ES2285741T3 - Polimeros polianionicos como adyuvantes para la inmunizacion mucosa. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un polímero polianiónico soluble en agua para la preparación de un adyuvante mucoso para la inducción o la potenciación de respuestas inmunes mucosas a los antígenos, estando formado el polímero polianiónico por dos unidades constitutivas repetitivas aniónicas distintas, siendo una unidad ácido acrílico y seleccionando la otra de entre el ácido vinilsulfónico y el ácido acrilamidometilpropansulfónico.
Description
Polímeros polianiónicos como adyuvantes para la
inmunización mucosa.
La invención se refiere a una nueva inmunización
mucosa (no parenteral) de los animales de sangre caliente.
Existen dos tipos principales de inmunidad que
pueden proporcionar a un organismo huésped protección contra la
enfermedad y/o la infección: inmunidad sistémica (o general), que se
proporciona a través de la vacunación parenteral; e inmunidad
mucosa (local) que se proporciona mediante la vacunación no
parenteral.
Tradicionalmente, el desarrollo de vacunas se ha
centrado en la inducción de la inmunidad sistémica, que incluye las
respuestas humorales (anticuerpos específicos de tipo IgM o IgG) y
las respuestas inmunes celulares (linfocitos T activados,
macrófagos activados u otros), utilizando vacunas parenterales.
Dichas vacunas parenterales se administran a través de, entre otras
cosas, las vías intramuscular o subcutánea.
Aunque mediante la utilización de las vacunas y
de la vacunación parenteral se ha proporcionado inmunidad sistémica
que ha mostrado ser efectiva para establecer una inmunidad
protectora contra muchos patógenos distintos, esto no ocurre
siempre así.
Existen numerosos ejemplos en los que se ha
mostrado que dicha inmunidad es total o parcialmente inefectiva.
Además, las vacunas parenterales y la vacunación parenteral para
proporcionar una inmunidad sistémica presentan otras desventajas,
tales como la necesidad de violar la integridad de la piel del
organismo que está siendo inmunizado, la dificultad de
administración (que requiere, por ejemplo, personal entrenado para
administrar dichas vacunas), el alto grado de pureza que es
necesario para dichas vacunas, la falta de establecimiento de la
inmunidad en el sitio de la infección natural, la no prevención de
la infección y menos que la protección completa del organismo
contra la infección en sí misma. Además, las vacunas parenterales
pueden presentar problemas cuando se desea la inmunización efectiva
de los huéspedes inmunodeprimidos (por ejemplo, animales jóvenes
con anticuerpos
maternales).
maternales).
Gran cantidad de patógenos infectan de modo
natural sus huéspedes a través de los tejidos mucosos (por ejemplo,
el respiratorio, gastrointestinal o el genital).
La inmunidad mucosa (o local) proviene de la
formación y secreción locales de anticuerpos del tipo IgA. Estos
anticuerpos forman dímeros que pueden ser secretados en la luz de
los órganos respiratorios, gastrointestinales o genitales. Los
anticuerpos específicos IgA en la luz son capaces de reducir la
infección impidiendo y bloqueando la penetración del tejido del
huésped por el patógeno. Los mecanismos que se sabe subyacen en la
inhibición de la penetración del tejido del huésped incluyen: la
neutralización de los virus; la formación de complejos con enzimas,
toxinas u otros componentes producidos por los patógenos (que dan
lugar a la neutralización de la actividad de estos componentes y/o
al bloqueo de la adsorción de estos componentes); la inhibición de
la adherencia de los patógenos a las superficies mucosas; la
supresión de las reacciones inflamatorias mediadas por el
anticuerpo en las superficies mucosas; y el sinergismo con factores
antibacterianos innatos en la superficie mucosa.
Las vacunas mucosas (no parenterales) y la
vacunación mucosa tienen otras ventajas adicionales respecto a las
vacunas parenterales y a la vacunación parenteral. Estas ventajas
incluyen la eliminación de la necesidad de violar la integridad de
la piel, tejidos u órganos del huésped, la facilidad de
administración, la posibilidad de utilizar un bajo grado de pureza,
el establecimiento de la inmunidad en el sitio de la infección
natural, la prevención de la penetración del tejido del huésped por
el patógeno, una protección más completa del organismo contra tanto
los síntomas clínicos como no clínicos de la infección, así como de
la infección en sí misma, la protección contra el estado de
latencia y la inducción concomitante de la inmunidad sistémica y de
la mucosa. Además, las vacunas mucosas y la vacunación mucosa
permiten la inmunización efectiva de los huéspedes inmunodeprimidos
(es decir, los animales jóvenes con anticuerpos maternales).
De este modo, puede apreciarse que, en muchos
casos la utilización de las vacunas mucosas (no parenterales), la
vacunación mucosa y la inmunidad provocada, por tanto, son
preferibles con respecto al uso de vacunas parenterales,
vacunaciones parenterales y por tanto, de la inmunidad que se
proporciona.
Dependiendo de varios factores, la infección
natural o artificial con microorganismos vivos puede inducir
niveles considerables de inmunidad mucosa. Estos factores incluyen:
la vía de infección, la naturaleza del organismo, la dosis
infecciosa implicada y el estado inmune del huésped.
Sin embargo, la administración de antígenos
muertos (que no se replican), proporciona poca o no proporciona
inmunidad. Para aliviar este problema, se utilizan adyuvantes para
aumentar las respuestas inmunes a los antígenos muertos.
La inducción adecuada de la inmunidad mucosa con
antígenos muertos (que no se replican) requiere tanto la
administración del antígeno a las mucosas, como la utilización de
adyuvantes apropiados o sistemas de presentación de antígenos.
Aunque se conocen numerosos adyuvantes para las
vacunas parenterales, sólo algunos se han mostrado útiles para
potenciar la inmunidad mucosa. Dichos adyuvantes incluyen la toxina
de Vibrio cholera (toxina colérica) o sus productos (subunidad B de
la toxina colérica-CTB), la toxina termolábil de
E. coli o sus productos, toxinas bacterianas o sus productos
que están conjugados con los antígenos, micropartículas o
microcápsulas de distintos polímeros naturales o sintéticos que
tienen antígenos allí incorporados, antígenos liposómicos
incorporados allí o liposomas mezclados con antígenos, lectinas,
complejos inmunoestimulantes, muramildipéptidos y sus derivados, y
polímeros catiónicos (véase, "Novel Delivery Systems for Oral
Vaccines", CRC Press, London, 1984).
Aunque bien conocida, la utilización de
adyuvantes mucosos conocidos ha sido limitada. Esto se ha debido a
diversos factores, que incluyen: riesgos inaceptables asociados con
los efectos secundarios perjudiciales de dichos adyuvantes,
problemas de eficacia insuficiente, la desnaturalización (parcial)
de los antígenos resultantes de tratamientos mecánicos y/o químicos
que están implicados en su procedimiento de preparación;
procedimientos complicados de producción que están asociados; la
inconsistencia de su producción; los altos costes de su producción;
respuestas inmunes específicas provocadas para el componente del
adyuvante; la inestabilidad del adyuvante o de la vacuna que
contiene el adyuvante; y la potenciación o activación de reacciones
inmunes no específicas que provienen de su utilización.
De este modo, puede apreciarse que subsiste la
urgente necesidad de adyuvantes para las vacunas mucosas (y, en
particular para las vacunas mucosas contra enfermedades
respiratorias, enfermedades gastrointestinales y enfermedades
transmisibles sexualmente) que sean seguros, baratos, fáciles de
preparar y de incorporar en las vacunas mucosas.
Un objetivo primario de la presente invención es
proporcionar la utilización de adyuvantes mucosos que puedan
inducir o potenciar las respuestas inmunes a los antígenos.
Otro objetivo primario de la presente invención
es proporcionar la utilización de adyuvantes mucosos para vacunas
mucosas (y, en particular, para las vacunas mucosas contra
enfermedades respiratorias, enfermedades gastrointestinales y
enfermedades transmisibles sexualmente) que sean seguros, baratos y
fáciles de preparar para incorporar a dichas vacunas mucosas, en
las que van a utilizarse.
Todavía otro objetivo primario de la presente
invención es proporcionar vacunas mucosas que incorporen dichos
adyuvantes mucosos para inducir o potenciar las respuestas inmunes a
los antígenos.
Aún otro objetivo primario de la presente
invención es proporcionar procedimientos para inducir o potenciar
respuestas inmunes a antígenos y proporcionar procedimientos para
proporcionar adyuvantes mucosos y vacunas mucosas compuestas por
adyuvantes mucosos que puedan llevar a cabo dicha inducción o
potenciación.
La presente invención se refiere a adyuvantes
mucosos para la incorporación en vacunas mucosas, y a vacunas
mucosas que incorporan dichos adyuvantes, que son útiles para la
inducción o potenciación de respuestas mucosas y/o inmunes
sistémicas a los antígenos, según se define en la reivindicación
1.
Tal como se utilizan en la presente memoria, los
términos siguientes tienen los significados siguientes:
La expresión "soluble en agua", cuando se
refiere a polímeros polianiónicos de la presente invención, se
refiere a polímeros que son solubles en una fase acuosa a una
concentración de por lo menos 0,01 gramos por litro.
El término "polímero" se refiere a
compuestos que tienen por lo menos, tres unidades constitutivas
químicas repetitivas idénticas, las cuales unidades están
conectadas covalentemente con otra.
La expresión "unidad constitutiva
repetitiva" se refiere a la unidad estructural mínima de un
polímero.
El término "homopolímero" se refiere a
polímeros que constan de un tipo de unidad constitutiva
repetitiva.
El término "heteropolímero" se refiere a
polímeros que tienen dos o más distintas unidades constitutivas
repetitivas.
La expresión "polímero aniónico" se refiere
a polímeros que, cuando se disuelven en un medio acuoso, se cargan
negativamente debido a la presencia de unidades constitutivas
aniónicas repetitivas (por ejemplo, unidades que contienen grupos
sulfato, sulfonato, carboxilato, fosfato y borato).
La expresión "unidad constitutiva aniónica
repetitiva" se refiere a unidades constitutivas repetitivas
poliméricas que están cargadas negativamente en medio acuoso en
condiciones fisiológicas.
La expresión "unidad constitutiva hidrofóbica
repetitiva" se refiere a unidades constitutivas repetitivas de
polímeros que se caracterizan porque el monómero correspondiente es
menos soluble en una fase acuosa que en disolvente orgánico (es
decir, la cantidad, en peso (en gramos), del monómero, que puede
disolverse en un volumen fijado, en ml, de una fase acuosa, es
menor que la cantidad, en peso (en gramos), del monómero que puede
disolverse en el mismo volumen fijado, en ml, del disolvente
orgánico).
\newpage
Los adyuvantes mucosos se seleccionan a partir
de heteropolímeros polianiónicos que tienen dos grupos aniónicos
diferentes (distintos), siendo un grupo ácido acrílico y el otro
cualquiera entre ácido vinilsulfónico y ácido
acrilamidometil-propanosulfónico.
Los polímeros polianiónicos según la presente
invención son el copolímero
(p(A-c-AMPS)[poli(acrilato-co-ácido
acrilamidometilpropanosulfónico], y el copolímero
(p(A-c-VS)
[poli(acrilato-co-vinilsulfonato).
En aún otro aspecto de la presente invención, en
la presente memoria se da a conocer la utilización de los polímeros
polianiónicos solubles en agua de la presente invención, para la
preparación o producción de adyuvantes mucosos, para la inducción o
la potenciación de las respuestas inmunes sistémicas o mucosas.
Tal como se da a conocer en la presente memoria,
el adyuvante mucoso, que se compone de un polímero polianiónico
dado a conocer en la presente memoria, se administra mucosamente
para la potenciación de la inmunidad mucosa o sistémica contra los
antígenos.
El antígeno incluye virus vivos o inactivados,
bacterias, hongos, parásitos y otros microorganismos, así como
componentes o productos derivados de estos microorganismos,
productos obtenidos mediante síntesis química, capaces de provocar
inmunidad protectora, y productos obtenidos mediante otros medios,
capaces de provocar inmunidad protectora.
Los antígenos preferidos son los capaces de
provocar inmunidad protectora respecto a enfermedades que son
infecciones del aparato respiratorio. Ejemplos de dichas infecciones
son la infección por el virus de Newcastle, la infección por el
virus de la bronquitis infecciosa, por el virus de la gripe, las
infecciones por rinovirus, por el virus de la parainfluenza, por
adenovirus, por Actinobacilus pleuropneumoniae,
Pasteurella multocida, Streptococcus pneumonia,
Streptococcus pyogenes, e infecciones del tracto
gastrointestinal con, por ejemplo, rotavirus, parvovirus,
coronavirus, E. coli, Salmonella, Shigella, Yersinia,
Campylobacter, Clostridium, Vibrio y Giardia, Entamoeba
y Cryptosporidium.
Los polímeros polianiónicos que pueden
utilizarse como adyuvantes de la presente invención pueden obtenerse
mediante el aislamiento y purificación de sus formas naturales o
mediante su síntesis.
Los procedimientos para sintetizar polímeros
polianiónicos que tienen unidades constitutivas repetitivas y/o
tanto unidades constitutivas repetitivas como unidades constitutivas
repetitivas hidrofóbicas, son bien conocidos en la técnica. Dichos
procedimientos incluyen: copolimerización de monómeros aniónicos e
hidrofóbicos, injertos directos (parciales) de polímeros
apropiados; injertos indirectos (parciales) de polímeros apropiados,
e hidrólisis parcial de polímeros apropiados.
La utilización de los adyuvantes en las vacunas
para la vacunación mucosa (inmunización) ofrece varias importantes
ventajas con respecto a los adyuvantes mucosos conocidos (y con
respecto a las vacunas parenterales), como que los adyuvantes son
baratos, no inmunogénicos, solubles en agua, estables químicamente,
fáciles de preparar y fáciles de incorporar a las vacunas que se
tiene el propósito de utilizar. Además, estos adyuvantes son más
efectivos para inducir las respuestas inmunes mucosas deseadas que
los otros adyuvantes de los que se tiene constancia. Finalmente,
varios de los adyuvantes que se describen en la presente memoria se
aplican ya ampliamente en los alimentos y en las preparaciones
farmacéuticas, aumentando por tanto su aceptación.
Las observaciones relativas a los adyuvantes
mucosos y a las vacunas mucosas que incorporan dichos adyuvantes
mucosos, que se ilustran en los ejemplos que se exponen a
continuación, se consideran inesperadas porque: la mayoría de los
adyuvantes bien conocidos para la inmunidad sistémica no son
efectivos para potenciar la inmunidad mucosa; aquéllos adyuvantes
mucosos que se utilizan actualmente constituyen adyuvantes moderados
o pobres para la inmunidad sistémica, hay diferencias decisivas que
existen en los mecanismos que están implicados en la inducción y
desarrollo de la inmunidad mucosa y sistémica, y los polímeros
polianiónicos que se dan a conocer en la presente memoria son más
efectivos que varios de los adyuvantes más prometedores que se
conocen
actualmente.
actualmente.
Se considera además que los polímeros
polianiónicos que se utilizan en la presente invención, son útiles
para la inducción y/o potenciación de las respuestas inmunes
mucosas para los antígenos, cuando se administran conjuntamente con
el antígeno, o separadamente a partir del antígeno, a través de vías
mucosas.
Las vacunas mucosas que contienen los adyuvantes
son efectivas para la inducción de la inmunidad mucosa, e incluyen
tanto un antígeno como un adyuvante, en la que el adyuvante es un
polímero polianiónico soluble en agua.
Los adyuvantes son sólidos (por ejemplo, están
en forma de polvo). Si se desea, pueden utilizarse como tales,
aplicándose directamente a la superficie en la que se desea (que se
produzca) la respuesta inmune. En tal caso, como son solubles en
agua, son solubilizados por los líquidos naturales de las
superficies mucosas.
Alternativamente, los adyuvantes mucosos pueden
incorporarse a la solución acuosa disolviéndose o incorporándose en
un medio líquido.
A este respecto, los adyuvantes mucosos pueden
incorporarse además a una vacuna que contenga un medio líquido (tal
como un transportador farmacéuticamente aceptable). Esto puede
conseguirse, por ejemplo, solubilizándose (como, por ejemplo, un
polvo) en una solución (tal como una solución acuosa) que contenga,
por ejemplo, un antígeno (y/o una molécula medicamentosa). Otro
procedimiento alternativo para alcanzar esto puede ser disolviendo
primero el adyuvante sólido en una fase acuosa, que puede mezclarse
entonces con una solución acuosa del antígeno (y/o de una molécula
medicamentosa), o que puede entonces tener un antígeno liofilizado
(y/o una molécula medicamentos) que se solubiliza en la solución
que contiene el adyuvante.
Preferentemente, las vacunas se formulan de
forma que tienen entre 0,01 y 40 mg del polímero polianiónico
(adyuvante mucoso) por ml vacunal.
Más preferentemente, las vacunas se formulan de
forma que tengan entre 0,02 y 20 mg del polímero polianiónico
(adyuvante mucoso)por ml vacunal.
Muy preferentemente, las vacunas se formulan de
forma que tengan entre 0,25 y 5 mg del polímero
polianiónico (adyuvante mucoso) por ml vacunal.
Las vacunas pueden aplicarse a las superficies
mucosas de los animales o del hombre mediante vías no parenterales
tales como la intranasal, oral, oro-nasal,
intratraqueal o intracloacal. Dicha aplicación puede llevarse a
cabo mediante, por ejemplo, la utilización de aerosoles líquidos,
agua bebida, alimentos, etc.
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
términos siguientes tendrán el significado que se les asigna:
La expresión "inmunización parenteral" se
refiere a la administración de una vacuna por la piel, utilizando
una aguja u otro dispositivo que utilice, entre otras, una de las
vías siguientes: intracutánea, subcutánea, intraperitoneal,
intramuscular y/o intradérmica.
Las expresiones "inmunización no
parenteral" e "inmunización mucosa" se refieren a la
administración de una vacuna a una superficie mucosa, mediante,
entre otras, una de las vías siguientes: intranasal,
oro-nasal, intratraqueal, intragástrica,
intra-intestinal, oral, rectal, intracloacal y/o
intravaginal.
La expresión "inmunidad sistémica" se
refiere a la defensa antígeno específica del huésped mediada por los
anticuerpos séricos de tipo IgM o IgG mediante los linfocitos T
activados.
La expresión "inmunidad mucosa" se refiere
a la defensa antígeno específica del huésped mediada por los
anticuerpos de tipo IgA que se encuentran en el huésped, o que son
secretados en la luz de distintos órganos.
La expresión "vacuna mucosa" se refiere a
vacunas que se administran por una vía no parenteral para aumentar
la respuesta inmune sistémica o mucosa con respecto a un
antígeno.
La expresión "adyuvante mucoso" se refiere
a adyuvantes que se administran por una vía no parenteral para
aumentar la respuesta inmune sistémica o mucosa con respecto a un
antígeno.
El término "polímero injertado" se refiere
a polímeros que se obtienen añadiendo grupos químicos con un efecto
significativo en las propiedades químicas, fisicoquímicas o
biológicas del polímero.
El término "copolímero" se refiere a
polímeros que se obtienen mediante la polimerización de dos o más
monómeros distintos, conjuntamente con otro que presenta otras
propiedades químicas, fisicoquímicas o biológicas distintas
significativas, cuando se compara con los polímeros obtenidos a
partir del monómero.
La expresión "medio líquido" se refiere a
medios de líquidos que incluyen, pero no se limitan a: soluciones
acuosas, soluciones acuosas fisiológicas, emulsiones del tipo aceite
- en - agua y suspensiones de sales insolubles en una solución
acuosa (así como otros tipos de transportadores farmacéuticamente
aceptables).
Los medios líquidos preferidos son soluciones
acuosas, prefiriéndose las soluciones acuosas fisiológicas, aunque
una de las ventajas de la presente invención es que la formulación
vacunal que incorpora los adyuvantes mucosos que se dan a conocer
en la presente memoria, no necesitan ser fisiológicos.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención, y
sólo los ejemplos 20-21 y 24-27
están comprendidos dentro del alcance de las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
540 mmoles de ácido acrílico (Merck, Darmstadt,
Alemania), 60 mmoles de n-butilacrilato (Janssen,
Bélgica), y 150 ml de agua destilada, se mezclaron conjuntamente en
un recipiente para reacción. La mezcla reactiva resultante se agitó
y se ajustó a pH 4,8 con 10N NaOH. La mezcla reactiva se saturó
entonces con nitrógeno para eliminar el oxígeno que se encontraba
allí presente.
Cinco ml de una solución de 88 mM
Na_{2}S_{2}O_{8} y 5 ml de una solución de 175 mM
Na_{2}S_{2}O_{5} se añadieron entonces a la mezcla reactiva y
ésta se incubó durante 6 horas a temperatura ambiente con agitación
continua.
La mezcla reactiva se dializó a continuación
contra 1 M NaCl y 0,15 M NaCl utilizando una membrana para diálisis
con una extinción de 10 kD (Spectra/por), dializándose durante por
lo menos siete días contra agua destilada para obtener el polímero.
El producto se sometió entonces a liofilización para eliminar el
agua de él y se guardó como un polvo seco a temperatura
ambiente.
El análisis del producto liofilizado mediante
NMR (NMR protónica con un cambio químico calculado a partir de TMS
(0 ppm estándar), en un dispositivo de 500 megaciclos (BRUCKER
AMX500) utilizando D_{2}O como disolvente a 25ºC, reveló que el
producto consistía en un polímero que contenía monómeros de
butilacrilato y monómeros de acrilato en una proporción molar de 5
monómeros de butilacrilato por 95 monómeros de acrilato. El análisis
del peso molecular mediante cromatografía de impregnación gélica
(tal como se describe en Vaccine 12, 653-659
(1994)) del polímero formado de esta forma, reveló un peso molecular
medio de más de 100.000 daltons.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Muestras respectivas de un gramo de ácido
poliacrílico-907 (PAA-907)
(CARBOPOL-907) de BFGoodrich, Cleveland, Ohio,
USA), se esterificaron según el procedimiento descrito por Cohen (J.
Polymer Sci, 14, 7-22, 1976), solubilizándose en
muestras respectivas de 50 ml de alcanol puro (octanol, butanol y
metanol, respectivamente), calentándose las soluciones a 135ºC. 50
\mul de 18 MH_{2}SO_{4} se añadieron a cada una de las
soluciones y las mezclas se mantuvieron a 135ºC entre 10 y 30
minutos. Las reacciones se finalizaron entonces añadiendo 50 ml de
agua destilada fría a cada mezcla reactiva, y enfriando las mezclas
reactivas a la temperatura ambiental. El pH de cada mezcla reactiva
se ajustó entonces a 6 con una solución 1M NaOH y los disolventes se
eliminaron calentando las mezclas hasta 80ºC a presión baja
(10^{-6})bar.
Los productos obtenidos se solubilizaron
entonces en agua destilada, se dializaron durante por lo menos siete
días utilizando una membrana con una extinción de 10 kD
(Spectra/por) contra agua destilada y se sometieron a liofilización
para eliminar el agua de él.
Los compuestos obtenidos de esta forma eran
(polímeros injertados) octil-PAA,
butil-PAA y metil-PAA. Estos
polímeros injertados se analizaron mediante NMR (NMR protónica con
un cambio químico calculado a partir de TMS (0 ppm estándar) en un
dispositivo de 500 megaciclos (BRUCKER AMX500) utilizando DMSO como
disolvente a 120ºC) para determinar su grado de esterificación
(número promedio de grupos alquilos por número total de grupos
carboxilos de la molécula original. Los resultados de esta NMR
revelaron grados de esterificación del 16% para
octil-PAA, 16% para butil-PAA y del
15% para metil-PAA.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se preparó una solución de 36 gramos de
PAA-907 (CARBOPOL-907 de BFGoodrich,
Ohio, USA) por litro de dimetilformamida anhidra. 50 ml de esta
solución se mezclaron entonces con 10 ml de piridina anhidra para
formar una solución PAA-907.
Se preparó una solución de CH_{3}COCl a una
concentración de 71,2 ml por litro de dimetilformamida anhidra. 7,5
ml de esta solución de CH_{3}COCl se añadieron a la solución
PAA-907 (relación molar de 0,3 de CH_{3}COCl por
COOH de PAA-907), y se incubó la mezcla reactiva
primero durante 6 horas a 60ºC y entonces, durante 18 horas a
temperatura ambiente, formando por lo tanto un anhídrido entre los
grupos COOH del PAA-907 y el CH_{3}COCl.
A la mezcla formada de este modo, se añadieron 7
ml de l-butanol anhidro puro, incubándose otra vez
la mezcla reactiva durante 24 horas a temperatura ambiente, por lo
que el anhídrido reaccionó con el butanol, formando ésteres
butil-PAA y butil O(C=O)CH_{3}. El
producto obtenido se dializó entonces durante por lo menos siete
días contra agua destilada utilizando una membrana para diálisis con
una extinción de 10 kD (Spectra/por). El polímero se analizó
mediante NMR (NMR protónica con un cambio químico calculado a partir
de TMS (0 ppm estándar) en un dispositivo de 500 megaciclos
(BRUCKER AMX500) utilizando DMSO como disolvente a 25ºC) que reveló
monómeros de butil acrilato y monómeros de acrilato con una relación
molar de 16 monómeros de butil acrilato por 84 monómeros de
acrilato.
\newpage
Ejemplo
4
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se solubilizó entonces en diversas
cantidades de un tampón fosfato (pH = 7,5) que contiene 15,16 gramos
de Na_{2}HPO_{4} y 2,83 gramos de NaH_{4}PO_{4}*2H_{2}O
por litro de agua ultrapura, para producir soluciones del adyuvante
Butil-PAA (formulaciones) que tengan concentraciones
del adyuvante Butil-PAA tal como se expone
seguidamente en la Tabla 1.
La subunidad B de la toxina colérica (CTB) se
obtuvo a partir de Sigma. CTB se solubilizó entonces en diversas
cantidades de un tampón fosfato (pH = 7,5) que contiene 15,16 gramos
de Na_{2}HPO_{4} y 2,83 gramos de NaH_{4}PO_{4}*2H_{2}O
por litro de agua ultrapura, para producir soluciones del adyuvante
CTB (formulaciones) que tengan concentraciones del adyuvante CTB
tal como se expone seguidamente en la Tabla 1.
Parte
2
La cepa Lasota del Virus de la enfermedad de
Newcastle (NDV) (Solvay Duphar, Weesp), Holanda), se hizo crecer en
huevos (según los procedimientos y condiciones especificadas en
Wilson, et al., Avian Diseases, 28,
1079-1085 (1984)), y se purificó en gradiente de
sacarosa, inactivándose mediante la
\beta-propiolactona (según los procedimientos y
condiciones especificadas en Wilson, et al., Avian Diseases,
28, 1079-1085 (1984)), para dar lugar a una
solución de almacenamiento del antígeno. La concentración final de
la solución antigénica contenía 10^{8,8} dosis infecciosas
embrionarias por ml, de promedio, antes de la inactivación.
Las diversas formulaciones vacunales, que se
especifican a continuación en la Tabla 1, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las diversas respectivas formulaciones de
los adyuvantes, preparadas tal como se ha descrito anteriormente,
con un volumen de la solución antigénica de almacenamiento.
Finalmente, se preparó una solución tampón
fosfato (pH = 7,5), que contenía 15,16 gramos de Na_{2}HPO_{4}
y 2,83 gramos de NaH_{4}PO_{4}*2H_{2}O por litro de agua
ultrapura. Esta solución de tampón fosfato se utilizó como control
en el experimento que se describe a continuación.
Parte
3
Se obtuvieron 24 ratones hembras (NMRI, Charles
River, Alemania), y se dividieron en cuatro grupos de seis animales
cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
cuatro grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron entonces dosis, respectivamente, de 40 \mug
de la solución tampón fosfato (pH = 7,5) que se ha descrito
anteriormente en la parte 1 de este ejemplo, que no contenía ni
antígeno ni adyuvante, haciendo gotear 20 \mul de dicha solución
tampón fosfato en cada orificio nasal de cada animal.
A cada uno de los animales de un segundo grupo
(Grupo 2) se le administraron dosis, respectivamente, de 40 \mul
que contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica pura
de almacenamiento del NDV y 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (que se ha descrito anteriormente), haciendo gotear 20 \mul
de esta solución en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los dos grupos
restantes (Grupos 3 y 4) se inmunizaron entonces intranasalmente
con dosis respectivamente, de 40 \mul de las formulaciones
vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían 20 \mul de la
solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de una formulación
particular del adyuvante), tal como se especifica seguidamente en
la Tabla 1, haciendo gotear 20 \mul de una formulación vacunal
particular en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la solución tampón fosfato
(a los animales del Grupo 1), de la solución antigénica de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 2), o de las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 3 y 4), se repitió en el día 14 con idéntica mezcla y
utilizando el mismo protocolo que el que se describe anteriormente
para el día 0.
\newpage
Parte
4
En el día 21 (semana 3), todos los grupos de
animales se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor
cantidad de sangre posible de cada uno de sus plexos venosos.
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos. Sus bazos
también se extrajeron.
Se preparó medio M199/FCS con 500 ml de medio
M199 (BioWhittaker), 30 ml de suero fetal de ternera (Gibco BRL),
11,6 ml de una solución de 1M HEPES (Sigma), 7 ml de una solución de
NaHCO_{3} al 5,6% (peso/peso) (Analar) y 145 \mul de una
solución de gentamicina (Gibco BRL).
En cada grupo, se juntaron los pulmones de dos
animales y se trataron ulteriormente como una muestra única, dando
lugar a 3 muestras por grupo.
Los pulmones se fragmentaron en pequeños trozos
y se incubaron durante 2 horas a 37ºC en 5 ml del medio M199/FCS
(que se ha descrito anteriormente), que se complementó ulteriormente
con colagenasa (Sigma), a una concentración final de 0,4 mg por ml
y CaCl_{2} a una concentración final de 0,01 M.
Las células esplénicas se trataron de la misma
forma que las células pulmonares, exceptuando que el medio M199/FCS
no se complementó con la colagenasa o con el CaCl_{2}.
Después de la incubación, los trozos de los
pulmones se desmenuzaron mediante un filtro de nylon (Nybold, red
con poros de 243 micras), filtrándose las suspensiones celulares a
través de un filtro de nylon (red con poros de 243 micras) y
recuperándose en tubos.
Las células esplénicas se trataron de la misma
forma, recuperándose asimismo en tubos.
Los tubos (que contenían las suspensiones
celulares pulmonares y las de células esplénicas), se centrifugaron
entonces durante 5 minutos a 1000 RPM (180 g) a 4ºC, eliminándose
los sobrenadantes de ellos. Los sedimentos celulares que quedaban
se volvieron entonces a suspender en 2 ml del medio M1999/FCS (que
se ha descrito anteriormente). Las suspensiones celulares que se
obtuvieron entonces se añadieron a tubos que contenían 3 ml de
Ficoll-paque (Pharmacia), centrifugándose los
mismos durante 20 minutos a 18ºC y 2000 RPM (540 g).
Las dos fracciones más ligeras que resultaron de
la centrifugación, que contenían los linfocitos, se recuperaron
entonces en una nueva serie de tubos. Las células de lavaron
entonces añadiendo 8 ml del medio M199/FCS (que se ha descrito
anteriormente) a alrededor de 2 ml de suspensiones celulares, y
centrifugándose durante 5 minutos a 1000 RPM (180 g) a 4ºC. El
sobrenadante resultante se eliminó entonces y el procedimiento de
lavado se repitió una vez más.
Los sedimentos celulares resultantes se
volvieron entonces a suspender en 2 ml del medio M199/FCS (que se
ha descrito anteriormente) y 2 ml del 0,83% (peso/vol) de
NH_{4}Cl, se añadieron a cada muestra. Las suspensiones celulares
se mezclaron entonces suavemente, seguido por centrifugación durante
5 minutos a 1000 RPM (180 g) a 4ºC. El sedimento celular resultante
se volvió entonces a suspender inmediatamente en 8 ml del medio
M199/FCS (que se ha descrito anteriormente). Los tubos se
centrifugaron otra vez entonces durante 5 minutos a 1000 RPM (180
g) a 4ºC. El sobrenadante se eliminó entonces de los sedimentos y
los sedimentos celulares se volvieron a suspender en el medio
M199/FCS (que se ha descrito anteriormente). El número de células
vivientes se determinó entonces bajo el microscopio utilizando Azul
Tripan (SIGMA), ajustándose las suspensiones a 2.10^{6} células
por 0,1 ml (100 \mul).
Parte
5
El número de células productoras de IgA e IgG
específicas antigénicas en tanto las suspensiones celulares
pulmonares como en las suspensiones celulares esplénicas, se calculó
mediante un ensayo ELISA en placa (ELISPOT), tal como se describe
por Sedwick y Holt J. Immunol. Meth 87, 37-44) con
las especificaciones siguientes: las placas ELISA se recubrieron
por la noche con 50\mul de una solución de NDV inactivados y
purificados (cepa Lasota, Solvay Duphar) en un tampón carbonato (pH
9,6) que contenía 0,015M NA_{2}CO_{3} y 0,035M NaHCO_{3} a
una concentración de alrededor de una dosis infecciosa embrionaria
promedio de 10^{8,8} por ml antes de la inactivación. Las placas
se lavaron a continuación 5 veces con Tween 20 al 0,05% (vol/vol)
(Merck) en solución salina tamponada de fosfato (Oxoid; PBS/Tween
20).
A continuación, se añadieron 100 \mul del
medio M199/FCS (que se ha descrito anteriormente) se añadió entonces
a cada pocillo. 100 \mul de las suspensiones celulares que
contenían 2.10^{6} células por 100 \mul a los pocillos de la
primera columna y se diluyeron serialmente dos veces en los pocillos
de la misma fila.
Las placas se cubrieron entonces y se incubaron
durante 4 horas a 37ºC en un incubador sin vibraciones para evitar
desplazamientos de las células fijadas en el fondo de los pocillos.
Después de la incubación, se inyectó en cada pocillo agua
desmineralizada con fuerza suficiente como para eliminar de él las
células que estaban adheridas. Las placas se lavaron a continuación
cinco veces con PBS/Tween 20 (anteriormente descrito). 50 \mul de
IgA anticonejo de cabra conjugada con biotina (Zymed) que se había
diluido 500 veces en medio M199/FCS (que se ha descrito
anteriormente), se añadió entonces a cada pocillo, incubándose las
placas durante 2 horas a 37ºC.
Las placas se lavaron entonces 10 veces con
PBS/Tween 20 (descrito anteriormente) y 50 \mul del conjugado de
fosfato alcalino-estreptavidina (Zymed) que se había
diluido previamente 500 veces en medio M199/FCS (descrito
anteriormente), se añadió entonces a cada pocillo, incubándose las
placas durante 18 horas a 4ºC.
Las placas se lavaron entonces 10 veces con
PBS/Tween 20 (descrito anteriormente). 100 \mul de un tampón
substrato calentado (40ºC) compuesto de 4 volúmenes de una solución
de 1 mM
5-bromo-4-cloro-3-indolil
fosfato (SIGMA) en tampón 1M 2-amino, 2 metil,
1-propanol (pH = 10,25; Sigma) y 1 volumen de una
solución de agarosa al 3% (peso/vol), se añadieron entonces a cada
pocillo. Las placas se incubaron entonces durante 2 horas a
temperatura ambiente y se contó el número de manchas azules en los
pocillos, que contenían entre 10 y 40 manchas azules bajo el
microscopio (ampliación x 100). El número de manchas azules por
10^{6} células se calculó entonces dividiendo el número de
manchas contadas en un pocillo por el número de células añadido a
aquel pocillo, y multiplicando el resultado por 10^{6}.
Las suspensiones celulares pulmonares
respectivas (derivándose cada suspensión de los pulmones de dos
animales individuales), se ensayaron entonces por triplicado en el
ELISPOT. Las suspensiones celulares esplénicas respectivas
(derivándose cada suspensión de los bazos de dos animales
individuales), se ensayaron entonces por triplicado en el ELISPOT.
Se calcularon entonces los valores promedio y el error estándar del
promedio (SEM) de las tres muestras de las suspensiones celulares
de los pulmones y del bazo.
Los resultados de dichos cálculos se muestran
seguidamente en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
5
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se ha descrito
antes en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de adyuvantes
que presentan las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA que se muestran a continuación en la Tabla
2.
Se preparó una formulación
sulfolipo-ciclodextrin/escualeno/agua
(SL-CD/escualeno/agua) del adyuvante, siguiendo el
protocolo descrito en Hilgers (Vaccine 12, 653-660,
1994) para la formulación
sulfolipo-polisacarosa/escualeno/
agua, con la excepción de que el sulfolipo-ciclodextrin (SL-CD) se sintetizó añadiendo grupos sulfato y lauroilo a la beta-ciclodextrina, tal como se ha descrito por Hilgers (Immunology, 60, 141-146, 1987) para la síntesis de sulfolipo-polisacarosa añadiendo grupos sulfato y lauroilo a la polisacarosa, con una proporción molar de 1 mol de sulfato, 8 moles de lauroilo y 1 mol de ciclodextrina.
agua, con la excepción de que el sulfolipo-ciclodextrin (SL-CD) se sintetizó añadiendo grupos sulfato y lauroilo a la beta-ciclodextrina, tal como se ha descrito por Hilgers (Immunology, 60, 141-146, 1987) para la síntesis de sulfolipo-polisacarosa añadiendo grupos sulfato y lauroilo a la polisacarosa, con una proporción molar de 1 mol de sulfato, 8 moles de lauroilo y 1 mol de ciclodextrina.
Un gramo del SL-CD obtenido se
disolvió entonces en dos gramos de Tween-80. 8
gramos de escualeno y 390 gramos de solución salina tamponada de
fosfato (PBS), se añadieron entonces a la solución
SL-CD/Tween 80. La mezcla obtenida se emulsificó
entonces a través de un Microfluidificador (Microfluidics Inc), tal
como se describe por Hilgers (Vaccine 12, 653-660,
1994) para SL-polisacarosa/escualeno/agua, formando
por tanto una emulsión SL-CD/escualeno/agua del
adyuvante. Las concentraciones finales de SL-CD,
Tween 80 y escualeno que se encuentran en las formulaciones
SL-CD/escualeno/agua del adyuvante que se utilizan a
continuación en los respectivos ejemplos, fueron de 2,5 gramos de
SD-CD por litro de emulsión del adyuvante, de 5,0
gramos de Tween 80 por litro de la emulsión del adyuvante y de 20
gramos de escualeno por litro de la emulsión del adyuvante.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la Enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, que se especifican a continuación en la Tabla 2, se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron 18 ratones hembra (NMRI, Charles
River, Alemania), y se dividieron en tres grupos de seis animales
cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
cuatro grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron entonces dosis de 40 \mul que contenían una
mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento pura
de NDV y 20 \mul del tampón fosfato (pH = 7,5) (anteriormente
descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta mezcla en cada orificio
nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los dos grupos
restantes (Grupos 2 y 3) se inmunizaron entonces intranasalmente
con dosis respectivamente, de 40 \mul de las formulaciones
vacunales (mezclas antígeno/mezclas que contenían 20 \mul de la
solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de una formulación
particular del adyuvante), tal como se especifica seguidamente en
la Tabla 2, haciendo gotear 20 \mul de una formulación vacunal
particular en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la solución antigénica pura
de almacenamiento del NDV (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2 y 3), se repitió en el día 14 con idéntica mezcla y
utilizando el mismo protocolo que el que se describe anteriormente
para el día 0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los 3 grupos de
animales se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor
cantidad de sangre posible de cada uno de sus plexos venosos.
\newpage
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales del Grupo 1 y del
Grupo 2 (tal como se especifica en la Tabla 2 a continuación), sus
bazos también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específicas antigénicas en las suspensiones
celulares se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 4, con
la excepción de que sólo se determinó el número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones de
células esplénicas de dos muestras de los Grupos 1
y 2.
y 2.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 3.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich)) se solubilizó en
diversas cantidades de un tampón fosfato (pH = 7,5) que contiene
15,16 gramos de Na_{2}HPO_{4} y 2,83 gramos de
NaH_{4}PO_{4}*2H_{2}O por litro de agua ultrapura, para
producir soluciones del adyuvante PAA-907
(formulaciones) que tengan concentraciones variables del adyuvante
PAA-907 tal como se expone seguidamente en la Tabla
3.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, que se especifican a continuación en la Tabla 3, se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron cuarenta y dos ratones hembra
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en siete grupos de
seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
cuatro grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron respectivamente dosis de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento pura de NDV y 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los seis grupos
restantes (Grupos 2, 3, 4, 5, 6) se inmunizaron entonces
intranasalmente con dosis respectivamente, de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/mezclas que contenían 20
\mul de la solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de
una formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 3, haciendo gotear 20 \mul de una
formulación vacunal particular en cada orificio nasal de cada
animal.
La administración de la solución antigénica pura
de almacenamiento del NDV (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2-7), se repitió en el día 14 con idéntica
mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se describe
anteriormente para el día 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los siete grupos de
animales se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor
cantidad posible de sangre de cada uno de sus plexos venosos.
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos.
Las suspensiones celulares de los pulmones se
prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente en el
ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específicas antigénicas en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe en el
Ejemplo 4.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
7
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones del
adyuvante que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 4.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich) y sus formulaciones
adyuvantes se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 6, teniendo las concentraciones del adyuvante
PAA-907 que se exponen seguidamente en la tabla
4.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, que se especifican a continuación en la Tabla 4, se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4.
Se prepararon asimismo entonces diversas
diluciones graduadas de los antígenos de NDV, por ejemplo diluciones
de 1/12 (dosis estándar) (v/v), 1/40 (v/v) y 1/120 (v/v) en PBS, a
partir de la solución antigénica de almacenamiento, mediante su
dilución con cantidades apropiadas de PBS. Estas diluciones
produjeron soluciones antigénicas que tenían, respectivamente,
dosis promedio infectivas embrionales, por ml, antes de
inactivación, de 10^{7,8}, 10^{7,3} y de 10^{6,8},
respectivamente.
Parte
3
Se obtuvieron cincuenta y cuatro ratones hembra
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en nueve grupos de
seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
cuatro grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de los tres grupos
(Grupos 1, 2 y 3), se administraron respectivamente dosis de 40
\mul que contenían una mezcla de 20 \mul de la solución
antigénica de almacenamiento de NDV puro y de 20 \mul del tampón
fosfato (pH = 7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20
\mul de esta mezcla en cada orificio nasal de cada animal. La
dilución exacta de la solución antigénica de almacenamiento de NDV
puro administrada a los animales de cada uno de los Grupos 1,2 y 3
se expone a continuación en la Tabla 4.
Cada uno de los animales de los seis grupos
restantes (Grupos 4, 5, 6, 7, 8 y 9) se inmunizaron entonces
intranasalmente con dosis respectivamente, de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de
una formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 4, haciendo gotear 20 \mul de una
formulación vacunal particular en cada orificio nasal de cada
animal.
La administración de la solución antigénica de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo
1-3), o las formulaciones vacunales
antígeno/adyuvante (a los animales de los grupos
4-9), se repitió en el día 14 con idéntica mezcla y
utilizando el mismo protocolo que el que se describe anteriormente
para el día 0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales se
narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor cantidad de
sangre posible de cada uno de sus plexos venosos.
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 4
(tal como se especifica en la Tabla 4 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones se
prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente en el
ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe en el
Ejemplo 4.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe en el
Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se determinó el número de
células productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas de dos muestras de los Grupos 1 y 4.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 4.
Ejemplo
8
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 5.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich)) y sus formulaciones del
adyuvante se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 6, teniendo las concentraciones del adyuvante
PAA-907 que se exponen seguidamente en la tabla
5.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, que se especifican a continuación en la Tabla 5, se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron cuarenta y dos ratones hembra
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en siete grupos de
seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
siete grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron respectivamente dosis de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los seis grupos
restantes (Grupos 2, 3, 4, 5, 6 y 7) se inmunizaron entonces
intranasalmente con dosis respectivamente, de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de
una formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 5, haciendo gotear 20 \mul de una
formulación vacunal particular en cada orificio nasal de cada
animal.
La administración de la solución antigénica de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2-7), se repitió en el día 14 con idéntica
mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se describe
anteriormente para el día 0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales se
narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor cantidad de
sangre posible de cada uno de sus plexos venosos.
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos.
Las suspensiones celulares de los pulmones se
prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente en el
ejemplo 4.
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
del Grupo 3.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 5.
Ejemplo
9
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 6.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich)) y sus formulaciones del
adyuvante se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 6, teniendo las concentraciones del adyuvante
PAA-907 que se exponen seguidamente en la Tabla
6.
CTB y sus formulaciones del adyuvante se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4,
teniendo las concentraciones del adyuvante CTB que se exponen a
continuación en la Tabla 6.
PAA-934PH
(CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) se solubilizó en
diversas cantidades de un tampón fosfato (pH = 7,5) que contiene
15,16 gramos de Na_{2}HPO_{4} y 2,83 gramos de
NaH_{4}PO_{4}*2H_{2}O por litro de agua ultrapura, para
producir soluciones del adyuvante PAA-934PH
(formulaciones) que tengan concentraciones variables del adyuvante
PAA-934PH tal como se expone seguidamente en la
Tabla 6.
Los liposomas formados por fosfatidilcolina de
yema de huevo (Sigma), colesterol (Sigma) y cetilfosfato (Sigma) en
una relación molar de 4:5:1, respectivamente, se prepararon tal como
se describe por Haan et al. (Vaccine 13,
155-162. 1995). Estos liposomas se suspendieron
entonces en diversas cantidades de un tampón fosfato (pH =7,5) que
contiene 15,16 gramos de Na_{2}HPO_{4} y 2,83 gramos de
NaH_{4}PO_{4}*2H_{2}O por litro de agua ultrapura, para
producir suspensiones del adyuvante del liposoma (formulaciones) que
tengan concentraciones variables del adyuvante liposómico, que se
exponen seguidamente en la Tabla 6.
Al(OH)_{3} (SUPERFOS) se
suspendió en diversas cantidades de un tampón fosfato (pH = 7,5) que
contiene 15,16 gramos de Na_{2}HPO_{4} y 2,83 gramos de
NaH_{4}PO_{4.2H2O} por litro de agua ultrapura, para producir
suspensiones del adyuvante Al(OH)_{3}
(formulaciones) que tengan concentraciones variables del adyuvante
Al(OH)_{3} que se exponen seguidamente en la Tabla
6.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, que se especifican a continuación en la Tabla 6, se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron cuarenta y dos ratones hembra
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en siete grupos de
seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
siete grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron respectivamente dosis de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los seis grupos
restantes (Grupos 2, 3, 4, 5, 6 y 7) se inmunizaron entonces
intranasalmente con dosis respectivamente, de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de
una formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 6, haciendo gotear 20 \mul de una
formulación vacunal particular en cada orificio nasal de cada
animal.
La administración de la solución antigénica de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2-7), se repitió en el día 14 con idéntica
mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se describe
anteriormente para el día 0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales se
narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor cantidad de
sangre posible de cada uno de sus plexos venosos.
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 2
(tal como se especifica en la Tabla 6 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y del
bazo se prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente
en el ejemplo 4.
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1 y 2.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 6.
Ejemplo
10
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 7.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich)) y sus formulaciones del
adyuvante se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 6, teniendo las concentraciones del adyuvante
PAA-907 que se exponen seguidamente en la Tabla
7.
CTB y sus formulaciones del adyuvante se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4,
teniendo las concentraciones del adyuvante CTB que se exponen a
continuación en la Tabla 7.
PAA-934PH
(CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) y sus formulaciones del
adyuvante, los liposomas y sus formulaciones del adyuvante y
Al(OH)_{3} (SUPERFOS) y sus formulaciones del
adyuvante, se prepararon todos tal como se describe anteriormente
en el Ejemplo 9 teniendo las concentraciones de dichos respectivos
adyuvantes, que se exponen en la Tabla 7.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, que se especifican a continuación en la Tabla 7, se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron 42 ratones hembra (NMRI, Charles
River, Alemania), y se dividieron en siete grupos de seis animales
cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
siete grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron respectivamente dosis de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los seis grupos
restantes (Grupos 2, 3, 4, 5, 6 y 7) se inmunizaron entonces
intranasalmente con dosis respectivamente, de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de
una formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 7, haciendo gotear 20 \mul de una
formulación vacunal particular en cada orificio nasal de cada
animal.
La administración de la solución de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2-7), se repitió en el día 14 con idéntica
mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se describe
anteriormente para el día 0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales se
narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor cantidad de
sangre posible de cada uno de sus plexos venosos.
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 2
(tal como se especifica en la Tabla 7 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y del
bazo se prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente
en el ejemplo 4.
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares pulmonares de dos muestras
del Grupo 1.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1 y 2.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
11
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 8.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich) y sus formulaciones del
adyuvante se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 6, exponiéndose a continuación las concentraciones del
adyuvante PAA-907 en la
Tabla 8.
Tabla 8.
CTB y sus formulaciones del adyuvante se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4,
exponiéndose a continuación las concentraciones del adyuvante CTB
en la Tabla 8.
PAA-934PH
(CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) y sus formulaciones del
adyuvante, los liposomas y sus formulaciones del adyuvante y
Al(OH)_{3} (SUPERFOS) y sus formulaciones del
adyuvante, se prepararon todos tal como se describe anteriormente
en el Ejemplo 9, exponiéndose a continuación las concentraciones de
dichos respectivos adyuvantes en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, que se especifican a continuación en la Tabla 8, se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron cuarenta y dos ratones hembra
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en siete grupos de
seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
siete grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron respectivamente dosis de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los seis grupos
restantes (Grupos 2, 3, 4, 5, 6 y 7) se inmunizaron entonces
intranasalmente con dosis respectivamente, de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de
una formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 8, haciendo gotear 20 \mul de una
formulación vacunal particular en cada orificio nasal de cada
animal.
La administración de la solución de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2-7), se repitió en el día 14 con idéntica
mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se describe
anteriormente para el día 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales se
narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la mayor cantidad de
sangre posible de cada uno de sus plexos venosos.
Los animales se sacrificaron entonces mediante
dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente,
de forma que se evitara la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 2
(tal como se especifica en la Tabla 8 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y del
bazo se prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente
en el ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1 y 2.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 8.
Ejemplo
12
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 9.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich) y sus formulaciones del
adyuvante se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 6, exponiéndose a continuación las concentraciones del
adyuvante PAA-907 en la
Tabla 9.
Tabla 9.
PAA-934PH
(CARBOPOL-934PH; BFGoodrich) y sus formulaciones del
adyuvante, y Al(OH)_{3} (SUPERFOS) y sus
formulaciones del adyuvante, se prepararon todos tal como se
describe anteriormente en el Ejemplo 9, que presentan las
concentraciones del adyuvante PAA-934PH o del
adyuvante Al(OH)_{3} exponiéndose a continuación las
concentraciones de dichos respectivos adyuvantes en la Tabla 9.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron sesenta ratones hembra (NMRI,
Charles River, Alemania), y se dividieron en diez grupos de seis
animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
diez grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo 1
y Grupo 2), se administraron dosis respectivas de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los ocho grupos
restantes (Grupos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10)) se inmunizaron entonces
intranasalmente con dosis respectivas de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica y 20 \mul de una formulación
particular del adyuvante), tal como se especifica seguidamente en
la Tabla 9, haciendo gotear 20 \mul de una formulación vacunal
particular en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la solución de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1 y del Grupo
2), o las formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los
animales de los grupos 3-10), se repitió en el día
14 con idéntica mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se
describe anteriormente para el día 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales de los 5
grupos (Grupos 1, 3, 5, 7 y 9), se narcotizaron otra vez con éter,
recuperándose la mayor cantidad de sangre posible de cada uno de sus
plexos venosos.
Los animales de estos cinco grupos (Grupos 1, 3,
5, 7 y 9) se sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y
sus pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara
la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 3
(tal como se especifica en la Tabla 9 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y del
bazo se prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente
en el ejemplo 4.
En el día 28 (semana 4), los animales de estos
cinco grupos (Grupos 2, 4, 6, 8 y 10) se sacrificaron entonces
mediante dislocación cervical y sus pulmones se extrajeron
cuidadosamente, de forma que se evitara la entrada de sangre en
ellos.
Los animales de estos cinco grupos (Grupos 2, 4,
6, 8 y 10) se sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y
sus pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara
la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 2 y 4
(tal como se especifica en la Tabla 9 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares pulmonares de dos muestras
de los Grupos 6 y 8.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1-4.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 9.
Ejemplo
13
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que tienen las concentraciones que se exponen a
continuación en la Tabla 10.
PAA-907
(CARBOPOL-907; BFGoodrich) y sus formulaciones del
adyuvante se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 6, exponiéndose a continuación las concentraciones del
adyuvante PAA-907 en la Tabla 10.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron ochenta y cuatro ratones hembra
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en catorce grupos
de seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
catorce grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de dos grupos (Grupo
1 y Grupo 2), se administraron dosis respectivas de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los dieciseís grupos
restantes (Grupos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 y 14), se
inmunizaron entonces intranasalmente con dosis respectivas de 40
\mul de las formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante
que contenían 20 \mul de la solución antigénica y 20 \mul de una
formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 10, haciendo gotear 20 \mul de la mezcla
en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la solución de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1 y del Grupo
2), o las formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los
animales de los grupos 3-14), se repitió en el día
14 con idéntica mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se
describe anteriormente para el día 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales de los 5
grupos (Grupos 1, 3, 5, 7, 9, 11 y 13), se narcotizaron otra vez
con éter, recuperándose la mayor cantidad de sangre posible de cada
uno de sus plexos venosos.
Los animales de estos siete grupos (Grupos 1, 3,
5, 7, 9, 11 y 13) se sacrificaron entonces mediante dislocación
cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que
se evitara la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 3
(tal como se especifica en la Tabla 10 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 4.
En el día 28 (semana 4), los animales de los
otros siete grupos (Grupos 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 14), se narcotizaron
otra vez con éter y se recuperó tanta sangre como fue posible de
cada uno de sus plexos venosos.
Los animales de estos siete grupos (Grupos 2,
4, 6, 8, 10, 12 y 14), se sacrificaron entonces mediante dislocación
cervical y sus pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que
se evitara la entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 2 y 4
(tal como se especifica en la Tabla 10 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares pulmonares de dos muestras
de los Grupos 10 y 12.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de tres
muestras de los Grupos 1-4.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 10.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Ejemplo
14
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se ha descrito
antes en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de adyuvantes
que presentan las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA que se muestran a continuación en la Tabla
11.
Se preparó una formulación
sulfolipo-ciclodextrin/escualeno/agua
(SL-CD/escualeno/agua) del adyuvante, tal como se
describe anteriormente en el Ejemplo 5, que presenta las
concentraciones del adyuvante (SL-CD/escualeno/agua)
que se exponen seguidamente en la Tabla 11.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la Enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron 72 ratones hembra (NMRI, Charles
River, Alemania), y se dividieron en doce grupos de seis animales
cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
cuatro grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de cuatro grupos
(Grupo 1, Grupo 2, Grupo 3 y Grupo 4), se administraron entonces
dosis respectivas de 40 \mul que contenían una mezcla de
20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento del NDV
puro y 20 \mul del tampón fosfato (pH = 7,5) (anteriormente
descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta mezcla en cada
orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los ocho grupos
restantes (Grupos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12) se inmunizaron
entonces intranasalmente con dosis respectivas de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento y 20 \mul de
una formulación particular del adyuvante), tal como se especifica
seguidamente en la Tabla 11, haciendo gotear 20 \mul de una
formulación vacunal particular en cada orificio nasal de cada
animal.
La administración de la solución antigénica de
almacenamiento del NDV puro (a los animales de los Grupos
1-4), o las formulaciones vacunales
antígeno/adyuvante (a los animales de los grupos
5-12), se repitió en el día 14 con idéntica mezcla
y utilizando el mismo protocolo que el que se describe anteriormente
para el día 0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales de 3 de
los grupos (Grupos 1, 5 y 9), se narcotizaron otra vez con éter,
recuperándose la mayor cantidad de sangre posible de cada uno de sus
plexos venosos.
Los animales de estos tres grupos (Grupos 1, 5 y
9) se sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus
pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la
entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales del Grupo 1 y del
Grupo 5 (tal como se especifica en la Tabla 11 a continuación), sus
bazos también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 4.
En el día 28 (semana 4), los animales de los
otros tres grupos (Grupos 2, 6, y 10), se narcotizaron otra vez con
éter y se recuperó tanta sangre como fue posible de cada uno de sus
plexos venosos.
Los animales de estos tres grupos (Grupos 2, 6 y
10), se sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus
pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la
entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 2 y 6
(tal como se especifica en la Tabla 11 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 4.
En el día 35 (semana 5), los animales de los
otros tres grupos (Grupos 3, 7 y 11), se narcotizaron otra vez con
éter y se recuperó tanta sangre como fue posible de cada uno de sus
plexos venosos.
Los animales de estos tres grupos (Grupos 3, 7 y
11), se sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus
pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la
entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 3 y 7
(tal como se especifica en la Tabla 11 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 4.
En el día 49 (semana 7), los animales de los
otros tres grupos (Grupos 4, 8, y 12), se narcotizaron otra vez con
éter y se recuperó tanta sangre como fue posible de cada uno de sus
plexos venosos.
Los animales de estos tres grupos (Grupos 4, 8 y
12), se sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus
pulmones se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la
entrada de sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 4 y 9
(tal como se especifica en la Tabla 11 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 4.
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de tres
muestras de los Grupos 1-8.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 11.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
15
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se ha descrito
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se ha descrito
antes en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de adyuvantes
que presentan las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA que se muestran a continuación en la Tabla
12.
Se preparó una formulación
sulfolipo-ciclodextrin/escualeno/agua
(SL-CD/escualeno/agua) del adyuvante, tal como se
describe anteriormente en el Ejemplo 5, que presenta las
concentraciones del adyuvante (SL-CD/escualeno/agua)
que se exponen seguidamente en la Tabla 12.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la Enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron 18 ratones hembra (NMRI, Charles
River, Alemania), y se dividieron en tres grupos de seis animales
cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
cuatro grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron entonces dosis respectivas de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de NDV puro y 20 \mul del tampón fosfato (pH =
7,5) (anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta
mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los dos grupos
restantes (Grupos 2 y 3) se inmunizaron entonces intranasalmente
con dosis respectivas de 40 \mul de las formulaciones vacunales
(mezclas antígeno/adyuvante que contenían 20 \mul de la solución
antigénica de almacenamiento y 20 \mul de una formulación
particular del adyuvante), tal como se especifica seguidamente en
la Tabla 12, haciendo gotear 20 \mul de una formulación vacunal
particular en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la solución antigénica de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2 y 3), se repitió en el día 21 con idéntica mezcla y
utilizando el mismo protocolo que el que se describe anteriormente
para el día 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
En el día 42 (semana 6), los animales de los 3
grupos (Grupos se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la
mayor cantidad de sangre posible de cada uno de sus plexos
venosos.
Los animales de estos tres grupos se
sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus pulmones
se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la entrada de
sangre en ellos.
En el caso de los animales del Grupo 1 y del
Grupo 2 (tal como se especifica en la Tabla 12 a continuación), sus
bazos también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y de
los bazos se prepararon entonces tal como se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 4.
\newpage
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
del Grupo 1.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1 y 2.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 12.
Ejemplo
16
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar las formulaciones de
adyuvantes que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 13.
CTB y sus formulaciones del adyuvante se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4, que
tienen las concentraciones del adyuvante CTB que se exponen a
continuación en la Tabla 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron dieciocho ratones hembra (NMRI,
Charles River, Alemania), y se dividieron en tres grupos de seis
animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
siete grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales de un grupo (Grupo
1), se administraron dosis respectivas de 40 \mul que contenían
una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento
de NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH = 7,5)
(anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta mezcla
en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los dos grupos
restantes (Grupos 2 y 3) se inmunizaron entonces intranasalmente
con dosis respectivas de 40 \mul de las formulaciones vacunales
(mezclas antígeno/adyuvante que contenían 20 \mul de la solución
antigénica de almacenamiento y 20 \mul de una formulación
particular del adyuvante), tal como se especifica seguidamente en
la Tabla 13, haciendo gotear 20 \mul de una formulación vacunal
particular en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la solución de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los
grupos 2 y 3), se repitió en el día 21 con idéntica mezcla y
utilizando el mismo protocolo que el que se describe anteriormente
para el día 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
En el día 42 (semana 6), los animales de los
tres grupos se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la
mayor cantidad de sangre posible de cada uno de sus plexos
venosos.
Los animales de estos tres grupos se
sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus pulmones
se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la entrada de
sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 2
(tal como se especifica en la Tabla 13 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y del
bazo se prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente
en el ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1 y 2.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 13.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
17
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar sus formulaciones de
adyuvante, que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA que se exponen en la Tabla 14.
Los liposomas y sus formulaciones de adyuvante
se prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 9,
que poseen las concentraciones del adyuvante liposoma que se exponen
a continuación en le Tabla 14.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 4.
Parte
3
Se obtuvieron dieciocho ratones hembra (NMRI,
Charles River, Alemania), y se dividieron en tres grupos de seis
animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
tres grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales del Grupo 1, se
administraron respectivamente dosis de 40 \mul que contenían una
mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento de
NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH = 7,5)
(anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta mezcla
en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales de los dos grupos
restantes (Grupos 2 y 3,) se inmunizaron entonces intranasalmente
con dosis respectivas de 40 \mul de las formulaciones vacunales
(mezclas antígeno/adyuvante que contenían 20 \mul de la solución
antigénica de almacenamiento y 20 \mul de una solución particular
del adyuvante), tal como se especifica seguidamente en la Tabla 14,
haciendo gotear 20 \mul de la mezcla en cada orificio nasal de
cada animal.
La administración de la solución de
almacenamiento del NDV puro (a los animales del Grupo 1), o las
formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los animales del
Grupo 2 y del Grupo 3), se repitió en el día 14 con idéntica mezcla
y utilizando el mismo protocolo que el que se describe anteriormente
para el día 0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales de los
tres grupos se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la
mayor cantidad de sangre posible de cada uno de sus plexos
venosos.
Los animales de estos tres grupos se
sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus pulmones
se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la entrada de
sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 2
(tal como se especifica en la Tabla 14 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y del
bazo se prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente
en el Ejemplo 4.
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4,
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1 y 2.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 14.
Ejemplo
18
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar sus formulaciones del
adyuvante, que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 15.
Las formulaciones del adyuvante
PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich)
se prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 6,
exponiéndose a continuación las concentraciones del adyuvante
PAA-907 en la Tabla 15.
Las formulaciones del adyuvante
PAA-934PH (CARBOPOL-934PH;
BFGoodrich) y las formulaciones del adyuvante
Al(OH)_{3} (SUPERFOS) se prepararon tal como se
describe anteriormente en el Ejemplo 9, exponiéndose a continuación
las concentraciones de dichos respectivos adyuvantes en la Tabla
15.
CTB y sus formulaciones del adyuvante se
prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4,
exponiéndose a continuación las concentraciones del adyuvante CTB
en la Tabla 15.
Los liposomas y sus formulaciones adyuvantes se
prepararon tal como se describe anteriormente en el ejemplo 9,
exponiéndose a continuación las concentraciones del adyuvante
liposómico en la Tabla 15.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
Se obtuvo una cepa MRC-11
purificada del virus inactivado de la gripe (SOLVAY DUPHAR), Weesp,
The Netherlands),y se hizo crecer en huevos embrionarios y se
purificó en gradiente de sacarosa, inactivándose mediante incubación
con la \beta-propiolactona al 0,05% (vol/vol),
más timerosal al 0,01% (peso/vol) durante 4 días a 4ºC y a
continuación durante 3 días a temperatura ambiente tal como se
describe en Vaccine 12, 653-660 (1994).
Se preparó entonces una solución antigénica de
almacenamiento a partir del MRC-11 inactivado que
contenía 50 \mug de la hemoaglutinina de la cepa
MRC-11 del virus inactivado y purificado de la
gripe, por ml de solución de tampón fosfato (pH = 7,5).
La formulación vacunal que iba a utilizarse se
obtuvo entonces mezclando un volumen de solución antigénica con un
volumen de la solución del adyuvante.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron treinta y seis ratones hembras
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en seis grupos de
seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
seis grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales del grupo (Grupo 1),
se administraron entonces dosis respectivas de 40 \mul que
contenían una mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de
almacenamiento de la MRC-11 pura, tal como se ha
descrito anteriormente, y 20 \mul de la solución de tampón fosfato
(pH = 7,5) haciendo gotear 20 \mul de esta mezcla en cada
orificio nasal de cada animal.
A cada uno de los animales de los cinco grupos
restantes (Grupos 2-6), se inmunizó entonces
intranasalmente con dosis respectivas de 40 \mul de las
formulaciones vacunales (mezclas antígeno/adyuvante que contenían
20 \mul de la solución antigénica y 20\mul de una solución
particular del adyuvante), tal como se especifica a continuación en
la Tabla 15 (las cuales formulaciones vacunales se obtuvieron tal
como se ha descrito anteriormente), haciendo gotear 20 \mul de
esta solución en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la solución antigénica de
almacenamiento del MRC-11 puro (a los animales del
Grupo 1), o las formulaciones vacunales antígeno/adyuvante (a los
animales de los Grupos 2-6), se repitió en el día
14 con idéntica mezcla y utilizando el mismo protocolo que el que se
describe anteriormente para el día 0.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales de los
seis grupos se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la
mayor cantidad de sangre posible de cada uno de sus plexos
venosos.
Los animales de estos seis grupos se
sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus pulmones
se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la entrada de
sangre en ellos.
En el caso de los animales de los Grupos 1 y 2
(tal como se especifica en la Tabla 15 a continuación), sus bazos
también se extrajeron.
Las suspensiones celulares de los pulmones y del
bazo se prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente
en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares pulmonares de dos muestras
de los Grupos 1 y que, para el ELISPOT, las placas se recubrieron
con 25 \mul de la cepa MRC-11 inactivada y
purificada del virus de la gripe por ml de tampón de
recubrimiento.
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares esplénicas se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que sólo se
determinó el número de células productoras de IgA específica
antigénica en las suspensiones celulares esplénicas de dos muestras
de los Grupos 1 y 2, y que, para el ELISPOT, las placas se
recubrieron con 25 \mul de la cepa MRC-11
inactivada y purificada del virus de la gripe por ml de tampón de
recubrimiento.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 15.
Ejemplo
19
Parte
1
El éster butilo del ácido poliacrílico
(BUTIL-PAA), sintetizado tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 2, se preparó tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4 para formar sus formulaciones del
adyuvante, que poseen las concentraciones del adyuvante
Butil-PAA, tal como se expone en la Tabla 16.
Las formulaciones del adyuvante
PAA-907 (CARBOPOL-907; BFGoodrich)
se prepararon tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 6,
exponiéndose a continuación las concentraciones del adyuvante
PAA-907 en la Tabla 16.
Parte
2
La solución antigénica de almacenamiento del
Virus de la enfermedad de Newcastle y las diversas formulaciones
vacunales, se prepararon tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 4.
La albúmina sérica bovina (BSA) (procedente de
la fracción V de BSA, SIGMA), se preparó disolviendo en PBS hasta
una concentración final de 500 \mug/ml.
Parte
3
Se obtuvieron treinta y seis ratones hembra
(NMRI, Charles River, Alemania), y se dividieron en seis grupos de
seis animales cada uno.
En el día 0, los animales de cada uno de los
tres grupos se narcotizaron ligeramente con éter.
A cada uno de los animales del Grupo 1, se
administraron e dosis respectivas de 40 \mul que contenían una
mezcla de 20 \mul de la solución antigénica de almacenamiento de
NDV puro y de 20 \mul del tampón fosfato (pH = 7,5)
(anteriormente descrito), haciendo gotear 20 \mul de esta mezcla
en cada orificio nasal de cada animal.
Cada uno de los animales del Grupo 4 se
inmunizaron entonces con dosis respectivas de 40 \mul de la
solución antigénica de almacenamiento de BSA, haciendo gotear 20
\mul de dicha mezcla antigénica en cada orificio nasal.
A cada uno de los animales de los cuatro grupos
restantes (Grupos 2, 3, 5 y 6), se inmunizaron entonces
intranasalmente con d 40 \mul de las formulaciones vacunales
(mezclas antígeno/adyuvante que contenían 20 \mul de una solución
antigénica y 20\mul de una solución particular del adyuvante), tal
como se especifica a continuación en la Tabla 16 haciendo gotear 20
\mul de la mezcla en cada orificio nasal de cada animal.
La administración de la formulación vacunal pura
(a los animales del Grupo 1 y del Grupo 4), o de las formulaciones
vacunales antígeno/adyuvante (a los animales de los Grupos 2, 3, 5 y
6), se repitió en el día 14 con idéntica mezcla y utilizando el
mismo protocolo que el que se describe anteriormente para el día
0.
Parte
4
En el día 21 (semana 3), los animales de los
seis grupos se narcotizaron otra vez con éter, recuperándose la
mayor cantidad de sangre posible de cada uno de sus plexos
venosos.
Los animales de estos seis grupos se
sacrificaron entonces mediante dislocación cervical y sus pulmones
se extrajeron cuidadosamente, de forma que se evitara la entrada de
sangre en ellos.
Las suspensiones celulares de los pulmones se
prepararon entonces tal como se ha descrito anteriormente en el
ejemplo 4.
Parte
5
La determinación del número de células
productoras de IgA específica antigénica en las suspensiones
celulares pulmonares se llevó a cabo tal como se describe
anteriormente en el Ejemplo 4, con la excepción de que para el
ELISPOT para los animales de los Grupos 4, 5 y 6, las placas se
recubrieron con 25 \mul de BSA por ml de tampón de
revestimiento.
Los resultados de dichos cálculos se exponen a
continuación en la Tabla 16.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
20
Se sintetizaron dos copolímeros
p(A-c-AMPS), tal como se ha
descrito por Iliopoulos y Audebert en Macromolecules 24,
2566-2575 (1991). Brevemente, el ácido monoacrílico
(AA; Merck) y el ácido acrilamidometilpropanosulfónico) (AMPS;
Merck), se disolvieron en agua ultrapura, ajustándose el pH a 7,4
con una solución de 10 NaOH y se añadió agua ultrapura hasta una
concentración final total monomérica de 2 M. El aire se eliminó de
la solución haciendo pasar ésta a través de nitrógeno durante por
lo menos 20 minutos. (NH_{4)}2 S_{2} O_{8} y
Na_{2}S_{2}O_{5} se añadieron a concentraciones finales de
1,46 mM y 2,912 mM, respectivamente.La mezcla se incubó durante
2,25h a 24ºC o 3h a 20ºC bajo nitrógeno y agitación continua.
Después de la incubación, se añadió un exceso de metanol y la
mezcla se mantuvo durante la noche a temperatura ambiental. El
precipitado formado se recuperó en una solución de 9 g de NaCl por
litro de agua ultrapura y se dializó (Spectro/Por; MWCO
12000-14000 D) a 4ºC hasta que no se detectaron
monómeros en el filtrado (Absorbancia a 210 nm<0,1 unidades de
absorción), dializándose entonces (Spectro/Por; MWCO
12000-14000 D) contra agua ultrapura. La sustancia
retenida se liofilizó y los copolímeros se recuperaron como polvo y
se guardaron a temperatura ambiente hasta su utilización. El peso
molecular de los polímeros se determinó mediante cromatografíae
penetración en gel en una columna Sephacryl S400 (Pharmacia,
Suecia), utilizando polímeros de poliacrilato con pesos moleculares
de 5, 90, 450, 750, 1.000 y 3.000 kD (Aldrich) como estándares y
absorbancia a 210 nm como sistema de detección. El porcentaje del
monómero AMPS en el copolímero obtenido, se determinó mediante
análisis elemental. Detalles del procedimiento de preparación de
los copolímeros y de los copolímeros obtenidos se exponen a
continuación en la Tabla 17.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
21
Se sintetizó un copolímero
p(A-c-VS), tal como se ha
descrito anteriormente para
p(A-c-AMPS) en el ejemplo
20. Brevemente, el ácido monoacrílico (AA; Merck) y la sal sódica
del ácido vinilsulfónico (VS; Fluka), se disolvieron en agua
ultrapura, ajustándose el pH a 7,4 con una solución de 10 N NaOH,
añadiéndose agua ultrapura hasta una concentración total monomérica
de 2 M. El aire se eliminó saturando la solución con nitrógeno.
(NH_{4})_{2}S_{2}O_{8} y Na_{2}S_{2}O_{5} se
añadieron a concentraciones finales de 1,46 mM y 2,91 mM,
respectivamente. La mezcla se incubó durante 6h a 19ºC y agitación
continua. Después de la incubación, se añadió un exceso de metanol
y la mezcla se mantuvo durante la noche a temperatura ambiental. El
precipitado formado se recuperó en una solución de 9 g de NaCl por
l de agua ultrapura y se dializó (Spectro/Por; MWCO
12000-14000 D) a 4ºC hasta que no se detectaron
monómeros en el filtrado (Absorbancia a 210 nm<0,1
unidades de absorción), dializándose entonces (Spectro/Por; MWCO
12000-14000 D) contra agua ultrapura. La sustancia
retenida se liofilizó y los copolímeros se recuperaron como polvo y
se guardaron a temperatura ambiente hasta su utilización. El peso
molecular de los polímeros se determinó mediante cromatografía de
penetración en gel en una columna Sephacryl S400 (Pharmacia,
Suecia), utilizando polímeros de poliacrilato con pesos moleculares
de 5, 90, 450, 750, 1.000 y 3.000 kD (Aldrich) como estándares y
absorbancia a 210 nm como sistema de detección. El porcentaje del
monómero VS en el copolímero obtenido, se determinó mediante
análisis elemental. Detalles del procedimiento de preparación de
los copolímeros y del copolímero obtenido se exponen a continuación
en la Tabla 18.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
22
Se sintetizaron los copolímeros
p(A-c-VBS), tal como se ha
descrito anteriormente para
p(A-c-AMPS) en el ejemplo
20. Brevemente, el ácido monoacrílico (AA) y la sal sódica del ácido
vinilbencenosulfónico (VBS), se disolvieron en agua ultrapura,
ajustándose el pH a 7,4 con una solución de 10 N NaOH, añadiéndose
agua ultrapura hasta una concentración total monomérica de 2 M. Las
soluciones de los dos monómeros se saturaron con nitrógeno durante
por lo menos 20 minutos. (NH_{4})_{2}S_{2}O_{8} y
Na_{2}S_{2}O_{5} se añadieron a concentraciones finales de
1,46 mM y 2,91 mM, respectivamente. La mezcla se incubó durante 6h o
24h a 20ºC bajo nitrógeno y agitación continua de la solución.
Después de la incubación, se añadió un exceso de metanol y las
mezclas se mantuvieron durante la noche a temperatura ambiental.
Los precipitados formados se recuperaron en una solución de 9 g de
NaCl por l de agua ultrapura y se dializó (Spectro/Por; MWCO
12.000-14.000 D) a 4ºC hasta que no se detectaron
monómeros en el filtrado (Absorbancia a 210 nm<0,1 unidades de
absorción), dializándose entonces (Spectro/Por; MWCO
12.000-14.000 D) contra agua ultrapura. La sustancia
retenida se liofilizó y los copolímeros se recuperaron como polvo y
se guardaron a temperatura ambiente hasta que se utilizaron. El peso
molecular de los polímeros se determinó mediante cromatografía de
penetración en gel en una columna Sephacryl S400 (Pharmacia,
Suecia), utilizando polímeros de poliacrilato con pesos moleculares
de 5, 90, 450, 750, 1.000 y 3.000 kD (Aldrich) como estándares y
una absorbancia a 210 nm como sistema de detección. El porcentaje
del monómero VBS en el copolímero obtenido, se determinó mediante
análisis elemental. Los detalles del procedimiento de preparación
de los copolímeros y de los copolímeros obtenidos se exponen a
continuación en la Tabla 19.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
23
Los copolímeros nº 10 a nº 18
p(A-c-VBS) se sintetizaron
tal como se ha descrito anteriormente para
p(A-c-VBS) en el Ejemplo 22,
con la excepción de que el tiempo de incubación estaba entre 24 y
168 horas, y la temperatura de incubación fue de 37ºC recuperándose
los copolímeros mediante filtración sobre 100 kD
(UFP-100-E6, AG Filtration) y 10 kD
(UFP-10-E6, AGF Filtration), dando
lugar a dos fracciones de polímeros con pesos moleculares > 100
kD y 10-100 kD. Los polímeros se sometieron a
liofilización y se guardaron a temperatura ambiente hasta que se
utilizaron. Los detalles de los copolímeros y su procedimiento de
preparación se muestran en la Tabla 20.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
24
Parte
1
(BUTIL-PAA),
p(A-c-VS) y
p(A-c-VBS) se sintetizaron y
prepararon tal como se describe anteriormente en los Ejemplos 2, 21
y 22 para formar las formulaciones del adyuvante, que poseen las
concentraciones que se exponen a continuación en la Tabla 21.
El sulfonato de poliestireno con un peso
molecular de 6000 kD (PSS, Polysience Inc), se disolvió en solución
tampón de fosfato (pH = 5) para formar la formulación del adyuvante
que tiene la concentración del polímero que se muestra a
continuación en la Tabla 21.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
Las diversas formulaciones vacunales que se
especifican a continuación en la Tabla 21, se prepararon tal como
se describen anteriormente en el Ejemplo 4. La solución tampón de
fosfato (pH = 7,5), preparada tal como se describe en el Ejemplo
4, se utilizó como control en el experimento que se describe a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron treinta ratones hembra (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en cinco grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 21, según la metodología que se describe en el Ejemplo
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
Tal como se describe en el Ejemplo 4
Los resultados se exponen a continuación en la
Tabla 21.
Ejemplo
25
El ejemplo 24 se repitió y los resultados se
expresan a continuación en la Tabla 22.
Ejemplo
26
Parte
1
p(A-c-AMPS)
sintetizado tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 20, se
disolvió en solución de tampón fosfato (pH = 7,5) para formar las
formulaciones del adyuvante, que se exponen a continuación en la
Tabla 23.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
Preparación antigénica A/Porcina: la cepa
A/Porcina del virus de la gripe se hizo crecer en huevos
embrionarios y se purificó mediante centrifugación en gradiente de
sacarosa, inactivándose mediante incubación con la
\beta-propiolactona al 0,05% (vol/vol) más
timerosal al 0,01% (peso/vol) durante 4 días a 4ºC y a continuación
durante 3 días a temperatura ambiente tal como se describe en
Vaccine 12, 653-660 (1994). Se preparó entonces una
solución antigénica de almacenamiento de 250 \mug HA por ml. Las
diversas formulaciones de vacunas, que se especifican a
continuación en la Tabla 23, se prepararon entonces mezclando un
volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante, preparadas
tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de la solución
de almacenamiento del antígeno A/Porcino. La solución tampón de
fosfato (pH = 7,5) preparada tal como se muestra en
el Ejemplo 4, se utilizó como un control en el experimento que se
menciona a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron treinta y seis ratones hembras
(BALB/c, Charles River, Alemania), y se dividieron en seis grupos
de seis animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se
exponen en la Tabla 23, según la metodología que se describe en el
Ejemplo 4.
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Porcina de la gripe por ml de
tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se muestran seguidamente en la
Tabla 23.
Ejemplo
27
Parte
1
Butil-PAA,
p(A-c-VBS) y PSS se
obtuvieron tal como se describe anteriormente en los Ejemplos 4, 22
y 24, respectivamente.
El dextransulfato con un peso molecular de 500
kD (DXS: Pharmacia, Suecia), se disolvió en solución tampón fosfato
(pH = 7,5) para formar la formulación del adyuvante que posee la
concentración del polímero que se muestra en la Tabla 24.
Parte
2
La solución antigénica A/Porcina preparada tal
como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 26, se ajustó a
concentraciones finales de 50 \mug HA por ml.
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 24, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento del antígeno A/Porcino descrita
anteriormente. La solución tampón de fosfato (pH =7,5) preparada
tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como un control en
el experimento que se menciona a continuación.
Parte
3
Se obtuvieron treinta y seis ratones hembras
(BALB/c, Charles River, Alemania), y se dividieron en seis grupos
de seis animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se
muestran en la Tabla 21, según la metodología que se describe en el
Ejemplo 4.
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Porcina de la gripe por ml
del tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se muestran seguidamente en la
Tabla 24.
Ejemplo
28
Parte
1
Butil-PAA se sintetizó y preparó
tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4 para formar la
formulación del adyuvante que posee la concentración de
BUTIL-PAA que se muestra en la Tabla 25.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
La solución antigénica A/Porcina preparada tal
como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 26, se ajustó a
concentraciones finales de 50,150 y 500 \mug HA por ml. Las
diversas formulaciones de vacunas, que se especifican a
continuación en la Tabla 25, se prepararon entonces mezclando un
volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante, preparadas
tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de la solución
de almacenamiento del antígeno A/Porcino descrita anteriormente. La
solución tampón de fosfato (pH = 7,5) preparada tal como se muestra
en el Ejemplo 4, se utilizó como un control en el experimento que se
menciona a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron treinta y seis ratones hembras
(BALB/c, Charles River, Alemania), y se dividieron en seis grupos
de seis animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se
muestran en la Tabla 25, según la metodología general que se
describe en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que las placas se recubrieron con 50 \mug
de la cepa A/Porcina de la gripe por ml del tampón de revestimiento
que se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se muestran seguidamente en la
Tabla 25.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
29
Parte
1
BUTIL-PAA se sintetizó y preparó
tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4 para formar la
formulación del adyuvante que posee las diversas concentraciones
que se muestran en la Tabla 26.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 26, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento del antígeno A/Porcino descrita
anteriormente en el Ejemplo 26. La solución tampón de fosfato (pH =
7,5) preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como
un control en el experimento que se menciona a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron 24 ratones hembras (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en cuatro grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 26, según la metodología general.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT, las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Porcina de la gripe por ml
del tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se muestran seguidamente en la Tabla 26.
Ejemplo
30
Parte
1
BUTIL-PAA se sintetizó y preparó
tal como se describe anteriormente en el Ejemplo 4 para formar la
formulación del adyuvante que posee las diversas concentraciones
que se muestran en la Tabla 27. La preparación antigénica A/Texas:
cepa A/Texas (Texas) del virus de la gripe se hizo crecer en huevos
embrionarios y se purificó mediante centrifugación en gradiente de
sacarosa, inactivándose mediante incubación con la
\beta-propiolactona al 0,05% (vol/vol) más
timerosal al 0,01% (peso/vol) durante 4 días a 4ºC y a continuación
durante 3 días a temperatura ambiente, tal como se describe en
Vaccine 12, 653-660 (1994). Se aislaron subunidades
hemaglutinina/neuraminidasa (HA/NA)del virus a partir de
éste, utilizando detergente(s). Se preparó entonces una
solución antigénica de almacenamiento de 250 \mug HA por ml.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 27, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento del antígeno A/Texas preparada tal
como se ha descrito anteriormente. La solución tampón de fosfato
(pH = 7,5) preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó
como un control en el experimento que se menciona a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron 12 ratones hembras (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en dos grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 27, según la metodología general del Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el ejemplo
4, con la excepción de que para el ELISPOT, las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Texas de la gripe por ml del
tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se muestran seguidamente en la Tabla 27.
Ejemplo
31
El experimento del Ejemplo 30 se repitió y los
resultados se muestran seguidamente en la Tabla 28.
Ejemplo
32
Parte
1
BUTIL-PAA y
p(A-c-VS) se sintetizaron tal
como se describe anteriormente en los Ejemplos 4 y 21
respectivamente y se disolvieron en solución tampón fosfato (pH =
7,5) para formar la formulación del adyuvante que tiene las
diversas concentraciones que se muestran en la Tabla 29.
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 29, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución antigénica de almacenamiento A/Texas preparada tal como
se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 30.
La solución tampón de fosfato (pH = 7,5)
preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como un
control en el experimento que se menciona a continuación.
Parte
3
Se obtuvieron 24 ratones hembras (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en cuatro grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 29, según la metodología general del Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT, las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Texas de la gripe por ml del
tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se muestran seguidamente en la Tabla 29.
Ejemplo
33
Parte
1
Se repitió el Ejemplo 32 con dos formulaciones
del adyuvante copolímero
p(A-c-VBS). Los resultados
se muestran seguidamente en la Tabla 30.
\newpage
Ejemplo
34
Parte
1
Butil-PAA,
p(A-c-VBS), PSS y DXS se
sintetizaron tal como se describe anteriormente en los Ejemplos 4,
22 y 24 y 27 respectivamente para formar los adyuvantes que tienen
las concentraciones que se exponen a continuación en la Tabla
31.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 30, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento del antígeno A/Texas descrita
anteriormente en el Ejemplo 30. La solución tampón de fosfato (pH =
7,5) preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como
un control en el experimento que se menciona a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron 24 ratones hembras (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en cuatro grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 31, según la metodología que se describe en el Ejemplo
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
Tal como se describe en el Ejemplo 4, con la
excepción de que, para el ELISPOT las placas se recubrieron con 50
\mug de la cepa A/Texas de la gripe por ml del tampón de
revestimiento que se describe en el Ejemplo 4.
Los resultados se exponen a continuación en la
Tabla 31.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
35
Parte
1
BUTIL-PAA y los copolímeros
p(A-c-VBS) se sintetizaron
tal como se describe anteriormente en los Ejemplos 4 y 23, para
formar las formulaciones de adyuvantes que tienen las
concentraciones que se exponen a continuación en la Tabla 32.
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 32, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento del antígeno A/Texas descrita
anteriormente en el Ejemplo 30. La solución tampón de fosfato (pH =
7,5) preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como
un control en el experimento que se menciona a continuación.
Parte
3
Se obtuvieron 48 ratones hembras (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en 6 grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 32, según la metodología que se describe en el Ejemplo
4.
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Texas de la gripe por ml del
tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se exponen a continuación en la Tabla 32.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
36
Parte
1
BUTIL-PAA y los copolímeros
p(A-c-VBS) se sintetizaron
tal como se describe anteriormente en los Ejemplos 4 y 23, para
formar las formulaciones de adyuvantes que tienen las
concentraciones que se exponen a continuación en la Tabla 33.
Las dos fracciones con peso molecular de
10-100 y > a 100 kD de los copolímeros nº12, nº13
y nº16 p(A-c-VBS)
sintetizados y purificados tal como se describe anteriormente en el
Ejemplo 23, se disolvieron en solución tampón de fosfato (pH =
7,5) para formar la formulación del adyuvante que tiene la
concentración del adyuvante
p(A-c-VBS) que se expone a
continuación en la Tabla 33.
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 33, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento del antígeno A/Texas descrita
anteriormente en el Ejemplo 30. La solución tampón de fosfato (pH =
7,5) preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como
un control en el experimento que se menciona a continuación.
Parte
3
Se obtuvieron cuarenta y ocho ratones hembras
(BALB/c, Charles River, Alemania), y se dividieron en seis grupos
de seis animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se
muestran en la Tabla 33, según la metodología que se describe en el
Ejemplo 4.
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Texas de la gripe por ml del
tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se exponen a continuación en la Tabla 33.
Ejemplo
37
Parte
1
Butil-PAA y el copolímero nº5
p(A-c-VBS) se sintetizaron y
prepararon tal como se describe anteriormente en los Ejemplos 4 y
22, para formar las formulaciones de adyuvantes que tienen las
concentraciones que se exponen a continuación en la Tabla 34.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 34, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento del antígeno A/Texas descrita
anteriormente en el Ejemplo 30. La solución tampón de fosfato (pH =
7,5) preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como
un control en el experimento que se menciona a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
3
Se obtuvieron 18 ratones hembras (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en tres grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 34, según la metodología que se describe en el Ejemplo
4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
\vskip1.000000\baselineskip
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Texas de la gripe por ml del
tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se exponen a continuación en la Tabla 34.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Ejemplo
38
Parte
1
Butil-PAA, sintetizado tal como
se describe anteriormente en el Ejemplo 4, se disolvió en una
solución tampón fosfato (pH = 7,5) para formar la formulación del
adyuvante que se muestra a continuación en la Tabla 35.
CTB se disolvió en solución tampón de fosfato
(pH = 7,5), para formar la formulación del adyuvante que tiene la
concentración de CTB que se muestra a continuación en la Tabla
34.
Parte
2
Las diversas formulaciones de vacunas, que se
especifican a continuación en la Tabla 35, se prepararon entonces
mezclando un volumen de las respectivas formulaciones del adyuvante,
preparadas tal como se ha descrito anteriormente, con un volumen de
la solución de almacenamiento. La solución tampón de fosfato (pH =
7,5) preparada tal como se muestra en el Ejemplo 4, se utilizó como
un control en el experimento que se menciona a continuación.
Parte
3
Se obtuvieron 18 ratones hembras (BALB/c,
Charles River, Alemania), y se dividieron en tres grupos de seis
animales cada uno, y se trataron con las vacunas que se muestran en
la Tabla 35, según la metodología que se describe en el Ejemplo
4.
Parte
4
Tal como se describe en el Ejemplo 4.
Parte
5
Tal como se describe anteriormente en el Ejemplo
4, con la excepción de que, para el ELISPOT las placas se
recubrieron con 50 \mug de la cepa A/Texas de la gripe por ml del
tampón de revestimiento que se describe en el Ejemplo 4. Los
resultados se exponen a continuación en la Tabla 35.
Claims (3)
1. Utilización de un polímero polianiónico
soluble en agua para la preparación de un adyuvante mucoso para la
inducción o la potenciación de respuestas inmunes mucosas a los
antígenos, estando formado el polímero polianiónico por dos
unidades constitutivas repetitivas aniónicas distintas, siendo una
unidad ácido acrílico y seleccionando la otra de entre el ácido
vinilsulfónico y el ácido acrilamidometilpropansulfónico.
2. Utilización según la reivindicación 1, que
comprende asimismo una solución acuosa del polímero polianiónico
soluble en agua en un medio líquido.
3. Utilización de un adyuvante mucoso según
cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación
de una vacuna mucosa destinada al tratamiento de enfermedades
respiratorias, gastrointestinales o transmisibles sexualmente.
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