ES2235489T3 - Uso de polimeros de acido hialuronico para la administracion por las mucosas de antigenos y coadyuvantes de vacunas. - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un polímero de éster de ácido hialurónico y un antígeno seleccionado, en la que el mencionado antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente 0, 1 % a aproximadamente 40 % (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico, y se deriva de un patógeno viral, bacteriano, fúngico o parásito.

Description

Uso de polímeros de ácido hialurónico para la administración por las mucosas de antígenos y coadyuvantes de vacunas.

Campo técnico

La presente invención se refiere de manera general a sistemas de polímeros bioadhesivos. De manera particular, la invención se refiere al uso de polímeros de ácido hialurónico para la liberación en la mucosa de antígenos y coadyuvantes de vacunas.

Antecedentes de la invención

La inmunidad de las mucosas proporciona un importante mecanismo de defensa frente a una amplia variedad de patógenos. En este aspecto, las superficies mucosas de los tractos gastrointestinal, respiratorio y genitourinario están continuamente expuestas a antígenos externos, incluyendo bacterias potencialmente infecciosas, virus y, algunas veces, organismos parásitos. Las respuestas inmunes de la mucosa protegen frente a estos desafíos y tienen características distintas y especializadas.

Por ejemplo, la principal inmunoglobulina producida por el sistema inmune de la mucosa es la IgA secretora. Las células especializadas en la absorción de antígenos en las Placas de Peyer del tracto intestinal o de los tejidos linfoides nasofaríngeos, denominadas micropliegues o células M, transportan el antígeno hasta la mucosa subyacente asociada a los tejidos linfoides (MALT). En otras zonas del epitelio de la mucosa, tales como el epitelio seudo estratificado de las vías respiratorias, las células dendríticas actúan como células "adivinadoras" de antígeno, y migran a los nódulos linfáticos locales o MALT. El procesamiento y presentación del antígeno se produce en la MALT, dando como resultado la activación de las células IgA B específicas del antígeno. El tráfico y recirculación subsiguiente de las células IgA-B activadas a otros componentes del sistema inmune de la mucosa, por ejemplo, los tractos respiratorio, intestinal y genital, proporciona respuestas diseminadas de la mucosa local en todo el "Sistema Común de la Mucosa". De esta manera, el sistema inmune de la mucosa es el único adecuado para responder a los tipos de desafíos antigénicos que se presentan en las superficies de las mucosas, y puede proporcionar el tipo más efectivo de respuesta inmune frente a patógenos particulares. De acuerdo con esto, los mecanismos liberadores de antígenos que tienen como objetivo el sistema inmune de la mucosa proporcionan un medio atractivo para conseguir inmunidad.

Se han hecho intentos para usar polímeros bioadhesivos para la liberación de fármacos en la mucosa. Los bioadhesivos son materiales sintéticos y naturales capaces de adherirse a los sustratos biológicos durante período de tiempo largos. Por ejemplo, el carbopol y policarbopol, ambos derivados sintéticos entrecruzados del ácido poli (acrílico), presentan excelentes propiedades de adhesión in vitro. Sin embargo, el rendimiento de estos bioadhesivos no se ha duplicado in vivo. De manera adicional, dichos bioadhesivos pueden causar irritación local. De aquí que estén disponibles pocos sistemas bioadhesivos para liberación.

La atención se ha dirigido por tanto hacia el desarrollo de sistemas bioadhesivos de liberación basados en sustancias que se producen de forma natural, tales como las lectinas y las proteínas fimbricas. Estos bioadhesivos se adhieren a las superficies celulares de la mucosa mediante mecanismos mediados por receptor. Otro bioadhesivo natural es el ácido hialurónico, también conocido como hialuronano. El ácido hialurónico es un mucopolisacárido producido de forma natural constituido por residuos de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. El ácido hialurónico se encuentra en la matriz del tejido extracelular de los vertebrados, incluyendo los tejidos conectivos, así como en el fluido sinovial y en el humor vítreo y acuoso del ojo. Se ha demostrado que el ácido hialurónico es bioadhesivo in vivo e in vitro.

Se han usado derivados esterificados del ácido hialurónico para producir microesferas que sean biocompatibles y biodegradables. Véase, por ejemplo, Cortivo y col., Biomaterials (1991) 12: 727-730; European Publication Nº 517.565. Estas microesferas se han usado para liberar a la mucosa numerosas sustancias. Véase, por ejemplo, International Publication Nº WO 96/29998. Por ejemplo, Richardson y col., Int. J. Pharm. (1995) 115:9-15) describe la liberación vaginal de calcitonina en ratas. De manera adicional, Illum y col., J. Controlled Rel. (1994) 29: 133-141 y European Publication Nº 517.565 describen el uso de microesferas de éster de ácido hialurónico para la liberación intranasal de insulina en ovejas.

Sin embargo, no ha sido descrito hasta ahora el uso de ácido hialurónico para liberar antígenos de vacunas.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento efectivo para obtener una respuesta inmune en un sujeto mamífero usando inmunización de la mucosa y las técnicas de liberación del ácido hialurónico. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la liberación en la mucosa de derivados del ácido hialurónico, tales como polímeros esterificados de ácido hialurónico y polímeros autoentrecruzados de ácido hialurónico, en combinación con un antígeno de interés, y de manera opcional un coadyuvante, actúan para mejorar la inmunogenicidad del antígeno coadministrado con el mismo. Sin desear quedar ligado por una teoría concreta, se cree que las propiedades bioadhesivas de los polímeros del ácido hialurónico disminuyen la velocidad de limpieza mucociliar de la cavidad nasal, y de esta manera permiten un mayor tiempo de contacto entre el antígeno y la membrana absorbente. De manera adicional, se produce un ensanchamiento transitorio de las junturas impermeables entre las células del epitelio de la mucosa, permitiendo un transporte más eficiente del antígeno de interés. El uso de polímeros de ácido hialurónico proporciona una hipótesis segura y efectiva para mejorar la inmunogenicidad de una amplia variedad de antígenos.

De acuerdo con esto, en una forma de realización, la invención se dirige a una composición que comprende un polímero de éster de ácido hialurónico y un antígeno seleccionado, en la que el antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 40% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico.

En formas de realización particularmente preferidas, el éster de ácido hialurónico se selecciona entre el grupo constituido por un ácido hialurónico del que aproximadamente un 75% a aproximadamente un 100% de grupos carboxilo libres están esterificados con uno o más grupos alquilo, y un derivado entrecruzado de ácido hialurónico en el que aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 20% de grupos carboxilo del polímero de ácido hialurónico están entrecruzados con grupos hidroxilo de la misma o diferente molécula de ácido hialurónico.

En otra forma de realización, la invención se dirige a una composición que comprende (a) una microesfera formada por un éster de ácido hialurónico seleccionada del grupo constituido por un ácido hialurónico del que aproximadamente un 75% a aproximadamente un 100% de grupos carboxilo libres están esterificados con uno o más grupos alquilo, y un derivado entrecruzado del ácido hialurónico que comprende ésteres internos en los que aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 20% de grupos carboxilo del polímero de ácido hialurónico se entrecruzan con grupos hidroxilo de la misma o diferente molécula de ácido hialurónico; (b) un antígeno seleccionado atrapado o adsorbido en la microesfera, en la que el antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 25% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico; y (c) en un coadyuvante inmunológico.

En formas de realización adicionales, el sujeto de la invención se dirige a los procedimientos de fabricación de composiciones farmacéuticas que comprenden la combinación de las composiciones anteriores con excipientes para mucosa farmacéuticamente aceptables, así como a los procedimientos de inmunización que comprenden la administración terapéutica a un sujeto vertebrado en la mucosa de cantidades efectivas de composiciones farmacéuticas.

Estas y otras formas de realización de la presente invención serán evidentes fácilmente para aquellas personas expertas en la técnica a la vista de la descripción del presente documento.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra títulos de IgG anti-Ha en a las que se ha administrado sólo HA intramuscularmente (barras abiertas), HA y el coadyuvante LT-K63 intranasalmente (barras sólidas) y HA con micropartículas HYAFF y LT-K63 intranasalmente (barras cruzadas).

La Figura 2 muestra títulos de IgG anti-Ha en a las que se ha administrado sólo HA intramuscularmente (barras abiertas), HA y el coadyuvante LT-K63 intranasalmente (barras sólidas) y HA con micropartículas HYAFF y LT-K63 intranasalmente (barras cruzadas).

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, al alcance del experto en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick y N Kaplan, eds., Academic Press, Inc); y Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir y C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell scientific Publications); y Sambrook, y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª Edición, 1989).

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en el presente documento, ya sean supra o infra, se incorporan completamente como referencia en su totalidad.

Tal como se usa en esta descripción y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "a", "un" y "el" incluyen referencias plurales a no ser que se dicte claramente el contenido de otra manera. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un antígeno" incluye una mezcla de dos o más de los mencionados agentes.

I. Definiciones

En la descripción de la presente invención se emplearán los siguientes términos y se pretende definirlos como se indica a continuación.

Los términos "ácido hialurónico" y "hialuronano" se usan en el presente documento para indicar un polisacárido ácido reconocido por la técnica que es una molécula de cadena larga no ramificada compuesta por unidades monoméricas repetidas de ácido D-glucurónico enlazadas mediante un enlace \beta1-3 glucosídico a la N-acetil-D-glucosamina (estructura 1, a continuación); un enlace \beta1-3 glucosídico enlaza las unidades simples.

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Un "derivado de ácido hialurónico" es una molécula derivada del ácido hialurónico e indica cualquiera de la diversas sustancias, conocidas en la técnica, tales como moléculas esterificadas de ácido hialurónico en las que aproximadamente un 75%-100% de grupos carboxilo libres se esterifican con un grupo alquilo, denominado colectivamente "HYAFF" en el presente documento. El término también incluye ésteres de ácido hialurónico "mezclados", en los que los grupos carboxilo se esterifican con más de un grupo alquilo Dichos ésteres "mezclados" se describen más completamente a continuación. Además, el término "derivado de ácido hialurónico" se refiere también a derivados auto-entrecruzados de ácido hialurónico, denominados "ACP" en el presente documento, que incluyen ésteres internos y en los que aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 20% de grupos carboxilo del polímero de ácido hialurónico se entrecruzan con grupos hidroxilo de las mismas o diferentes moléculas de ácido hialurónico. Dichas moléculas se describen con mayor detalle a continuación.

El término "microesfera" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una partícula de ácido hialurónico de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 150 \mum de diámetro, de manera más preferible aproximadamente 200 nm a aproximadamente 30 \mum de diámetro, y de manera más preferible 500 nm a aproximadamente 10 \mum de diámetro. El tamaño de la microesfera se determina fácilmente mediante técnicas bien conocidas en la técnica, tales como espectroscopia de correlación de fotones, difractometría láser y/o microscopía de barrido de electrones. Las microesferas para uso en el presente documento se formarán a partir de polímeros de ácido hialurónico y derivados de los anteriores, descritos con más detalle, que sean no tóxicos y biodegradables.

El término "alquilo" tal como se usa en el presente documento se refiere a un grupo hidrocarburo saturado ramificado o no ramificado de 1 a 24 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, t-butilo, octilo, decilo, tetradecilo, hexadecilo, eicosilo, tetracosilo y similares, así como a grupos cicloalquilo tales como ciclopentilo, ciclohexilo, bencilo, y similares.

Por liberación en la "mucosa" se entiende la liberación de un antígeno en una superficie mucosa, incluyendo la liberación nasal, pulmonar, vaginal, rectal, uretral, y sublingual o bucal.

Por "antígeno" se define una molécula que contiene uno o más epítopos que estimularán el sistema inmunológico del huésped para dar lugar a una respuesta inmunocelular antígeno específica cuando se presenta el antígeno, o a una respuesta humoral al anticuerpo. Normalmente un epítopo incluirá entre aproximadamente 3-15, de manera general aproximadamente 5-15, aminoácidos.

Para los objetivos de la presente invención, los antígenos se pueden obtener a partir de cualquiera de los diversos virus, bacterias, parásitos y hongos conocidos. El término también incluye diferentes antígenos tumorales. Además, para los objetivos de la presente invención, un "antígeno" se refiere a una proteína que incluye modificaciones, tales como delecciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservativas por naturaleza), en la secuencia nativa, de forma que, la proteína mantiene la capacidad para despertar una respuesta inmunológica. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, dirigidas desde un principio al emplazamiento de la mutagénesis, o pueden ser accidentales, tales como mediante las mutaciones de los huéspedes que producen los antígenos.

Una "respuesta inmunológica" a un antígeno o composición es el desarrollo en un sujeto de una respuesta inmune celular y/o humoral a las moléculas presentes en la composición de interés Para los objetivo de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras que una "respuesta inmune celular" es una respuesta mediada por linfocitos-T y/o otros leucocitos de la sangre. Un aspecto importante de la inmunidad celular implica una respuesta antígeno específica por las células-T citolíticas ("CTL"). Las CTL tienen especificidad por los péptidos de antígenos que se presentan en asociación con proteínas codificadas por la histocompatibilidad compleja principal (MHC) y expresadas sobre la superficie de las células Las CTL ayudan a inducir y promover la destrucción intracelular de los microbios intracelulares, o la lisis de las células infectadas con dichos microbios. Otro aspecto de la inmunidad celular implica una reacción antígeno específica de las células-T ayudantes. Las células-T ayudantes actúan para ayudar a estimular la función, y centran la actividad de las células efectoras no específicas frente a las células que presentan péptidos de antígenos en asociación con moléculas MHC sobre su superficie. Una "respuesta inmune celular" se refiere también a la producción de citoquinas, quimioquinas y otras de las mencionadas moléculas producidas por células-T activadas y/o otros leucocitos de la sangre, incluyendo aquellos derivadas de células T CD4+ y CD8+.

Una composición o vacuna que despierta una respuesta inmune celular puede servir para sensibilizar un sujeto vertebrado por la presentación del antígeno en asociación con moléculas MHC en la superficie celular. La respuesta inmune mediada por células se dirige a, o cerca de, las células que presentan antígeno en su superficie. Además, pueden generarse linfocitos T específicos para permitir la protección futura de un huésped inmunizado.

La capacidad de un antígeno o composición particular para estimular una respuesta inmunológica mediada por células se puede determinar mediante numerosos ensayos tales como los ensayos de linfoproliferación (activación de los linfocitos), ensayos celulares citotóxicos de las CTL, o ensayando los linfocitos-T específicos para el antígeno en un sujeto sensibilizado. Dichos ensayos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Erickson y col., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe y col., Eur. J. Immunol. (1994) 24:2369-2376; y los ejemplos a continuación.

De esta manera, una respuesta inmunológica, tal como se usa en el presente documento, puede ser tal que estimule la producción de CTL y/o la producción o activación de las células-T ayudantes. El antígeno de interés puede despertar también una respuesta inmune mediada por anticuerpos. Por lo tanto una respuesta inmunológica puede incluir uno o más de los siguientes efectos: la producción de anticuerpos por células-B; y/o la activación de células-T supresoras y/o células-T \gamma\delta específicamente dirigidas a un antígeno o antígenos presentes en la composición o vacuna de interés. Estas respuestas pueden servir para neutralizar la infectividad, y/o mediar el complemento del anticuerpo, o anticuerpo dependiente de la citotoxicidad celular (ADCC) para proporcionar protección a un huésped inmunizado Dichas respuestas se pueden determinar usando inmunoensayos normalizados y ensayos de neutralización, bien conocidos en la técnica.

Una composición para vacuna que contiene un antígeno seleccionado en combinación con un polímero de ácido hialurónico como se describe en el presente documento, presenta una "inmunogenicidad mejorada" cuando posee una mayor capacidad para obtener una respuesta inmune que la respuesta inmune que se obtiene con una cantidad equivalente del antígeno sin el polímero de ácido hialurónico. De esta, una composición para vacuna puede ejercer una "inmunogenicidad mejorada" debido a que el sujeto vertebrado absorbe más fácilmente el antígeno, o debido a que el antígeno es más fuertemente inmunogénico, o debido a que es necesaria una dosis menor de antigeno para alcanzar una respuesta inmune en el sujeto al que se ha administrado. Se puede determinar tal inmunogenicidad mejorada administrando la composición polímero/antígeno, y controles de antígeno en animales y comparando los títulos de anticuerpo usando los dos ensayos normalizados como el radioinmunoensayo y ELISA, bien conocidos en la técnica.

Los términos "cantidad efectiva" o "cantidad farmacéuticamente efectiva" de un agente, tal como se proporcionan en el presente documento, se refieren a una cantidad suficiente pero no tóxica del agente para proporcionar la respuesta inmunológica deseada y el efecto terapéutico correspondiente. Como se indicará a continuación, la cantidad exacta variará entre sujeto y sujeto, dependiendo de las especies, edad y estado general del sujeto, la severidad de la dolencia que está siendo tratada, y el antígeno particular de interés, forma de administración, y similar. En cualquier caso individual se puede determinar una cantidad "efectiva" apropiada por cualquier persona experta en la técnica usando la experimentación de rutina.

Tal como se usa en el presente documento "tratamiento" se refiere a cualquiera de (i) la prevención de la infección o reinfección, como en una vacuna tradicional, (ii) la reducción o eliminación de los síntomas, y (iii) la eliminación sustancial o completa del patógeno en cuestión. El tratamiento se puede efectuar profilácticamente (antes de la infección) o terapéuticamente (después de la infección).

Por "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se entiende un material que no es indeseable biológicamente o de otra manera, es decir, el material se puede administrar a un individuo junto con las formulaciones de micropartículas sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los componentes de la composición en que se contiene.

Por "sujeto vertebrado" se entiende cualquier miembro del subfilum cordata, incluyendo, sin limitación, seres humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otros simios y especies de monos; animales de granja tales como ganado ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores, tales como ratones, ratas y cobayas; pájaros, incluyendo los domésticos, pájaros silvestres y de caza autorizada tales como gallinas, pavos, y otras aves gallináceas, patos, gansos, y similares. El término no representa una edad particular. De esta manera, se pretende que estén cubiertos los adultos y recién nacidos. El sistema descrito anteriormente se pretende para uso con cualquier especie anterior de vertebrado, ya que los sistemas inmunes de todos estos vertebrados funcionan de manera similar.

II. Formas de llevar a cabo la invención

Antes de describir la presente invención en detalle, deberá entenderse que esta invención no se limita a las formulaciones particulares o parámetros de procedimiento que como tales pueden, por supuesto, variar. Debe entenderse también que la terminología usada en el presente documento es únicamente con el objetivo de describir formas de realización particulares de la invención, y no se pretende que la limiten.

Aunque en el presente documento se describen numerosos procedimientos y materiales similares a aquellos que se pueden usar en la práctica de la presente invención, en el presente documento se describen los materiales y procedimientos preferidos.

La presente invención utiliza las técnicas de liberación mediadas por ácido hialurónico para obtener una respuesta inmune frente a los patógenos transmitidos a través de la mucosa. El sistema proporciona una respuesta inmune vigorosa, incluso cuando el antígeno es por si mismo débilmente inmunogénico. Aunque eran conocidos los componentes individuales de las composiciones y procedimientos para vacuna descritos en el presente documento, fue inesperado y sorprendente que dichas combinaciones pudieran mejorar la eficiencia de los antígenos más allá de los niveles alcanzados cuando los componentes se usaban por separado.

Aunque la invención es aplicable de manera amplia para proporcionar una respuesta inmune frente a cualquiera de los patógenos anteriormente mencionados, la invención se ejemplifica en el presente documento con referencia al virus de la gripe.

El procedimiento de la invención proporciona inmunidad mediada por células, y/o respuestas anticuerpo humorales. De acuerdo con esto, los procedimientos de la presente invención encontrarán uso para cualquier antígeno para el que se deseen respuestas celulares y/o inmuno humorales, incluyendo antígenos derivados de patógenos virales, bacterianos, fúngicos y parásitos que puedan inducir anticuerpos, epítopos de células-T ayudantes y células-T citotóxicas. Dichos antígenos incluyen, pero no se limitan a, aquellos codificados por virus humanos y animales, y pueden corresponder tanto a proteínas estructurales como no estructurales.

Por ejemplo, la presente invención encontrará uso para estimular una respuesta inmune frente a una amplia variedad de proteínas de la familia de los virus herpes, incluyendo proteínas derivadas del virus simple del herpes (HSV) tipos 1 y 2, tales como las glicoproteínas gB, gD y gH de los HSV-1 y HSV-2; los antígenos derivados del virus zoster de la varicela (VZV), virus de Epstein-Barr (EBV) y citomegalovirus (CMV) incluyendo gB y gH del CMV; y los antígenos de otros virus del herpes humano tales como HHV6 y HHV7. (Véase, por ejemplo, Chee y col., Cytomegaloviruses (J. K. McDougall, ed., Springer-Verlag 1990) pp 125-169, para una revisión del contenido codificante de la proteína de citomegalovirus; McGeoch y col., J. Gen. Virol. (1988) 69: 1531-1574, para una descripción de las diversas proteínas codificadas de HSV-1; la Patente de Estados Unidos Nº 5.171.568 para una descripción de las proteínas gB y gD de los HSV-1 y HSV-2 y por tanto de los genes que las codifican; Baer y col., Nature (1984) 310:207-211, para la identificación de las secuencias codificadas de la proteína en un genoma de EBV, y Davison y Scott, J. Gen. Virol. (1986) 67:1759-1816, para una revisión de VZV.).

Se pueden usar también de manera conveniente en las técnicas descritas en el presente documento los antígenos de la familia de virus de la hepatitis, incluyendo el virus de la hepatitis A (HAV), virus de la hepatitis B (HBV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la hepatitis delta (HDV), virus de la hepatitis E ((HEV) y virus de la hepatitis G (HGV). Se conoce mediante ejemplos la secuencia genómica viral del HCV, ya que son los procedimientos para obtener la secuencia. Véase, por ejemplo, International Publication N^{os} WO 89/04669; WO 90/11089; y WO 90/14436. El genoma del HCV codifica diversas proteínas virales, incluyendo E1 (conocida también como E) y E2 (conocida también como E2/NSI) y una proteína N-terminal de la nucleocápsida (denominada "núcleo") (véase, Houghton y col., Hepatology (1991) 14:381-388, para una descripción de las proteínas de HCV, incluyendo E1 y E2). Cada una de estas proteínas, así como los fragmentos antigénicos de las anteriores, encontrará uso en los procedimientos presentes. De manera similar, se conoce la secuencia del antígeno-\delta del HDV (véase, por ejemplo la Patente de Estados Unidos Nº 5.378.814) y este antígeno se puede usar también de manera conveniente en los procedimientos presentes. De manera adicional, encontrarán uso en el presente documento los antígenos derivados de HVB, tales como el antígeno del núcleo, el antígeno de la superficie, sAg, así como las secuencias presuperficiales, pre-S1 y pre-S2 (denominadas formalmente pre-S), así como las combinaciones de las anteriores, tales como sAg/pre-S1, sAg/pre-S2, sAg/pre-S1/pre-S2, y pre-S1/pre-S2. Véase, por ejemplo, "HBV vaccines - from the laboratory to license: a case study" en Mackett, M y Williamson, J. D., Human Vaccines and Vaccination, pp. 159-176, para una descripción de la estructura del HBV, y las Patentes de Estados Unidos N^{os} 4.722.840, 5.098.704, 5.324.513, incorporadas como referencia en su totalidad en el presente documento; Beames y col., J. Virol. (1995) 69: 6833-6838, Birnbaum y col., J. Virol. (1990) 64:3319-3330; y Zhou y col., J. Virol. (1991) 65:5457-5464.

Los antígenos derivados de otros virus encontrarán también uso en los procedimientos reivindicados tales como, sin limitación, proteínas de miembros de las familias Picornaviridae (por ejemplo, polivirus, etc); Caliciviridae; Togaviridae (por ejemplo, virus de la rubéola, virus del dengue, etc); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae; Birnaviridae; Rhabodoviridae (por ejemplo, virus de la rabia, etc); Filoviridae, Paramyxoviridae (por ejemplo virus de la parotiditis, virus del sarampión, virus sincitial respiratorio, etc); Orthomyxoviridae (por ejemplo, tipos A, B y C del virus de la gripe, etc; Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviridae (por ejemplo, HTLV-1; HTLV-II; HIV-1 (también conocidos como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)) que incluyen, pero no se limitan a los antígenos de los HIV_{IIIb}, HIV_{SF2}, HIV_{LAV}, HIV_{LAI}, HIV_{MN} aislados); HIV-1_{CM235}, HIV-1_{US4}; HIV-2; y virus de la inmunodeficiencia en simios (SIV) entre otros. De manera adicional, los antígenos se pueden derivar del virus del papiloma humano (HPV) y de los virus de la encefalitis transmitidos por garrapatas. Véase, por ejemplo, Virology 3ª edición (W. K. Joklik ed 1988); Fundamental Virology, 2ª edición (B. N. Fields y D. M. Knipe, eds 1991), para una descripción de estos y otros virus.

De manera particular, se conoce y está informado que la proteína de envuelta gp120 de cualquiera de los HIV aislados anteriores, incluyendo miembros de los diferentes subtipos genéticos de HIV (véase, por ejemplo, Myers y col., Los Alamos Database, Los Alamos National laboratory, Los Alamos, New Mexico (1992); Myers y col., Human Retroviruses and Aids, 1990, Los Alamos, New México: Los Alamos National Laboratory; y Modrow y col., J. Virol (1987) 61.570-578, para una comparación de las secuencias de envoltura para una variedad de HIV aislados) y antígenos derivados de cualquiera de estos aislados encontrarán uso en los procedimientos presentes. Además, la invención es igualmente aplicable a otras proteínas inmunogénicas derivadas de cualquiera de los diversos HIV aislados, que incluye cualquiera de las diversas proteínas de la envoltura tales como la gp160 y gp41, antígenos gag tales como p24gag y p55gag, así como proteínas derivadas de la región pol. Como se ha explicado anteriormente, el virus de la gripe es otro ejemplo de virus para el que la presente invención será particularmente útil. De manera específica, son de particular interés las glicoproteínas de la envoltura HA y NA de la gripe A para generar una respuesta inmune. Se han identificado numerosos subtipos HA de gripe A (Kawaoka y col., Virology (1990) 179:759-767; Webster y col., "Antigenic variation among type A influenza viruses", p. 127-168. En: P. Pales y D. W. Kingsbury (ed.), Genetics of influenza viruses. Springer-Verlag, Nueva York). De esta manera, se pueden usar también las proteínas derivadas de cualquiera de estos aislados en las técnicas de inmunización descritas en el presente documento.

Los procedimientos descritos en el presente documento encontrarán uso con numerosos antígenos bacterianos, tales como los que se derivan de los organismos que causan la difteria, el cólera, la tuberculosis, el tétanos, la tos ferina, la meningitis, y otros estados patogénicos, que incluyen, sin limitaciones, Meningococcus A, B y C,
Hemophilus influenzae tipo B (HIB), y Helicobacter pylori. Los ejemplos de antígenos parasíticos incluyen los derivados de organismos que causan la malaria y la enfermedad de Lyme.

Además, los procedimientos descritos en el presente documento proporcionan un medio para el tratamiento de una variedad de cánceres malignos. Por ejemplo, el sistema de la presente invención se puede usar para aumentar las respuestas tanto humoral como mediada por células a proteínas específicas particulares del cáncer en cuestión, tales como un oncogén activado, un antígeno fetal, o marcador de activación. Tales antígenos tumorales incluyen cualquiera de los diversos MAGE (melanoma asociado al antígeno E), que incluyen MAGE 1, 2, 3, 4, etc (Boon, T. Scientific American (Marzo de 1993): 82-89), cualquiera de las diversas tirosinasas; MART 1 (antígeno del melanoma reconocido por las células T), ras mutante, p53 mutante, antígeno del melanoma p97; CEA (antígeno carcinoembrionario), entre
otros.

Es fácilmente aparente que el sujeto de la invención se puede usar para prevenir o tratar una amplia variedad de enfermedades.

El antígeno seleccionado se combina con el polímero de ácido hialurónico para la subsiguiente liberación en la mucosa. Los polímeros de ácido hialurónico para uso en las composiciones sujetas están disponibles de, por ejemplo, Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abano Terme, Italia). Por ejemplo, los polímeros útiles en los procedimientos descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, derivados autoentrecruzados y esterificados de ácido hialurónico. Estos polímeros están disponibles en una variedad de pesos moleculares, y el peso molecular apropiado para uso con un antígeno dado se determina fácilmente por una persona experta en la técnica. De esta manera, por ejemplo, para derivados esterificados, un peso molecular adecuado estará en el orden de aproximadamente 2000 a 300.000, de manera más preferible aproximadamente 50.000 a aproximadamente 250.000, incluso de manera más preferible aproximadamente 75.000 a aproximadamente 200.000, y de manera más preferible aproximadamente 100.000 a aproximadamente 150.000.

Las formas esterificadas particularmente útiles de ácido hialurónico son aquellas en las que aproximadamente un 75-100% de grupos carboxilo están esterificados con un grupo alquilo tal como un etilo, propilo, pentilo, bencilo, dodecilo, y similares, formados por la reacción de grupos carboxilo libres con el correspondiente alcohol. Tales derivados son particularmente preferidos debido a su biocompatibilidad y su capacidad de biodegradarse por hidrólisis de los enlaces éster. Los residuos que no están esterificados con un grupo alquilo como los anteriores, pueden hacerse reaccionar con una cadena lípida/residuos de alquilo de un alcohol alifático C_{10-20} para producir ésteres "mezclados". En esta forma de realización, preferiblemente un 75% de los grupos carboxilo se esterifican con, por ejemplo, grupos bencilo y al menos aproximadamente un 5% de los grupos que restan se esterifican con el alcohol alifático. Véase, por ejemplo, International Publication Nº WO 97/07833.

Se muestra a continuación una estructura representativa de un ácido hialurónico esterificado como estructura 2, en la que R representa un grupo alquilo como se ha descrito anteriormente.

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Tales derivados se describen en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N^{os} 4.651.521 y 4.965.353, y la Publicación de Patente Europea Nº 517.565 y están disponibles de por ejemplo, Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abano Terme, Italia). Las formulaciones representativas incluyen aquellas conocidas como: HYAFF7 (etil éster), HYAFF9 (propil éster), HYAFF11 (bencil éster), HYAFF21 (pentil éster), HYAFF73 (dodecil éster), y similares que estén esterificados aproximadamente un 100%; y HYAFF11p50 (bencil éster), HYAFF7p75 (etil éster), y HYAFF11p75 (bencil éster), etc. Que están esterificados aproximadamente un 50 a 75%.

Estos derivados se producen fácilmente por reacción de los grupos carboxilos libres presentes en el ácido hialurónico con un alcohol, en presencia de sustancias catalizadoras, tales como ácidos inorgánicos fuertes o intercambiadores iónicos de tipo ácido, o con un agente eterificante capaz de introducir el residuo alcohólico deseado en presencia de bases inorgánicas u orgánicas. Por ejemplo, se puede tratar una sal de amonio cuaternario del ácido hialurónico con un agente eterificante, tal como un solvente orgánico aprótico, como se describe en la Publicación Europea Nº 216.453. Véanse también la Publicación Europea Nº 433.133 y las Patentes de Estados Unidos N^{os} 4.851.521 y 4.965.353, incorporadas en el presente documento como referencia en su totalidad.

El grado y tipo de esterificación pueden variar, y son amplia materia de elección, dependiendo en parte del antígeno coadministrado, el grado de bioadhesión deseada, así como de la velocidad de liberación deseada, como se describe con más detalle a continuación. Un porcentaje y tipo de esterificación adecuada se determinan fácilmente por una persona experta en la técnica, basándose en la naturaleza del antígeno y en el transtorno en cuestión.

Como se ha explicado anteriormente, el derivado del ácido hialurónico conocido como ACP encontrará también uso en el presente documento para liberar antígenos de vacuna. De manera general, los ACP para uso en la presente invención serán aquellos en los que aproximadamente de un 0,5 a aproximadamente un 20%, de manera preferible de un 3% a aproximadamente un 10%, y de manera más preferible de aproximadamente un 4% a aproximadamente un 5% de los grupos carboxilo del polímero de ácido hialurónico están entrecruzados con grupos hidroxilo de las mismas o diferentes moléculas de ácido hialurónico. El resto de la molécula se puede salificar. Una forma de un ACP para uso en el presente documento es una composición viscosa parecida a un gel. Véase, por ejemplo, Publicación Internacional Nº WO 97/07883.

Los derivados de ACP se fabrican activando en primer lugar un ácido hialurónico que tenga bien grupos carboxilo libres o grupos carboxilo salificados, con un agente que active la función carboxilo. Los agentes típicos incluyen carbodiimidas, diciclohexilcarbodiimida, bencilisopropilcarbodiimida, benciletil carbodiimida, etoxiacetileno, derivados halogenados de hidrocarburos alifáticos, cicloalifáticos o aromáticos, y similares. Pueden estar presentes agentes auxiliares con formación favorecida de derivados intermedios activados y/o bases terciarias orgánicas o inorgánicas, tales como trietilamina.

La activación se lleva a cabo en un solvente aprótico orgánico, como en DMSO, y la mezcla se expone al calor o a la irradiación (particularmente luz UV). De esta manera, se forman intermedios inestables que se separan espontáneamente, bien después de la adición del catalizador y/o después de un aumento en la temperatura, formando por tanto enlaces éster internos con hidroxilos de las mismas u otras moléculas de ácido hialurónico. Véase, por ejemplo, la Publicación Europea Nº 341.745 y la Publicación Internacional Nº WO 97/07883, para los procedimientos de producción de estos derivados.

Los derivados de ácido hialurónico descritos anteriormente se pueden proporcionar como microesferas, bien con un antígeno adsorbido o incorporado físicamente (enlazado), usando cualquiera de las técnicas diversas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, las microesferas se pueden fabricar usando técnicas de evaporación y extracción con solvente. De manera general, estos procedimientos suponen la preparación de una emulsión de dos líquidos inmiscibles, denominados fases continua y discontinua. La fase discontinua incluye microgotitas de solución de polímero/solvente que contienen el antígeno (si este va a enlazarse). La fase discontinua se mezcla a continuación con una fase acuosa continua que contiene un estabilizador de partícula/tensioactivo. Después de que se estabiliza la emulsión; se elimina la fase discontinua por evaporación o extracción. Véase, por ejemplo, Benedetti y col., J. Controlled Rel. (1990) 13: 33-41; Ghezzo y col., Int. J. Pharm. (1992) 87: 21-29; Illum y col., J. Controlled Rel. (1994) 29: 133-141; Publicación Europea Nº 517.565.

De manera más particular, se disuelve un derivado apropiado de ácido hialurónico en un solvente, el solvente se selecciona de tal manera que no reaccione químicamente con el polímero o el antígeno y sea inmiscible en la fase continua. Se puede usar cualquier tipo de solventes, tales como, por ejemplo, un solvente aprótico que incluye, pero no se limita a, dimetilsulfóxidoo (DMSO), 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) y similares. El polímero se añade a una concentración de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 10% p/v, de manera preferible aproximadamente 1% a aproximadamente 8% p/v, y de manera más preferible aproximadamente 6% a aproximadamente 8% p/v. Dependiendo del antígeno usado y de la carga deseada, se añade una cantidad de antígeno que dará como resultado una microesfera con aproximadamente 1% a aproximadamente 40% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico, de manera más preferible aproximadamente 1% a aproximadamente 25% (p/p) de antígeno, e incluso de manera más preferible aproximadamente 2% a aproximadamente 20% (p/p) de antígeno. Esta mezcla forma la fase discontinua.

Se prepara una mezcla en fase continua que incluye un segundo solvente, generalmente un aceite de viscosidad alta, tal como un aceite mineral pesado o aceite de parafina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Está presente un estabilizador de la emulsión, tal como un agente tensioactivo no iónico, que incluye por ejemplo, monooleato de manitol (Arlacel A®), dextran 70.000, éteres de polietileno (Triton®), éteres de poliglicol (Tergitol®), y similares, todos comercialmente disponibles de manera sencilla, por ejemplo de Sigma Chemical Co., St Louis, MO. El agente tensioactivo estará presente en una concentración de aproximadamente un 0,3% a aproximadamente un 10%, de manera preferible aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 8%, y de manera más preferible aproximadamente un 1% a aproximadamente un 5%.

Para producir las microesferas, se añade a continuación la fase discontinua a la fase continua en una relación de aproximadamente 1:16, y se forma una emulsión, por ejemplo por agitación mecánica a aproximadamente 700 a 1000 rpm. A continuación, se evaporan o extraen los solventes orgánicos. Si se evaporan, la temperatura de la emulsión se mantiene por debajo del punto de ebullición del solvente y se aumenta gradualmente (sigue manteniéndose por debajo del punto de ebullición del solvente) hasta que el solvente se evapora. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 3.891.570 y Benedetti y col., J. Controlled Rel. (1990) 13: 33-41.

Si se extrae, se añade a la emulsión un solvente de extracción apropiado, es decir, un solvente para el solvente de la fase discontinua pero no del derivado de ácido hialurónico, en una relación de aproximadamente 2:1 v/v, y la solución se agita a continuación hasta que se forman las microesferas. Por ejemplo, si se usa DMSO, este se puede extraer usando acetato de etilo o acetil acetato. Se pueden determinar fácilmente otros solventes de extracción apropiados por una persona experta en la técnica. Para una descripción adicional de la técnica de extracción con solvente, véase, por ejemplo, Illum y col., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141; y Ghezzo y col., Int. J. Pharm. (1992) 87:21-29; y la publicación Europea Nº 517.565.

Una vez se elimina el solvente de la fase dispersa, las microesferas suspendidas se separan de la fase oleosa por centrifugación. Las microesferas se pueden resuspender en una solución apropiada, tal como hexano, para eliminar el exceso de aceite mineral y tensioactivo, y a continuación, la solución se filtra. Este procedimiento se puede repetir varias veces para asegurar la eliminación del solvente. Las microesferas se secan a continuación en corriente de aire o se secan bajo vacío.

De manera alternativa, las microesferas se pueden formar también usando secado por atomizado, como se describe en, por ejemplo, Kyronen y col., Int. J. Pharm. (1992) 80:161-169; Ghezzo y col., Int. J. Pharm. (1992) 87:1-29; y Masters, K. (1976) Spray Drying 2ª Ed. Wiley, Nueva York. Las microesferas especialmente pequeñas, denominadas "nanoesferas", se pueden producir usando antisolventes supercríticos (SAS) como se describe en la publicación internacional Nº WO 96/29998.

Se puede modificar la velocidad de liberación del antígeno de las composiciones de ácido hialurónico dependiendo del procedimiento usado para asociar el antígeno con las microesferas. Por ejemplo, si el antígeno se dispersa físicamente en la matriz del polímero, la liberación se controla mucho mediante la velocidad de difusión del antígeno a través de la red de polímero. Además, si los solventes se extraen en lugar de evaporarse, las microesferas incluyen superficies más porosas que dan como resultado una liberación más rápida del antígeno enlazado.

Además, la esterificación de los grupos carboxilo reduce la bioadhesividad del ácido hialurónico debido a la menor tendencia de los ésteres a formar enlaces de hidrógeno con el sustrato biológico. De manera adicional, la hidrofobia de las microesferas, debida a los distintos ésteres y a los grados de entrecruzamiento, afectará a la cantidad de bioadhesión debido a que el tejido de la mucosa parece presentar una hidrofobia apreciable que puede tener implicaciones importantes para la bioadhesión. De esta manera, por ejemplo, un grado mayor de esterificación generalmente da lugar a una liberación más lenta y reducida de la proteína atrapada, pero produce una microesfera con propiedades bioadhesivas mejoradas.

De manera adicional, factores biológicos tales como la frecuencia del ritmo ciliar, así como factores físicos tales como el tamaño de partícula, densidad y grado de aglutinación, y la solubilidad en agua del antígeno, influenciarán el grado de bioadhesión y bioerosión. Véase, por ejemplo, Pritchard y col., Int. J. Pharm. (1996) 129: 137-145.

Por otra parte, las mezclas de microesferas con ésteres variables, las cantidades variables de esterificación, así como los grados variables de entrecruzamiento encontrarán uso en las formulaciones con el fin de conseguir la bioadhesión deseada y la cinética de liberación para un antígeno dado y proporcionar para ambos una respuesta inmune primaria y secundaria.

Una vez formado, la adherencia de una combinación particular de ácido hialurónico/antígeno se puede determinar usando cualquier tipo de procedimiento, bien conocidos en la técnica, con el fin de evaluar si una formulación particular tiene propiedades adhesivas apropiadas. Por ejemplo, se pueden realizar estudios in vitro de separación con pesas basándose en medidas de tensión superficial. Véase, por ejemplo, Smart y col., J. Pharm. Pharmacol. (1984) 36:295-299. De manera breve, las microesferas de ensayo se aplican a un sustrato biológico, tal como un tejido epitelial y se llevan a cabo estudios de separación con pesas usando un aparato que determina el peso requerido para separar dos secciones de tejido del bioadhesivo de ensayo que se empareda entre ellos. Véase, por ejemplo, Pritchard y col., Int. J. Pharm. (1996) 129:137-145. De manera alternativa, se puede usar la velocidad de transporte mucociliar como un determinante de la adherencia debido a que cuanto mayor sea la adherencia de la sustancia ensayo, la velocidad de transporte será más lenta. Dichos estudios se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante monitorización del movimiento de los bioadhesivos a lo largo de parte de un corte de paladar superior de la rana (Rana pipiens), tal como se describe en Pritchard y col., supra.

De manera similar, la velocidad de bioerosión de las microesferas se puede determinar usando técnicas normalizadas, bien conocidas en la técnica, tales como por perfiles de liberación in vitro, para determinar si la formulación de ácido hialurónico/antígeno en cuestión proporciona una cantidad adecuada de antígeno al sistema inmune para la enfermedad dada. Por ejemplo, se pueden llevar a cabo ensayos de disolución, por ejemplo, dispersando microesferas en un tampón apropiado tal como tampón fosfato o BSA, con agitación continua. Se toman muestras de la solución a intervalos fijos de tiempo y se ensayan para el antígeno de interés usando, por ejemplo, un ensayo ELISA o cualquier otro ensayo apropiado. Véase, Ghezzo y col., Int J. Pharm. (1992) 87:21-29.

El tamaño de partícula se puede determinar mediante, por ejemplo, dispersión de luz láser, usando por ejemplo, un espectrómetro que incorpora un láser de helio-neón. Generalmente, el tamaño de partícula se determina a temperatura ambiente, e implica múltiples análisis de la muestra en cuestión (por ejemplo, 5-10 veces) para dar como resultado un valor promedio para el diámetro de partícula. El tamaño de partícula se determina también fácilmente usando microscopía de barrido electrónico (SEM). Para hacer esto, las microesferas secas se recubren por pulverización iónica con una mezcla de oro/paladio hasta un espesor de aproximadamente 100 Angstroms, a continuación se examinan usando un microscopio de barrido electrónico.

Si el antígeno se proporciona en una microesfera, el contenido de antígeno se determina generalmente de forma que se pueda librar una cantidad apropiada de microesferas en un sujeto con el fin de presentar una respuesta inmune adecuada. El contenido en antígeno se puede determinar de acuerdo con los procedimientos conocidos en la técnica, tales como rotura de las microesferas y extracción del antígeno atrapado. Por ejemplo, las microesferas se pueden disolver en un solvente tal como DMSO o dispersar en, por ejemplo, NaOH 0,1 M conteniendo un 5% (p/v) de SDS. La muestra se agita, se centrífuga de manera opcional, y el sobrenadante se ensaya para el antígeno de interés usando un ensayo apropiado. Véase, por ejemplo, Benedetti y col., J. Controlled Rel. (1990) 13:33-41; y O'Hagan y col., Int. J. Pharm. (1994) 103:37-45.

De manera alternativa los derivados de ácido hialurónico, bien en forma de microesferas o no, se pueden combinar directamente con el antígeno, en lugar de atrapar el antígeno en su interior, usando cualquiera de los diversos procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el antígeno se puede absorber en lugar de atrapar en microesferas mezclando el antígeno con el polímero de ácido hialurónico en un tampón apropiado, incubando durante períodos variables de tiempo, dependiendo del polímero de ácido hialurónico usado, y si se desea, liofilizando la formulación para uso futuro. De esta manera, por ejemplo, si se usa HYAFF o derivados de éster mezclados, el antígeno se incuba generalmente con el polímero de ácido hialurónico en una cantidad que representa aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 40% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico, de manera más preferible aproximadamente un 1% a aproximadamente un 25% (p/p) de antígeno, e incluso de manera más preferible aproximadamente un 2% a aproximadamente un 20% (p/p) de antígeno. El porcentaje de antígeno dependerá de la dosis deseada y de la dolencia que está siendo tratada, como se describe con más detalle a continuación. La incubación del antígeno con el polímero se llevará a cabo durante aproximadamente 0 horas a 48 horas o más, de manera preferible aproximadamente 0 horas a aproximadamente 24 horas, de manera más preferible aproximadamente 1 hora a aproximadamente 10 horas, y de manera más preferible aproximadamente 2 horas a aproximadamente 4 horas. Después de la incubación, la suspensión se puede liofilizar y la composición seca se suspende en un vehículo apropiado antes de la inmuni-
zación.

Si se usa ACP, el ACP se puede proporcionar como un gel, véase, Publicación Internacional Nº WO 97/07833 (disponible de Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abano Terme, Italia )). El gel de ACP se diluye 1:30 con suero salino y se mezcla con el antígeno, y de manera opcional un coadyuvante (véase adicionalmente a continuación). La solución se puede administrar a continuación directamente al sujeto, por ejemplo, intranasalmente, como se describe con más detalle a continuación.

Una vez están fabricados el antígeno y los derivados del ácido hialurónico, como anteriormente, las composiciones se formulan para la libración subsiguiente en la mucosa. Las composiciones incluirán generalmente uno o más "excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables" apropiados para la liberación en la mucosa, tales como agua, suero salino, glicerol, polietilén glicol, ácido hialurónico, etanol, etc. De manera adicional, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, sustancias tamponantes del pH y similares.

Por ejemplo, las formulaciones intranasal y pulmonar incluirán de forma usual vehículos que no causen irritación en la mucosa nasal ni perturben significativamente la función ciliar. Se pueden emplear con el sujeto de la invención diluyentes tales como agua, suero salino acuoso u otras sustancias conocidas. Las formulaciones nasales pueden contener también conservantes tales como, pero no limitándose a, clorobutanol y cloruro de benzalconio. Puede estar presente un tensioactivo para mejorar la absorción de las proteínas sujeto por la mucosa nasal.

Para supositorios rectales y uretrales, la composición del vehículo incluirá ligantes y vehículos tradicionales, tales como, mantequilla de coco (aceite de teobroma) u otros triglicéridos, aceites vegetales modificados por esterificación, hidrogenación y/o fraccionación, gelatina glicerada, glicoles polialcalinos, mezcla de polietilén glicoles de diversos pesos moleculares y ésteres de ácido graso de polietilén glicol.

Para liberación vaginal, las formulaciones hialurónicas de la presente invención se pueden incorporar en pesarios bases, tales como aquellos que incluyen mezclas de polietilén triglicéridos, o suspenderse en aceite tal como aceite de maíz o aceite de sésamo, conteniendo de manera opcional sílice coloidal. Véase, por ejemplo, Richardson y col, Int. J. Pharm. (1995) 115:9-15.

Para una descripción adicional de los vehículos apropiados de uso para los modos particulares de liberación, véase, por ejemplo Remington: The science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19ª edición, 1995. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente el vehículo apropiado de uso para el antígeno particular y el emplazamiento de liberación.

Se pueden usar coadyuvantes para mejorar la efectividad de las composiciones farmacéuticas. Los coadyuvantes se pueden administrar de forma concurrente con las formulaciones de ácido hialurónico de la presente invención, por ejemplo, en la misma composición o en composiciones separadas. De manera alternativa, se puede administrar un coadyuvante de forma anterior o posterior a las composiciones de ácido hialurónico de la presente invención. Dichos coadyuvantes incluyen, pero no se limitan a: (1) sales de aluminio, tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, etc.; (2) formulaciones de emulsión de aceite en agua (con o sin otros agentes inmunoestimulantes específicos tales como péptidos de muramilo (véase a continuación) o componentes de la pared celular bacteriana), tales como por ejemplo (a) MF59 (Publicación Internacional Nº WO 90/14837), conteniendo escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5%, y Span 85 al 0,5% (conteniendo de manera opcional diversas cantidades de MTP-PE (véase a continuación), aunque no se requiera) formulado en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA), (b) SAF, conteniendo escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero en bloque de plurónico L121al 5% y thr-MDP (véase a continuación), bien microfluidizado en una emulsión submicrométrica o vortizado para generar una emulsión con mayor tamaño de partícula, y (c) sistema con coadyuvante Ribi^{TM} (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) conteniendo escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2%, y uno o más componentes de pared celular bacteriana entre el grupo constituido por monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), y pared esquelética celular (CWS), de manera preferible MPL + CWS (Detox^{TM}); (3) se pueden usar coadyuvantes de saponina, tales como Stimulon^{TM} (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o partículas generadas a partir del anterior tales como ISCOM (complejos inmunoestimulantes); (4) Coadyuvante Completo de Freunds (CFA) y Coadyuvante Incompleto de Freunds (IFA); (5) citoquinas, tales como interleucinas (IL-1, IL-2, etc), factor estimulante de las colonias de macrófagos (M-CSF), factor de necrosis del tumor (TNF), etc.; (6) mutantes detoxificados de una toxina ADP-ribosilante bacteriana tal como la toxina del cólera (CT), una toxina de la tos ferina (PT), o una toxina de E. coli lábil al calor (LT) particularmente LT-K63 (donde se sustituye la lisina por el aminoácido de tipo normal en la posición 63), LT-R72 (donde se sustituye la arginina por el aminoácido tipo normal en la posición 72), CT-S109 (donde se sustituye la serina por el aminoácido de tipo normal en la posición 109), y PT-K9/G129 (donde se sustituye la lisina por el aminoácido de tipo normal en la posición 9 y se sustituye la glicina en la posición 129) (véase, por ejemplo, Publicación Internacional N^{os} WO 93/13202 y WO 92/19265); y (7) otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulaantes para mejorar la efectividad de la composición.

Los péptidos de muramilo incluyen, pero no se limitan a, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normomuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MPT-PE), etc.

Los diversos componentes de la composición pueden estar presentes en un amplio intervalo de relaciones. Por ejemplo, los componentes del ácido hialurónico-antígeno y el coadyuvante se usan típicamente en una relación volumétrica de 1:50 a 50:1, de manera preferible 1:10 a 10:1, de manera más preferible entre aproximadamente 1:3 a 3:1, y de manera más preferible aproximadamente 1:1. Sin embargo, pueden ser más apropiadas para objetivos específicos otras relaciones, como cuando al mismo tiempo es difícil incorporar un antígeno particular en una composición de ácido hialurónico y tiene menor inmunogenicidad, en cuyo caso se requiere una cantidad relativa mayor del componente antígeno.

Las composiciones comprenderán una "cantidad terapéuticamente efectiva" del antígeno de interés. Esto es, se incluirá en las composiciones una cantidad de antígeno que cause en el sujeto la producción de una respuesta inmunológica suficiente con el fin de prevenir, reducir o eliminar los síntomas. La cantidad exacta necesaria variará dependiendo del sujeto que está siendo tratado; la edad y la dolencia general del sujeto a tratar; la capacidad del sistema inmune del sujeto para sintetizar anticuerpos; el grado de protección deseado; la severidad de la dolencia que está siendo tratada; el antígeno particular seleccionado y su forma de administración, entre otros factores. Una persona experta en la técnica puede determinar fácilmente una cantidad efectiva apropiada mediante ensayos de rutina. Por ejemplo, para los objetivos de la presente invención, una dosis efectiva oscilará típicamente entre aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 1 mg, y de manera más preferible aproximadamente 10 \mug a aproximadamente 500 \mug del antígeno liberado por dosis.

Una vez formuladas, las composiciones de la invención se administran por vía mucosa, usando técnicas normalizadas. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 19ª edición, 1995, para técnicas de liberación en la mucosa, que incluyen técnicas intranasales, pulmonares, vaginales y rectales así como en la Publicación Europea Nº 517.565 e Illum y col., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141, para técnicas de administración nasal.

La dosificación de tratamiento puede ser un calendario de monodosis o un calendario de dosis múltiples. Un calendario de dosis múltiples es aquel en el que un primer curso de vacunación puede ser con 1-10 dosis separadas, seguido por otras dosis administradas a intervalos de tiempo posteriores, escogidos para mantener y/o reforzar la respuesta inmune, por ejemplo de 1-4 meses para una segunda dosis, y si se necesita una dosis posterior, después de varios meses. El estímulo puede ser la misma formulación proporcionada para la respuesta inmune primaria, o puede ser con una formulación diferente que contenga el antígeno. Podrá determinarse también el régimen de dosificación, al menos en parte, por la necesidad del sujeto y dependerá del juicio del médico. Además, si se desea la prevención de la enfermedad, las vacunas se administran generalmente antes de la infección primaria con el patógeno de interés. Si se desea el tratamiento, por ejemplo, la reducción de síntomas o recurrencias, las vacunas se administran generalmente con posterioridad a la infección primaria.

Las formulaciones se pueden ensayar in vivo en numerosos modelos animales desarrollados para el estudio de liberación en la mucosa. Por ejemplo, el modelo de oveja consciente es un modelo reconocido en la técnica para ensayar la liberación nasal de sustancias debido a la cavidad nasal grande, accesibilidad de las venas yugulares para la canulación, así como al temperamento suave de la oveja bajo condiciones experimentales. Véase, por ejemplo, Longenecker y col., J. Pharm. Sci. (1987) 76:351-355 e Illum y col., J. Controlled Rel. (1994) 29:133-141 Se puede por tanto administrar a la oveja una sustancia de ensayo sedando brevemente los animales para prevenir el estornudo durante la administración, e insertar un tubo oral/nasal con la vacuna en cuestión en el interior del ollar de la oveja a una profundidad preestablecida. La vacuna, generalmente en forma de polvo liofilizado se sopla a continuación en la cavidad nasal. A continuación, se recogen muestras de sangre de la vena yugular canulada antes y después de la administración. Se pueden ensayar las muestras de sangre para los títulos de anticuerpos usando técnicas normalizadas conocidas en la técnica, como se ha descrito anteriormente.

Como es fácilmente aparente, las composiciones de la presente invención son útiles para el tratamiento y/o prevención de una amplia variedad de enfermedades e infecciones causadas por virus, bacterias, parásitos y hongos, así como para la estimular una respuesta inmune frente a una variedad de antígenos de tumores. No sólo se pueden usar las composiciones terapéutica o profilácticamente, tal como se ha descrito anteriormente; las composiciones se pueden usar también con el fin de preparar anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, para, por ejemplo, objetivos de diagnóstico, así como para inmunopurificación del antígeno de interés. Si se desean anticuerpos policlonales, se inmuniza un mamífero seleccionado (por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, etc) con las composiciones de la presente invención. El animal se estimula 2-6 semanas más tarde con una o más administraciones del antígeno. Se obtiene a continuación un antisuero policlonal del animal inmunizado, y se trata de acuerdo con los procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Jurgens y col. (1985) J. Chrom. 348:363-370.

Los anticuerpos monoclonales se preparan generalmente usando el procedimiento de Kohler y Milstein, Nature (1975) 256:495-96, o una modificación del anterior. Típicamente, se inmuniza un ratón o rata como se ha descrito anteriormente. Sin embargo, antes de sangrar al animal para extraer el suero, se elimina el bazo (y de manera opcional diversos nódulos linfáticos grandes) y se disocian en células individuales. Si se desea, se pueden tamizar las células del bazo (después de la eliminación de las células no específicamente adherentes) aplicando una suspensión celular a una placa o pocillo recubierto con el antígeno de la proteína. Las células B, que expresan inmunoglobulinas ligadas a la membrana específicas para el antígeno, se adherirán a la placa, y no se eliminarán con el lavado junto con el resto de la suspensión. Las células B resultantes, o todas las células disociadas del bazo, a continuación se inducen a fusionarse con las células de mieloma para formar hibridomas, y se cultivan en un medio selectivo (por ejemplo, hipoxantina, aminopterina, medio de timidina, "HAT"). Los hibridomas resultantes se plaquean por dilución limitante y se ensayan para la producción de anticuerpos que se enlazan de manera específica al antígeno inmunizante (y que no se enlazan con antígenos no relacionados. Los hibridomas seleccionados que secretan anticuerpos monoclonales se cultivan a continuación bien in vitro (por ejemplo, en botellas de cultivo de tejido o reactores de fibra hueca) o in vivo (como ascitas en ratones). Véase, por ejemplo, M.. Schreier y col., Hybridoma Techniques 81980); Hammerling y col., Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas 81981), Kennett y col., Monoclonal Antibodies (1980); véase también las patentes de Estados Unidos N^{os} 4.341.761, 4.399.121; 4.427.783; 4.444.887; 4.452.570; 4.466.917; 4.472.500, 4.491.632; y 4.493.890. Se pueden seleccionar para diversas propiedades los paneles de anticuerpos monoclonales producidos frente al polipéptido de interés, es decir, para el isotipo, epítopo, afinidad, etc.

III. Experimental

A continuación hay ejemplos de formas de realización específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen únicamente con objetivos ilustrativos, y no se pretende que limiten el alcance de la presente invención de manera alguna.

Se han realizado esfuerzos para asegurar la previsión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc), pero deberían permitirse, por supuesto, algunos errores y desviaciones experimentales.

Ejemplo 1 Preparación y uso de formulaciones HYAFF que incluye el antígeno de la gripe

Se suministraron de Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abano, Terme, Italia) micropartículas placebo (blanco) de polímero HYAFF11, esterificado aproximadamente en un 100% con alcohol bencílico. El tamaño medio de estas micropartículas fue de aproximadamente 8 micrómetros (con una parte de la distribución de tamaños menor de 1 micrómetro y una porción superior a 10 micrómetros) tal como se determina mediante un Malvern Mastersizer Instrument.

Con el fin de alcanzar una dosis de 10 \mug del antígeno de la gripe H3N2 ("HA") (Chiron Vaccines, Siena, Italia) y 10-25 \mug de LT-K63 (Publicación Internacional Nº WO 93/13202) una carga del 1% p/p de HA/LT-K63 en las micropartículas era el objetivo. Para conseguirlo se incubaron 1 mg de HA y 1 mg de LT-K63 en Na_{2}HPO4 84 mM, KH2PO4 11 mM, NaCl 82 mM, junto con 100 mg de microesferas blanco en PBS a 4ºc durante tres horas. A continuación la suspensión se congeló a -80ºC y se secó congelada durante toda la noche.

La carga real antígeno/coadyuvante se confirmó por hidrólisis de las micropartículas y estimación del contenido total en proteína mediante micro-BCA, tal como se describe en Sharif y O'Hagan, Int J. Pharm. (1995) 115:259-263. La carga real osciló de aproximadamente 0,8% a 1,0% p/p de antígeno/LT-K63 a micropartícula.

Antes de la inmunización, se suspendieron aproximadamente 20 mg de la formulación de micropartículas secas en suero salino normal antes de la liberación intranasal a los animales. Para ratones, la formulación se suspendió en 50 \mul de suero salino; para cobayas la formulación se suspendió en 250 \mul de suero salino; para microcobayas, la formulación se suspendió en 500 \mul.

Los ratones Balb/C se dividieron en 6 grupos, y se administraron las formulaciones indicadas más adelante intranasalmente con una micropipeta. Los animales se estimularon 28 días después.

Grupo 1

Antígeno (HA) sólo en suero salino

Grupo 2

HA coliofilizado con 0,5 mg de micropartículas de placebo HYAFF

Grupo 3

HA con LT-K63 (10 \mug) en suero salino

Grupo 4

HA coliofilizado con 0,5 mg de micropartículas de placebo HYAFF y 10 \mug de LT-K63

Grupo 5

HA con LT-K63 (25 \mug) en suero salino

Grupo 6

HA coliofilizado con 0,5 mg de micropartículas de placebo HYAFF y 25 \mug de LT-K63

Los animales fueron sangrados en el día 42 y se determinaros los títulos anti-HA mediante ELISA estimando los títulos de la IgG anti-HA en la muestra de suero. Como se muestra en la Tabla 1, los animales a los que se administró antígeno en combinación con HYAFF, ambos con y sin coadyuvante, tenían títulos de anticuerpo mayores que aquellos a los que se administró antígeno solo. Aquellos a los que se administró antígeno con HYAFF y coadyuvante tenían los títulos más altos.

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Ejemplo 2 Preparación y uso de formulaciones de ACP incluyendo el antígeno de la gripe

Se obtuvo gel de ácido hialurónico con polisacárido auto-entrecruzado (ACP) de Fidia Advanced Biopolymers Srl (Abano Terme, Italia) y se usó tal como se recibió. Se añadieron al gel 10 \mug de HA y 10-25 \mug de LT-K63,en una solución acuosa para hacer una relación gel-agua de 1:30.

Se administraron intranasalmente 50 \mul de solución viscosa usando una micropipeta a tres grupos de ratones Balb/C, cada uno con cinco animales, como se muestra a continuación en la Tabla 2. Las formulaciones se administraron a los 60 minutos de preparación. Los animales fueron estimulados 28 días más tarde, sangrados en el día 42 y se determinaron los títulos anti-HA mediante ELISA. Se ensayaron también los títulos de IgA a partir de un lavado nasal.

Como se muestra en la Tabla 2, los animales a los que se administró antígeno en combinación con ACP y coadyuvante tenían títulos más altos de anticuerpos que aquellos a los que se administró solo antígeno.

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El estudio anterior se repitió usando tres grupos de cobayas con cinco animales cada uno. El procedimiento usado fue como el que se ha descrito anteriormente, excepto en que se administraron a las cobayas 200 \mul de la formulación indicada en la Tabla 3 y se estimularon dos veces, una vez en el día 28 y una vez en el día 56. Como se muestra en la Tabla 3, los animales a los que se administró antígeno en combinación con ACP y coadyuvante tenían títulos de anticuerpo más altos que aquellos a los que se administró sólo antígeno.

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Ejemplo 3 Comparación de las formulaciones de HYAFF y ACP

Se evaluó la inmunogenicidad del antígeno HA en HYAFF y el gel de ACP en microcobayas (Yucatán). 12 cobayas se dividieron en tres grupos de cuatro cobayas cada uno, como se muestra en la Tabla 4. Con el fin de alcanzar la dosis apropiada, se administraron a las cobayas intranasalmente usando un catéter de teflón calibre 16 500 \mul de la formulación de ACP, o 50 mg de la formulación de HYAFF. Se administraron a las cobayas de control 500 \mul de antígeno solo. Las cobayas se estimularon a los 28 días y el suero recogido se evaluó para los niveles de IgG en el suero anti-HA usando un ELISA.

Como se puede ver en la Tabla 4, los grupos de cobayas a los que se administró antígeno con HYAFF o ACP tenían ambos títulos más altos que las cobayas a las que se administró solo antígeno, mientras que las cobayas a las que se administraron las formulaciones HYAFF alcanzaron los títulos más altos.

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Ejemplo 4 Comparación de las formulaciones liberadas intramuscular e intranasalmente

Se evaluó en microcobayas (Yucatán) la capacidad de las formulaciones especificadas en la Tabla 5, liberadas bien intramuscularmente (i.m) o intranasalmente (i.n) para presentar una respuesta inmune. De manera particular, 12 cobayas se dividieron en tres grupos de cuatro cobayas cada uno, como se muestra en la Tabla 5. Las cobayas se inmunizaron bien con 25 \mug de antígeno HA, i.m. (Grupo 1), 25 \mug de HA con microesferas de HYAFF y 100 \mug de LT-K63, i.n. (Grupo 2), o 25 \mug de HA con microesferas de HYAFF y 100 \mug de LT-K63, i.n. (Grupo 3). Las cobayas se inmunizaron en las semanas 0 y 4. Se recogieron el suero y las secreciones nasales en los días 28, 42 y 56,y se ensayaron para los niveles de IgG del suero anti-HA y los niveles de IgA usando un ELISA.

Como se puede ver en las Figuras 1 y 2, las cobayas a las que se administró la formulación de HYAFF generaron una respuesta significativamente más alta de los grupos i.m. o i.n. desprovistos de HYAFF. La formulación HYAFF también dio una respuesta más alta de IgA nasal HA-específica. Los títulos de inhibición de la hemaglutinización (HI) (véase Tabla 5), fueron también más altos en el grupo de animales inmunizado con HYAFF.

Este ejemplo muestra que la administración intranasal o antígeno con HYAFF alcanza mejores resultados que la administración intramuscular de antígeno solo.

TABLA 5

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De acuerdo con esto, se describe el uso de derivados de ácido hialurónico para liberar antígenos de vacuna. Aunque se han descrito con algún detalle las formas de realización preferidas del sujeto de la invención, debe entenderse que se pueden hacer variaciones obvias sin desviarse del espíritu y alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (16)

1. Una composición que comprende un polímero de éster de ácido hialurónico y un antígeno seleccionado, en la que el mencionado antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 40% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico, y se deriva de un patógeno viral, bacteriano, fúngico o parásito.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el mencionado antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente 2% a aproximadamente un 25% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico.

3. La composición de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el éster de ácido hialurónico se selecciona entre el grupo constituido por un ácido hialurónico en el que entre aproximadamente un 75% a aproximadamente un 100% de grupos carboxilo libres están esterificados con uno o más grupos alquilo, y un derivado entrecruzado de ácido hialurónico en el que aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 20% de los grupos carboxilo del polímero de ácido hialurónico se entrecruzan con grupos hidroxilo de la misma o diferente molécula de ácido hialurónico.

4. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende de manera adicional un coadyuvante inmunológico.

5. La composición de la reivindicación 4, en la que el coadyuvante es un mutante detoxificado de una toxina ADP-ribosilante bacteriana seleccionada entre el grupo constituido por LT-K63 y LT-R72.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el antígeno seleccionado es un antígeno viral.

7. La composición de la reivindicación 6, en la que el antígeno seleccionado es un antígeno de la gripe.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el éster de ácido hialurónico se proporciona en forma de una microesfera.

9. Una composición que comprende (a) una microesfera constituida por un polímero de éster de ácido hialurónico seleccionado entre el grupo constituido por un ácido hialurónico donde entre aproximadamente un 75% a aproximadamente un 100% de grupos carboxilo libres están esterificados con uno o más grupos alquilo, y un derivado entrecruzado de ácido hialurónico en el que aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 20% de grupos carboxilo del polímero de ácido hialurónico se entrecruzan con grupos hidroxilo de la misma o diferente molécula de ácido hialurónico; (b) un antígeno atrapado seleccionado en, o adsorbido en, la microesfera, en la que el mencionado antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 25% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico, y (c) un coadyuvante inmunológico.

10. La composición de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la que el antígeno seleccionado se atrapa en la microesfera.

11. La composición de la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en la que el antígeno seleccionado se adsorbe en la microesfera.

12. Un procedimiento de fabricación de una composición farmacéutica, que comprende combinar la composición de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores con un excipiente para mucosas farmacéuticamente aceptable.

13. El uso de un polímero de éster de ácido hialurónico y un antígeno en la fabricación de un medicamento para administración en la mucosa, comprendiendo el mencionado medicamento el mencionado polímero y el mencionado antígeno, en el que el mencionado antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente un 0,1% a aproximadamente un 40% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico y se deriva a partir de un patógeno viral, bacteriano, fúngico o parásito.

14. El uso de la reivindicación 13, en el que el medicamento tiene las características adicionales de una cualquiera de las composiciones de las reivindicaciones 2 a 8.

15. El uso de una microesfera, un antígeno y un coadyuvante inmunológico en la fabricación de un medicamento para inmunización de la mucosa, en el que (a) la microesfera comprende un polímero de éster de ácido hialurónico seleccionado entre el grupo constituido por un ácido hialurónico en el que entre aproximadamente un 75% y aproximadamente un 100% de grupos carboxilo libres están esterificados con uno o más grupos alquilo, y un derivado entrecruzado de ácido hialurónico en el que aproximadamente un 0,5% a aproximadamente un 20% de grupos carboxilo del polímero de ácido hialurónico se entrecruzan con grupos hidroxilo de la misma o diferente molécula de ácido hialurónico; (b) el antígeno está atrapado en, o adsorbido en, la microesfera, y (c) el antígeno está presente en una cantidad de aproximadamente un 2% a aproximadamente un 25% (p/p) de antígeno a polímero de ácido hialurónico.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15 en el que la administración en la mucosa es intranasal.