JP2001335510A - エイズワクチン - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 レクチンが結合した疎水性基材からなる
微粒子担体にＨＩＶ又はその一部のタンパクもしくはペ
プチドを捕捉してなる微粒子を含有するエイズワクチ
ン。 【効果】 本発明のエイズワクチンは、ＨＩＶ特異的Ｉ
ｇＡ抗体を誘導し、優れたＨＩＶ中和活性を有すること
から、経粘膜的に投与することにより、ＨＩＶに感染す
ることなくエイズを防止することができる。
微粒子担体にＨＩＶ又はその一部のタンパクもしくはペ
プチドを捕捉してなる微粒子を含有するエイズワクチ
ン。 【効果】 本発明のエイズワクチンは、ＨＩＶ特異的Ｉ
ｇＡ抗体を誘導し、優れたＨＩＶ中和活性を有すること
から、経粘膜的に投与することにより、ＨＩＶに感染す
ることなくエイズを防止することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はエイズ（ＡＩＤＳ：
Acquired Immune Deficiency Syndrome後天性免疫不全
症候群）ワクチンに関する。
Acquired Immune Deficiency Syndrome後天性免疫不全
症候群）ワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】エイズウイルス（ＨＩＶ）は、血液や体
液を媒介として、感染者との性交渉や患者の血液輸血な
どによって感染する。体内でＨＩＶはＴリンパ球（ＣＤ
４抗原陽性）などに直接感染することによって、又は感
染細胞が非感染細胞に融合することによって体内に広が
る。これらの感染ルートのうち、輸血による感染につい
ては、ＨＩＶの検出が可能になったことから防止が可能
となった。従って、現在ＨＩＶ伝播の大部分は性交渉に
よるものである。そのため生殖器粘膜は、ＨＩＶ侵入の
第一関門である。粘膜組織には微生物侵入を防ぐため、
様々な機構があり、なかでもＩｇＡを中心とした免疫機
構は最も主要な役割を果たしている。
液を媒介として、感染者との性交渉や患者の血液輸血な
どによって感染する。体内でＨＩＶはＴリンパ球（ＣＤ
４抗原陽性）などに直接感染することによって、又は感
染細胞が非感染細胞に融合することによって体内に広が
る。これらの感染ルートのうち、輸血による感染につい
ては、ＨＩＶの検出が可能になったことから防止が可能
となった。従って、現在ＨＩＶ伝播の大部分は性交渉に
よるものである。そのため生殖器粘膜は、ＨＩＶ侵入の
第一関門である。粘膜組織には微生物侵入を防ぐため、
様々な機構があり、なかでもＩｇＡを中心とした免疫機
構は最も主要な役割を果たしている。
【０００３】ＨＩＶに高率に暴露されている売春婦につ
いての疫学調査によれば、ＨＩＶに抵抗性をもつグルー
プが存在し、膣液中のＨＩＶ特異的ＩｇＡが有意に検出
されている。このことは生殖器粘膜に存在する特異的Ｉ
ｇＡが、ＨＩＶ感染の防御に重要な役割をもっているこ
とのみならず、女性生殖器が免疫誘導の場として働いて
いることを意味している。
いての疫学調査によれば、ＨＩＶに抵抗性をもつグルー
プが存在し、膣液中のＨＩＶ特異的ＩｇＡが有意に検出
されている。このことは生殖器粘膜に存在する特異的Ｉ
ｇＡが、ＨＩＶ感染の防御に重要な役割をもっているこ
とのみならず、女性生殖器が免疫誘導の場として働いて
いることを意味している。
【０００４】現在の知見では、粘膜免疫は固有の機構を
もっており、従来の注射針を介した抗原の投与法（皮
下、筋内、腹腔内）では、粘膜にＩｇＡを誘導すること
はできない。これらの方法のみで免疫した動物に、粘膜
からの感染実験を行うと、感染は阻止されない。粘膜免
疫誘導には粘膜からの抗原投与が必要といわれている。
しかし経膣投与では、非増殖性の抗原に対して誘導され
る免疫応答は一般的に弱いとされる。免疫応答を増強さ
せるためにアジュバントが使用されるが、経粘膜投与の
動物モデルで用いられるコレラトキシンは、ヒトへの適
用には安全性の面で問題がある。
もっており、従来の注射針を介した抗原の投与法（皮
下、筋内、腹腔内）では、粘膜にＩｇＡを誘導すること
はできない。これらの方法のみで免疫した動物に、粘膜
からの感染実験を行うと、感染は阻止されない。粘膜免
疫誘導には粘膜からの抗原投与が必要といわれている。
しかし経膣投与では、非増殖性の抗原に対して誘導され
る免疫応答は一般的に弱いとされる。免疫応答を増強さ
せるためにアジュバントが使用されるが、経粘膜投与の
動物モデルで用いられるコレラトキシンは、ヒトへの適
用には安全性の面で問題がある。
【０００５】また、ＨＩＶには亜型があり、その分布は
地域によって異なる。予防ワクチンとしては、その地域
に蔓延しているＨＩＶに対して免疫応答を誘導するワク
チンでなくてはならない。さらにＨＩＶの易変異性によ
り、暴露ウイルスの抗原性は容易に変化する。ＨＩＶの
単一部位に対するワクチンは、その部位の変異により無
効となり、予防ワクチンの実現を困難なものにしてい
る。
地域によって異なる。予防ワクチンとしては、その地域
に蔓延しているＨＩＶに対して免疫応答を誘導するワク
チンでなくてはならない。さらにＨＩＶの易変異性によ
り、暴露ウイルスの抗原性は容易に変化する。ＨＩＶの
単一部位に対するワクチンは、その部位の変異により無
効となり、予防ワクチンの実現を困難なものにしてい
る。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の目的は
ＨＩＶ特異的ＩｇＡ抗体を誘導し、かつ優れたＨＩＶ中
和活性を有するエイズワクチンを提供することにある。
ＨＩＶ特異的ＩｇＡ抗体を誘導し、かつ優れたＨＩＶ中
和活性を有するエイズワクチンを提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者は、レク
チンとＨＩＶとの結合性に着目して種々検討してきたと
ころ、全く意外にもレクチンを結合した微粒子担体にＨ
ＩＶ又はその一部のタンパクもしくはペプチドを捕捉さ
せた微粒子を経粘膜的に投与すれば、ＨＩＶ特異的Ｉｇ
Ａ抗体のみが誘導され、ＩｇＧ抗体は誘導されず、かつ
当該微粒子はＨＩＶ中和活性が優れており、エイズワク
チンとして有用であることを見出し、本発明を完成する
に至った。
チンとＨＩＶとの結合性に着目して種々検討してきたと
ころ、全く意外にもレクチンを結合した微粒子担体にＨ
ＩＶ又はその一部のタンパクもしくはペプチドを捕捉さ
せた微粒子を経粘膜的に投与すれば、ＨＩＶ特異的Ｉｇ
Ａ抗体のみが誘導され、ＩｇＧ抗体は誘導されず、かつ
当該微粒子はＨＩＶ中和活性が優れており、エイズワク
チンとして有用であることを見出し、本発明を完成する
に至った。
【０００８】すなわち、本発明は、レクチンが結合した
疎水性基材からなる微粒子担体にＨＩＶ又はその一部の
タンパクもしくはペプチドを捕捉してなる微粒子を含有
するエイズワクチンを提供するものである。
疎水性基材からなる微粒子担体にＨＩＶ又はその一部の
タンパクもしくはペプチドを捕捉してなる微粒子を含有
するエイズワクチンを提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】本発明のエイズワクチンに用いら
れる微粒子は、レクチンが結合した疎水性基材からなる
微粒子担体にＨＩＶ又はその一部のタンパクもしくはペ
プチドを捕捉してなるものである。ここで、微粒子担体
としては、本発明者が先に報告した特開平１０−４５６
０１号公報及びＷＯ９８／０６２６６記載の抗ウイルス
素材として知られているもの、すなわちマンノース結合
型レクチンが親水性高分子鎖を介して疎水性高分子基材
に結合してなる微粒子担体が挙げられる。
れる微粒子は、レクチンが結合した疎水性基材からなる
微粒子担体にＨＩＶ又はその一部のタンパクもしくはペ
プチドを捕捉してなるものである。ここで、微粒子担体
としては、本発明者が先に報告した特開平１０−４５６
０１号公報及びＷＯ９８／０６２６６記載の抗ウイルス
素材として知られているもの、すなわちマンノース結合
型レクチンが親水性高分子鎖を介して疎水性高分子基材
に結合してなる微粒子担体が挙げられる。
【００１０】当該微粒子担体に使用されるレクチン、例
えばマンノース結合型レクチンとしては、多糖類や複合
糖質中のマンノシル残基を認識するレクチンであれば特
に制限されないが、例えばアスパラギン結合糖鎖の母核
の構成糖であるα−マンノシル残基を認識するレクチ
ン、例えば、Conavalia ensiformis(コンカナバリンA；
ConA)、Lens culinaris(LCA)、Bowringia midbraedii(B
MA)、Dolichos lablab(DLA)、Galanthus nivalis(GN
A)、Gerardia savaglia(GSL)、Machaerium biovulatum
(MBA)、Machaeriumu lunatus(MLA)、Narcissus pseudon
arcissus(NPA)、Epipactis heleborine(EHA)、Listera
ovata(LOA)などが挙げられる。ＨＩＶ捕捉性及び経済性
の面から、これらのマンノース結合型レクチンの中でも
特に、ＣｏｎＡが好適である。
えばマンノース結合型レクチンとしては、多糖類や複合
糖質中のマンノシル残基を認識するレクチンであれば特
に制限されないが、例えばアスパラギン結合糖鎖の母核
の構成糖であるα−マンノシル残基を認識するレクチ
ン、例えば、Conavalia ensiformis(コンカナバリンA；
ConA)、Lens culinaris(LCA)、Bowringia midbraedii(B
MA)、Dolichos lablab(DLA)、Galanthus nivalis(GN
A)、Gerardia savaglia(GSL)、Machaerium biovulatum
(MBA)、Machaeriumu lunatus(MLA)、Narcissus pseudon
arcissus(NPA)、Epipactis heleborine(EHA)、Listera
ovata(LOA)などが挙げられる。ＨＩＶ捕捉性及び経済性
の面から、これらのマンノース結合型レクチンの中でも
特に、ＣｏｎＡが好適である。
【００１１】レクチンを結合させる基材全体の構造とし
ては、親水性高分子鎖と疎水性高分子鎖とがブロックも
しくはグラフト共重合体として形成されているのがよ
く、親水性高分子鎖が疎水性高分子のグラフト鎖として
存在していることが好ましい。疎水性高分子を基材とす
ることにより、水中での強度や寸法安定性が向上し、性
能や操作性に優れた微粒子担体となる。また、親水性高
分子鎖をグラフト鎖とすることにより、疎水性高分子か
らなる基材の表層部を覆い、水系溶媒中において、疎水
性相互作用による非特異的な蛋白質等の吸着を抑制し、
レクチンの選択的吸着性が発現されやすい環境を提供す
ることとなる。さらに、微粒子形状とすることにより、
表面に存在する親水性高分子鎖により、水系溶媒で均一
に分散できるようになる。
ては、親水性高分子鎖と疎水性高分子鎖とがブロックも
しくはグラフト共重合体として形成されているのがよ
く、親水性高分子鎖が疎水性高分子のグラフト鎖として
存在していることが好ましい。疎水性高分子を基材とす
ることにより、水中での強度や寸法安定性が向上し、性
能や操作性に優れた微粒子担体となる。また、親水性高
分子鎖をグラフト鎖とすることにより、疎水性高分子か
らなる基材の表層部を覆い、水系溶媒中において、疎水
性相互作用による非特異的な蛋白質等の吸着を抑制し、
レクチンの選択的吸着性が発現されやすい環境を提供す
ることとなる。さらに、微粒子形状とすることにより、
表面に存在する親水性高分子鎖により、水系溶媒で均一
に分散できるようになる。
【００１２】疎水性高分子は、特に構造は限定されない
が、吸水率が２％以上では水中における材料の強度や寸
法安定性が悪くなったり、微粒子の粒径を小さくし表面
積を増やすことにより、保持させるレクチン量を増加さ
せることが困難となるため、吸水率が２％未満の水不溶
性の高分子より構成されているのが好ましい。例えば、
アクリル酸エステルやメタクリル酸エステル類、スチレ
ンやその誘導体の重合体や共重合体、ポリオレフィン、
ポリスルホン、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタ
ン、ポリイミド等の中から選ばれる疎水性高分子が好ま
しく、これらの共重合体でもよい。
が、吸水率が２％以上では水中における材料の強度や寸
法安定性が悪くなったり、微粒子の粒径を小さくし表面
積を増やすことにより、保持させるレクチン量を増加さ
せることが困難となるため、吸水率が２％未満の水不溶
性の高分子より構成されているのが好ましい。例えば、
アクリル酸エステルやメタクリル酸エステル類、スチレ
ンやその誘導体の重合体や共重合体、ポリオレフィン、
ポリスルホン、ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタ
ン、ポリイミド等の中から選ばれる疎水性高分子が好ま
しく、これらの共重合体でもよい。
【００１３】親水性高分子鎖は、特に構造は限定されな
いが、吸水率が２％未満では疎水性相互作用による非特
異的吸着や、微粒子間の凝集が起こりやすくなるため、
水溶液中で溶解もしくは２％以上の吸収率を有し、単量
体より形成された繰り返し構造を有する重合体が好まし
い。例えば、アクリルアミドやメタクリルアミド及びそ
の誘導体、アクリル酸やメタクリル酸のように分子内に
カルボキシル基を有する単量体、ビニル硫酸やスチレン
スルホン酸のように分子内に硫酸基を有する単量体、ビ
ニルアミンやアリルアミノのように分子内にアミンを有
する単量体、Ｎ−ビニルアセトアミドやＮ−ビニルアル
キルアミド類、ビニルピロリドンやビニルピロリジノ
ン、ビニルエーテル類、アミノ酸や糖を分子内に有する
親水性単量体、アジリジン化合物、リン脂質を分子内に
有する単量体、アクリル酸エステルやメタクリル酸エス
テル等から選ばれる単量体を構成成分とする重合体や共
重合体であって、親水性高分子鎖に該当するものを用い
ることができる。また、ポリエーテル化合物、多糖類、
ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン等であっても
吸水率が２％以上であればよい。
いが、吸水率が２％未満では疎水性相互作用による非特
異的吸着や、微粒子間の凝集が起こりやすくなるため、
水溶液中で溶解もしくは２％以上の吸収率を有し、単量
体より形成された繰り返し構造を有する重合体が好まし
い。例えば、アクリルアミドやメタクリルアミド及びそ
の誘導体、アクリル酸やメタクリル酸のように分子内に
カルボキシル基を有する単量体、ビニル硫酸やスチレン
スルホン酸のように分子内に硫酸基を有する単量体、ビ
ニルアミンやアリルアミノのように分子内にアミンを有
する単量体、Ｎ−ビニルアセトアミドやＮ−ビニルアル
キルアミド類、ビニルピロリドンやビニルピロリジノ
ン、ビニルエーテル類、アミノ酸や糖を分子内に有する
親水性単量体、アジリジン化合物、リン脂質を分子内に
有する単量体、アクリル酸エステルやメタクリル酸エス
テル等から選ばれる単量体を構成成分とする重合体や共
重合体であって、親水性高分子鎖に該当するものを用い
ることができる。また、ポリエーテル化合物、多糖類、
ポリアミド、ポリエステル、ポリウレタン等であっても
吸水率が２％以上であればよい。
【００１４】好ましい親水性高分子鎖としては、蛋白質
の非特異的な吸着を抑制する高分子であり、ポリアクリ
ルアミドやその誘導体、ポリＮ−ビニルアセトアミド類
のような水溶性高分子が挙げられる。
の非特異的な吸着を抑制する高分子であり、ポリアクリ
ルアミドやその誘導体、ポリＮ−ビニルアセトアミド類
のような水溶性高分子が挙げられる。
【００１５】レクチンを親水性高分子鎖に結合させる方
法としては、イミドカルボナート誘導体を介する臭化シ
アン活性化法、カルボジイミド試薬やウッドワード試薬
を用いる縮合試薬法、ジアゾニウム化合物を介したジア
ゾ法、酸アジド誘導体法、ハロゲン化アセチル誘導体
法、トリアジニル誘導体法、ハロゲン化メタクリル（ア
クリル）酸誘導体法、グルタルアルデヒドや両末端エポ
キシ化合物のような多官能性の架橋剤を用いる架橋法な
どいずれも可能である。
法としては、イミドカルボナート誘導体を介する臭化シ
アン活性化法、カルボジイミド試薬やウッドワード試薬
を用いる縮合試薬法、ジアゾニウム化合物を介したジア
ゾ法、酸アジド誘導体法、ハロゲン化アセチル誘導体
法、トリアジニル誘導体法、ハロゲン化メタクリル（ア
クリル）酸誘導体法、グルタルアルデヒドや両末端エポ
キシ化合物のような多官能性の架橋剤を用いる架橋法な
どいずれも可能である。
【００１６】これらの結合方法を用いる理由は、レクチ
ンが有する官能基として、カルボキシル基、アミノ基、
ヒドロキシル基、イミダゾール基、フェノール基などが
考えられるためであり、これらの官能基と反応する種々
のジアゾニウム塩、酸アジド、イソシアネート、ハロゲ
ン化アルキル、エポキシ、アルデヒド等の官能基を親水
性高分子鎖に導入したり、架橋剤や縮合剤を用い、適当
な条件下でレクチンと反応させればよい。親水性高分子
鎖に官能基を導入する方法としては、当該官能基を有す
る単量体を共重合する方法、別の官能基を有する単量体
から変換する方法等がある。
ンが有する官能基として、カルボキシル基、アミノ基、
ヒドロキシル基、イミダゾール基、フェノール基などが
考えられるためであり、これらの官能基と反応する種々
のジアゾニウム塩、酸アジド、イソシアネート、ハロゲ
ン化アルキル、エポキシ、アルデヒド等の官能基を親水
性高分子鎖に導入したり、架橋剤や縮合剤を用い、適当
な条件下でレクチンと反応させればよい。親水性高分子
鎖に官能基を導入する方法としては、当該官能基を有す
る単量体を共重合する方法、別の官能基を有する単量体
から変換する方法等がある。
【００１７】微粒子担体を製造する方法としては、
（１）基材となる疎水性高分子の微粒子を作製した後、
該基材表面に親水性高分子鎖を結合させたり表面グラフ
トにより形成させる方法、（２）加水分解等により疎水
性基から親水性基へと変換可能な官能基を有する単量体
やマクロモノマーを原料として疎水性の微粒子を作製し
た後、加水分解等を利用して親水性高分子鎖に変換する
方法、（３）親水性のマクロモノマーと疎水性の単量
体、あるいは、疎水性のマクロモノマーと親水性の単量
体というように、親水性と疎水性の原料とを組み合わせ
て微粒子を製造する方法などがある。中でも、微粒子の
均一性や製造上の容易さから、高分子合成の過程で、微
粒子状に成形する方法が好ましい。
（１）基材となる疎水性高分子の微粒子を作製した後、
該基材表面に親水性高分子鎖を結合させたり表面グラフ
トにより形成させる方法、（２）加水分解等により疎水
性基から親水性基へと変換可能な官能基を有する単量体
やマクロモノマーを原料として疎水性の微粒子を作製し
た後、加水分解等を利用して親水性高分子鎖に変換する
方法、（３）親水性のマクロモノマーと疎水性の単量
体、あるいは、疎水性のマクロモノマーと親水性の単量
体というように、親水性と疎水性の原料とを組み合わせ
て微粒子を製造する方法などがある。中でも、微粒子の
均一性や製造上の容易さから、高分子合成の過程で、微
粒子状に成形する方法が好ましい。
【００１８】例えば、親水性マクロモノマーを、水やエ
タノール、あるいはエタノール／水混合溶媒中でスチレ
ンやブチルメチルメタクリレートなどの疎水性モノマー
と分散共重合すると、マイクロスフェアやナノスフェア
と呼ばれる、比較的粒径が揃った、水に良好な分散性を
示す高分子マイクロスフェアが合成できる（高分子加
工、３７巻、ｐ１２０〜１２５、「水溶性マクロモノマ
ー」明石満著）。この方法を用いることにより、疎水性
高分子を核として親水性高分子鎖により表面が覆われた
微粒子を、簡便かつ均一に製造することが可能となる。
この方法により得られる微粒子は、強度及び安定性（膨
潤による寸法変化が少ない）に優れているため、レクチ
ンを固定化する基材（担体）として好適である。
タノール、あるいはエタノール／水混合溶媒中でスチレ
ンやブチルメチルメタクリレートなどの疎水性モノマー
と分散共重合すると、マイクロスフェアやナノスフェア
と呼ばれる、比較的粒径が揃った、水に良好な分散性を
示す高分子マイクロスフェアが合成できる（高分子加
工、３７巻、ｐ１２０〜１２５、「水溶性マクロモノマ
ー」明石満著）。この方法を用いることにより、疎水性
高分子を核として親水性高分子鎖により表面が覆われた
微粒子を、簡便かつ均一に製造することが可能となる。
この方法により得られる微粒子は、強度及び安定性（膨
潤による寸法変化が少ない）に優れているため、レクチ
ンを固定化する基材（担体）として好適である。
【００１９】マクロモノマーとは、重合性のモノマーと
しての機能を有する重合体である。マクロモノマーは、
主鎖ポリマーの合成と重合性官能基の導入とから組み立
てられる。例えば、アニオンリビング重合（停止法、開
始法）、カチオン重合（開環カチオンリビング重合、ビ
ニルカチオン重合、イニファーターを利用したカチオン
重合等）、ラジカル重合における連鎖移動反応を利用す
る方法、あるいは、主鎖ポリマーの末端等の官能基に、
クロルメチルスチレン、グリシジルメタクリレート、メ
タクリロイルイソシアネート、メタクロレイン、メタク
リル酸クロライド等を用いて重合性官能基を導入する方
法などがある（高分子加工、３３巻、ｐ４３９〜４４
５、「マクロマーの合成と重合」浅見柳三著）。
しての機能を有する重合体である。マクロモノマーは、
主鎖ポリマーの合成と重合性官能基の導入とから組み立
てられる。例えば、アニオンリビング重合（停止法、開
始法）、カチオン重合（開環カチオンリビング重合、ビ
ニルカチオン重合、イニファーターを利用したカチオン
重合等）、ラジカル重合における連鎖移動反応を利用す
る方法、あるいは、主鎖ポリマーの末端等の官能基に、
クロルメチルスチレン、グリシジルメタクリレート、メ
タクリロイルイソシアネート、メタクロレイン、メタク
リル酸クロライド等を用いて重合性官能基を導入する方
法などがある（高分子加工、３３巻、ｐ４３９〜４４
５、「マクロマーの合成と重合」浅見柳三著）。
【００２０】かかる微粒子担体の好ましい微粒子サイズ
は、１００nm〜１mmである。単位体積当たりの微粒子の
表面積を増やすためには、微粒子の粒径を小さくしなけ
ればならないが、１００nm以下の大きさになるとＨＩＶ
ウイルスサイズに近づき、遊離のＨＩＶ粒子との分離が
困難になる。また、粒径が１mmより大きくなると吸着速
度や効率が低下し、実用性が低くなる。
は、１００nm〜１mmである。単位体積当たりの微粒子の
表面積を増やすためには、微粒子の粒径を小さくしなけ
ればならないが、１００nm以下の大きさになるとＨＩＶ
ウイルスサイズに近づき、遊離のＨＩＶ粒子との分離が
困難になる。また、粒径が１mmより大きくなると吸着速
度や効率が低下し、実用性が低くなる。
【００２１】これらの微粒子担体に捕捉させるためのＨ
ＩＶとしては、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２が挙げられる
が、ＨＩＶ−１が好ましい。ＨＩＶ粒子そのものを用い
る場合は、安全のために不活化することが好ましい。ま
たＨＩＶの一部のタンパク又はペプチドを用いてもよ
い。
ＩＶとしては、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２が挙げられる
が、ＨＩＶ−１が好ましい。ＨＩＶ粒子そのものを用い
る場合は、安全のために不活化することが好ましい。ま
たＨＩＶの一部のタンパク又はペプチドを用いてもよ
い。
【００２２】ＨＩＶの不活化手段としては、加熱処理が
好ましく、例えば６０〜８０℃に１０分以上、特に６０
℃３０分間加熱処理するのが特に好ましい。
好ましく、例えば６０〜８０℃に１０分以上、特に６０
℃３０分間加熱処理するのが特に好ましい。
【００２３】前記の微粒子担体へのＨＩＶの捕捉は、微
粒子担体上のマンノース結合型レクチンはＨＩＶの外被
糖蛋白質であるｇｐ１２０の糖鎖に結合するので、これ
らを単に接触させればよい。具体的には、ＨＩＶ浮遊液
に微粒子担体を添加して放置し、未捕捉のＨＩＶを除去
すればよい。ここで、ＨＩＶは微粒子担体１mg当たりｇ
ｐ１２０換算で５ng以上、特に１０ng〜４０ng捕捉され
ているのが好ましい。
粒子担体上のマンノース結合型レクチンはＨＩＶの外被
糖蛋白質であるｇｐ１２０の糖鎖に結合するので、これ
らを単に接触させればよい。具体的には、ＨＩＶ浮遊液
に微粒子担体を添加して放置し、未捕捉のＨＩＶを除去
すればよい。ここで、ＨＩＶは微粒子担体１mg当たりｇ
ｐ１２０換算で５ng以上、特に１０ng〜４０ng捕捉され
ているのが好ましい。
【００２４】かくして得られたＨＩＶ捕捉微粒子は、経
膣、経尿道、経鼻、経口等の経粘膜投与により、ＨＩＶ
特異的ＩｇＧ抗体を誘導せず、ＨＩＶ特異的ＩｇＡ抗体
を選択的に誘導する。さらに、ＨＩＶ捕捉微粒子は優れ
たＨＩＶ中和活性を有する。従って、当該ＨＩＶ捕捉微
粒子はエイズワクチンとして有用である。
膣、経尿道、経鼻、経口等の経粘膜投与により、ＨＩＶ
特異的ＩｇＧ抗体を誘導せず、ＨＩＶ特異的ＩｇＡ抗体
を選択的に誘導する。さらに、ＨＩＶ捕捉微粒子は優れ
たＨＩＶ中和活性を有する。従って、当該ＨＩＶ捕捉微
粒子はエイズワクチンとして有用である。
【００２５】本発明のエイズワクチンは、前記のように
経粘膜投与用製剤とすることが好ましく、当該製剤とし
ては、液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤等が挙げら
れる。これらの製剤を調製するにあたっては、蒸留水、
ブドウ糖液、生理食塩水、リン酸緩衝液等を用いること
ができる。
経粘膜投与用製剤とすることが好ましく、当該製剤とし
ては、液剤、錠剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏剤等が挙げら
れる。これらの製剤を調製するにあたっては、蒸留水、
ブドウ糖液、生理食塩水、リン酸緩衝液等を用いること
ができる。
【００２６】本発明エイズワクチンの投与量は特に限定
されないが成人当たり、ＨＩＶ量（ｇｐ１２０換算）と
して１５〜４５μｇを１〜２回、１４〜４８日間隔で投
与するのが好ましい。
されないが成人当たり、ＨＩＶ量（ｇｐ１２０換算）と
して１５〜４５μｇを１〜２回、１４〜４８日間隔で投
与するのが好ましい。
【００２７】
【実施例】次に、実施例によって本発明を詳細に説明す
るが、本発明は、これらに限定されるものではない。
るが、本発明は、これらに限定されるものではない。
【００２８】実施例１ （１）親水性高分子鎖を有する微粒子の合成 ｔ−ブチルメタクリレート（ｔ−ＢＭＡ）をテトラヒド
ロフランに溶解させ、連鎖移動剤（２−メルカプトエタ
ノール）、重合開始剤（アゾビスイソブチロニトリル；
ＡＩＢＮ）存在下、窒素気流下で６０℃、６時間重合を
行った。反応終了後、水／メタノール（１／１，ｖ／
ｖ）混合液に再沈殿し、減圧乾燥後再びイソプロパノー
ルに溶解させ、水／メタノールへの再沈殿を繰り返すこ
とにより精製を行い、末端に水酸基を有するｔ−ＢＭＡ
オリゴマーを得た（M. Riza, S. Tokura, M. Iwasaki,
E. Yashima, A. Kishida, M. Akashi J. Polym. Sci. P
artA：Polym. Chem. Ed., 33, 1219-1225(1995)参
照）。
ロフランに溶解させ、連鎖移動剤（２−メルカプトエタ
ノール）、重合開始剤（アゾビスイソブチロニトリル；
ＡＩＢＮ）存在下、窒素気流下で６０℃、６時間重合を
行った。反応終了後、水／メタノール（１／１，ｖ／
ｖ）混合液に再沈殿し、減圧乾燥後再びイソプロパノー
ルに溶解させ、水／メタノールへの再沈殿を繰り返すこ
とにより精製を行い、末端に水酸基を有するｔ−ＢＭＡ
オリゴマーを得た（M. Riza, S. Tokura, M. Iwasaki,
E. Yashima, A. Kishida, M. Akashi J. Polym. Sci. P
artA：Polym. Chem. Ed., 33, 1219-1225(1995)参
照）。
【００２９】得られたｔ−ＢＭＡオリゴマーをＤＭＦ
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）１００mLに溶解さ
せ、オリゴマーに対し５倍モル当量の相間移動触媒（テ
トラブチルフォスフォニウムブロマイド）と１０倍モル
当量の５０％ＫＯＨ水溶液を加え３０℃で６０分間攪拌
後、１０倍モル当量のｐ−クロロメチルスチレンを加え
３０℃で４８時間攪拌することにより反応させた。反応
終了後、生成物を水／メタノール（１／１，ｖ／ｖ）混
合液に再沈殿した。減圧乾燥後再びイソプロパノールに
溶解させ、水／メタノールへの再沈殿を繰り返すことに
より、末端にビニルベンジル基を有するｔ−ＢＭＡマク
ロモノマーを得た。マクロモノマーの分子量は、合成条
件により制御可能であるが、通常Ｍｎ＝２，０００〜１
０，０００のものがよく使用される。得られたｔ−ＢＭ
Ａマクロモノマーとスチレンとを、ＡＩＢＮを開始剤と
してエタノール中で、脱気封管後６０℃で４８時間反応
させた後、反応生成物をメタノール中で透析することに
より精製し、減圧乾燥により微粒子状物（以下マイクロ
スフェア）を得た。続いて、このマイクロスフェアをエ
タノール中に分散させ、濃塩酸を加え（エタノール／塩
酸；５／１，ｖ／ｖ）、７５℃で１２時間反応させるこ
とで、ｔ−ＢＭＡ鎖をメタクリル酸鎖に変換した。精製
は、上澄みを除去して濃縮した後、水で透析することに
より行った。
（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）１００mLに溶解さ
せ、オリゴマーに対し５倍モル当量の相間移動触媒（テ
トラブチルフォスフォニウムブロマイド）と１０倍モル
当量の５０％ＫＯＨ水溶液を加え３０℃で６０分間攪拌
後、１０倍モル当量のｐ−クロロメチルスチレンを加え
３０℃で４８時間攪拌することにより反応させた。反応
終了後、生成物を水／メタノール（１／１，ｖ／ｖ）混
合液に再沈殿した。減圧乾燥後再びイソプロパノールに
溶解させ、水／メタノールへの再沈殿を繰り返すことに
より、末端にビニルベンジル基を有するｔ−ＢＭＡマク
ロモノマーを得た。マクロモノマーの分子量は、合成条
件により制御可能であるが、通常Ｍｎ＝２，０００〜１
０，０００のものがよく使用される。得られたｔ−ＢＭ
Ａマクロモノマーとスチレンとを、ＡＩＢＮを開始剤と
してエタノール中で、脱気封管後６０℃で４８時間反応
させた後、反応生成物をメタノール中で透析することに
より精製し、減圧乾燥により微粒子状物（以下マイクロ
スフェア）を得た。続いて、このマイクロスフェアをエ
タノール中に分散させ、濃塩酸を加え（エタノール／塩
酸；５／１，ｖ／ｖ）、７５℃で１２時間反応させるこ
とで、ｔ−ＢＭＡ鎖をメタクリル酸鎖に変換した。精製
は、上澄みを除去して濃縮した後、水で透析することに
より行った。
【００３０】以上の操作により、ポリメタクリル酸を親
水性高分子鎖とし、ポリスチレンを疎水性高分子鎖とす
るナノスフェアを得た。ナノスフェアのサイズは、モノ
マー組成や合成条件により制御可能であり、１００nm〜
１０００nmのものが好適に使用される。本実施例におい
ては、粒径２００nm〜４００nmのナノスフェアを用いて
以下の実験を行った。
水性高分子鎖とし、ポリスチレンを疎水性高分子鎖とす
るナノスフェアを得た。ナノスフェアのサイズは、モノ
マー組成や合成条件により制御可能であり、１００nm〜
１０００nmのものが好適に使用される。本実施例におい
ては、粒径２００nm〜４００nmのナノスフェアを用いて
以下の実験を行った。
【００３１】（２）レクチンの固定化 マンノース結合型レクチンであるコンカナバリンＡ（Ｃ
ｏｎＡ）を例にして、以下に固定化方法を説明する。上
記ナノスフェア（ＮＳ）の分散液（２５０mg／mL）１．
２mLに０．５ＭＫＨ 2ＰＯ4溶液０．１５mL、さらに１．
０wt％ＷＳＣ（１−エチル−３−（ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミドハイドロクロライド）水溶液０．
１５mLを加えて、３０分間室温で静置することでナノス
フェア表面のカルボキシル基を活性化させた。１３，０
００rpmで２０分間、遠心分離することで、ナノスフェ
アと溶液とを分離し、溶液（上清）を除去した後、素早
く１．０mg／mLＣｏｎＡ溶液（１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝
液，ｐＨ８．０，４℃）を加え、４℃で２４時間静置す
ることでＣｏｎＡをナノスフェアに固定化させた。反応
後、遠心分離（１３，０００rpm、２０分間）と再分散
を繰り返すことにより未反応のＣｏｎＡを除去した。以
下、得られた微粒子担体を、ＣｏｎＡ−ＮＳとして示
す。
ｏｎＡ）を例にして、以下に固定化方法を説明する。上
記ナノスフェア（ＮＳ）の分散液（２５０mg／mL）１．
２mLに０．５ＭＫＨ 2ＰＯ4溶液０．１５mL、さらに１．
０wt％ＷＳＣ（１−エチル−３−（ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミドハイドロクロライド）水溶液０．
１５mLを加えて、３０分間室温で静置することでナノス
フェア表面のカルボキシル基を活性化させた。１３，０
００rpmで２０分間、遠心分離することで、ナノスフェ
アと溶液とを分離し、溶液（上清）を除去した後、素早
く１．０mg／mLＣｏｎＡ溶液（１０mM ＨＥＰＥＳ緩衝
液，ｐＨ８．０，４℃）を加え、４℃で２４時間静置す
ることでＣｏｎＡをナノスフェアに固定化させた。反応
後、遠心分離（１３，０００rpm、２０分間）と再分散
を繰り返すことにより未反応のＣｏｎＡを除去した。以
下、得られた微粒子担体を、ＣｏｎＡ−ＮＳとして示
す。
【００３２】ナノスフェア表面に固定化されたＣｏｎＡ
の定量は、２Ｎ−ＨＣｌ中で１００℃２時間加水分解し
て生成したアミノ酸をニンヒドリンで発色させ、予めＣ
ｏｎＡ溶液で作製していた検量線を用いて行った。表面
のＣｏｎＡの固定化量は、ナノスフェアの構造や反応条
件により制御可能であるが、以下の実験には、ＣｏｎＡ
が２mg／cm2固定化されたナノスフェアを用いた。
の定量は、２Ｎ−ＨＣｌ中で１００℃２時間加水分解し
て生成したアミノ酸をニンヒドリンで発色させ、予めＣ
ｏｎＡ溶液で作製していた検量線を用いて行った。表面
のＣｏｎＡの固定化量は、ナノスフェアの構造や反応条
件により制御可能であるが、以下の実験には、ＣｏｎＡ
が２mg／cm2固定化されたナノスフェアを用いた。
【００３３】（３）ＨＩＶ−１浮遊液の作成 ＨＩＶ−１持続感染細胞株ＭＯＬＴ−４／IIIBを４日間
培養し、これを２，０００rpmで１０分間遠心した。こ
の上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、これをウ
イルス浮遊液として用いた。
培養し、これを２，０００rpmで１０分間遠心した。こ
の上清を０．４５μｍのフィルターでろ過し、これをウ
イルス浮遊液として用いた。
【００３４】（４）ＨＩＶ−１捕捉微粒子の作成 ウイルス浮遊液を６０℃３０分間熱処理し、ウイルスを
完全に不活化した。この不活化ＨＩＶ−１浮遊液を前記
ＣｏｎＡ−ＮＳ（濃度０．５mg／mL）と反応させ、１時
間室温に静置した。その後１０，０００rpmで１０分
間、４℃にて遠心した。得られた沈渣をＰＢＳで１回洗
浄した後、ＰＢＳに再浮遊した（ＨＩＶ−１−ＮＳ）。
ウイルス浮遊液の総ｇｐ１２０量と未捕捉ｇｐ１２０量
をＨＩＶ−１ｇｐ１２０Antigen Capture ELISA Kit(Ad
vanced Biotechnologies, Colombia, MD)で測定するこ
とにより、ＣｏｎＡ−ＮＳに捕捉されたｇｐ１２０量を
計算した。このＨＩＶ−１−ＮＳにはｇｐ１２０が約３
００ng／mL、ＣｏｎＡ−ＮＳが２０mg／mL含まれてい
る。一方、対照としてＨＩＶ−１−ＮＳと同じｇｐ１２
０濃度の不活化ウイルス浮遊液（ＨＩＶ−１）とＨＩＶ
−１フリーのＣｏｎＡ−ＮＳも準備した（ＮＳ）。
完全に不活化した。この不活化ＨＩＶ−１浮遊液を前記
ＣｏｎＡ−ＮＳ（濃度０．５mg／mL）と反応させ、１時
間室温に静置した。その後１０，０００rpmで１０分
間、４℃にて遠心した。得られた沈渣をＰＢＳで１回洗
浄した後、ＰＢＳに再浮遊した（ＨＩＶ−１−ＮＳ）。
ウイルス浮遊液の総ｇｐ１２０量と未捕捉ｇｐ１２０量
をＨＩＶ−１ｇｐ１２０Antigen Capture ELISA Kit(Ad
vanced Biotechnologies, Colombia, MD)で測定するこ
とにより、ＣｏｎＡ−ＮＳに捕捉されたｇｐ１２０量を
計算した。このＨＩＶ−１−ＮＳにはｇｐ１２０が約３
００ng／mL、ＣｏｎＡ−ＮＳが２０mg／mL含まれてい
る。一方、対照としてＨＩＶ−１−ＮＳと同じｇｐ１２
０濃度の不活化ウイルス浮遊液（ＨＩＶ−１）とＨＩＶ
−１フリーのＣｏｎＡ−ＮＳも準備した（ＮＳ）。
【００３５】実施例２ （１）免疫実験 ＢＡＬＢ／ｃマウス（７〜８週齢・雌）を日本ＳＬＣよ
り購入した。マウス４匹を１グループとして、ＨＩＶ−
１−ＮＳ，ＨＩＶ−１，ＮＳの各免疫原を１グループに
投与した。投与方法はマウスの膣に免疫原を１回３０μ
ｌ投与した。この量はＨＩＶ−１−ＮＳ，ＨＩＶ−１と
もに１回約１０ngのｇｐ１２０を投与したことになる。
０日目及び２８日目に免疫原を投与した。
り購入した。マウス４匹を１グループとして、ＨＩＶ−
１−ＮＳ，ＨＩＶ−１，ＮＳの各免疫原を１グループに
投与した。投与方法はマウスの膣に免疫原を１回３０μ
ｌ投与した。この量はＨＩＶ−１−ＮＳ，ＨＩＶ−１と
もに１回約１０ngのｇｐ１２０を投与したことになる。
０日目及び２８日目に免疫原を投与した。
【００３６】（２）試料の回収 膣洗浄液は、膣腔内をＰＢＳ５０μｌで数回ピペッティ
ングし回収した。同一グループの４匹分の膣洗浄液をプ
ールした。浮遊物を除去するために、１０，０００rpm
で１０分間、４℃にて遠心上清を採取した。試料は抗体
測定まで−２０℃にて保存した。膣洗浄液は初回免疫か
ら約２ケ月間にわたって回収した。
ングし回収した。同一グループの４匹分の膣洗浄液をプ
ールした。浮遊物を除去するために、１０，０００rpm
で１０分間、４℃にて遠心上清を採取した。試料は抗体
測定まで−２０℃にて保存した。膣洗浄液は初回免疫か
ら約２ケ月間にわたって回収した。
【００３７】（３）ＨＩＶ−１特異的抗体の検出 ＨＩＶ−１（IIIB株）のｇｐ１２０Ｖ３ループ由来のペ
プチドをコートしたＥＬＩＳＡプーレートを作成した。
膣洗浄液は４倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００
μｌ／well加え、一晩４℃でインキュベートした。ＰＢ
Ｓで４回洗浄後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ抗体、あるいはアルカリホスファターゼ標識
ヤギ抗マウスＩｇＡ抗体（ともにSouthern Biotechnolo
gy Associates, Inc. Birmingham, AL）を加えた。ＰＢ
Ｓで４回洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
（Sigma Chemical Co. St. Louis, MO）を加え、吸光度
計（４０５nm）で測定し、得られた吸光度（O. D.値）
を抗ＨＩＶ抗体価とした。
プチドをコートしたＥＬＩＳＡプーレートを作成した。
膣洗浄液は４倍に希釈し、ＥＬＩＳＡプレートに１００
μｌ／well加え、一晩４℃でインキュベートした。ＰＢ
Ｓで４回洗浄後、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マ
ウスＩｇＧ抗体、あるいはアルカリホスファターゼ標識
ヤギ抗マウスＩｇＡ抗体（ともにSouthern Biotechnolo
gy Associates, Inc. Birmingham, AL）を加えた。ＰＢ
Ｓで４回洗浄した後、ｐ−ニトロフェニルホスフェート
（Sigma Chemical Co. St. Louis, MO）を加え、吸光度
計（４０５nm）で測定し、得られた吸光度（O. D.値）
を抗ＨＩＶ抗体価とした。
【００３８】（４）中和活性 初回の免疫後、３８日目に回収した膣洗浄液とウイルス
液を１：１で混合した。２時間室温に静置した後、９６
ウェルプレートに５倍希釈列を作成し、これにＨＩＶ−
１に高い感受性をもつＭＴ−４細胞を加え培養した。培
養４日目に顕微鏡下でＨＩＶ−１による細胞変性効果出
現の有無を確認し、Reed-Muench法により、元のウイル
ス液の感染価を求め、５０％ cell culture infective
dose perml(CCID50/mL)で表した。
液を１：１で混合した。２時間室温に静置した後、９６
ウェルプレートに５倍希釈列を作成し、これにＨＩＶ−
１に高い感受性をもつＭＴ−４細胞を加え培養した。培
養４日目に顕微鏡下でＨＩＶ−１による細胞変性効果出
現の有無を確認し、Reed-Muench法により、元のウイル
ス液の感染価を求め、５０％ cell culture infective
dose perml(CCID50/mL)で表した。
【００３９】（５）結果 得られた結果を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】その結果、ＨＩＶ−１−ＮＳ投与群は、Ｈ
ＩＶ−１投与群より高いＨＩＶ−１特異的ＩｇＡ抗体の
誘導が観察され、その膣洗浄液は、ＨＩＶ−１の中和活
性を有していた。すなわち、対照群由来膣洗浄液で処理
した場合の感染価３９．１に対して、ＨＩＶ−１−ＮＳ
投与群のそれは３．５と１／１０以下に低下した。
ＩＶ−１投与群より高いＨＩＶ−１特異的ＩｇＡ抗体の
誘導が観察され、その膣洗浄液は、ＨＩＶ−１の中和活
性を有していた。すなわち、対照群由来膣洗浄液で処理
した場合の感染価３９．１に対して、ＨＩＶ−１−ＮＳ
投与群のそれは３．５と１／１０以下に低下した。
【００４２】
【発明の効果】本発明のエイズワクチンは、ＨＩＶ特異
的ＩｇＡ抗体を誘導し、優れたＨＩＶ中和活性を有する
ことから、経粘膜的に投与することにより、ＨＩＶに感
染することなくエイズを防止することができる。
的ＩｇＡ抗体を誘導し、優れたＨＩＶ中和活性を有する
ことから、経粘膜的に投与することにより、ＨＩＶに感
染することなくエイズを防止することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 明石 満 鹿児島県鹿児島市皇徳寺台２丁目14−６ (72)発明者 足立 正一 群馬県高崎市石原町3493番の９ Ｆターム(参考） 4C076 AA06 AA22 AA30 AA31 AA37 BB30 CC06 EE02A EE03A EE10A EE12A EE24A EE26A EE41A FF02 4C085 AA03 BA69 CC08 DD72 GG10
Claims (3)
- 【請求項１】 レクチンが結合した疎水性基材からなる
微粒子担体にＨＩＶ又はその一部のタンパクもしくはペ
プチドを捕捉してなる微粒子を含有するエイズワクチ
ン。 - 【請求項２】 微粒子担体の直径が１００nm〜１mmであ
る請求項１記載のエイズワクチン。 - 【請求項３】 経粘膜投与用剤である請求項１又は２記
載のエイズワクチン。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000151487A JP2001335510A (ja) | 2000-05-23 | 2000-05-23 | エイズワクチン |
| PCT/JP2001/004258 WO2001089561A1 (fr) | 2000-05-23 | 2001-05-22 | Vaccins contre le sida |
| AU2001256792A AU2001256792A1 (en) | 2000-05-23 | 2001-05-22 | Aids vaccines |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000151487A JP2001335510A (ja) | 2000-05-23 | 2000-05-23 | エイズワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001335510A true JP2001335510A (ja) | 2001-12-04 |
Family
ID=18657038
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000151487A Pending JP2001335510A (ja) | 2000-05-23 | 2000-05-23 | エイズワクチン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
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Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| JPH1045601A (ja) * | 1996-08-08 | 1998-02-17 | Mitsuru Akashi | 抗ウイルス素材 |
-
2000
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- 2001-05-22 WO PCT/JP2001/004258 patent/WO2001089561A1/ja active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2001089561A1 (fr) | 2001-11-29 |
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