイション; フィディアアドバンスドバイオポリマーズエスアールエル
Priority date: 1998-06-01
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2002-06-11
Anticipated expiration: 2019-05-28
Also published as: DE69922804T2; ES2235489T3; JP2010163432A; AU755465C; CA2332455C; WO1999062546A1; JP4610735B2; CA2332455A1; AU4410699A; EP1082135A1; ATE285250T1; EP1082135B1; AU755465B2; DE69922804D1

Abstract

(57)【要約】ワクチン抗原、および必要に応じてアジュバントと組み合せたヒアルロン酸誘導体を含む、粘膜送達のための組成物が提供される。この組成物の生成方法、およびそれを用いた免疫方法もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（技術分野）本発明は、一般に、生体接着性ポリマー系に関する。特に、本発明は、ワクチ
ン抗原およびアジュバントの粘膜送達のためのヒアルロン酸ポリマーの使用に関
する。

【０００２】（発明の背景）粘膜免疫は、広範な種々の病原体に対して重要な防御機構を提供する。この点
に関して、胃腸管、気道、および尿生殖器管の粘膜表面は、潜在的に感染性の細
菌、ウイルスおよび時には寄生生物を含む外来抗原に連続的に曝露される。粘膜
免疫応答は、このようなチャレンジに対して防御し、そして別個のかつ特殊化し
た特徴を有する。

【０００３】例えば、粘膜免疫系により産生される主な免疫グロブリンは、分泌ＩｇＡであ
る。腸管のパイアー斑または鼻咽頭のリンパ系組織における特殊化された抗原取
り込み細胞（マイクロフォールドまたはＭ細胞と呼ばれる）は、抗原を下層の粘
膜結合リンパ組織（ＭＡＬＴ）に輸送する。粘膜上皮の他の領域（例えば、多列
気道上皮）において、樹状細胞は、抗原提示細胞として作用し、そして局所リン
パ球またはＭＡＬＴに移動する。抗原プロセシングおよび抗原提示がＭＡＬＴ中
で生じ、その結果、抗原特異的ＩｇＡＢ細胞の活性化を生じる。引き続く活性
化ＩｇＡ−Ｂ細胞の、粘膜免疫系の他の構成要素（例えば、気道、腸管および生
殖管）への輸送および再循環は、「共通の粘膜系」全体に散在する局所粘膜Ｉｇ
Ａ応答を提供する。従って、粘膜免疫系は、粘膜表面により遭遇する抗原性チャ
レンジの型に対する応答に比類なく適合し、そして特定の病原体に対して最も有
効な型の免疫応答を提供し得る。従って、粘膜免疫系を標的化する抗原送達機構
は、免疫を達成するのに魅力的な手段を提供する。

【０００４】薬物の粘膜送達のために生体接着ポリマーを使用する試みがなされている。生
体接着物は、長い期間、生物的基材に接着し得る、合成物質または天然に存在す
る物質である。例えば、カルボポール（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）およびポリカルボフ
ィル（共に、ポリ（アクリル酸）の合成架橋誘導体である）は、インビトロで非
常に良好な接着特性を示す。しかし、これらの生体接着物の性能は、インビボで
は繰り返されなかった。さらに、このような生体接着物は、局所刺激をもたらし
得る。よって、生体接着物送達系は、ほとんど市販されていない。

【０００５】従って、天然に存在する物質（例えば、レクチンおよび線毛タンパク質）に基
づく生体接着物送達系の開発が注目された。これらの生体接着物は、レセプター
媒介機構を介して粘膜細胞表面に接着する。別の天然の生体接着物は、ヒアルロ
ン酸（ヒアルロナンとしてもまた公知である）である。ヒアルロン酸は、天然に
存在するムコ多糖であり、Ｄ−グルクロン酸の残基およびＮ−アセチル−Ｄ−グ
ルコサミンからなる。ヒアルロン酸は、結合組織ならびに滑液および眼の硝子体
液および房水を含む脊椎動物の細胞外組織マトリックスにおいて見出されている
。ヒアルロン酸は、インビボおよびインビトロの両方において生体接着性である
ことが示されている。

【０００６】ヒアルロン酸のエステル化誘導体は、生体適合性および生分解性であるミクロ
スフェアを産生するために使用されている。例えば、Ｃｏｒｔｉｖｏら、Ｂｉｏ
ｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９１）１２：７２７〜７３０；欧州公開第５１７，５
６５号を参照のこと。これらのミクロスフェアは、多くの物質の粘膜送達に使用
されている。例えば、国際公開第ＷＯ９６／２９９９８号を参照のこと。例えば
、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら、（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９５）１１５：
９〜１５）は、ラットにおけるカルトシニンの腟送達の使用を記載する。さらに
、Ｉｌｌｕｍら、Ｊ．ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌ．（１９９４）２９：１３
３〜１４１および欧州公開第５１７，５６５号は、ヒツジにおけるインスリンの
鼻腔内送達のためのヒアルロン酸エステルミクロスフェアの使用を記載する。

【０００７】しかし、ワクチン抗原を送達するためのヒアルロン酸誘導体の使用は、これま
でのところ記載されていない。

【０００８】（発明の開示）本発明は、粘膜免疫およびヒアルロン酸送達技術を用いて、哺乳動物被験体に
おける免疫応答を誘発するための有効な方法を提供する。本発明は、目的の抗原
および必要に応じてアジュバントと組み合わせた、ヒアルロン酸誘導体（例えば
、エステル化ヒアルロン酸ポリマーおよび自己架橋ヒアルロン酸ポリマー）の粘
膜送達は、それらと同時投与された抗原の免疫原性を増強するように作用すると
いう知見に基づく。特定の理論に結びつけられることを望まないが、ヒアルロン
酸ポリマーの生体接着特性は、鼻腔からの粘膜線毛（ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ）
クリアランスの速度を減少させ、それ故抗原と吸収する膜との間のより長い接触
時間を可能にすると考えられている。さらに、粘膜上皮細胞間の密着結合におい
て一過的な拡大（ｗｉｄｅｎｉｎｇ）が生じて、目的の抗原のより効率的な輸送
を可能にする。ヒアルロン酸ポリマーの使用は、広範な種々の抗原の免疫原性を
増強するための、安全かつ有効なアプローチを提供する。

【０００９】従って、１つの実施態様において、本発明は、ヒアルロン酸エステルポリマー
および選択された抗原を含む組成物に関し、ここで、その抗原は、ヒアルロン酸
ポリマーに対して約０．１％〜約４０％（ｗ／ｗ）の抗原量で存在する。

【００１０】特に好ましい実施態様において、このヒアルロン酸エステルは、約７５％〜約
１００％の遊離のカルボキル基が１つ以上のアルキル基でエステル化されたヒア
ルロン酸、およびこのヒアルロン酸ポリマーのこのカルボキシル基の約０．５％
〜約２０％が同じかまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシル基に架橋した
ヒアルロン酸の架橋誘導体からなる群より選択される。

【００１１】別の実施態様において、本発明は、（ａ）約７５％〜約１００％の遊離のカル
ボキシル基が１つ以上のアルキル基でエステル化されたヒアルロン酸、およびヒ
アルロン酸ポリマーのこのカルボキシル基の約０．５％〜約２０％が同じかまた
は異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシル基に架橋した内部エステルを含むヒア
ルロン酸の架橋誘導体からなる群より選択されるヒアルロン酸エステルから構成
されるミクロスフェア；（ｂ）このミクロスフェア中に封入または吸着されてい
る選択された抗原であって、ここでこの抗原は、ヒアルロン酸ポリマーに対して
約２％〜約２５％（ｗ／ｗ）の抗原量で存在する、選択された抗原；ならびに（
ｃ）免疫学的アジュバント、を含む組成物に関する。

【００１２】なおさらなる実施態様において、本発明は、上記の組成物を薬学的に受容可能
な粘膜賦形剤と組み合わせる工程を包含する、薬学的組成物を作製する方法、お
よび治療有効量のこの薬学的形組成物を、脊椎動物被験体に粘膜投与する工程を
包含する免疫方法に関する。

【００１３】本発明のこれらの実施態様および他の実施態様は、本明細書中の開示を考慮す
ると当業者には容易に行われる。

【００１４】（発明の詳細な説明）本発明の実施は、他に示されない限り、化学、生化学、分子生物学、免疫学お
よび薬理学の当該分野の技術範囲内の従来の方法を用いる。そのような技術は、
文献において十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍ
ａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓ
ｙｌｖａｎｉａ：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ、１９９０
）；ＭｅｔｈｏｄｓＩｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋおよ
びＮ．Ｋａｐｌａｎ編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．）；およびＨ
ａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第
Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６
、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；
およびＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（第２版、１９８９）を参照のこと。

【００１５】本明細書中で引用される（前出または後出に関わらず）全ての刊行物、特許お
よび特許出願は、本明細書中でその全体において参考として援用される。

【００１６】本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、単数形「ａ
」、「ａｎ」および「その（ｔｈｅ）」は、その内容が明らかに他のものを示す
のでない限り、複数の参照を含む。従って、例えば、「抗原（ａｎａｎｔｉｇ
ｅｎ）」に対する参照は、２つ以上のそのような因子の混合物を含む。

【００１７】（Ｉ．定義）本発明を記載する際、以下の用語を使用し、そして以下に示すように定義され
ることを意図する。

【００１８】用語「ヒアルロン酸」および「ヒアルロナン」は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコ
サミンへのβ１−３グルコシド結合により連結されたＤ−グルコン酸の反復モノ
マーユニットから構成され；β１−３グルコシド結合が単一のユニットを連結し
ている、分枝していない長鎖の分子である、当該分野で認識される酸性の多糖（
構造１、以下）を示すため本明細書中で使用される。

【００１９】

【化１】「ヒアルロン酸誘導体」は、ヒアルロン酸由来の分子であり、そして当該分野
において公知である任意の種々の物質（例えば、約７５％から１００％の遊離の
カルボキシル基がアルキル基によってエステル化されているエステル化ヒアルロ
ン酸分子、本明細書では、集合的には「ＨＹＡＦＦ」と称する）を示す。この用
語はまた、「混合」ヒアルロン酸エステルを含み、ここで、カルボキシル基は１
つより多くのアルキル基でエステル化されている。このような「混合」エステル
は、以下により十分に記載される。さらに、用語「ヒアルロン酸誘導体」はまた
、ヒアルロン酸の自己架橋誘導体（本明細書中では「ＡＣＰ」と称する）をいい
、これは、内部エステルを含み、そしてここでは、ヒアルロン酸ポリマーのカル
ボキシル基の約０．５％〜約２０％が、同じかまたは異なるヒアルロン酸分子の
ヒドロキシル基と架橋している。そのような分子は、以下により詳細に記載され
る。

【００２０】本明細書中で使用される場合、用語「ミクロスフェア」は、直径約１００ｎｍ
〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして最も好
ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍのヒアルロン酸粒子をいう。ミクロスフ
ェアのサイズは、当該分野において周知の技術（例えば、光子相関分光法、レー
ザー回折法および／または走査型電子顕微鏡）により容易に決定される。本明細
書中で使用するためのミクロスフェアは、より詳細に記載されるように、非毒性
かつ生分解性であるヒアルロン酸ポリマーおよびその誘導体から形成される。

【００２１】本明細書中で使用される場合、用語「アルキル」とは、分枝したかまたは分枝
していない１〜２４個の炭素原子の飽和炭化水素基（例えば、メチル、エチル、
ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、オクチル
、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなど）およ
びシクロアルキル基（例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、ベンジルなど
）をいう。

【００２２】「粘膜」送達とは、粘膜表面（鼻、肺、膣、直腸、尿道、および舌下を含む）
への抗原の送達かまたは口腔送達を意味する。

【００２３】「抗原」とは、抗原が提示される場合、宿主の免疫系を刺激して細胞の抗原特
異的免疫応答または体液抗体応答をもたらす、１つ以上のエピトープを含む分子
を意味する。通常、エピトープは、約３〜１５の間、一般的には約５〜１５の間
のアミノ酸を含む。

【００２４】本発明の目的のために、抗原は、任意のいくつかの公知のウイルス、細菌、寄
生生物および真菌由来であり得る。この用語はまた、これらのうちの、任意の種
々の腫瘍抗原を意図する。さらに、本発明の目的のために、「抗原」とは、タン
パク質が免疫学的応答を誘発する能力を維持する限り、ネイティブな配列に対す
る改変（例えば、欠失、付加および置換（一般的に性質が保存的である））を含
むタンパク質をいう。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるように、意図
的であり得るか、または抗原を産生する宿主の変異によるように、偶然であり得
る。

【００２５】抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、被験体における、目的の組成
物中に存在する分子に対する体液性および／または細胞性の免疫応答の発達であ
る。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」とは、抗体分子により媒介され
る免疫応答をいい、一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他
の白血球により媒介される応答である。細胞免疫の１つの重要な局面は、細胞傷
害性Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適
合性複合体（ＭＨＣ）によりコードされ、そして細胞の表面で発現されるタンパ
ク質と会合して提示されるペプチド抗原に対して特異性を有す。ＣＴＬは、細胞
内微生物の細胞内破壊またはそのような微生物に感染した細胞の溶解の誘導およ
び促進を補助する。細胞免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応
答を含む。ヘルパーＴ細胞は、細胞表面上でＭＨＣ分子と会合したペプチド抗原
を提示する細胞に対して非特異的なエフェクター細胞の機能の刺激を補助するよ
うに、そして活性を集中させるように作用する。「細胞性免疫応答」とはまた、
サイトカイン、ケモカインならびに活性化Ｔ細胞および／または他の白血球（Ｃ
Ｄ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞由来の白血球）により産生されるそのような
他の分子の産生をいう。

【００２６】細胞性免疫応答を誘発する組成物またはワクチンは、細胞表面でＭＨＣ分子と
会合した抗原の提示により脊椎動物被験体を感作するように作用し得る。細胞媒
介性免疫応答は、細胞表面で抗原を提示する細胞にか、またはその近くに指向さ
れる。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球を産生して、免疫化宿主の将来的防御を可
能にし得る。

【００２７】特定の抗原または組成物が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多くの
アッセイ（例えば、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害
性細胞アッセイによるか、または感作された被験体中の抗原に特異的なＴリンパ
球についてアッセイすること）によって、決定され得る。そのようなアッセイは
、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６；および以下の実施例を参
照のこと。

【００２８】従って、本明細書中で使用される場合、免疫学的応答は、ＣＴＬの産生および
／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的
の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答を誘発し得る。それ故、免疫学的応答は、１
つ以上の以下の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；ならびに／あるいは
、目的の組成物またはワクチン中に存在する抗原に特異的に指向されるサプレッ
サーＴ細胞および／またはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和
し、そして／または抗体−補体、すなわち抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を
媒介して免疫化宿主に防御を提供するように作用し得る。そのような応答は、当
該分野において周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定
され得る。

【００２９】本明細書中に記載されるように、ヒアルロン酸ポリマーと組み合せた選択され
た抗原を含むワクチン組成物は、それがヒアルロン酸ポリマーなしでの等量の抗
原により誘発される免疫応答よりも大きな免疫応答を誘発する能力を保有する場
合、「増強された免疫原性」を提示する。従って、ワクチン組成物は、「増強さ
れた免疫原性」を提示し得る。なぜならば、この抗原は、脊椎動物被験体によっ
てより容易に吸収されるからであるか、またはこの抗原はより強力な免疫原性で
あるからであるか、または抗原が投与される被験体における免疫応答を達成する
ために、より低い用量の抗原が必要とされるからである。そのような増強された
免疫原性は、ポリマー／抗原組成物および抗原コントロールを動物に投与し、そ
して当該分野で周知の標準的アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイおよびＥ
ＬＩＳＡ）を用いて、この２つに対する抗体力価を比較することによって決定さ
れ得る。

【００３０】本明細書中で提供される場合、用語「有効量」または「薬学的有効量」の薬剤
とは、無毒性であるが、所望の免疫学的応答および対応する治療効果を提供する
のに十分な量の薬剤をいう。以下に指摘されるように、必要とされる正確な量は
、被験体の種、年齢、および一般的状態、処置される状態の重篤度、ならびに目
的の特定の抗原、投与の様式などに依存して被験体間で変化する。任意の個々の
症例における適切な「有効」量は、慣用的な実験を用いて当業者により決定され
得る。

【００３１】本明細書中で使用される場合、「処置」とは、（ｉ）伝統的なワクチンにおい
てのように、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の軽減または除去、および
（ｉｉｉ）問題の病原体の実質的または完全な除去のいずれかをいう。処置は、
予防的（感染前）または治療的（感染後）に成し遂げられ得る。

【００３２】「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的にま
たは他の点で望ましくないことがない物質を意味し、すなわち、この物質は、任
意の望ましくない生物学的効果、またはこの物質が含まれる組成物の任意の成分
との有害な様式での相互作用をもたらすことなく、微粒子処方物とともに個体に
投与され得る。

【００３３】「脊椎動物被験体」とは、脊索動物（ｃｏｒｄａｔａ）亜門の任意のメンバー
（ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーおよび他の無尾もしくは短尾のサル（ａ
ｐｅ）および有尾のサル（ｍｏｎｋｅｙ）の種のような非ヒト霊長類を含む）；
ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような農業用動物；イヌおよびネコのよ
うな家庭用哺乳動物；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む
実験用動物；ニワトリ、七面鳥および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウなど
のような家庭用、野生および狩猟用のトリを含む鳥類、を含むが、これらに限定
されない）を意味する。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体被験
体および新生児被験体の両方を含むことが意図される。上記の系は、任意の上記
の脊椎動物種において使用されることが意図される。なぜならば、これら全ての
脊椎動物の免疫系は、同様に機能するからである。

【００３４】（ＩＩ．発明を実施するための形態）本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の処方物または処理パラメータ
ーはもちろん変化し得るのでこのようなものに限定されないことが理解されるべ
きである。本明細書中で使用される用語は、本発明の特定の実施態様を記載する
目的のためだけであり、そして限定することを意図しないこともまた理解される
。

【００３５】本明細書中に記載される方法および材料と類似するかまたは等価な多くの方法
および材料は、本発明の実施において使用され得、好ましい材料および方法は、
本明細書中に記載される。

【００３６】本発明は、粘膜感染病原体に対する免疫応答を誘発するためのヒアルロン酸媒
介送達技術を利用する。この系は、抗原がそれ自体免疫原性が弱い場合でさえも
、強力な免疫応答を生じる。本明細書中に記載されるワクチン組成物および方法
の個々の成分は公知であったが、そのような組合わせが、それらの成分を別々に
使用した場合に達成されるレベルを超えて抗原の効率を増大させることは、予期
されておらずかつ驚くべきことであった。

【００３７】本発明は、任意の上記の病原体に対する免疫応答を提供するのに広く利用可能
であるが、本発明は、本明細書中ではインフルエンザウイルスに関して例証され
る。

【００３８】本発明の方法は、細胞媒介性免疫および／または体液性抗体応答を提供する。
従って、本発明の方法は、細胞性および／または体液性免疫応答が所望される任
意の抗原（抗体、Ｔ細胞ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞傷害性エピトープ
を誘導し得るウイルス、細菌、真菌および寄生生物である病原体由来の抗原を含
む）を用いた使用を見出す。そのような抗原には、ヒトおよび動物のウイルスに
よりコードされる抗原が含まれるが、それらに限定されず、そして構造タンパク
質または非構造タンパク質のいずれかに対応し得る。

【００３９】例えば、本発明は、ヘルペスウイルス科からの広範な種々のタンパク質（単純
ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型由来のタンパク質（例えば、ＨＳＶ
−１およびＨＳＶ−２の糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘−帯状疱疹
ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原（ＣＭＶのｇＢおよびｇＨを含む）；ならびに
、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原）に対
する免疫応答を刺激するための使用を見出す。（例えば、サイトメガロウイルス
のタンパク質コード内容の総説について、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａ
ｇ１９９０）１２５〜１６９頁；ＨＳＶ−１にコードされる種々のタンパク質
の考察について、ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６
９：１５３１〜１５７４；ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＢタンパク質および
ｇＤタンパク質ならびにそれらをコードする遺伝子の考察について、米国特許第
５，１７１，５６８号；ＥＢＶゲノム中のタンパク質コード配列の同定について
、Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７〜２１１；ならびに、
ＶＺＶの総説について、ＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ
ｏｌ．（１９８６）６７：１７５９〜１８１６を参照のこと）。

【００４０】Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイル
ス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）
およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む肝炎ウイルスの科由来の抗原はまた、
本明細書中に記載される技術において都合よく使用され得る。例として、ＨＣＶ
のウイルスゲノム配列は、その配列を得るための方法と同様に公知である。例え
ば、国際公開第ＷＯ８９／０４６６９号；第ＷＯ９０／１１０８９号；および第
ＷＯ９０／１４４３６号を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、Ｅ１（Ｅとしてもまた
公知である）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳＩとしても公知である）を含むいくつかの
ウイルスタンパク質、ならびにＮ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と
呼ばれる）をコードする（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の考察につい
て、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１〜３
８８を参照のこと）。これらの各々のタンパク質およびそれらの抗原性フラグメ
ントは、本発明の方法において使用を見出す。同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原につ
いての配列は公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこ
と）、そしてこの抗原はまた、本発明の方法において都合よく使用され得る。さ
らに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原、ｓＡｇ、および前表面
（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前はｐｒｅ
−Ｓと呼ばれた）、および上記の組合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓ
Ａｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ
１／ｐｒｅ−Ｓ２））は、本明細書中で使用を見出す。例えば、ＨＢＶ構造の考
察について、Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．の「
ＨＢＶＶａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍｔｈｅｌａｂｏｒａｔｏｒｙｔｏ
ｌｉｃｅｎｃｅ：ａｃａｓｅｓｔｕｄｙ」、ＨｕｍａｎＶａｃｃｉｎｅｓ
ａｎｄＶａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、１５９〜１７６頁；ならびに米国特許第４
，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号（
それらの全体において参考として本明細書中で援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３〜６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら
、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９〜３３３０；ならびにＺｈｏｕ
ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７〜５４６４を参照のこと。

【００４１】他のウイルス由来の抗原もまた、本願の方法における使用を見出す。その抗原
は、例えば以下の科のメンバー由来のタンパク質であるがそれらに限定されない
：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カリチウイルス科；ト
ガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイル
ス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス
科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロ
ウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウ
イルス、ＲＳウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型、Ｂ型お
よびＣ型のインフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス
科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（
ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしてもまた公知である））
（とりわけ、単離体ＨＩＶ_IIIb、ＨＩＶ_SF2、ＨＩＶ_LAV、ＨＩＶ_LAI、ＨＩＶ_MN
；ＨＩＶ−１_CM235、ＨＩＶ−１_US4；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩ
Ｖ）由来の抗原を含むが、これらに限定されない）。さらに、抗原はまた、ヒト
パピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルス由来であり得る。例
えば、これらのおよび他のウイルスの説明について、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版
（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；ＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌ
ｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１
）を参照のこと。

【００４２】より詳細には、任意の上記のＨＩＶ単離体（ＨＩＶの種々の遺伝子サブタイプ
のメンバーを含む）由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質は、公知でありそ
して報告されている（例えば、種々のＨＩＶ単離体のエンベロープ配列の比較に
ついて、Ｍｙｅｒｓら、ＬｏｓＡｌａｍｏｓＤａｔａｂａｓｅ、ＬｏｓＡ
ｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＬｏｓＡｌａｍｏｓ
、ＮｅｗＭｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、ＨｕｍａｎＲｅｔｒｏ
ｖｉｒｕｓｅｓａｎｄＡｉｄｓ、１９９０、ＬｏｓＡｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ
Ｍｅｘｉｃｏ：ＬｏｓＡｌａｍｏｓＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０〜５
７８を参照のこと）。そして、任意のこれらの単離体由来の抗原は、本発明の方
法における使用を見出す。さらに、本発明は、任意の種々のエンベロープタンパ
ク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａ
ｇおよびｐ５５ｇａｇ）、およびｐｏｌ領域由来のタンパク質を含む、任意の種
々のＨＩＶ単離体由来の他の免疫原性タンパク質に等しく適用可能である。上記
で説明するように、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイル
スの別の例である。詳細には、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質Ｈ
ＡおよびＮＡは、免疫応答を生じるために特に重要である。インフルエンザＡの
多くのＨＡサブタイプが同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
（１９９０）１７９：７５９〜７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉ
ｃｖａｒｉａｔｉｏｎａｍｏｎｇｔｙｐｅＡｉｎｆｌｕｅｎｚａｖ
ｉｒｕｓｅｓ」、１２７〜１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇ
ｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓｏｆｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ
ｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。従って、任意の
これらの単離体由来のタンパク質はまた、本明細書中に記載される免疫技術にお
いて使用され得る。

【００４３】本明細書中に記載される方法はまた、多くの細菌性抗原（例えば、ジフテリア
、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病的状態を引き起こす生物
体（ＭｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓＡ、ＢおよびＣ、Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａＢ型（ＨＩＢ）、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌ
ｏｒｉを含むが、これらに限定されない））由来の細菌性抗原を用いた使用を見
出す。寄生生物性抗原の例は、マラリアおよびライム病を引き起こす生物体由来
の抗原である。

【００４４】さらに、本明細書中に記載される方法は、種々の悪性の癌を処置するための手
段を提供する。例えば、本発明の系は、問題の癌に対して特異的な特定のタンパ
ク質（例えば、活性化癌遺伝子、胎児の抗原または活性化マーカー）に対する体
液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答の両方を増大させるために使用され得る
。そのような腫瘍抗原は、とりわけ、ＭＡＧＥ１、２、３、４など（Ｂｏｏｎ，
Ｔ．、ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎ（１９９３年３月）：８２〜８
９）を含む任意の種々のＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）；任意の種々のチロ
シナーゼ；ＭＡＲＴ１（Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原）、変異体ｒ
ａｓ；変異体ｐ５３；ｐ９７メラノーマ抗原；ＣＥＡ（癌胎児抗原）を含む。

【００４５】本発明を使用して、広範な種々の疾患を予防または処置し得ることが容易に明
らかである。

【００４６】選択された抗原は、引き続いての粘膜送達のためにヒアルロン酸ポリマーと組
み合わせられる。本発明の組成物における使用のためのヒアルロン酸ポリマーは
、例えば、ＦｉｄｉａＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓＳｒｌ（
ＡｂａｎｏＴｅｒｍｅ、Ｉｔａｌｙ）より入手可能である。例えば、本明細書
中に記載される方法において有用なポリマーは、ヒアルロン酸のエステル化誘導
体および自己架橋誘導体を含むが、これらに限定されない。これらのポリマーは
、種々の分子量で入手可能であり、そして所定の抗原を用いる使用に適切な分子
量は、当業者によって容易に決定される。従って、例えばエステル化誘導体につ
いて、適切な分子量は、約２，０００〜３００，０００、より好ましくは約５０
，０００〜約２５０，０００、さらにより好ましくは約７５，０００〜約２００
，０００、および最も好ましくは約１００，０００〜約１５０，０００の桁であ
る。

【００４７】特に有用な、ヒアルロン酸のエステル化形態は、約７５％〜１００％のカルボ
キシル基が、エチル、プロピル、ペンチル、ベンジル、ドデシルなどのようなア
ルキル基でエステル化され、遊離のカルボキシル基と対応するアルコールとの反
応によって形成されるものである。このような誘導体は、その生体適合性および
エステル結合の加水分解により生分解される能力により、特に好ましい。上記の
アルキル基でエステル化されない残基は、Ｃ₁₀〜₂₀の脂肪族アルコール由来の脂
質鎖／アルキル残基と反応して「混合」エステルを生成し得る。この実施態様に
おいて、好ましくは７５％のカルボキシル基が、例えばベンジル基でエステル化
され、そして少なくとも約５％の残りの基が脂肪族アルコールでエステル化され
る。例えば、国際公開第ＷＯ９７／０７８３３号を参照のこと。

【００４８】エステル化ヒアルロン酸の代表的な構造は、以下に構造２として示され、ここ
で、Ｒは、上記のようなアルキル基を表す。

【００４９】

【化２】このような誘導体は、例えば、米国特許第４，８５１，５２１号および同第４
，９６５，３５３号、および欧州特許公開第５１７，５６５号に記載され、そし
て例えば、ＦｉｄｉａＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓＳｒｌ（
ＡｂａｎｏＴｅｒｍｅ、Ｉｔａｌｙ）より入手可能である。代表的な処方物と
しては、ＨＹＡＦＦ７（エチルエステル）、ＨＹＡＦＦ９（プロピルエステル）
、ＨＹＡＦＦ１１（ベンジルエステル）、ＨＹＡＦＦ２１（ペンチルエステル）
、ＨＹＡＦＦ７３（ドデシルエステル）など（これらは約１００％エステル化さ
れている）：ならびにＨＹＡＦＦ１１ｐ５０（ベンジルエステル）、ＨＹＡＦＦ
７ｐ７５（エチルエステル）、およびＨＹＡＦＦ１１ｐ７５（ベンジルエステル
）など（これらは約５０〜７５％エステル化されている）として公知の処方物が
、挙げられる。

【００５０】これらの誘導体は、ヒアルロン酸中に存在する遊離のカルボキシル基と、触媒
をする物質（例えば、強無機酸または酸型のイオン交換体）の存在下で、アルコ
ールとの反応によって、または無機塩基もしくは有機塩基の存在下で、所望のア
ルコール性残基を導入し得るエーテル化剤との反応によって容易に生成される。
例えば、ヒアルロン酸の第四アンモニウム塩は、欧州公開第２１６，４５３号に
記載されるとおりにエーテル化剤（例えば、非プロトン性有機溶媒）を用いて処
理され得る。また、本明細書中にその全体が参考として援用される、欧州公開第
４３３，１３３号ならびに米国特許第４，８５１，５２１号および同第４，９６
５，３５３号を参照のこと。

【００５１】エステル化の程度および型は、変更され得、そして主に選択の問題であり、以
下でより詳細に記載されるように、同時投与される抗原、所望される生体接着の
程度、ならびに所望される送達速度に部分的に依存する。エステル化の適切な百
分率および型は、問題の抗原および障害の性質に基づいて当業者によって容易に
決定される。

【００５２】上記に説明されるように、ＡＣＰとして公知のヒアルロン酸誘導体はまた、本
明細書中のワクチン抗原を送達するための用途を見出す。一般に、本発明ととも
に用いるためのＡＣＰは、ヒアルロン酸ポリマーの約０．５％〜約２０％、好ま
しくは約３％〜約１０％、そして最も好ましくは約４％〜約５％のカルボキシル
基が、同じまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシル基に架橋されているＡ
ＣＰである。この分子の残りの部分は、塩化され得る。本明細書中で使用するた
めの１つの好ましい形態のＡＣＰは、粘性のゲル様組成物である。例えば、国際
公開第ＷＯ９７／０７８８３号を参照のこと。

【００５３】ＡＣＰ誘導体は、遊離のカルボキシル基または塩化されるカルボキシル基のい
ずれかを有するヒアルロン酸を、カルボキシル官能基を活性化する薬剤を用いて
最初に活性化することにより作製される。代表的な薬剤としては、カルボジイミ
ド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ベンジルイソプロピルカルボジイミド、
ベンジルエチルカルボジイミド、エトキシアセチレン、脂肪族炭化水素、脂環式
炭化水素または芳香族炭化水素由来のハロゲン誘導体などが挙げられる。中間体
活性化誘導体および／または第三級有機塩基（例えば、トリエチルアミン）もし
くは第三級無機塩基の形成に好都合な補助的な薬剤が存在し得る。

【００５４】活性化は、有機性の非プロトン性溶媒中で、例えば、ＤＭＳＯ中で実施され、
そしてこの混合物は、熱または照射（特にＵＶ光）に曝露される。このようにし
て、触媒の添加後および／または温度の高い状態でのリンスに続いていずれかで
自発的に分離する不安定な中間体が形成され、それにより、同じまたは他のヒア
ルロン酸分子のヒドロキシルとの内部エステル結合が形成される。例えば、これ
らの誘導体を生成するための方法については、欧州公開第３４１，７４５号およ
び国際公開第ＷＯ９７／０７８８３号を参照のこと。

【００５５】上記のヒアルロン酸誘導体は、当該分野で周知のいくつかの技術のいずれかを
用いて、吸着されたかまたは物理的に取り込まれた（封入された）かのいずれか
の抗原とともにミクロスフェアとして提供され得る。例えば、ミクロスフェアは
、溶媒エバポレーション技術および抽出技術を用いて作製され得る。一般に、こ
れらの方法は、不連続相および連続相と呼ばれる、混合不可能な２つの液体のエ
マルジョンを調製することを必要とする。不連続相は、（封入されるべきである
場合）抗原を含むポリマー／溶媒溶液の微小滴（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔｓ）
を含む。不連続相は、続いて、粒子安定剤／界面活性剤を含む連続水相と混合さ
れる。このエマルジョンが安定化された後、不連続相は、エバポレーションまた
は抽出によって除去される。例えば、Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏ
ｌｌｅｄＲｅｌ．（１９９０）１３：３３−４１；Ｇｈｅｚｚｏら、Ｉｎｔ．
Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９２）８７：２１−２９；Ｉｌｌｕｍら、Ｊ．Ｃｏｎｔ
ｒｏｌｌｅｄＲｅｌ．（１９９４）２９：１３３−１４１；欧州公開第５１７
，５６５号を参照のこと。

【００５６】より詳細には、適切なヒアルロン酸誘導体は、溶媒中に溶解される。この溶媒
は、この溶媒が、ポリマーとも抗原とも化学的に反応せず、そしてこの連続相に
おいて不混和性であるように選択される。例えば、非プロトン性溶媒（ジメチル
スルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プ
ロパノール（ＨＦＩＰ）などを含むがこれらに限定されない）のような任意の数
の溶媒が用いられ得る。このポリマーは、約０．５％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／
ｖ、好ましくは約１％ｗ／ｖ〜約８％ｗ／ｖ、そして最も好ましくは約６％
ｗ／ｖ〜約８％ｗ／ｖの濃度で添加される。用いられる抗原および所望され
るローディングに依存して、ヒアルロン酸ポリマーに対して約０．１％（ｗ／ｗ
）〜約４０％（ｗ／ｗ）の抗原、より好ましくは約１％（ｗ／ｗ）〜約２５％（
ｗ／ｗ）の抗原、そしてさらにより好ましくは約２％（ｗ／ｗ）〜約２０％（ｗ
／ｗ）の抗原を有するミクロスフェアをもたらす量の抗原が、添加される。この
混合物は、不連続相を形成する。

【００５７】第２の溶媒、一般に高粘度油（例えば、重い鉱油（ｈｅａｖｙｍｉｎｅｒａ
ｌｏｉｌ）またはパラフィン油（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む連続相混合物が調製される。非イオン性界面活性
剤のようなエマルジョン安定剤（例えば、マンニドモノオレアート（ｍａｎｎｉ
ｄｅｍｏｎｏｏｌｅａｔｅ）（ＡｒｌａｃｅｌＡ（登録商標））、デキスト
ラン７０，０００、ポリオキシエチレンエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））
、ポリグリコールエーテル（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標））など（全て、例え
ば、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから容易
に商業的に入手可能である）を含む）が存在する。界面活性剤は、約０．３％〜
約１０％、好ましくは約０．５％〜約８％、そしてより好ましくは約１％〜約５
％の濃度で存在する。

【００５８】ミクロスフェアを生成するために、次いで、不連続相は、連続相に、約１：１
６の比で添加され、そして例えば、約７００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍにて機械的
に攪拌することにより、エマルジョンが形成される。次いで、有機溶媒は、エバ
ポレーションまたは抽出される。エバポレーションされる場合、このエマルジョ
ン温度を、溶媒の沸点未満に保持し、そしてこの溶媒がエバポレーションされる
まで徐々に上昇させる（溶媒の沸点未満に依然として維持しながら）。例えば、
米国特許第３，８９１，５７０号およびＢｅｎｅｄｅｔｔｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒ
ｏｌｌｅｄＲｅｌ．（１９９０）１３：３３−４１を参照のこと。

【００５９】抽出される場合、適切な抽出溶媒（すなわち、不連続相溶媒についての溶媒で
あって、ヒアルロン酸誘導体ではない）を、このエマルジョンに約２：１のｖ／
ｖ比で添加し、次いでこの溶液を、ミクロスフェアが形成されるまで攪拌する。
例えば、ＤＭＳＯを用いる場合、ＤＭＳＯを、酢酸エチルまたは酢酸アセチルを
用いて抽出し得る。他の適切な抽出溶媒は、当業者によって容易に決定され得る
。溶媒抽出技術のさらなる説明については、例えば、Ｉｌｌｕｍら、Ｊ．Ｃｏｎ
ｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌ．（１９９４）２９：１３３−１４１；およびＧｈｅｚ
ｚｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９２）８７：２１−２９；および欧州
公開第５１７，５６５号を参照のこと。

【００６０】一旦、分散相の溶媒が除去されたら、懸濁されたミクロスフェアは、遠心分離
によって油相から分離される。ミクロスフェアは、適切な溶液（例えば、ヘキサ
ン）中に再懸濁されて、過剰な鉱油および界面活性剤が除去され得、次いでこの
溶液が濾過される。このプロセスは、溶媒の除去を確実にするために何回も繰り
返され得る。次いで、このミクロスフェアは、風乾または減圧下で乾燥される。

【００６１】あるいは、ミクロスフェアはまた、例えば、以下に記載されるとおりに噴霧乾
燥を用いて形成され得る：Ｋｙｙｒｏｎｅｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１
９９２）８０：１６１−１６９；Ｇｈｅｚｚｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（
１９９２）８７：２１−２９；およびＭａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒ
ａｙＤｒｙｉｎｇ第２版Ｗｉｌｅｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ。「ナノスフェア
」と称される特に小さいミクロスフェアは、国際公開第ＷＯ９６／２９９９８
号に記載されるように超臨界逆溶媒（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌａｎｔｉｓ
ｏｌｖｅｎｔｓ）（ＳＡＳ）を用いて生成され得る。

【００６２】ヒアルロン酸組成物からの抗原の放出速度は、抗原をミクロスフェアと会合さ
せるために用いられる方法に依存して改変され得る。例えば、この抗原がポリマ
ーマトリックス中に物理的に分散される場合、放出は、ポリマーネットワークを
通る抗原の分散速度によって大部分が制御される。さらに、溶媒がエバポレート
されるのではなく抽出される場合、ミクロスフェアは、より多孔質の表面を含み
、このことは、封入された抗原のより迅速な放出をもたらす。

【００６３】さらに、カルボキシル基のエステル化は、エステルが、生物学的基質と水素結
合を形成する傾向の減少に起因して、ヒアルロン酸の生体接着性を減少させる。
さらに、異なるエステルおよび架橋程度によって与えられるミクロスフェアの疎
水性は、生体接着の量に影響を与える。なぜなら、粘膜組織は、生体接着につい
ての重要な関係を有し得るかなりの疎水性を提示するようであるからである。従
って、例えば、より高い程度のエステル化は一般に、封入されたタンパク質のよ
り遅くかつ減少した放出を生じるが、生体接着特性が増強されたミクロスフェア
を生成する。

【００６４】さらに、抗原の生物学的因子（例えば、毛様体うなり周波数（ｃｉｌｉａｒｙ
ｂｅａｔｆｒｅｑｕｅｎｃｙ））、ならびに物理的因子（例えば、粒子の大
きさ、凝集の密度および程度、ならびに水溶解度）は、生体接着および生体腐食
（ｂｉｏｅｒｏｓｉｏｎ）の程度に影響を与える。例えば、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ
ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９６）１２９：１３７−１４５を参照のこ
と。

【００６５】さらに、種々のエステル、種々の量のエステル化、ならびに種々の程度の架橋
を有するミクロスフェアの混合物は、所定の抗原についての所望の生体接着およ
び放出反応速度を達成するため、ならびに一次免疫応答および二次免疫応答の両
方を提供するための処方物において用途を見出す。

【００６６】一旦形成されると、特定のヒアルロン酸／抗原組合せの接着性は、当該分野で
周知の任意の多数の方法を用いて、特定の処方が適切な生体接着特性を有するか
否かを評価するために決定され得る。例えば、表面張力測定に基づく、インビト
ロでの剥離重量研究が実施され得る。例えば、Ｓｍａｒｔら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．
Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８４）３６：２９５−２９９を参照のこと。手短に
は、試験ミクロスフェアは、生物学的基質、例えば、上皮組織に適用され、そし
て２つの組織切片を、それらの間に挟まれた試験生体接着剤から剥離するために
必要な重量を決定する装置を用いて剥離重量研究が実施される。例えば、Ｐｒｉ
ｔｃｈａｒｄら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９６）１２９：１３７−１４
５を参照のこと。あるいは、粘膜毛様体輸送速度（ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙｔ
ｒａｎｓｐｏｒｔｒａｔｅ）が、接着性の決定因子として用いられ得る。なぜ
なら、試験物質の接着性が大きいほど、輸送速度が遅いからである。このような
研究は、例えば、Ｐｒｉｔｃｈａｒｄら、前出に記載されるように、カエル（Ｒ
ａｎａｐｉｐｉｅｎｓ）から切り出された上部口蓋の一部に沿った生体接着剤
の動きをモニタリングすることにより実施され得る。

【００６７】同様に、ミクロスフェアの生体腐食速度は、問題のヒアルロン酸／抗原処方物
が適切な量の抗原を所定の疾患について免疫系に提供するか否かを決定するため
に、当該分野で周知の標準的な技術を用いて、例えば、インビトロ放出プロフィ
ールによって決定され得る。例えば、溶解試験は、例えば、ミクロスフェアを適
切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液またはＢＳＡ）に連続的に攪拌しながら分散
させることにより、実施され得る。この溶液のサンプルを、一定の時間間隔で取
り出し、そして目的の抗原について例えば、ＥＬＩＳＡまたは任意の他の適切な
アッセイを用いてアッセイする。Ｇｈｅｚｚｏら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（
１９９２）８７：２１−２９を参照のこと。

【００６８】粒子の大きさは、例えば、レーザー光分散によって、例えば、ヘリウム−ネオ
ンレーザーを備えている分光光度計を用いて決定され得る。一般に、粒子の大き
さは室温にて決定され、そして問題のサンプルの複数の分析物（例えば、５〜１
０回）を含み、粒子直径についての平均値が得られる。粒子の大きさはまた、走
査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて容易に決定される。こうするために、乾燥し
たミクロスフェアは、金／パラジウム混合物を用いて、約１００オングストロー
ムの厚さにスパッターコーティングされ、次いで走査型電子顕微鏡を用いて調べ
られる。

【００６９】この抗原がミクロスフェア中に提供される場合、この抗原含量は、一般に、適
切な量のミクロスフェアが、適切な免疫応答を惹起するために被験体に送達され
得るように決定される。抗原含量は、当該分野で公知の方法に従って、例えば、
ミクロスフェアを破壊し、そして任意の封入された抗原を抽出することにより、
決定され得る。例えば、ミクロスフェアは、溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）に溶解さ
れ得るか、または例えば、５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する０．１ＭＮａＯＨ
中に分散され得る。このサンプルは攪拌され、必要に応じて遠心分離され、そし
て上清が適切なアッセイを用いて目的の抗原についてアッセイされる。例えば、
Ｂｅｎｅｄｅｔｔｉら、ＪＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌ．（１９９０）１３
：３３−４１；およびＯ’Ｈａｇａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９４
）１０３：３７−４５を参照のこと。

【００７０】あるいは、ミクロスフェアの形態であるかまたはそうでないかのいずれかのヒ
アルロン酸誘導体は、当該分野で周知のいくつかの方法のうちのいずれかを用い
て、その中に封入された抗原ではなく、抗原と直接合わされ得る。例えば、抗原
は、ミクロスフェア中に封入するのではなく、抗原とヒアルロン酸ポリマーとを
適切な緩衝液中で混合し、用いたヒアルロン酸ポリマーに依存して種々の時間の
間インキュベートし、そして所望の場合、この処方物を将来の使用のために凍結
乾燥することにより、吸着させ得る。従って、例えば、ＨＹＡＦＦまたは混合型
エステル誘導体が用いられる場合、この抗原は一般に、ヒアルロン酸ポリマーに
対して約０．１％（ｗ／ｗ）〜約４０％（ｗ／ｗ）の抗原、より好ましくは約１
％（ｗ／ｗ）〜約２５％（ｗ／ｗ）の抗原、そしてさらにより好ましくは約２％
（ｗ／ｗ）〜約２０％（ｗ／ｗ）の抗原を表す量でヒアルロン酸ポリマーと共に
インキュベートされる。抗原の百分率は、以下でより詳細に議論されるように、
所望の用量および処置される状態に依存する。抗原とポリマーとのインキュベー
ションを、約０時間〜４８時間以上、好ましくは約０時間〜約２４時間、より好
ましくは約１時間〜約１０時間、そして最も好ましくは約２時間〜約４時間の間
進行させる。インキュベーション後、懸濁物は、凍結乾燥され得、そして乾燥し
た組成物は、免疫の前に適切なビヒクルに懸濁され得る。

【００７１】ＡＣＰを用いる場合、ＡＣＰは、ゲルとして提供され得る。国際公開第ＷＯ
９７／０７８３３号（ＦｉｄｉａＡｄｖａｎｃｅｄＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓＳｒｌ（ＡｂａｎｏＴｅｒｍｅ，Ｉｔａｌｙ）から入手可能）を参照のこと
。ＡＣＰゲルは、生理食塩水を用いて１：３０に希釈され、そして抗原と（そし
て必要に応じてアジュバントと）混合される（以下をさらに参照のこと）。次い
で、この溶液は、以下でより詳細に考察されるように被験体に、例えば、鼻腔内
に直接投与され得る。

【００７２】一旦抗原およびヒアルロン酸誘導体が上記のように作製されると、組成物は、
続いての粘膜送達のために処方される。この組成物は、一般に、粘膜送達に適切
な１以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食
塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど
）を含む。さらに、補助的な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質
など）がこのようなビヒクル中に存在し得る。

【００７３】例えば、鼻腔内処方物および肺処方物は、通常、鼻粘膜への刺激を生じず、か
つ線毛の機能を有意に乱さない、ビヒクルを含む。希釈剤（例えば、水、生理食
塩水または他の公知の物質）は、本発明とともに用いられ得る。鼻処方物はまた
、保存剤（例えば、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムであるがこれ
らに限定されない）を含み得る。界面活性剤は、鼻粘膜による本タンパク質の吸
収を増強するために存在し得る。

【００７４】直腸坐剤および尿道坐剤については、このビヒクル組成物は、伝統的な結合剤
およびキャリア（例えば、ココアバター（カカオ脂）または他のトリグリセリド
、エステル化、水素化、および／または分別により改変された植物油、グリセリ
ンゼラチン、多価アルカリグリコール、種々の分子量のポリエチレングリコール
の混合物、ならびにポリエチレングリコールの脂肪酸エステル）を含む。

【００７５】膣送達については、本発明のヒアルロン酸処方物は、ペッサリー基剤（例えば
、ポリエチレントリグリセリドの混合物を含むペッサリー基剤、または油（例え
ば、トウモロコシ油またはゴマ油）に懸濁された、必要に応じてコロイド状シリ
カを含むペッサリー基剤）に取り込まれ得る。例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎら
、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９５）１１５：９−１５を参照のこと。

【００７６】特定の送達態様について使用するための適切なビヒクルのさらなる議論につい
ては、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａ
ｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ
ｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，第１９版，１９９５を
参照のこと。当業者は、特定の抗原および送達部位に使用するために適切なビヒ
クルを容易に決定し得る。

【００７７】アジュバントは、薬学的組成物の有効性を増強するために使用され得る。この
アジュバントは、例えば、同じ組成物中で、または別個の組成物中で、本発明の
ヒアルロン酸処方物と同時に投与され得る。あるいは、アジュバントは、本発明
のヒアルロン酸組成物の前にまたはその後に投与され得る。このようなアジュバ
ントは、以下を含むがこれらに限定されない：（１）アルミニウム塩（ミョウバ
ン）（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムな
ど）；（２）水中油型エマルジョン処方物（他の特定の免疫刺激剤（例えば、ム
ラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌細胞壁成分）を有するかまたは
有さない）、例えば、（ａ）マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉ
ｚｅｒ）（例えば、Ｍｏｄｅｌ１１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒ
ｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ））を用いてサブミクロンの粒子に処
方された、５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓ
ｐａｎ８５を含む（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥ（以下を参照のこと
）を含むがその必要はない）、ＭＦ５９（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号
）など、（ｂ）１０％スクアレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニ
ック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（
以下を参照のこと）を含む、サブミクロンエマルジョンにマイクロフルイダイズ
されたかまたはより大きな粒子の大きさのエマルジョンを生成するようにボルテ
ックスされたかのいずれかの、ＳＡＦ、ならびに（ｃ）２％スクアレン、０．２
％Ｔｗｅｅｎ８０、およびモノホスホリルリピドＡ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈ
ｏｒｙｌｉｐｉｄＡ）（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、お
よび細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群から選択される１以上の細菌細胞壁成分（
好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）を含む、Ｒｉｂｉ^TMアジュバント
システム（ＲＡＳ）（ＲｉｂｉＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍ
Ｔ）；（３）サポニンアジュバント（例えば、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^TM（Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）が用いられ得る
かまたはそれから粒子が生成され得る（例えば、ＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）
）；（４）完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジ
ュバント（ＩＦＡ）；（５）サイトカイン（例えば、インターロイキン（ＩＬ−
１、ＩＬ−２など）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊
死因子（ＴＮＦ）など）；（６）細菌ＡＤＰ−リボシル化毒素（例えば、コレラ
毒素（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定毒素（ＬＴ）
、特にＬＴＫ６３（ここでリジンが、野生型アミノ酸を６３位で置換している
）、ＬＴＲ７２（ここで、アルギニンが、野生型アミノ酸を７２位で置換して
いる）、ＣＴ−Ｓ１０９（ここでセリンが、野生型アミノ酸を１０９位で置換
している）、およびＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９（ここでリジンが野生型アミノ酸を９
位で置換しており、そしてグリシンが１２９位で置換している）（例えば、国際
公開第Ｗ０９３／１３２０２号および同第Ｗ０９２／１９２６５号を参照のこと
）の無毒化変異体；ならびに（７）免疫刺激剤として作用して、組成物の有効性
を増強する他の物質。

【００７８】ムラミルペプチドとしては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−
イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル（ａｃｔｅｙｌ）−ノルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ノル−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラ
ミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−
Ｌ−アラニン−２（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロ
キシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エ
チルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）などが挙げられるがこれらに限定されない。

【００７９】この組成物の種々の成分は、広範な範囲の比で存在し得る。例えば、ヒアルロ
ン酸−抗原およびアジュバント成分は、代表的に、１：５０〜５０：１、好まし
くは１：１０〜１０：１、より好ましくは約１：３〜３：１、そして最も好まし
くは約１：１の容量比で用いられる。しかし、他の比が、特定の目的のためによ
り適切であり得、例えば、特定の抗原が、ヒアルロン酸組成物中に組み込まれる
のが困難でありかつ低い免疫原性を有するという両方の場合、より高い相対量の
抗原成分が必要とされる。

【００８０】組成物は、「治療有効量」の目的の抗原を含む。すなわち、症状を予防、低減
、または排除するために充分な免疫学的応答を被験体において生じさせる抗原の
量が組成物中に含まれる。正確な必要量は、とりわけ、処置される被験体；処置
される被験体の年齢および一般的状態；被験体の免疫系が抗体を合成する能力；
所望される防御の程度；処置される状態の重篤度；選択される特定の抗原および
その投与形態などの要因に依存して変動する。適切な有効量は、当業者によって
容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、慣用的な試験によって決定さ
れ得る比較的広範な範囲に入る。例えば、本発明の目的については、有効用量は
、代表的に１用量あたり、約１μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは約５μｇ〜
約１ｍｇ、そして最も好ましくは約１０μｇ〜約５００μｇの送達される抗原の
範囲である。

【００８１】一旦処方されると、本発明の組成物は、標準的な技術を用いて粘膜投与される
。例えば、鼻腔内、肺、膣、および直腸の技術を含む粘膜送達技術については、
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏ
ｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，Ｅ
ａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，第１９版，１９９５を、ならびに鼻腔
内投与の技術については欧州公開第５１７，５６５号およびＩｌｌｕｍら、Ｊ．
ＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄＲｅｌ．（１９９４）２９：１３３−１４１を参照のこ
と。

【００８２】投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多回用量スケジュールであり得る。
多回用量スケジュールは、初期のワクチン接種過程が、１〜１０回の別個の用量
を用いてであり得、続いて他の用量が、免疫応答を維持および／または強化する
ために選択された間隔（例えば、２回目の用量については１〜４ヶ月）をおいて
次回に与えられ、そして必要に応じてそれに続く用量が数ヶ月後に与えられるス
ケジュールである。ブーストは、一次免疫応答について与えられるのと同じ処方
を用いてであり得るか、またはその抗原を含む異なる処方物を用いてであり得る
。投薬レジメはまた、少なくとも部分的に、被験体の必要性によって決定され、
そして開業医の判断に依存する。さらに、疾患の予防が所望される場合、このワ
クチンは一般に、目的の病原体による一次感染前に投与される。処置（例えば、
症状または再発の低減）が所望される場合、このワクチンは一般に、一次感染後
に投与される。

【００８３】処方物は、粘膜送達の研究のために開発された多数の動物モデルにおいてイン
ビボで試験され得る。例えば、意識的なヒツジモデルは、大きな鼻腔、カニュー
レ挿入のための頸静脈への接近しやすさ、ならびに実験条件下でのヒツジの穏や
かな気質に起因して、物質の鼻送達を試験するための当該分野で認識されたモデ
ルである。例えば、Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１
９８７）７６：３５１−３５５およびＩｌｌｕｍら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ
Ｒｅｌ．（１９９４）２９：１３３−１４１を参照のこと。それゆえ、ヒツジ
は、この動物に手短に鎮静剤を飲ませて投与の間のくしゃみを予防し、そして経
口チューブ／鼻チューブを問題のワクチンとともにヒツジの外鼻孔の規定の深さ
まで挿入することにより、試験物質が投与され得る。次いで、通常、粉末の凍結
乾燥形態であるワクチンは、鼻腔に吹き込まれる。次いで、血液サンプルが、投
与の前および投与に続いて、カニューレ挿入された頸静脈から収集される。血液
サンプルは、上記のように、当該分野において公知の標準的な技術を用いて抗体
力価についてアッセイされ得る。細胞免疫応答はまた、上記の通りにモニタリン
グされ得る。

【００８４】容易に明らかなように、本発明の組成物は、ウイルス、細菌、寄生生物および
真菌によって引き起こされる広範な種々の疾患および感染を処置および／または
予防するために、ならびに種々の腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激するために有
用である。上記のように、この組成物は治療的または予防的にのみ用いられ得る
のではなく、この組成物は、例えば、診断目的のためにポリクローナルおよびモ
ノクローナルの両方の抗体を調製するためにも、ならびに目的の抗原の免疫精製
（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）のためにも用いられ得る。ポリクロ
ーナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、
ヤギ、ウマなど）が、本発明の組成物を用いて免疫される。この動物は通常、２
〜６週間後に１以上の抗原投与によってブーストされる。次いで、ポリクローナ
ル抗血清が、免疫された動物から得られ、そして公知の手順に従って処理される
。例えば、Ｊｕｒｇｅｎｓら（１９８５）Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．３４８：３６３−３
７０を参照のこと。

【００８５】モノクローナル抗体は、一般に、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａ
ｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−９６の方法またはその変法を用いて調製
される。代表的には、マウスまたはラットは、上記の通りに免疫される。しかし
、血清を抽出するために動物から採血するよりも、脾臓（および必要に応じてい
くつかの大きなリンパ節）を取り出し、そして単細胞に解離する。所望の場合、
脾臓細胞は、細胞懸濁物を、タンパク質抗原でコーティングしたプレートまたは
ウェルに適用することにより、（非特異的接着細胞を除去した後に）スクリーニ
ングされ得る。この抗原に特異的な膜結合型免疫グロブリンを発現するＢ細胞は
、このプレートに結合し、そして残りの懸濁物を用いるリンスによっては流され
ない。次いで、得られるＢ細胞または全ての解離した脾臓細胞は、ミエローマ細
胞と融合するように誘導されて、ハイブリドーマを形成し、そして選択培地（例
えば、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地である「ＨＡＴ」）中で
培養される。得られるハイブリドーマは、限界希釈によってプレーティングされ
、そして免疫した抗原に特異的に結合する（そして関連のない抗原に結合しない
）抗体の生成についてアッセイされる。次いで、選択された、モノクローナル抗
体分泌性ハイブリドーマは、インビトロ（例えば、組織培養瓶もしくは中空繊維
リアクターにおいて）またはインビボ（マウスにおいて腹水として）のいずれか
で培養される。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、ＨｙｂｒｉｄｏｍａＴｅｃ
ｈｎｉｑｕｅｓ（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴ−ｃｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ（１９
８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら、ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１
９８０）を参照のこと；米国特許第４，３４１，７６１号；同第４，３９９，１
２１号；同第４，４２７，７８３号；同第４，４４４，８８７号；同第４，４５
２，５７０号；同第４，４６６，９１７号；同第４，４７２，５００号、同第４
，４９１，６３２号；ならびに同第４，４９３，８９０号もまた参照のこと。目
的のポリペプチドに対して生成されたモノクローナル抗体のパネルは、種々の特
性（すなわち、アイソタイプ、エピトープ、親和性など）についてスクリーニン
グされ得る。

【００８６】（ＩＩＩ．実験）以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の実施例である。これらの実
施例は、例示の目的のためにのみ提供され、そして本発明の範囲を如何様にも限
定することは意図しない。

【００８７】用いた数字（例えば、量、温度など）に関して精度を確実にするように努力し
たが、いくつかの実験誤差および偏差が、もちろん許容されるべきである。

【００８８】（実施例１：インフルエンザ抗原を含むＨＹＡＦＦ処方物の調製および使用）ＨＹＡＦＦ１１ポリマーのプラシーボ（ブランク）微粒子（ベンジルアルコー
ルを用いて約１００％エステル化した）は、ＦｉｄｉａＡｄｖａｎｃｅｄＢ
ｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓＳｒｌ（ＡｂａｎｏＴｅｒｍｅ，Ｉｔａｌｙ）によっ
て供給された。これらの微粒子の平均の大きさは、ＭａｌｖｅｒｎＭａｓｔｅ
ｒｓｉｚｅｒＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔによって決定した場合、約８ミクロンであ
った（大きさの分布の一部は１ミクロン未満であり、そして一部は１０ミクロン
を超えていた）。

【００８９】１０μｇのインフルエンザ抗原Ｈ３Ｎ２（「ＨＡ」）（ＣｈｉｒｏｎＶａｃ
ｃｉｎｅｓ，Ｓｉｅｎｎａ，Ｉｔａｌｙ）および１０〜２５μｇのＬＴ−Ｋ６３
（国際公開第ＷＯ９３／１３２０２号）の用量を達成するために、微粒子への
１％ｗ／ｗのＨＡ／ＬＴ−Ｋ６３ローディングを標的化した。このようにする
ために、１ｍｇのＨＡおよび１ｍｇのＬＴ−Ｋ６３（８４ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、
１１ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄、８２ｍＭＮａＣｌ中）を、ＰＢＳ中の１００ｍｇのブ
ランクミクロスフェアとともに、４℃にて３時間インキュベートした。次いで、
懸濁物を、−８０℃にて凍結し、そして一晩凍結乾燥した。

【００９０】実際の抗原／アジュバント負荷量を、微粒子を加水分解し、そしてＳｈａｒｉ
ｆおよびＯ’Ｈａｇａｎ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９５）１１５：２５
９−２６３に記載される通りに微量−ＢＣＡにより総タンパク質含量を評価する
ことにより確認した。実際の負荷量は、微粒子に対して約０．８％ｗ／ｗ〜１
．０％ｗ／ｗの抗原／ＬＴ−Ｋ６３の範囲であった。

【００９１】免疫の前に、約２０ｍｇの乾燥した微粒子処方物を、通常の生理食塩水中に懸
濁し、その後、動物に鼻腔内送達した。マウスについては、この処方物を、５０
μ１の生理食塩水中に懸濁した；モルモットについては、この処方物を、２５０
μｌの生理食塩水中に懸濁した；そしてミニブタ（ｍｉｃｒｏｐｉｇ）につい
ては、この処方物を５００μｌ中に懸濁した。

【００９２】Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、６つの群に分け、そして以下に示す処方物を、微量ピ
ペットを用いて鼻腔内投与した。動物を、２８日後にブーストした。

【００９３】群１生理食塩水中抗原（ＨＡ）単独群２０．５ｍｇのＨＹＡＦＦプラシーボ微粒子と同時凍結乾燥したＨＡ群３生理食塩水中のＬＴ−Ｋ６３（１０μｇ）を有するＨＡ群４０．５ｍｇのＨＹＡＦＦプラシーボ微粒子および１０μｇのＬＴ−Ｋ
６３と同時凍結乾燥したＨＡ群５生理食塩水中のＬＴ−Ｋ６３（２５μｇ）を有するＨＡ群６０．５ｍｇのＨＹＡＦＦプラシーボ微粒子および２５μｇのＬＴ−Ｋ
６３と同時凍結乾燥したＨＡ動物を、４２日目に採血し、そして抗ＨＡ力価を、ＥＬＩＳＡによってサンプ
ル血清中の総抗ＨＡＩｇＧ力価を評価することにより決定した。表１に示すよ
うに、アジュバントありおよびなしの両方で、ＨＹＡＦＦと組み合わせて抗原を
投与した動物は、抗原単独で投与した動物よりも高い抗体力価を有していた。Ｈ
ＹＡＦＦおよびアジュバントとともに抗原を投与した動物は、最大の力価を有し
ていた。

【００９４】

【表１】（実施例２：インフルエンザ抗原を含むＡＣＰ処方物の調製および使用）自己架橋した多糖（ＡＣＰ）ヒアルロン酸ゲルを、ＦｉｄｉａＡｄｖａｎｃ
ｅｄＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓＳｒｌ（ＡｂａｎｏＴｅｒｍｅ，Ｉｔａｌｙ
）から入手し、そして輸送されるとともに用いた。このゲルに、１０μｇのＨＡ
および１０μｇ〜２５μｇのＬＴ−Ｋ６３を水溶液中で添加し、ゲル対水の比を
１：３０とした。

【００９５】５０μｌの粘性溶液を、微量ピペットを用いて、以下の表２に示すように各群
５匹の動物からなる３群のＢａｌｂ／Ｃマウスに鼻腔内投与した。処方物を、調
製してから６０分以内に投与した。動物を、２８日後にブーストし、４２日目に
採血し、そして抗ＨＡ力価をＥＬＩＳＡにより決定した。鼻洗浄物からのＩｇＡ
力価もまた、アッセイした。

【００９６】表２に示すように、ＡＣＰおよびアジュバントと組合せて抗原を投与した動物
は、抗原単独で投与した動物よりも高い抗体力価を有していた。

【００９７】

【表２】上記の研究を、各群５匹の動物からなる３群のモルモットを用いて繰り返した
。用いた方法は、モルモットに表３に示す２００μｌの処方物を投与し、そして
２８日目に１回および５６日目に１回の２回ブーストしたこと以外は、上記の通
りであった。表３に示すように、ＡＣＰおよびアジュバントと組合せて抗原を投
与した動物は、抗原単独で投与した動物よりも高い抗体力価を有していた。

【００９８】

【表３】（実施例３：ＨＹＡＦＦ処方物とＡＣＰ処方物との比較）ＨＹＡＦＦおよびＡＣＰゲルにおけるＨＡ抗原の免疫原性を、ミニブタ（Ｙｕ
ｃａｔａｎ）において評価した。１２匹のブタを、表４に示すように、各群４匹
からなる３つの群に分けた。適切な用量を達成するために、ブタに、１６ゲージ
のＴｅｆｌｏｎカテーテルを用いて、５００μｌのＡＣＰ処方物または５０ｍｇ
のＨＹＡＦＦ処方物を鼻腔内投与した。コントロールのブタに、５００μｌの抗
原単独を与えた。ブタに、２８日目にブーストし、そして血清を採集し、そして
抗ＨＡ血清ＩｇＧレベルについてＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。

【００９９】表４からわかり得るように、ＨＹＡＦＦまたはＡＣＰとともに抗原を投与した
ブタの群は両方とも、抗原単独を投与したブタよりも高い力価を有しており、Ｈ
ＹＡＦＦ処方物を投与したブタが最大の力価を有していた。

【０１００】

【表４】（実施例４：筋肉内で送達された処方物と鼻腔内で送達された処方物との比較
）筋肉内（ｉ．ｍ．）または鼻腔内（ｉ．ｎ．）のいずれかで送達された、表５
に指定される処方物が免疫応答を誘発する能力を、ミニブタ（Ｙｕｃａｔａｎ）
において評価した。詳細には、１２匹のブタを、表５に示すように、各群４匹の
ブタからなる３群に分けた。ブタを、２５μｇのＨＡ抗原でｉ．ｍ．にて（群１
）、２５μｇのＨＡ抗原および１００μｇのＬＴ−Ｋ６３でｉ．ｎ．にて（群２
）、またはＨＹＡＦＦミクロスフェアを有する２５μｇのＨＡおよび１００μｇ
のＬＴ−Ｋ６３でｉ．ｎ．にて（群３）のいずれかで免疫した。ブタを、０週目
および４週目に免疫した。血清および鼻分泌物を、２８日目、４２日目および５
６日目に採集し、そして抗ＨＡ血清ＩｇＧレベルおよびＩｇＡレベルについてＥ
ＬＩＳＡを用いてアッセイした。

【０１０１】図１および図２においてわかり得るように、ＨＹＡＦＦ処方物を投与されたブ
タは、ＨＹＡＦＦを欠くｉ．ｍ．群またはｉ．ｎ．群のいずれよりも有意に高い
応答を生じた。ＨＹＡＦＦ処方物はまた、より高いＨＡ特異的鼻ＩｇＡ応答を与
えた。血球凝集阻害（ＨＩ）力価（表５を参照のこと）もまた、ＨＹＡＦＦ免疫
群の動物において最大であった。

【０１０２】本実施例は、ＨＹＡＦＦを有する抗原の鼻腔内投与が、抗原単独の筋肉内投与
よりも良好な結果を達成することを示す。

【０１０３】

【表５】従って、ワクチン抗原を送達するためのヒアルロン酸誘導体の使用が記載され
る。本発明の好ましい実施態様がいくぶん詳細に記載されているが、添付の特許
請求の範囲によって規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、
明らかな改変が行われ得ることが理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ＨＡのみを筋肉内に（白抜きの棒）、ＨＡおよびアジュバントＬＴ
−Ｋ６３を鼻腔内に（黒塗りの棒）、ならびにＨＹＡＦＦ微粒子およびＬＴ−Ｋ
６３とともにＨＡを鼻腔内に（斜交平行線の棒）投与されたブタにおける抗ＨＡ
ＩｇＧの力価を示す。

【図２】図２は、ＨＡのみを筋肉内に（白抜きの棒）、ＨＡおよびアジュバントＬＴ
−Ｋ６３を鼻腔内に（黒塗りの棒）、ならびにＨＹＡＦＦ微粒子およびＬＴ−Ｋ
６３とともにＨＡを鼻腔内に（斜交平行線の棒）投与されたブタにおける抗ＨＡ
ＩｇＡの力価を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者オハガン，デレックアメリカ合衆国カリフォルニア 94608，エミリービル，ホートンストリート −アール400 4560，カイロンコーポレイション内 (72)発明者パベジオ，アレッサンドライタリア国イ−35100 パドバ， 159，ビアデコラティアルバロレシビルＦターム(参考） 4C076 AA61 AA93 BB25 CC06 CC35 EE37 FF34 GG21 4C085 AA03 AA38 BA51 BA55 EE10 FF24 GG10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒアルロン酸エステルポリマーおよび選択された抗原を含む
組成物であって、該抗原が、ヒアルロン酸ポリマーに対して約０．１％〜約４０
％（ｗ／ｗ）の抗原量で存在する、組成物。
【請求項２】前記抗原が、ヒアルロン酸ポリマーに対して約２％〜約２５
％（ｗ／ｗ）の抗原量で存在する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】前記ヒアルロン酸エステルが、約７５％〜約１００％の遊離
のカルボキシル基が１つ以上のアルキル基でエステル化されたヒアルロン酸、お
よび前記ヒアルロン酸ポリマーの該カルボキシル基の約０．５％〜約２０％が同
じまたは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシル基と架橋したヒアルロン酸の架
橋誘導体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】免疫学的アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の組成
物。
【請求項５】前記アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２から
なる群より選択される細菌性ＡＤＰリボシル化毒素の無毒化変異体である、請求
項４に記載の組成物。
【請求項６】前記選択された抗原がウイルス抗原である、請求項１に記載
の組成物。
【請求項７】前記選択された抗原がインフルエンザ抗原である、請求項６
に記載の組成物。
【請求項８】前記ヒアルロン酸エステルが、ミクロスフェアの形態で提供
される、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】前記選択された抗原が、前記ミクロスフェア中に封入されて
いる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】前記選択された抗原が、前記ミクロスフェアに吸着されて
いる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】組成物であって、（ａ）約７５％〜約１００％の遊離のカ
ルボキシル基が１つ以上のアルキル基でエステル化されているヒアルロン酸、お
よびヒアルロン酸ポリマーの該カルボキシル基の約０．５％〜約２０％が同じま
たは異なるヒアルロン酸分子のヒドロキシル基と架橋したヒアルロン酸の架橋誘
導体からなる群より選択される、ヒアルロン酸エステルポリマーから構成されて
いるミクロスフェア；（ｂ）該ミクロスフェア中に封入、または吸着されている
選択された抗原であって、該抗原が、ヒアルロン酸ポリマーに対して約２％〜約
２５％（ｗ／ｗ）の抗原量で存在する、抗原；ならびに（ｃ）免疫学的アジュバ
ント、を含む、組成物。
【請求項１２】前記選択された抗原が前記ミクロスフェア中に封入されて
いる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】前記選択された抗原が前記ミクロスフェアに吸着されてい
る、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】請求項１に記載の組成物を薬学的に受容可能な粘膜賦形剤
と組み合わせる工程を包含する、薬学的組成物を生成する方法。
【請求項１５】請求項１１に記載の組成物を薬学的に受容可能な粘膜賦形
剤と組み合わせる工程を包含する、薬学的組成物を生成する方法。
【請求項１６】治療有効量の、請求項１４に記載の薬学的組成物を脊椎動
物被験体に粘膜投与する工程を包含する、免疫方法。
【請求項１７】治療有効量の、請求項１５に記載の薬学的組成物を脊椎動
物被験体に粘膜投与する工程を包含する、免疫方法。
【請求項１８】前記投与が鼻腔内でなされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】前記投与が鼻腔内でなされる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】粘膜免疫のための医薬品の製造におけるヒアルロン酸エス
テルポリマーの使用であって、該医薬品が該ポリマーおよび選択された抗原を含
み、ここで、該抗原がヒアルロン酸ポリマーに対して約０．１％〜約４０％（ｗ
／ｗ）の抗原量で存在する、使用。