CN114531879A - 颗粒、具有针对目标物质的配体的亲和颗粒、包含其的体外诊断用试剂和试剂盒和目标物质的检测方法 - Google Patents

颗粒、具有针对目标物质的配体的亲和颗粒、包含其的体外诊断用试剂和试剂盒和目标物质的检测方法 Download PDF

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Abstract

提供的是：适合于胶乳凝集法的颗粒和亲和颗粒，所述颗粒和亲和颗粒具有小的非特异性吸附并且具有用于化学结合配体的反应性官能团；包含这些颗粒作为胶乳凝集法用颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒；和目标物质的检测方法。一种颗粒，其中颗粒表层包含共聚物，所述共聚物具有重复单元A和重复单元B，所述重复单元A各自具有在侧链末端具有用于与配体结合的羧基的侧链A，并且所述重复单元B各自具有在侧链末端具有羟基的侧链B，颗粒的特征在于，当颗粒分散在离子交换水中时，颗粒表层含水并且形成溶胀层，溶胀层中含有的羧基密度满足0.04‑0.15/nm3，并且当颗粒干燥时测得的干燥粒径与当颗粒分散在离子交换水中时测得的水中粒径之比满足1.10‑1.40。

Description

颗粒、具有针对目标物质的配体的亲和颗粒、包含其的体外诊 断用试剂和试剂盒和目标物质的检测方法
技术领域
本发明涉及颗粒、包括针对目标物质的配体的亲和颗粒、以及各自包含该亲和颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒，并且涉及目标物质的检测方法。
背景技术
简单且迅速的免疫检测方法的实例为胶乳凝集法。在该方法中，将通过使颗粒与对目标物质具有亲和性的配体彼此结合而获得的亲和颗粒的分散液与可能包含目标物质的试样混合。此时，当试样包含目标物质时，亲和颗粒引起凝集反应，因此，可以通过将该凝集反应作为例如散射光强度、透射光强度或吸光度等的变化量进行光学检测来确定疾病的有无。
通常使用抗体和抗原的组合或抗原和抗体的组合作为配体和目标物质的组合。要用于胶乳凝集法的颗粒和特征在于在颗粒表面上包括针对目标物质的配体的亲和颗粒各自期望较小程度地显示此类吸附目标物质以外的物质的特性(即，所谓的非特异性吸附)，目的在于防止非源自目标物质的非特异性凝集反应的发生。此外，亲和颗粒的分散液可能会在一些检测机构中静置保存数周，因此维持分散液中的亲和颗粒的分散状态的发明是极其重要的技术问题。
作为用于减少颗粒或亲和颗粒的非特异性吸附的手段，包括用例如白蛋白、酪蛋白或明胶等生物来源的物质覆盖颗粒表面的方法是可用的。然而，此类生物来源的物质的物性可能会因生产批次不同而不同。此外，听到以下意见：担心由于使用大量的此类物质而导致未来的生物污染。
用两亲性高分子化合物覆盖颗粒或亲和颗粒的表面的手段作为减少非特异性吸附的方法也是有效的。然而，高分子化合物对颗粒或亲和颗粒的吸附源自物理吸附。因此，化合物可能通过其稀释而游离，因此在一些情况下可能无法充分地抑制非特异性吸附。
作为引起小的非特异性吸附的颗粒，已知在表面上配置有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的颗粒。认为由于配置在颗粒的表面上的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的缩水甘油基的一部分经历开环以形成二醇，因此非特异性吸附受到抑制。
在专利文献1中，公开了将通过使配体经由聚乙二醇链化学结合至其上配置有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的颗粒的表面而获得的颗粒应用于生物分离的情况。
在专利文献2中，公开了将通过使配体经由氨基酸化学结合至其上配置有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的颗粒的表面而获得的颗粒应用于胶乳凝集法的情况。
引文列表
专利文献
专利文献1：日本专利申请特开No.2000-351814
专利文献2：国际公开No.WO2007/063616
发明内容
发明要解决的问题
本发明人进行了深入研究，结果，确认了例如专利文献1和专利文献2的各颗粒在高浓度试样中会引起非特异性吸附，各颗粒在应用于胶乳凝集法时可能无法显示充分的灵敏度，以及担心在静置条件下发生静电异质凝集(electrostatic heteroagglutination)。
鉴于此类背景技术和技术问题做出了本发明。本发明的目的在于提供一种引起小的非特异性吸附、具有用于化学结合配体的反应性官能团、并且适合于胶乳凝集法的颗粒；和在分散稳定性方面优异的亲和颗粒。本发明的另一目的在于提供各自包括颗粒或亲和颗粒作为胶乳凝集法用颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒、以及目标物质的检测方法。
本发明涉及颗粒、包括针对目标物质的配体的亲和颗粒、各自包括亲和颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒、以及目标物质的检测方法。
用于解决问题的方案
即，本发明涉及一种颗粒，所述颗粒在其表层中包含具有重复单元A和重复单元B的共聚物，其中重复单元A具有侧链A，并且侧链A在其末端具有要与配体结合的羧基，其中重复单元B具有侧链B，并且侧链B在其末端具有羟基，其中将颗粒构成为使得当将颗粒分散在离子交换水中时，颗粒的表层含水以形成溶胀层，其中溶胀层中包含的羧基的密度满足式(1-1)，并且其中当颗粒干燥时测得的干燥粒径和当颗粒分散在离子交换水中时测得的水中粒径满足式(1-2)。
0.040≤[羧基密度(个/nm3)]≤0.150…式(1-1)
1.10≤[水中粒径/干燥粒径]≤1.40…式(1-2)
本发明还涉及一种亲和颗粒，其包括：颗粒；和与颗粒结合的配体。
本发明还涉及包含亲和颗粒的用于通过体外检测诊断检测试样中的目标物质的试剂，并且涉及用于通过凝集法(胶乳凝集法)检测试样中的目标物质的试剂。
本发明的另一实施方案涉及一种亲和颗粒，其包括：颗粒；和颗粒表面上的配体，其中配体相对于颗粒表面的占有面积率满足式(2-1)的关系，其中颗粒和配体的zeta电位满足式(2-2)的关系，并且其中颗粒具有由式(2-3)表示的重复单元A。
10≤[占有面积率(％)]≤40…式(2-1)
0≤[||颗粒的Zeta电位|-|配体的zeta电位||]≤20…式(2-2)
[化学式1]
Figure BDA0003522627970000041
在式(2-3)中，R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以具有取代基的具有1至15个碳原子的亚烷基或可以具有取代基的具有1至15个碳原子的氧化烯基(oxyalkylene group)。
此外，本发明的另一实施方案涉及包含亲和颗粒的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂，并且涉及用于通过凝集法(胶乳凝集法)检测试样中的目标物质的试剂。
即，本发明的又一实施方案的第一方面涉及一种颗粒，其包括包含由下式(3-1)表示的重复单元A的共聚物，通过在重复单元A中具有包含硫醚基的结构，该颗粒能够以高收率使配体化学结合至其表面。
[化学式2]
Figure BDA0003522627970000042
此外，本发明的又一实施方案的第二方面涉及包括经由重复单元A化学结合的配体的胶乳凝集法用颗粒。
此外，本发明的又一实施方案的第三方面涉及包含胶乳凝集法用颗粒的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂、至少包含该试剂的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒，并且涉及包括将胶乳凝集法用颗粒和可能包含目标物质的试样混合的检测方法。
发明的效果
根据本发明，可以提供引起小的非特异性吸附、具有用于结合配体的反应性官能团并且适合于凝集法(胶乳凝集法)的颗粒。
此外，根据本发明，可以提供各自包含通过结合配体而形成的亲和颗粒作为凝集法(胶乳凝集法)用颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒、和目标物质的检测方法。
此外，根据本发明的另一实施方案，可以提供引起小的非特异性吸附并且在分散稳定性方面优异的亲和颗粒。根据本发明的又一实施方案，可以提供各自包含该亲和颗粒作为凝集法(胶乳凝集法)用颗粒的高灵敏度体外诊断用试剂和试剂盒、和目标物质的检测方法。
具体实施方式
[第一实施方案]
以下详细地描述本发明的第一实施方案，但是本发明的技术范围不限于实施方案。
根据本发明的第一实施方案的颗粒为如下颗粒，所述颗粒在其表层中包含具有重复单元A和重复单元B的共聚物，所述重复单元A具有侧链A，所述侧链A在其末端具有要与配体结合的羧基，所述重复单元B具有侧链B，所述侧链B在其末端具有羟基。
要用于凝集法(例如，胶乳凝集法)的颗粒优选在水系分散液中在分散稳定性方面优异，因此羧基优选形成羧酸盐。羧酸盐的实例包括：金属盐，例如钠盐或钾盐；和有机盐，例如铵盐。考虑到羧基和配体通过化学反应结合时的反应性，有机盐是更优选的。用于与羧基形成有机盐的有机碱的实例包括氨、二乙胺、三乙胺、乙醇胺和二乙基氨基乙醇。然而，本发明不限于此。考虑到例如沸点或在各种溶剂中的溶解性等实验可操作性，三乙胺易于使用。用于形成羧酸盐的有机碱可以单独地或以其组合使用，只要可以达到第一实施方案的目的即可。类似地，金属碱和有机碱可以组合使用。
当第一实施方案的颗粒分散在水或水溶液中时，颗粒表层含水以形成水凝胶样溶胀层。该溶胀层的特征在于溶胀层中包含的羧基的密度满足下式(1-1)，并且当颗粒干燥时测得的干燥粒径和当颗粒分散在离子交换水中时测得的水中粒径满足式(1-2)。
0.04≤[羧基密度(个/nm3)]≤0.15…式(1-1)
1.10≤[水中粒径/干燥粒径]≤1.40…式(1-2)
当羧基密度小于0.04个/nm3时，颗粒与配体之间的反应性(下文中表示为“敏化率”)不充分。羧基密度大于0.15个/nm3的情况不是优选的，这是因为溶胀层具有高的水约束力，因此当将第一实施方案的颗粒应用于胶乳凝集法时，发生渗透压凝集，观察到疑似的非特异性吸附现象。此外，当羧基密度大于0.15个/nm3时，颗粒的zeta电位增大。因此，当配体与颗粒结合以提供亲和颗粒时，发生配体与颗粒表面之间的静电相互作用而损害配体与目标物质之间的反应性，由此使胶乳凝集法的检测灵敏度降低。此外，随着羧基密度变得更大，颗粒与配体之间的zeta电位差也变得更大。这意味着对各自通过使配体与颗粒结合而获得的亲和颗粒表面赋予具有不同符号的电荷，因此促进亲和颗粒的静电凝集。因此，第一实施方案的颗粒的zeta电位优选满足式(1-3)。
-30≤[Zeta电位(mV)]≤-10…式(1-3)
如上所述，从敏化率、渗透压凝集、当将亲和颗粒应用于胶乳凝集法时的检测灵敏度、和亲和颗粒的静电凝集的观点，对于羧基密度存在优选的范围。因此，羧基密度优选为0.04个/nm3以上且0.15个/nm3以下，更优选0.10个/nm3以上且0.13个/nm3以下。
式(1-2)与溶胀层的厚度相关。式(1-2)表示的比值越小意味着溶胀层越薄，并且式(1-2)表示的比值越大意味着溶胀层越厚。当[水中粒径/干燥粒径]之比小于1.10时，可能难以期望基于含水溶胀层的非特异性吸附的抑制效果。此外，溶胀层含水不充分，因此溶胀层的源自重复单元A的羧基在水系分散液中的运动性不大。因此，可能难以实现充分的敏化率。此外，当配体与颗粒结合以提供亲和颗粒时，配体的运动性受到抑制而损害配体与目标物质之间的反应性，并且受损的反应性可能会是降低胶乳凝集法的检测灵敏度的原因。[水中粒径/干燥粒径]之比为1.10以上的事实在很大程度上有助于颗粒的分散稳定性。要用于胶乳凝集法的颗粒优选在正常试样或以生理盐水为代表的缓冲液中具有优异的分散稳定性。在这一点上，当[水中粒径/干燥粒径]之比为1.10以上时，溶胀层充分含水以对颗粒赋予基于排除体积效果的分散稳定性。同时，[水中粒径/干燥粒径]之比大于1.40的情况不是优选的，这是因为溶胀层具有大的水约束力，以使当将第一实施方案的颗粒应用于胶乳凝集法时，发生渗透压凝集，观察到疑似的非特异性吸附现象。
如上所述，从敏化率、当将亲和颗粒应用于胶乳凝集法时的检测灵敏度、颗粒的分散稳定性和渗透压凝集的观点，对于溶胀层的厚度存在优选的范围。鉴于前述内容，[水中粒径/干燥粒径]之比优选为1.10以上且1.40以下，更优选1.15以上且1.30以下。
优选的是，构成第一实施方案的颗粒的颗粒表层的共聚物的重复单元A和重复单元B分别具有侧链A和侧链B，所述侧链A在其末端具有要与配体结合的羧基，所述侧链B在其末端具有羟基，并且重复单元A的摩尔数和重复单元B的摩尔数满足式(1-4)。
0.05≤[重复单元A的摩尔数]/[重复单元B的摩尔数]≤1.00…式(1-4)
当[重复单元A的摩尔数]/[重复单元B的摩尔数]之比小于0.05时，担心敏化率的降低，虽然该降低不是致命的。此外，重复单元A相对于颗粒表层的比例的降低与作为负电荷产生源的羧基的量的减少是同义的，并且对颗粒赋予源自静电斥力的分散稳定性的难度增加可能会是潜在的问题。当[重复单元A的摩尔数]/[重复单元B的摩尔数]之比大于1.00时，通过颗粒表层含水而形成的溶胀层的水约束力变得更大。因此，当将颗粒与高浓度试样混合时，可能会发生渗透压凝集。
描述了构成第一实施方案的颗粒的颗粒表层的共聚物的重复单元A的具体化学结构。重复单元A的特征在于在其侧链末端具有要与配体结合的羧基，并且其化学结构在可以达到第一实施方案的目的的范围内没有限定。然而，由式(1-5)表示的侧链结构是更优选的：
[化学式3]
Figure BDA0003522627970000081
其中R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以被取代的具有1至15个碳原子的亚烷基或氧化烯基。
式(1-5)中与酯键相邻的羟基用于减少颗粒的非特异性吸附。硫醚键为显示弱的疏水性倾向的化学结构。当重复单元A具有由式(1-5)表示的侧链结构时，使通过颗粒表层含水而形成的溶胀层的水约束力适度地减弱。因此，期望对在将颗粒与高浓度试样混合时可能发生的渗透压凝集的抑制作用。
在式(1-5)中，L1优选表示具有1个碳原子的亚烷基。L1的碳原子数与重复单元A的亲水性或疏水性相关，并且当碳原子数变得过大时，可以促进目标物质与颗粒的非特异性吸附。
从第一实施方案的颗粒的敏化率的观点，式(1-5)中的R2优选表示羧基。
描述了构成第一实施方案的颗粒的颗粒表层的共聚物的重复单元B的具体化学结构。第一实施方案的重复单元B的特征在于具有在末端具有羟基的侧链B，并且其化学结构在可以达到第一实施方案的目的的范围内没有限定。然而，由式(1-6)表示的侧链结构是更优选的：
[化学式4]
Figure BDA0003522627970000091
其中R1表示甲基或氢原子，L2表示可以被取代的具有2至15个碳原子的亚烷基或氧化烯基，并且具有[L1的碳原子数]+2≥[L2的碳原子数]的关系，并且X表示硫原子或可以被取代的氮原子。
式(1-6)中与酯键相邻的羟基和在侧链末端的羟基用于减少颗粒的非特异性吸附。式(1-6)中的X可以表示硫原子和氮原子中的任一者，更优选表示硫原子。硫醚键为显示弱的疏水性倾向的结构。当重复单元B具有由式(1-6)表示的侧链结构时，使通过颗粒表层含水而形成的溶胀层的水约束力适度地减弱。因此，期望对在将颗粒与高浓度试样混合时可能发生的渗透压凝集的抑制作用。
当将式(1-5)和式(1-6)进行比较时，构成式(1-5)中的L1的碳原子数与构成式(1-6)中的L2的碳原子数之间的关系优选为式(1-7)的关系。当不满足式(1-7)的关系时，与侧链A相比，侧链B变得相对更长，因此可以抑制侧链A在其末端具有的羧基的反应性。鉴于前述内容，当式(1-5)中的L1表示具有1个碳原子的亚烷基时，式(1-6)中的L2优选表示具有2个碳原子或3个碳原子的亚烷基。
[L1的碳原子数]+2≥[L2的碳原子数]…式(1-7)
当式(1-6)中的L2表示具有3个碳原子的亚烷基时，从减少颗粒的非特异性吸附的观点，亚烷基的一个氢原子被羟基取代的化学结构是更优选的。
第一实施方案的颗粒优选具有选自由苯乙烯类和(甲基)丙烯酸酯类组成的组中的至少一种作为重复单元C，并且更优选包含源自苯乙烯类和(甲基)丙烯酸缩水甘油酯中的任一者的重复单元。如本文中“背景技术”部分中所记载的，源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的重复单元具有减少颗粒的非特异性吸附的作用。同时，颗粒优选包含源自苯乙烯类中的任一者的重复单元的原因如下所述。当将第一实施方案的颗粒通过例如离心分离或超滤等方法来纯化时，具有高的玻璃化转变温度并且在机械强度方面优异的源自苯乙烯类中的任一者的重复单元的存在有助于抑制例如破裂(cracking)或碎裂(chipping)等对颗粒的损伤。苯乙烯类的实例包括苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、对正丁基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯、对正己基苯乙烯、对正辛基苯乙烯、对正壬基苯乙烯、对正癸基苯乙烯、对正十二烷基苯乙烯、对甲氧基苯乙烯、和对苯基苯乙烯。然而，苯乙烯类不限于此，只要可以达到第一实施方案的目的即可。此外，可以组合使用两种以上的苯乙烯类。当将颗粒的质量设为100质量份时，苯乙烯类的含量优选为10质量份以上且70质量份以下，这是因为在减少非特异性吸附的同时可以对颗粒赋予充分的强度。
第一实施方案的颗粒可以进一步包含源自各自具有交联性的自由基聚合性单体类中的任一者的重复单元。各自具有交联性的自由基聚合性单体类的实例包括二甘醇二丙烯酸酯、三甘醇二丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、2,2′-双(4-(丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二甘醇二甲基丙烯酸酯、三甘醇二甲基丙烯酸酯、四甘醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基聚乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙烯基萘、和二乙烯基醚。然而，单体类不限于此，只要可以达到第一实施方案的目的即可。此外，可以组合使用两种以上的各自具有交联性的自由基聚合性单体。
第一实施方案的颗粒的粒径以数均粒径计优选为0.05μm以上且1.00μm以下，更优选0.05μm以上且0.50μm以下，还更优选0.05μm以上且0.30μm以下。当粒径为0.05μm以上且0.30μm以下时，颗粒容易处理，并且在颗粒作为分散液长期保存的情况下，几乎不发生颗粒的沉降。
描述了第一实施方案的颗粒的典型的生产方法。然而，第一实施方案的颗粒的生产方法不限于可以达到第一实施方案的目的的程度。
该方法包括将(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、苯乙烯、二乙烯基苯、水和自由基聚合引发剂混合以形成粒状共聚物、由此提供粒状共聚物的水分散液的工序1。该方法包括将水分散液、3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸混合以制备混合液、然后使源自粒状共聚物的(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与源自3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸中的每一者的硫醇基彼此反应以形成第一实施方案的颗粒的工序2。自由基聚合引发剂为4,4′-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2′-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺]、2,2′-偶氮双[N-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]四水合物、2,2′-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、或2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二硫酸盐二水合物中的至少一种。该方法包括用不含任何伯胺的有机碱将工序2的混合液的pH调节在碱性区域内的工序。在工序2中，使源自粒状共聚物的(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与源自3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸中的每一者的硫醇基从粒状共聚物的表面沿其深度方向反应。为了在第一实施方案的颗粒上形成具有足够厚度的表层，优选选择对粒状共聚物具有渗透性的三乙胺作为有机碱。
形成粒状共聚物的方法不限于使用自由基聚合，只要可以达到第一实施方案的目的即可。当应用自由基聚合时，优选使用乳液聚合、无皂乳液聚合或悬浮聚合，并且更优选使用乳液聚合或无皂乳液聚合。还更优选使用无皂乳液聚合。通常，乳液聚合和无皂乳液聚合可以各自提供具有比通过悬浮聚合提供的粒状共聚物更尖锐的粒径分布的粒状共聚物。此外，当使颗粒与配体结合以提供亲和颗粒时，担心通常要用于乳液聚合的阴离子性表面活性剂或阳离子性表面活性剂作为残余物存在而使配体改性。鉴于前述内容，当通过乳液聚合形成粒状共聚物时，优选使用非离子性表面活性剂。
配体为与特定的目标物质具有的受体特异性结合的化合物。配体与目标物质结合的部位是确定的，并且配体对目标物质具有选择性或特异性的高亲和性。配体的实例包括：抗原和抗体；酶蛋白及其底物；以激素或神经递质为代表的信号物质及其受体；核酸；以及抗生物素蛋白和生物素。然而，配体不限于此，只要可以达到第一实施方案的目的即可。配体的具体实例包括抗原、抗体、抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、F(ab′)、Fv或scFv)、天然存在的核酸、人工核酸、适体、肽适体、寡肽、酶和辅酶。
在第一实施方案中，第一实施方案的颗粒旨在用作可以应用于免疫检测中的胶乳凝集法的胶乳凝集法用颗粒。
在第一实施方案中，可以应用常规已知的方法作为用于使源自重复单元A的羧基或羧酸盐与配体彼此结合的化学反应的方法，只要可以达到第一实施方案的目的即可。例如，碳二亚胺介导的反应或NHS酯活化反应为该化学反应的合适实例。此外，可以进行以下：使抗生物素蛋白与羧基结合，并且使生物素修饰的配体与所得物结合。然而，用于使源自重复单元A的羧基或羧酸盐与配体彼此结合的化学反应的方法不限于此，只要可以达到第一实施方案的目的即可。
在第一实施方案中，当使用抗体(抗原)作为配体并且使用抗原(抗体)作为目标物质时，作为体外诊断中试样中的目标物质的检测方法，可以非常优选地应用已广泛地用于例如临床检测和生物化学研究等领域的免疫检测中的胶乳凝集法。当使用通常的颗粒作为胶乳凝集法用颗粒时，作为目标物质的抗原(抗体)、或者血清或血浆中的异物等非特异性地吸附至颗粒表面，因此，担心由于吸附而导致发生非预期的颗粒间凝集会损害免疫检测的准确性。
第一实施方案的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂的特征在于包含胶乳凝集法用颗粒。第一实施方案的试剂中包含的胶乳凝集法用颗粒的量优选为0.001质量％至20质量％，更优选0.01质量％至10质量％。除了胶乳凝集法用颗粒以外，第一实施方案的试剂还可以包含例如溶剂或封闭剂等第三物质，只要可以达到第一实施方案的目的即可。要用于第一实施方案的溶剂的实例包括各种水系缓冲液，例如磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good's缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液和氨缓冲液。然而，第一实施方案的试剂中包含的溶剂不限于此。
第一实施方案的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒的特征在于至少包含第一实施方案的试剂。除了第一实施方案的试剂(下文中称为“试剂1”)以外，第一实施方案的试剂盒优选进一步包含含有白蛋白的反应缓冲液(下文中称为“试剂2”)。白蛋白为例如血清白蛋白，并且可以进行蛋白酶处理。作为标准，试剂2中包含的白蛋白的量为0.001质量％至5质量％，但是第一实施方案的试剂盒中的白蛋白的量不限于此。试剂1和试剂2二者中的每一者或者其中一者可以包含胶乳凝集测定用敏化剂。胶乳凝集测定用敏化剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸。然而，要用于第一实施方案的试剂盒的敏化剂不限于此。此外，除了试剂1和试剂2以外，第一实施方案的试剂盒可以包含例如阳性对照、阴性对照或血清稀释液。除了不含可以进行测定的目标物质的血清或生理盐水以外，还可以使用溶剂作为阳性对照或阴性对照的介质。第一实施方案的试剂盒可以与通常的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒同样地用于第一实施方案的目标物质的检测方法。此外，目标物质的浓度可以通过常规已知的方法来测量，并且该方法特别适合于通过胶乳凝集法检测试样中的目标物质。
第一实施方案的通过体外诊断检测试样中的目标物质的方法的特征在于包括将第一实施方案的亲和颗粒与可能包含目标物质的试样混合。此外，第一实施方案的亲和颗粒和试样优选在pH 3.0至11.0的范围内混合。此外，混合温度落在20℃至50℃的范围内，并且混合时间落在1分钟至20分钟的范围内。此外，在该检测方法中，优选使用溶剂。此外，第一实施方案的检测方法中的第一实施方案的亲和颗粒在反应体系中的浓度优选为0.001质量％至5质量％，更优选0.01质量％至1质量％。第一实施方案的检测方法的特征在于包括对由第一实施方案的亲和颗粒与试样的混合的结果而引起的颗粒间凝集进行光学检测。当对颗粒间凝集进行光学检测时，检测到试样中的目标物质，并且可以测量目标物质的浓度。作为光学检测凝集反应的方法，仅需要使用可以检测散射光强度、透射光强度和吸光度等的光学仪器来测量这些值的变化量。
描述了第一实施方案中颗粒的干燥粒径的测量方法。第一实施方案中的干燥粒径为数均粒径，并且在颗粒充分干燥的状态下测量。具体地，将颗粒以5质量％的浓度分散在离子交换水中，并且将分散液滴加至铝箔上，然后在25℃下干燥48小时。此后，将干燥产物用真空干燥机进一步干燥24小时，然后进行测量。将扫描电子显微镜和图像处理分析仪用于干燥粒径的测量。具体地，从处于干燥状态的颗粒的图像中随机抽取100个单个颗粒，该图像使用扫描电子显微镜(S-4800：Hitachi High-Technologies Corporation)来获得，并且通过用图像处理分析仪“Luzex AP”(Nireco Corporation)分析图像来计算它们的数均粒径。
描述了第一实施方案中的颗粒的水中粒径的测量方法。第一实施方案中的水中粒径为数均粒径，并且在颗粒分散在离子交换水中以使它们的浓度可以为0.001质量％的状态下测量。使用电导率为10μS/cm以下的离子交换水作为离子交换水。将动态光散射法应用于水中粒径的测量。具体地，使用ZETASIZER(Nano-ZS：Spectris Co.,Ltd.)在25℃下进行测量。关于分析参数，选择胶乳的折射率(n≈1.59)作为颗粒的折射率，并且选择纯水作为溶剂。测量进行10次，并且采用10次测量值的平均值作为水中粒径。
描述了第一实施方案中颗粒的zeta电位的测量方法。第一实施方案中的zeta电位在颗粒分散在pH为7.8的0.01N钾水溶液中以使其浓度可以为0.001质量％的状态下测量。使用通过将0.01N氯化钾水溶液、0.01N氢氧化钾水溶液和0.01N盐酸水溶液(其各自通过使用电导率为10μS/cm以下的离子交换水来制备)适当地混合而获得的溶液作为pH为7.8的0.01N钾水溶液。通过使用ZETASIZER(Nano-ZS：Spectris Co.,Ltd.)作为测量设备在25℃下进行测量。关于分析参数，选择胶乳的折射率(n≈1.59)作为颗粒的折射率，并且选择纯水作为溶剂。测量进行10次，并且采用10次测量值的平均值作为zeta电位。
由颗粒的羧基量与当颗粒分散在离子交换水中时要在颗粒表面上形成的溶胀层的体积之间的关系来计算第一实施方案中的羧基密度。
首先，描述测量颗粒的羧基量的方法。通过使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC/HCl)作为催化剂用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使颗粒的羧基活性酯化。此后，使该活性酯与氨基乙醇反应以使NHS游离，并且通过用高效液相色谱设备测定游离NHS量来计算每单位颗粒质量的羧基量。每单位颗粒质量的羧基量的单位为nmol/mg。以下描述具体方法。
<活性酯化>
将含有2.5mg颗粒的颗粒的水分散液添加至1.5mL微量管中，并且用离心分离机将颗粒从分散液中分离出来。此外，将颗粒再分散在二甲基甲酰胺(DMF)中。前述操作进行三次。此外，在用离心分离机使颗粒沉降在微量管中的状态下，将DMF从微量管中除去。接下来，将400μL DMF、19.2mg EDC·HCl和100μL N-羟基琥珀酰亚胺的1mol/L的DMF溶液添加至微量管中，并且将混合物在25℃下振摇2小时以使颗粒的羧基活性酯化。
<NHS的游离>
为了从活性酯化的颗粒的DMF分散液中除去过量的NHS，用离心分离机将活性酯化的颗粒从分散液中分离出来，并且将颗粒再分散在DMF中；前述操作进行三次。此外，在用离心分离机使活性酯化的颗粒沉降在微量管中的状态下，将DMF从微量管中除去。接下来，将500μL氨基乙醇的1mol/L的DMF溶液添加至微量管中，并且将混合物在25℃下振摇2小时以使NHS从颗粒中游离。
<NHS的定量>
将含有游离NHS的颗粒的DMF分散液进行离心分离，并且在颗粒沉降在微量管中的状态下回收含有游离NHS的DMF溶液，然后用高效液相色谱设备来对DMF溶液中的游离NHS量进行定量。通过使用定量值来计算每单位颗粒质量的羧基量。
要用于羧基量的定量的仪器和试剂如下所述。
<仪器>
高效液相色谱设备：LC20A-FL(Shimadzu Corporation)
柱：Kinetex 5μm C18 100ALC柱150×4.6mm(Phenomenex)
洗脱液：4mmоl/L乙酸铵水溶液
流速：1.0mL/min
烘箱温度：40℃
样品注入量：1μL
在对DMF溶液中包含的游离NHS的量进行定量时，在0.1mmol/L至10mmol/L的范围内制作源自NHS的峰面积与NHS量之间的校准曲线，并且由NHS峰面积对游离NHS量进行定量。
<试剂>
EDC/HCl(Dojindo Laboratories)
NHS(Kishida Chemical Co.,Ltd.)
氨基乙醇(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)
DMF(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)
乙酸铵(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)
接下来，描述颗粒的羧基密度的计算方法。在颗粒分散在水或水溶液中的情况下，在计算要在颗粒表层上形成的溶胀层中包含的每单位体积的羧基量(即，羧基密度)时，使用在颗粒分散在离子交换水中时的水中粒径和颗粒的干燥粒径的值。此外，通过应用式(1-8)来计算羧基密度，其中在计算干燥粒径和水中粒径中的每一者时，将颗粒的密度视为1(g/cm3)。
[羧基密度(个/nm3)]＝Dd3/(Dw3-Dd3)×A×NA×10-27…式(1-8)
在式(1-8)中，Dw表示颗粒的水中粒径(nm)，Dd表示颗粒的干燥粒径(nm)，A表示每单位颗粒质量的羧基量(nmol/mg)，并且NA表示阿伏伽德罗常数。
[第二实施方案]
以下详细描述本发明的第二实施方案，但是本发明的技术范围不限于该实施方案。
第二实施方案涉及一种亲和颗粒，其包括：颗粒；和颗粒表面上的配体，该亲和颗粒的特征在于配体相对于颗粒表面的占有面积率满足式(2-1)的关系，颗粒和配体的zeta电位满足式(2-2)的关系，并且颗粒具有由式(2-3)表示的重复单元A。
10≤[占有面积率(％)]≤40…式(2-1)
0≤[||颗粒的Zeta电位|-|配体的zeta电位||]≤20…式(2-2)
[化学式5]
Figure BDA0003522627970000181
在式(2-3)中，R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以具有取代基的具有1至15个碳原子的亚烷基或可以具有取代基的具有1至15个碳原子的氧化烯基。
首先，描述颗粒。在第二实施方案中，用于通过与配体结合而获得亲和颗粒的颗粒简称为“颗粒”。
颗粒具有由式(2-3)表示的重复单元A。
式(2-3)中与酯键相邻的羟基用于减少根据第二实施方案的亲和颗粒的非特异性吸附。
在式(2-3)中，L1优选表示具有1个碳原子的亚甲基。L1的碳原子数与重复单元A的亲水性或疏水性相关，并且当L1的碳原子数变得过大时，可以促进目标物质与亲和颗粒的非特异性吸附。
优选的是，颗粒的表层包含具有重复单元A的共聚物，并且当颗粒分散在水或水溶液中时，表层含水以形成溶胀层。溶胀层的厚度与当颗粒干燥时测得的颗粒的干燥粒径与当颗粒分散在离子交换水中时测得的颗粒的水中粒径之比相关，并且干燥粒径和水中粒径优选满足式(2-5)。
1.10≤[水中粒径/干燥粒径]≤1.40…式(2-5)
通过颗粒的表层在水或水溶液中含水而形成溶胀层有助于以下几点。即，该形成有助于减少目标物质与亲和颗粒的非特异性吸附、提高当将亲和颗粒应用于凝集法(例如，胶乳凝集法)用颗粒时的灵敏度、和提高亲和颗粒的分散稳定性。
特别地，[水中粒径/干燥粒径]之比为1.10以上的事实意味着溶胀层充分地含水以使颗粒表面亲水，因此目标物质与亲和颗粒的非特异性吸附显著地受到抑制。此外，[水中粒径/干燥粒径]之比为1.10以上的事实意味着溶胀层充分地含水以提高亲和颗粒的配体的运动性，因此提高配体与目标物质之间的反应性。此外，当溶胀层充分地含水时，对亲和颗粒赋予基于排除体积效果的分散稳定性。
相比之下，当[水中粒径/干燥粒径]之比大于1.40时，溶胀层具有大的水约束力，因此将第二实施方案的亲和颗粒应用于胶乳凝集法可能会引起渗透压凝集。难以在检测机构中将渗透压凝集与疑似的非特异性凝集现象区分开。
如上所述，从非特异性吸附、当将亲和颗粒应用于胶乳凝集法时的灵敏度、亲和颗粒的分散稳定性和渗透压凝集的观点，对于溶胀层的厚度存在优选范围。鉴于前述内容，[水中粒径/干燥粒径]之比优选为1.10以上且1.40以下，更优选1.15以上且1.30以下。
当颗粒表层在水或水溶液中含水以形成溶胀层时，由式(2-3)表示的重复单元A的硫醚键为显示弱的疏水性倾向的化学结构，因此使溶胀层的水约束力适度地变弱。因此，期望对在将根据第二实施方案的亲和颗粒与试样混合时发生的渗透压凝集的抑制作用。
式(2-3)中的R2优选表示羧基。当R2表示羧基时，颗粒表层容易含有水或水溶液，并且容易含水有利于溶胀层的形成。
接下来，描述配体。配体为与特定的目标物质的受体特异性结合的化合物。配体与目标物质结合的部位是确定的，并且配体对于目标物质具有选择性或特异性的高的亲和性。配体的实例包括：抗原和抗体；酶蛋白及其底物；以激素或神经递质为代表的信号物质及其受体；核酸；以及抗生物素蛋白和生物素。然而，配体不限于此，只要可以达到第二实施方案的目的即可。配体的具体实例包括抗原、抗体、抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、F(ab′)、Fv或scFv)、天然存在的核酸、人工核酸、适体、肽适体、寡肽、酶和辅酶。
虽然使颗粒与配体彼此结合的方法在可以达到第二实施方案的目的的范围内没有限定，但是优选通过利用化学反应使配体经由源自由式(2-3)表示的重复单元A的羧基结合至颗粒表面。
在第二实施方案中，可以应用常规已知的方法作为用于使源自重复单元A的羧基和配体彼此结合的化学反应的方法，只要可以达到第二实施方案的目的即可。例如，碳二亚胺介导的反应或NHS酯活化反应为合适的实例。此外，可以进行以下：使抗生物素蛋白与羧基结合，并且使生物素修饰的配体与所得物结合。
当源自重复单元A的羧基与配体彼此结合时，通过利用化学反应可以使羧基的一部分转化为另一化学结构。在第二实施方案中，此类转化反应称为“掩蔽处理”，并且要用于掩蔽处理的试剂称为“掩蔽剂”。通常使用胺类作为掩蔽剂，并且通常使用胺类中的三羟基甲基氨基甲烷。相比之下，作为本发明人的研究结果，认识到以下会大幅提高在将根据第二实施方案的亲和颗粒应用于胶乳凝集法时的检测灵敏度。即，通过使用乙醇胺作为掩蔽剂对重复单元A的一部分的羧基进行转化以提供由式(2-6)表示的化学结构。
[化学式6]
Figure BDA0003522627970000211
在式(2-6)中，R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以具有取代基的具有1至15个碳原子的亚烷基或可以具有取代基的具有1至15个碳原子的氧化烯基。
在第二实施方案中，当使用抗体(抗原)作为配体并且使用抗原(抗体)作为目标物质时，可以非常优选地应用免疫检测中的胶乳凝集法。免疫检测作为体外诊断中试样中的目标物质的检测方法已广泛地用于例如临床检测和生物化学研究等领域。当使用通常的亲和颗粒作为胶乳凝集法用颗粒时，作为目标物质的抗原(抗体)或者血清或血浆中的异物等非特异性吸附至颗粒表面。此外，担心由于吸附而导致发生非预期的亲和颗粒间凝集会损害免疫检测的准确性。
描述了第二实施方案中颗粒的zeta电位与配体的zeta电位之间的关系。根据第二实施方案的亲和颗粒的特征在于颗粒的zeta电位和配体的zeta电位满足式(2-2)的关系。
0≤[||颗粒的Zeta电位(mV)|-|配体的zeta电位(mV)||]≤20…式(2-2)
[||颗粒的Zeta电位(mV)|-|配体的zeta电位(mV)||]之差大于20mV的情况意味着对各自通过使配体与颗粒结合而获得的亲和颗粒表面赋予具有不同符号的电荷。在该情况下，当将亲和颗粒静置保存时，存在高的发生静电异质凝集的可能性，因此在检测机构中处理亲和颗粒时需要注意。在第二实施方案中，当使用抗体或抗原作为配体时，通常的抗原或抗体的zeta电位为-10mV左右，因此颗粒的zeta电位优选为-30mV以上且-10mV以下。
根据第二实施方案的亲和颗粒的特征在于配体相对于颗粒表面的占有面积率满足式(2-1)的关系。
10≤[占有面积率(％)]≤40…式(2-1)
描述了占有面积率。一个配体的占有面积通过使用已知公式来计算，在该公式中，将配体的尺寸近似为真球体并且计算具有与该球体相同的直径的圆的面积。同时，每个颗粒的表面积通过使用已知公式来计算，在该公式中，将颗粒近似为真球体并且计算该真球体的表面积。使用颗粒的水中粒径作为其粒径。同时，配体对颗粒的致敏量(μg/mg)由实验来进行定量，并且由定量值来计算每个亲和颗粒的配体数。假定通过使单层的配体与颗粒表面结合来获得第二实施方案的亲和颗粒，通过应用单分子层吸附模型来计算占有面积率。即，将占有面积率定义为通过使用式(2-7)计算的值。
[占有面积率(％)]＝[一个配体的占有面积(nm2)]×[每个亲和颗粒的配体数(个)]/[每个颗粒的表面积(nm2)]×100…式(2-7)
当配体为抗体时，认为通常的抗体为直径8nm的真球体，因此将一个抗体的专有面积确定为约50.2nm2。占有面积率为50％意味着亲和颗粒表面的50％被抗体占据，并且对应于剩余的50％的用作底层的颗粒表面露出。
当占有面积率小于10％时，在将亲和颗粒作为胶乳凝集用颗粒应用时，可能无法获得足够的检测灵敏度，这是因为亲和颗粒经由目标物质彼此凝集的频率小。此外，当配体的占有面积率过小时，担心在亲和颗粒表面上出现化学组成的不均一性而损害亲和颗粒的分散稳定性。同时，当占有面积率大于40％时，可能会在配体之间发生相互作用而损害配体与目标物质的固有反应性。在第二实施方案中，占有面积率更优选落在15％以上且小于30％的范围内。
描述了颗粒的更优选的形式。
除了具有由式(2-3)表示的重复单元A以外，颗粒优选具有特征在于在侧链末端具有羟基的重复单元B。通过使配体与具有此类特征的颗粒结合而获得的亲和颗粒显著地抑制了非特异性吸附。为了减少非特异性吸附的目的，更优选的是颗粒的表层包含具有重复单元A和重复单元B的共聚物，并且当颗粒分散在水或水溶液中时，表层含水以形成溶胀层。
描述了重复单元B的具体化学结构。重复单元B的特征在于在其侧链末端具有羟基，并且其化学结构在可以达到第二实施方案的目的的范围内没有限定。然而，具有由式(2-4)表示的侧链结构的重复单元是更优选的。
[化学式7]
Figure BDA0003522627970000231
在式(2-4)中，R1表示甲基或氢原子，L2表示可以具有取代基的具有2至15个碳原子的亚烷基或可以具有取代基的具有2至15个碳原子的氧化烯基，X表示硫原子或可以具有取代基的氮原子，并且式(2-3)中的L1和式(2-4)中的L2满足[L1的碳原子数]+2≥[L2的碳原子数]的关系。
式(2-4)中与酯键相邻的羟基和在侧链末端的羟基用于减少颗粒的非特异性吸附。式(2-4)中的X可以表示硫原子和氮原子中的任一者，更优选表示硫原子。硫醚键为显示弱的疏水性倾向的结构。因此，当形成通过颗粒表层含水而形成的溶胀层时，使溶胀层的水约束力适度地减弱，因此期望对在将颗粒与高浓度试样混合时可能发生的渗透压凝集的抑制作用。
当对式(2-3)和式(2-4)进行比较时，构成式(2-3)中的L1的碳原子数与构成式(2-4)中的L2的碳原子数之间的关系优选满足式(2-8)的关系。当不满足式(2-8)的关系时，与源自重复单元A的侧链相比，源自重复单元B的侧链变得相对更长，因此可能会遮蔽重复单元A在其侧链末端具有的羧基。鉴于前述内容，当式(2-3)中的L1表示具有1个碳原子的亚烷基时，式(2-4)中的L2优选表示具有2个碳原子或3个碳原子的亚烷基。
[L1的碳原子数]+2≥[L2的碳原子数]…式(2-8)
当式(2-4)中的L2表示具有3个碳原子的亚烷基时，从减少颗粒的非特异性吸附的观点，亚烷基的一个氢原子被羟基取代的化学结构是更优选的。
颗粒优选具有选自由苯乙烯类和(甲基)丙烯酸酯类组成的组中的至少一种作为重复单元C，并且更优选包含源自苯乙烯类和(甲基)丙烯酸缩水甘油酯中的任一者的重复单元。本文中，“(甲基)丙烯酸酯”是指“丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯”。如本文中“背景技术”部分中所记载的，源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的重复单元具有减少颗粒的非特异性吸附的作用。同时，颗粒优选包含源自苯乙烯类中的任一者的重复单元的原因如下所述。当将颗粒通过例如离心分离或超滤等方法来纯化时，具有高的玻璃化转变温度并且在机械强度方面优异的源自苯乙烯类中的任一者的重复单元的存在有助于抑制例如破裂或碎裂等对颗粒的损伤。苯乙烯类的实例包括苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、对正丁基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯、对正己基苯乙烯、对正辛基苯乙烯、对正壬基苯乙烯、对正癸基苯乙烯、对正十二烷基苯乙烯、对甲氧基苯乙烯、和对苯基苯乙烯。然而，苯乙烯类不限于此，只要可以达到第二实施方案的目的即可。此外，可以组合使用两种以上的苯乙烯类。
当将颗粒的质量设为100质量份时，苯乙烯类的含量优选为10质量份以上且70质量份以下，这是因为在减少非特异性吸附的同时可以对颗粒赋予足够的强度。
颗粒可以进一步包含源自各自具有交联性的自由基聚合性单体中的任一者的重复单元。各自具有交联性的自由基聚合性单体的实例包括二甘醇二丙烯酸酯、三甘醇二丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、2,2′-双(4-(丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二甘醇二甲基丙烯酸酯、三甘醇二甲基丙烯酸酯、四甘醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基聚乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙烯基萘、和二乙烯基醚。然而，单体不限于此，只要可以达到第二实施方案的目的即可。此外，可以组合使用两种以上的各自具有交联性的自由基聚合性单体。
颗粒的粒径以数均粒径计优选为0.05μm以上且1.00μm以下，更优选0.05μm以上且0.50μm以下，还更优选0.05μm以上且0.30μm以下。当粒径为0.05μm以上且0.30μm以下时，颗粒容易处理，并且在将颗粒作为分散液长期保存的情况下，几乎不发生颗粒的沉降。
描述了颗粒的典型的生产方法。然而，颗粒的生产方法不限于可以达到第二实施方案的目的的程度。
颗粒的生产方法包括将(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、苯乙烯、二乙烯基苯、水和自由基聚合引发剂混合以形成粒状共聚物、由此提供粒状共聚物的水分散液的工序1。
此外，颗粒的生产方法包括通过以下工序来形成颗粒的工序2。即，首先，将水分散液、3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸混合以制备混合液。随后，使源自粒状共聚物的(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与源自3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸中的每一者的硫醇基彼此反应。
自由基聚合引发剂优选为4,4′-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2′-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺]、2,2′-偶氮双[N-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]四水合物、2,2′-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、或2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二硫酸盐二水合物中的至少一种。
此外，颗粒的生产方法包括用不含任何伯胺的有机碱将工序2的混合液的pH调节在碱性区域内的工序。在工序2中，使源自粒状共聚物的(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与源自3-巯基-1,2-丙二醇和巯基琥珀酸中的每一者的硫醇基从粒状共聚物的表面沿其深度方向反应。为了在颗粒上形成具有足够厚度的表层，优选选择对粒状共聚物具有渗透性的三乙胺作为有机碱。
形成粒状共聚物的方法不限于使用自由基聚合，只要可以达到第二实施方案的目的即可。
当应用自由基聚合时，优选使用乳液聚合、无皂乳液聚合或悬浮聚合，并且更优选使用乳液聚合或无皂乳液聚合。还更优选使用无皂乳液聚合。
通常，乳液聚合和无皂乳液聚合可以各自提供具有比通过悬浮聚合提供的粒状共聚物更尖锐的粒径分布的粒状共聚物。此外，当使配体与颗粒结合以提供亲和颗粒时，担心通常要用于乳液聚合的阴离子性表面活性剂或阳离子性表面活性剂作为残余物存在而使配体改性。鉴于前述内容，当通过乳液聚合形成粒状共聚物时，优选使用非离子性表面活性剂。
根据第二实施方案的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂的特征在于包含根据第二实施方案的亲和颗粒作为胶乳凝集法用颗粒。
试剂中包含的胶乳凝集法用颗粒的量优选为0.001质量％以上且20质量％以下，更优选0.01质量％以上且10质量％以下。
除了根据第二实施方案的亲和颗粒以外，根据第二实施方案的试剂还可以包含例如溶剂或封闭剂等第三物质，只要可以达到第二实施方案的目的即可。
要用于第二实施方案的溶剂的实例包括各种水系缓冲液，例如磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good's缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液和氨缓冲液。然而，根据第二实施方案的试剂中包含的溶剂不限于此。
根据第二实施方案的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒的特征在于至少包含根据第二实施方案的试剂。
除了根据第二实施方案的试剂(下文中称为“试剂1”)以外，根据第二实施方案的试剂盒优选进一步包含含有白蛋白的反应缓冲液(下文中称为“试剂2”)。白蛋白为例如血清白蛋白，并且可以进行蛋白酶处理。作为标准，试剂2中包含的白蛋白的量为0.001质量％以上且5质量％以下，但是根据第二实施方案的试剂盒中的白蛋白的量不限于此。
试剂1和试剂2二者中的每一者或者其中一者可以包含胶乳凝集测定用敏化剂。胶乳凝集测定用敏化剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸。然而，要用于根据第二实施方案的试剂盒的敏化剂不限于此。
此外，除了试剂1和试剂2以外，根据第二实施方案的试剂盒可以包含例如阳性对照、阴性对照或血清稀释液。除了不含可以进行测定的目标物质的血清或生理盐水以外，还可以使用溶剂作为阳性对照或阴性对照的介质。
根据第二实施方案的试剂盒可以与通常的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒同样地用于根据第二实施方案的目标物质的检测方法。此外，目标物质的浓度可以通过常规已知的方法来测量，并且该方法特别适合于通过胶乳凝集法检测试样中的目标物质。
根据第二实施方案的通过体外诊断检测试样中的目标物质的方法的特征在于包括将根据第二实施方案的亲和颗粒与可能包含目标物质的试样混合。
根据第二实施方案的亲和颗粒和试样优选在pH 3.0至11.0的范围内混合。此外，混合温度落在20℃至50℃的范围内，并且混合时间落在1分钟至20分钟的范围内。此外，在该检测方法中，优选使用溶剂。此外，根据第二实施方案的检测方法中的根据第二实施方案的亲和颗粒在反应体系中的浓度优选为0.001质量％以上且5质量％以下，更优选0.01质量％以上且1质量％以下。根据第二实施方案的检测方法的特征在于包括对由根据第二实施方案的亲和颗粒与试样的混合的结果而引起的颗粒间凝集进行光学检测。当对颗粒间凝集进行光学检测时，检测到试样中的目标物质，并且可以测量目标物质的浓度。作为光学检测凝集反应的方法，仅需要使用可以检测散射光强度、透射光强度和吸光度等光学仪器来测量这些值的变化量。
描述了第二实施方案中颗粒的干燥粒径的测量方法。第二实施方案中的干燥粒径为数均粒径，并且在颗粒充分干燥的状态下测量。具体地，将颗粒以5质量％的浓度分散在离子交换水中，并且将分散液滴加至铝箔上，然后在25℃下干燥48小时。此后，将干燥产物用真空干燥机进一步干燥24小时，然后进行测量。将扫描电子显微镜和图像处理分析仪用于干燥粒径的测量。具体地，例如，从处于干燥状态的颗粒的图像中随机抽取100个单个颗粒，该图像使用扫描电子显微镜(商品名：S-4800，由Hitachi High-TechnologiesCorporation制造)来获得，并且通过用图像处理分析仪(商品名：Luzex AP，由NirecoCorporation制造)分析图像来计算它们的数均粒径。
描述了第二实施方案中颗粒的水中粒径的测量方法。第二实施方案中的水中粒径为数均粒径，并且在颗粒分散在离子交换水中以使它们的浓度可以为0.001质量％的状态下测量。使用电导率为10μS/cm以下的离子交换水作为离子交换水。将动态光散射法应用于水中粒径的测量。具体地，使用ZETASIZER(商品名：Nano-ZS，由Spectris Co.,Ltd.制造)在25℃下进行测量。关于分析参数，选择胶乳的折射率(n≈1.59)作为颗粒的折射率，并且选择纯水作为溶剂。测量进行10次，并且采用10次测量值的平均值作为水中粒径。
描述了第二实施方案中亲和颗粒的水中粒径的测量方法。第二实施方案中的水中粒径为数均粒径，并且在亲和颗粒分散在pH为7.8的0.01N钾水溶液中以使它们的浓度可以为0.001质量％的状态下测量。使用通过将0.01N氯化钾水溶液、0.01N氢氧化钾水溶液和0.01N盐酸水溶液(其各自通过使用电导率为10μS/cm以下的离子交换水来制备)适当地混合而获得的溶液作为pH为7.8的0.01N钾水溶液。将动态光散射法应用于水中粒径的测量。具体地，使用ZETASIZER(商品名：Nano-ZS，由Spectris Co.,Ltd.制造)在25℃下进行测量。关于分析参数，选择胶乳的折射率(n≈1.59)作为亲和颗粒的折射率，并且选择纯水作为溶剂。测量进行10次，并且采用10次测量值的平均值作为水中粒径。
描述了第二实施方案中颗粒或亲和颗粒的zeta电位的测量方法。第二实施方案中的zeta电位在颗粒分散在pH为7.8的0.01N钾水溶液中以使其浓度可以为0.001质量％的状态下测量。使用通过将0.01N氯化钾水溶液、0.01N氢氧化钾水溶液和0.01N盐酸水溶液(其各自通过使用电导率为10μS/cm以下的离子交换水来制备)适当地混合而获得的溶液作为pH为7.8的0.01N钾水溶液。通过使用ZETASIZER(商品名：Nano-ZS，由Spectris Co.,Ltd.制造)作为测量设备在25℃下进行测量。关于分析参数，选择胶乳的折射率(n≈1.59)作为颗粒的折射率，并且选择纯水作为溶剂。测量进行10次，并且采用10次测量值的平均值作为zeta电位。
描述了第二实施方案中抗体的zeta电位的测量方法。第二实施方案中的抗体的zeta电位在将抗体溶液用至少为该溶液的10倍量的pH为7.8的0.01N钾水溶液稀释以使蛋白浓度为0.5mg/mL至2.0mg/mL的状态下测量。使用通过将0.01N氯化钾水溶液、0.01N氢氧化钾水溶液和0.01N盐酸水溶液(其各自通过使用电导率为10μS/cm以下的离子交换水来制备)适当地混合而获得的溶液作为pH为7.8的0.01N钾水溶液。使用ZETASIZER(商品名：Nano-ZS，由Spectris Co.,Ltd.制造)作为测量设备在25℃下进行测量。关于分析参数，选择蛋白的折射率(n≈1.4)作为抗体的折射率，并且选择纯水作为溶剂。测量进行10次，并且采用10次测量值的平均值作为zeta电位。
[第三实施方案]
以下详细描述本发明的第三实施方案，但是本发明的技术范围不限于该实施方案。首先，描述第三实施方案的背景技术和该实施方案要解决的问题。
(第三实施方案的背景技术和该实施方案要解决的问题)
近年来，已经广泛地进行了使用通过使对目标物质具有亲和性的配体与颗粒彼此化学结合而获得的亲和颗粒来纯化目标物质或者对其进行定量的研究。期望要用于此类目的的颗粒小程度地显示吸附除目标物质以外的物质的特性(即，所谓的非特异性吸附性)。在例如Bioseparation using Affinity Latex(1995)第11页至第30页中，公开了通过包括使用苯乙烯和甲基丙烯酸缩水甘油酯两种单体的乳液聚合而获得的表面覆盖有聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的树脂颗粒(下文中称为“SG颗粒”)。此外，在日本专利申请特开No.2014-193972中，公开了SG颗粒的粒径控制方法。
在SG颗粒中，源自聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基的一部分经历开环以提供二醇，并且，作为二醇的亲水性的结果，非特异性吸附受到抑制。同时，当配体与SG颗粒表面化学结合时，可以原样利用源自聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基。然而，在通常的情况下，通常采用以下方法：在经过将各环氧基转化为另一反应性官能团例如羧基、氨基或硫醇基的工序之后，使反应性官能团与配体彼此发生化学反应。通过将SG颗粒的环氧基转化为此类基团中的羧基而获得的颗粒为优选的形式，这是因为该颗粒在配体与颗粒表面化学结合时具有最高的通用性。
此外，近年来，作为简便且快速的免疫检测方法，免疫胶乳凝集测定法已引起关注。在该方法中，将通过化学结合作为配体的抗体或抗原而获得的颗粒的分散液与可能包含目标物质(抗原或抗体)的试样混合。此时，当试样包含目标物质(抗原或抗体)时，颗粒引起凝集反应，因此可以通过将该凝集反应作为例如散射光强度、透射光强度或吸光度等的变化量进行光学检测来确定疾病的有无。为了减少假阳性噪音的目的，要用于免疫胶乳凝集测定法的颗粒优选具有小的非特异性吸附性并且具有用于固定配体的反应性官能团，如SG颗粒。
本发明人按照Bioseparation using Affinity Latex(1995)第11页至第30页合成SG颗粒，并且使氨基酸与SG颗粒的源自甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基发生化学反应以提供将环氧基转化为羧基的颗粒。然而，如上所述获得的颗粒的抑制非特异性吸附的能力比SG颗粒差。
同时，已知将羧基引入至SG颗粒中的方法。通过如下来获得引入羧基的颗粒：用氨水处理SG颗粒；然后使经处理的产物与乙二醇二缩水甘油醚发生化学反应；并且使源自上述乙二醇二缩水甘油醚的环氧基与氨基酸彼此发生化学反应。虽然如上所述获得的颗粒令人惊讶地抑制非特异性吸附，但是颗粒的分散稳定性过于优异以致颗粒几乎不彼此凝集，因此当将该颗粒用于免疫胶乳凝集法时，在一些情况下无法获得足够的灵敏度。此外，如上所述获得的颗粒涉及该颗粒由于化学反应需要很多工序并且工序复杂而不适合于工业化的问题。
鉴于此类背景技术和问题，做出了第三实施方案。第三实施方案的目的在于提供一种颗粒，其引起小的非特异性吸附、具有用于化学结合配体的反应性官能团并且适合于胶乳凝集法。第三实施方案的另一目的在于提供通过化学结合配体而获得的胶乳凝集法用颗粒、和各自包含颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒、以及目标物质的检测方法。
具体地，第三实施方案的目的在于提供一种颗粒，其具有与SG颗粒等同或更优异的抑制非特异性吸附的能力并且具有能够以高收率使配体与颗粒表面化学结合的反应性官能团。其另一目的在于提供简便且以高收率生产该颗粒的新方法。第三实施方案的又一目的在于提供通过化学结合作为配体的抗原或抗体而获得的亲和颗粒、和各自包含该颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒、以及目标物质的检测方法。
(关于根据第三实施方案的发明效果)
根据第三实施方案，可以提供如下颗粒和简便且以高收率生产该颗粒的新方法，所述颗粒具有与SG颗粒等同或更优异的抑制非特异性吸附的能力并且具有用于以高收率使配体与颗粒表面化学结合的反应性官能团。此外，根据第三实施方案，可以提供通过化学结合作为配体的抗原或抗体而获得的亲和颗粒、各自包含该颗粒的体外诊断用试剂和试剂盒、以及目标物质的检测方法。
以下描述关于第三实施方案的颗粒的细节。
根据本发明的第三实施方案的颗粒包含共聚物。共聚物中的重复单元A具有用于使配体与其侧链化学结合的反应性官能团。重复单元具有羧基作为用于使配体与侧链化学结合的反应性官能团。具体地，根据该实施方案的颗粒的特征在于该颗粒包含含有“重复单元A”的共聚物，并且重复单元A由式(3-1)表示。
[化学式8]
Figure BDA0003522627970000321
在式(3-1)中，R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以被取代的具有1至15个碳原子的亚烷基或可以被取代的具有1至15个碳原子的氧化烯基。
第三实施方案中的“重复单元A”隔着硫醚基具有羧基。羧基要与配体化学结合，并且当颗粒具有重复单元A的结构时，可以使配体以高收率与颗粒表面化学结合。因此，当将该颗粒用于免疫胶乳凝集测定法时，可以以高灵敏度检测到目标物质。虽然关于前述情况的细节是未知的，但是推测前述情况是因为重复单元的侧链与重复单元经由氨基具有羧基的情况相比几乎不被质子化，因此使颗粒静电稳定。此外，虽然关于前述情况的机理的细节是未知的，但是当适当地控制羧酸与硫醚基之间的距离时，可以以高灵敏度检测到目标物质。
此外，第三实施方案的颗粒的每单位质量的羧酸量优选为5[nmol/mg]以上，更优选100[nmol/mg]以上。结果，可以使大量的配体以高收率与颗粒表面化学结合。因此，当将该颗粒用于免疫胶乳凝集测定法时，可以以高灵敏度检测到目标物质。此外，第三实施方案的颗粒的每单位质量的羧酸量优选为300[nmol/mg]以下。当将每单位质量的羧酸量控制在该范围内时，可以抑制除目标物质以外的物质的非特异性吸附。
此外，第三实施方案的颗粒的数均粒径优选为0.05μm以上且1μm以下。当将数均粒径控制在该范围内时，在将该颗粒用于免疫胶乳凝集测定法的情况下，可以兼顾非凝集时的颗粒的分散稳定性和凝集时的浊度变化(即，优异的检测灵敏度)二者。
此外，第三实施方案的颗粒可以以每单位面积的羧酸量来表示，并且在该情况下，每单位面积的羧酸量优选为0.1至20[个分子/nm2]。前述情况使得能够抑制除目标物质以外的物质的非特异性吸附，并且兼顾非凝集时颗粒的分散稳定性和凝集时的浊度变化(即，优异的检测灵敏度)二者。
此外，第三实施方案的颗粒可以包含用于抑制非特异性吸附的具有亲水性结构的“重复单元B”。优选使用通过源自聚甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基的一部分的开环而获得的二醇结构、或者在侧链上具有硫醚基或仲胺和两个羟基的结构作为“重复单元B”。这些侧链的存在可以抑制除目标物质以外的物质的非特异性吸附。
此外，从颗粒强度和耐溶剂性的观点，第三实施方案的颗粒可以包含具有疏水性结构的“重复单元C”。虽然“重复单元C”的化学结构在可以实现第三实施方案的目的的范围内没有限定，但是选自由苯乙烯类和(甲基)丙烯酸酯类组成的组中的至少一种是优选的。重复单元C源自前述化合物中的苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯或这两种化合物的情况是优选的，这是因为重复单元C具有高的玻璃化转变温度，因此颗粒具有充分的强度。以下描述可以用于“重复单元C”的苯乙烯类和(甲基)丙烯酸酯类的实例，但是“重复单元C”不限于此。此外，疏水性“重复单元C”可以使用两种以上的油性自由基聚合性单体。
苯乙烯类的实例包括苯乙烯、α-甲基苯乙烯、β-甲基苯乙烯、邻甲基苯乙烯、间甲基苯乙烯、对甲基苯乙烯、2,4-二甲基苯乙烯、对正丁基苯乙烯、对叔丁基苯乙烯、对正己基苯乙烯、对正辛基苯乙烯、对正壬基苯乙烯、对正癸基苯乙烯、对正十二烷基苯乙烯、对甲氧基苯乙烯、和对苯基苯乙烯。
(甲基)丙烯酸酯类的实例包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸正己酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸正辛酯、丙烯酸正壬酯、丙烯酸环己酯、丙烯酸苄酯、二甲基磷酸酯乙基丙烯酸酯、二乙基磷酸酯乙基丙烯酸酯、二丁基磷酸酯乙基丙烯酸酯、2-苯甲酰氧基乙基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸正丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸正戊酯、甲基丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正壬酯、二乙基磷酸酯乙基甲基丙烯酸酯、和二丁基磷酸酯乙基甲基丙烯酸酯。
此外，在第三实施方案中，为了进一步提高颗粒的强度，可以包含交联性自由基聚合性单体。交联性自由基聚合性单体为在分子中具有两个以上的自由基聚合性基团的化合物，并且其实例可以包括：各自具有两个以上的自由基聚合性基团和芳香族环的自由基聚合性芳香族化合物，例如，芳香族二乙烯基化合物例如二乙烯基苯(DVB)、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯、二乙烯基蒽、二乙烯基萘和二乙烯基杜烯，芳香族三乙烯基化合物例如三乙烯基苯，和芳香族四乙烯基化合物例如四乙烯基苯；和各自具有两个以上的自由基聚合性基团和脂肪族基团的自由基聚合性脂肪族化合物，例如季戊四醇四丙烯酸酯。
此外，当使用疏水性重复单元C时，重复单元A、B和C的组成比在可以实现第三实施方案的目的的范围内没有限定。
第三实施方案的颗粒的粒径以水中数均粒径计为0.05μm以上且1μm以下，优选0.1μm以上且0.5μm以下，更优选0.15μm以上且0.3μm以下。当粒径为0.15μm以上且0.3μm以下时，颗粒在离心操作中在可操作性方面优异，并且作为颗粒的特征的大的比表面积变得突出。第三实施方案的颗粒的数均粒径通过动态光散射法来评价。
此外，第三实施方案涉及通过使源自第三实施方案的颗粒的"重复单元A"的羧基与配体彼此化学结合而获得的亲和颗粒。
配体为与特定的目标物质所具有的受体特异性结合的化合物。配体与目标物质结合的部位是确定的，并且配体对于目标物质具有选择性或特异性的高的亲和性。配体的实例包括：抗原和抗体；酶蛋白及其底物；例如激素或神经递质等信号物质及其受体；核酸；以及抗生物素蛋白和生物素。然而，配体不限于此。配体的具体实例包括抗原、抗体、抗原结合片段(例如，Fab、F(ab′)2、F(ab′)、Fv或scFv)、天然存在的核酸、人工核酸、适体、肽适体、寡肽、酶和辅酶。第三实施方案中的亲和颗粒意指对于目标物质具有选择性或特异性的高的亲和性的颗粒。
在第三实施方案中，可以应用常规已知的方法作为用于使源自第三实施方案的颗粒的"重复单元A"的羧基和配体彼此化学结合的化学反应的方法，只要可以实现第三实施方案的目的即可。例如，碳二亚胺介导的反应或NHS酯活化反应为经常使用的化学反应方法。此外，以下方法是可用的：使抗生物素蛋白与颗粒的羧基结合，并且使生物素修饰的配体与抗生物素蛋白结合。然而，用于使源自第三实施方案的颗粒的“重复单元A”的羧基和配体彼此化学结合的化学反应的方法不限于此。
当使用抗体(抗原)作为配体并且使用抗原(抗体)作为目标物质时，可以将第三实施方案的亲和颗粒优选应用于已广泛地用于例如临床检测和生物化学研究等领域的免疫胶乳凝集测定法。当将通常的颗粒应用于免疫胶乳凝集测定法时，存在如下问题：作为目标物质的抗原(抗体)或血清中的异物等非特异性地吸附至颗粒表面，并且检测到由吸附导致的非预期的颗粒凝集，从而妨碍准确的测量。
因此，为了减少假阳性噪音等的目的，通常使用涂覆有例如白蛋白等生物来源的物质作为封闭剂的颗粒，从而可以抑制对颗粒表面的非特异性吸附。然而，此类生物来源的物质的特性因批次而略有不同，因此涂覆有此类物质的颗粒的抑制非特异性吸附的能力因涂覆处理而不同。因此，在稳定供给具有相同水平的抑制非特异性吸附的能力的颗粒方面存在问题。此外，颗粒表面涂覆的生物来源的物质在被改性时可能会呈现疏水性，因此不一定在抑制非特异性吸附的能力方面优异。生物污染也是一个问题。
在专利文献2中，公开了一种用于体外诊断的亲和颗粒，其特征在于颗粒涂覆有具有在侧链上具有硫基(sulfenyl group)的重复单元的聚合物，所述聚合物用作封闭剂。然而，具有在侧链上具有硫基的重复单元的聚合物是水溶性的并且通过物理吸附覆盖颗粒表面，因此，本质上，担心共聚物由于其稀释而游离。此外，本发明人评价了通过Bioseparation using Affinity Latex(1995)第11页至第30页中记载的方法获得的SG颗粒和通过使聚合物在乳糜(chyle)中吸附至通过日本专利申请特开No.2014-153140中记载的方法获得的聚苯乙烯颗粒而获得的颗粒的抑制非特异性吸附的能力。
在通过日本专利申请特开No.2014-153140中记载的方法获得的颗粒中，通过无皂乳液聚合来获得具有在侧链上具有硫基的重复单元的聚合物。
结果，虽然存在无法完全重现Bioseparation using Affinity Latex(1995)第11页至第30页的可能性，但是与通过日本专利申请特开No.2014-153140中记载的方法获得的颗粒相比，SG颗粒在抑制非特异性吸附的能力方面更优异。本文中，SG颗粒为通过借助在酸性水溶液中加热将源自甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基转化为二醇而获得的颗粒。
第三实施方案的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂的特征在于包含第三实施方案的亲和颗粒。第三实施方案的试剂中包含的第三实施方案的亲和颗粒的量优选为0.001质量％至20质量％，更优选0.01质量％至10质量％。除了第三实施方案的亲和颗粒以外，第三实施方案的试剂还可以包含例如溶剂或封闭剂等第三物质，只要可以实现第三实施方案的目的即可。试剂可以组合包含两种以上的第三物质例如溶剂和封闭剂。要用于第三实施方案的溶剂的实例包括各种缓冲液，例如磷酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、氨缓冲液、以及МES(2-吗啉代乙磺酸)、ADA(N-(2-乙酰氨基)亚氨基二乙酸)、PIPES(哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸))、ACES(N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、氯化胆胺、BES(N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸)、TES(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)、HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸)、乙酰氨基甘氨酸、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、甘氨酰胺和N,N-二羟乙基甘氨酸(bicine)的Good's缓冲液。然而，第三实施方案的试剂中包含的溶剂不限于此。
第三实施方案的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒的特征在于至少包含第三实施方案的试剂。除了第三实施方案的试剂(下文中称为“试剂1”)以外，第三实施方案的试剂盒优选进一步包含含有白蛋白的反应缓冲液(下文中称为"试剂2")。白蛋白为例如血清白蛋白，并且可以进行蛋白酶处理。作为标准，试剂2中包含的白蛋白的量为0.001质量％至5质量％，但是第三实施方案的试剂盒中的白蛋白的量不限于此。试剂1和试剂2二者中的每一者或者其中一者可以包含胶乳凝集测定用敏化剂。胶乳凝集测定用敏化剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和海藻酸。然而，要用于第三实施方案的试剂盒的敏化剂不限于此。此外，除了试剂1和试剂2以外，第三实施方案的试剂盒可以包含例如阳性对照、阴性对照或血清稀释液。除了不含可以进行测定的目标物质的血清或生理盐水以外，还可以使用溶剂作为阳性对照或阴性对照的介质。第三实施方案的试剂盒可以与通常的用于通过体外诊断检测试样中的目标物质的试剂盒同样地用于第三实施方案的目标物质的检测方法。此外，目标物质的浓度可以通过常规已知的方法来测量，并且该方法特别适合于通过凝集法、特别是胶乳凝集法来检测试样中的目标物质。
第三实施方案的通过体外诊断检测试样中的目标物质的方法的特征在于包括将第三实施方案的亲和颗粒与可能包含目标物质的试样混合，并且可以用于凝集法。此外，第三实施方案的亲和颗粒和试样优选在pH 3.0至11.0的范围内混合。此外，混合温度落在20℃至50℃的范围内，并且混合时间落在1分钟至20分钟的范围内。此外，在该检测方法中，优选使用溶剂。此外，第三实施方案的检测方法中的第三实施方案的亲和颗粒在反应体系中的浓度优选为0.001质量％至5质量％，更优选0.01质量％至1质量％。第三实施方案的检测方法的特征在于包括对由第三实施方案的亲和颗粒与试样的混合的结果而引起的凝集反应进行光学检测。当对该凝集反应进行光学检测时，检测到试样中的目标物质，并且可以测量目标物质的浓度。作为光学检测凝集反应的方法，仅需要使用可以检测散射光强度、透射光强度和吸光度等的光学仪器来测量这些值的变化量。
接下来，描述第三实施方案的颗粒的优选生产方法。
第三实施方案为一种颗粒的生产方法，该方法的特征在于包括：将(甲基)丙烯酸缩水甘油酯、苯乙烯或(甲基)丙烯酸甲酯、水和自由基聚合引发剂混合以形成粒状共聚物、由此提供粒状共聚物的水分散液的工序1；和将水分散液与巯基琥珀酸或巯基丙酸混合以制备混合液，然后使源自粒状共聚物的(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与源自巯基琥珀酸或巯基丙酸的硫醇基彼此反应的工序2。
首先，描述工序1。工序1为形成粒状共聚物的工序，但是形成粒状共聚物的方法不限于自由基聚合，只要可以实现第三实施方案的目的即可。在各种自由基聚合中，优选使用乳液聚合、无皂乳液聚合或悬浮聚合，并且更优选使用乳液聚合或无皂乳液聚合。还更优选使用无皂乳液聚合。通常，乳液聚合和无皂乳液聚合可以各自提供具有比通过悬浮聚合提供的粒状共聚物更尖锐的粒径分布的粒状共聚物。此外，当使颗粒与配体化学结合时，担心通常要用于乳液聚合的此类阴离子性表面活性剂的存在使配体改性。因此，形成粒状共聚物的方法最优选为无皂乳液聚合。
优选用于工序1的自由基聚合引发剂为4,4′-偶氮双(4-氰基戊酸)、2,2′-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟基乙基)丙酰胺]、2,2′-偶氮双[N-(2-羧基乙基)-2-甲基丙脒]四水合物、2,2′-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐和2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二硫酸盐二水合物中的一种。其中，更优选使用2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐、2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二硫酸盐二水合物、2,2′-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐和2,2′-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]中的一种。这是因为在提供粒状共聚物的水分散液的工序1中，需要防止源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基的开环。例如，当使用过硫酸钾作为自由基聚合引发剂时，自由基聚合反应场在引发剂残基的影响下变为酸性，因此源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基可以与水反应以形成二醇。此外，当使用过硫酸铵作为自由基聚合引发剂时，源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与氨可以彼此反应。此外，当使用具有羧基的阴离子性自由基聚合引发剂作为自由基聚合引发剂时，源自(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与源自聚合引发剂的羧基彼此反应以使粒状共聚物的颗粒凝集。用于避免凝集的可行手段如下：在显著低于自由基聚合引发剂的10小时半衰期温度的温度下形成粒状共聚物。然而，该手段不适合于工业化，这是因为需要大量的自由基聚合引发剂并且自由基聚合时间变长。
此外，在工序1中，除了(甲基)丙烯酸缩水甘油酯和苯乙烯或(甲基)丙烯酸甲酯以外，优选进一步包含交联性自由基聚合性单体。包含交联性自由基聚合性单体使获得的粒状共聚物在物理上牢固，因此，即使在纯化时重复进行离心操作时，也无需担心共聚物的破裂或碎裂。
以下列出可以用于第三实施方案的交联性自由基聚合性单体的实例，但是第三实施方案不限于此。此外，可以使用两种以上的油性自由基聚合性单体。在示例的自由基聚合性单体中，由于二乙烯基苯在自由基聚合反应时优异的可操作性而优选使用二乙烯基苯，尽管二乙烯基苯在可操作性方面优异的原因是未知的。
交联性自由基聚合性单体的实例包括二甘醇二丙烯酸酯、三甘醇二丙烯酸酯、四甘醇二丙烯酸酯、聚乙二醇二丙烯酸酯、1,6-己二醇二丙烯酸酯、新戊二醇二丙烯酸酯、三丙二醇二丙烯酸酯、聚丙二醇二丙烯酸酯、2,2′-双(4-(丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二甘醇二甲基丙烯酸酯、三甘醇二甲基丙烯酸酯、四甘醇二甲基丙烯酸酯、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯、1,3-丁二醇二甲基丙烯酸酯、1,6-己二醇二甲基丙烯酸酯、新戊二醇二甲基丙烯酸酯、聚丙二醇二甲基丙烯酸酯、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基二乙氧基)苯基)丙烷、2,2′-双(4-(甲基丙烯酰氧基聚乙氧基)苯基)丙烷、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、四羟甲基甲烷四甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、二乙烯基萘、和二乙烯基醚。
此外，工序1优选进一步包含在形成粒状共聚物的过程中将(甲基)丙烯酸缩水甘油酯进一步混合至混合物中以用聚(甲基)丙烯酸缩水甘油酯覆盖粒状共聚物的表面的工序。本文中，表面涂覆有聚合物的状态可以为任何结合状态。即，聚合物不一定需要覆盖整个颗粒，并且可以覆盖颗粒的一部分，并且覆盖聚合物的层可能不是均一的。
接下来，描述工序2。工序2为使源自粒状共聚物的(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与源自巯基琥珀酸或巯基丙酸的硫醇基彼此反应以隔着硫醚基引入羧基的工序。
在工序2中，可以添加碱性组分以调节混合液的pH。虽然对碱性组分没有特别限制，优选使用具有仲胺或叔胺的有机碱。例如，优选使用吡啶、三乙胺、二氮杂双环十一碳烯或1,8-双(二甲基氨基)萘作为具有仲胺或叔胺的有机碱，并且更优选使用三乙胺。可以组合使用两种以上的有机碱。
此外，在工序2中，可以通过调节混合液的pH来控制羧酸量。特别地，当将pH调节在大于9.0的范围内时，可以将大量的羧酸添加至要生产的颗粒中。此外，更优选将pH设定为大于10.0，这是因为可以将更大量的羧酸添加至要生产的颗粒中。
<羧酸定量分析方法>
首先，描述测量颗粒的羧基量的方法。通过使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC/HCl)作为催化剂，用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)使颗粒的羧基活性酯化。此后，使活性酯与氨基乙醇反应以使NHS游离，并且通过用高效液相色谱设备测定游离NHS量来计算每单位颗粒质量的羧基量。每单位颗粒质量的羧基量的单位为nmol/mg。以下描述具体方法。
<活性酯化>
将含有2.5mg颗粒的颗粒的水分散液添加至1.5mL微量管中，并且用离心分离机将颗粒从分散液中分离出来。此外，将颗粒再分散在二甲基甲酰胺(DMF)中。前述操作进行三次。此外，在用离心分离机使颗粒沉降在微量管中的状态下，将DMF从微量管中除去。接下来，将400μL DMF、19.2mg EDC·HCl和100μL N-羟基琥珀酰亚胺的1mol/L的DMF溶液添加至微量管中，并且将混合物在25℃下振摇2小时以使颗粒的羧基活性酯化。
<NHS的游离>
为了从活性酯化的颗粒的DMF分散液中除去过量的NHS，用离心分离机将活性酯化的颗粒从分散液中分离出来，并且将颗粒再分散在DMF中；前述操作进行三次。此外，在用离心分离机使活性酯化的颗粒沉降在微量管中的状态下，将DMF从微量管中除去。接下来，将500μL氨基乙醇的1mol/L的DMF溶液添加至微量管中，并且将混合物在25℃下振摇2小时以使NHS从颗粒中游离。
<NHS的定量>
将含有游离NHS的颗粒的DMF分散液进行离心分离，并且在颗粒沉降在微量管中的状态下回收含有游离NHS的DMF溶液，然后用高效液相色谱设备对DMF溶液中的游离NHS量进行定量。通过使用定量值来计算每单位颗粒质量的羧基量。
要用于羧基量的定量的仪器和试剂如下所述。
<仪器>
高效液相色谱设备：LC20A-FL(Shimadzu Corporation)
柱：Kinetex 5μm C18 100ALC柱150×4.6mm(Phenomenex)
洗脱液：4mmоl/L乙酸铵水溶液
流速：1.0mL/min
烘箱温度：40℃
样品注入量：1μL
在对DMF溶液中包含的游离NHS量进行定量时，在0.1mmol/L至10mmol/L的范围内制作源自NHS的峰面积与NHS量之间的校准曲线，并且由NHS峰面积对游离NHS量进行定量。
<试剂>
EDC/HCl(Dojindo Laboratories)
NHS(Kishida Chemical Co.,Ltd.)
氨基乙醇(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)
DMF(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)
乙酸铵(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)
实施例
下文中，通过对应于第一实施方案的实施例的方式详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
[实施例1-1]
(粒状共聚物1-1的合成)
在2L四颈可分离烧瓶中称量22.7g苯乙烯(St：Kishida Chemical Co.,Ltd.)、33.9g甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA：Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)、0.86g二乙烯基苯(DVB：Kishida Chemical Co.,Ltd.)和2,168.6g离子交换水以提供混合液。此后，将混合液保持在70℃，同时以200rpm搅拌，并且使氮气以200mL/min的流量流过以从三颈可分离烧瓶内部除去氧。接下来，将另外制备的通过将1.13g V-50(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation)溶解于30g离子交换水中来获得的溶解液添加至混合液中以引发无皂乳液聚合。聚合开始2小时后，将5.8g GMA添加至四颈可分离烧瓶中，并且将混合物保持在70℃，同时以200rpm搅拌22小时。由此，获得含有粒状共聚物1-1的水分散液。在将分散液逐渐冷却至室温之后，收集一部分分散液，并且其聚合转化率通过使用质子NMR、气相色谱法和凝胶渗透色谱法来评价。结果，确认到聚合转化率基本为100％。粒状共聚物1-1的干燥粒径为196.6nm并且水中粒径为206.9nm。对粒状共聚物1-1进行超滤浓缩，或者通过添加离子交换水来稀释，以成为2.5wt％的水分散液，并且将分散液在遮光条件下、在4℃下保存。
[实施例1-2]
(粒状共聚物1-2的合成)
除了在实施例1-1中将22.7g St改变为12.0g、将33.9g GMA改变为17.9g、将0.86g二乙烯基苯改变为0.45g并且将聚合开始2小时后要添加至三颈可分离烧瓶中的GMA的量由5.8g改变为3.1g以外，以与实施例1-1中相同的方式获得粒状共聚物2的水分散液。在将分散液逐渐冷却至室温之后，收集一部分分散液，并且其聚合转化率通过使用质子NMR、气相色谱法和凝胶渗透色谱法来评价。结果，确认到聚合转化率基本为100％。粒状共聚物1-2的干燥粒径为151.4nm并且水中粒径为160.2nm。对粒状共聚物1-2进行超滤浓缩，或者通过添加离子交换水来稀释，以成为2.5wt％的水分散液，并且将分散液在遮光条件下、在4℃下保存。
[实施例1-3]
(粒状共聚物1-3的合成)
除了在实施例1-1中将22.7g St改变为5.0g、将33.9g GMA改变为7.5g、将0.86g二乙烯基苯改变为0.19g并且将聚合开始2小时后要添加至三颈可分离烧瓶中的GMA的量由5.8g改变为1.3g以外，以与实施例1-1中相同的方式获得粒状共聚物1-3的水分散液。在将分散液逐渐冷却至室温之后，收集一部分分散液，并且其聚合转化率通过使用质子NMR、气相色谱法和凝胶渗透色谱法来评价。结果，确认到聚合转化率基本为100％。粒状共聚物1-3的干燥粒径为96.8nm并且水中粒径为105.2nm。对粒状共聚物1-3进行超滤浓缩，或者通过添加离子交换水来稀释，以成为2.5wt％的水分散液，并且将分散液在遮光条件下、在4℃下保存。
[实施例1-4]
(颗粒1-1的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量24g的粒状共聚物1-1的2.5wt％水分散液、3.3g离子交换水、40mg(0.26mmol)巯基琥珀酸(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)和0.214mL(2.34mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)，并且将三乙胺(Kishida Chemical Co.,Ltd.)添加至混合物中以将其pH调节至10。接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持4小时以提供颗粒1-1的分散液。用离心分离机将颗粒1-1从分散液中分离出来，并且将颗粒1-1再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒1-1，以其中颗粒1-1的浓度最终调节至1.0wt％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表1-1总结了颗粒1-1的颗粒物性。
[实施例1-5]
(颗粒1-2的合成)
除了在实施例1-4中将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为6小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-2的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-2的颗粒物性。
[实施例1-6]
(颗粒1-3的合成)
除了在实施例1-4中将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为8小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-3的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-3的颗粒物性。
[实施例1-7]
(颗粒1-4的合成)
除了在实施例1-4中将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为12小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-4的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-4的颗粒物性。
[实施例1-8]
(颗粒1-5的合成)
除了在实施例1-4中将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为18小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-5的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-5的颗粒物性。
[实施例1-9]
(颗粒1-6的合成)
除了将实施例1-8的粒状共聚物1-1改变为粒状共聚物1-2以外，以与实施例1-8中相同的方式获得颗粒1-6的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-6的颗粒物性。
[实施例1-10]
(颗粒1-7的合成)
除了将实施例1-8的粒状共聚物1-1改变为粒状共聚物1-3以外，以与实施例1-8中相同的方式获得颗粒1-7的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-7的颗粒物性。
[实施例1-11]
(颗粒1-8的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量24g的粒状共聚物1-1的2.5wt％水分散液、3.3g离子交换水、0.046mL(0.52mmol)巯基丙酸(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)和0.190mL(2.08mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)，并且将三乙胺(Kishida Chemical Co.,Ltd.)添加至混合物中以将其pH调节至10。接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃，同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持18小时以提供颗粒1-8的分散液。用离心分离机将颗粒1-8从分散液中分离出来，并且将颗粒1-8再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒1-8，以其中颗粒1-8的浓度最终调节至1.0wt％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表1-1总结了颗粒1-8的颗粒物性。
[实施例1-12]
(颗粒1-9的合成)
除了在实施例1-4中将pH由pH为10改变为pH为11并且将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为18小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-9的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-9的颗粒物性。
[实施例1-13]
(颗粒1-10的合成)
除了在实施例1-4中将pH由pH为10改变为pH为11并且将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为30小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-10的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-10的颗粒物性。
[实施例1-14]
(颗粒1-11的合成)
除了在实施例1-4中将pH由pH为10改变为pH为11并且将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为48小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-11的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-11的颗粒物性。
[实施例1-15]
(颗粒1-12的合成)
除了在实施例1-11中将巯基丙酸改变为323mg(2.08mmol)巯基琥珀酸并且将3-巯基-1,2-丙二醇的量改变为0.047mL(0.52mmol)以外，以与实施例1-11中相同的方式获得颗粒1-12的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-12的颗粒物性。
[实施例1-16]
(颗粒1-13的合成)
除了在实施例1-15中将巯基琥珀酸的量改变为282mg(1.82mmol)并且将3-巯基-1,2-丙二醇的量改变为0.071mL(0.78mmol)以外，以与实施例1-15中相同的方式获得颗粒1-13的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-13的颗粒物性。
[实施例1-17]
(颗粒1-14的合成)
除了在实施例1-15中将巯基琥珀酸的量改变为242mg(1.56mmol)并且将3-巯基-1,2-丙二醇的量改变为0.095mL(1.04mmol)以外，以与实施例1-15中相同的方式获得颗粒1-14的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-14的颗粒物性。
[实施例1-18]
(颗粒1-15的合成)
除了在实施例1-15中将巯基琥珀酸的量改变为202mg(1.30mmol)并且将3-巯基-1,2-丙二醇的量改变为0.119mL(1.30mmol)以外，以与实施例1-15中相同的方式获得颗粒1-15的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-15的颗粒物性。
[实施例1-19]
(颗粒1-16的合成)
除了在实施例1-15中将巯基琥珀酸的量改变为81mg(0.52mmol)并且将3-巯基-1,2-丙二醇的量改变为0.191mL(2.08mmol)以外，以与实施例1-15中相同的方式获得颗粒1-16的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-16的颗粒物性。
[实施例1-20]
(颗粒1-17的合成)
除了在实施例1-15中将巯基琥珀酸的量改变为20mg(0.13mmol)并且将3-巯基-1,2-丙二醇的量改变为0.225mL(2.47mmol)以外，以与实施例1-15中相同的方式获得颗粒1-17的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-17的颗粒物性。
[比较例1-1]
(颗粒1-18的合成)
除了在实施例1-4中将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为3小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-18的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-18的颗粒物性。
[比较例1-2]
(颗粒1-19的合成)
除了在实施例1-4中将pH由pH为10改变为pH为11并且将在使圆底烧瓶的内容物升温至70℃后的保持时间由4小时改变为60小时以外，以与实施例1-4中相同的方式获得颗粒1-19的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-19的颗粒物性。
[比较例1-3]
(颗粒1-20的合成)
除了在实施例1-15中将巯基琥珀酸的量改变为403mg(2.60mmol)并且不使用3-巯基-1,2-丙二醇以外，以与实施例1-15中相同的方式获得颗粒1-20的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-20的颗粒物性。
[比较例1-4]
(颗粒1-21的合成)
除了在实施例1-15中将巯基琥珀酸的量改变为8mg(0.05mmol)并且将3-巯基-1,2-丙二醇的量改变为0.232mL(2.55mmol)以外，以与实施例1-15中相同的方式获得颗粒1-21的1.0wt％水分散液。表1-1总结了颗粒1-21的颗粒物性。
[比较例1-5]
(颗粒1-22的合成)
将在实施例1-1中获得的粒状共聚物1-1的2.5wt％水分散液用离心分离机浓缩为10wt％水分散液以得到浓缩分散液。在200ml圆底烧瓶中称量20g浓缩分散液。在将浓缩分散液保持在4℃的状态下，将相对于20g浓缩分散液中含有的源自GMA的环氧基的理论量为50倍摩尔的28％氨水(Kishida Chemical Co.,Ltd.)添加至其中，并且通过使用2N盐酸水溶液和2N氢氧化钠水溶液将混合物的pH调节为11。此后，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃，同时将内容物以100rpm搅拌。将内容物在该状态下保持24小时以提供颗粒1-22-1的分散液。用离心分离机将颗粒1-22-1从分散液中分离出来，并且将颗粒1-22-1再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒1-22-1，以其中颗粒1-22-1的浓度最终调节至10wt％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。
在50ml圆底烧瓶中称量6.3g的颗粒1-22-1的10wt％水分散液和3.81g乙二醇二缩水甘油醚(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)，并且通过使用0.1N盐酸水溶液和0.1N氢氧化钠水溶液将混合物的pH调节至9。此后，将圆底烧瓶的内容物升温至30℃，同时将内容物以100rpm搅拌。将内容物在该状态下保持24小时以提供颗粒1-22-2的分散液。用离心分离机将颗粒1-22-2从分散液中分离出来，并且将颗粒1-22-2再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒1-22-2，以其中颗粒1-22-2的浓度最终调节至10wt％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。
将6.0g的颗粒1-22-2的10wt％水分散液和相对于水分散液中含有的颗粒的源自乙二醇二缩水甘油醚的环氧基的理论量(假定粒状共聚物1-1的100％的源自甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基与氨反应以转化为伯胺，并且进一步假定100％的伯胺与乙二醇二缩水甘油醚的两端的环氧基之一反应)为10倍摩尔的28％氨水溶液添加至50ml圆底烧瓶中，并且通过使用1N盐酸水溶液和1N氢氧化钠水溶液将混合物的pH调节至11。此后，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃，同时将内容物以100rpm搅拌。将内容物在该状态下保持24小时以提供颗粒1-22-3的分散液。用离心分离机将颗粒1-22-3从分散液中分离出来，并且将颗粒1-22-3再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒1-22-3，以其中颗粒1-22-3的浓度最终调节至10wt％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。
用离心分离机将颗粒1-22-3从颗粒1-22-3的10wt％水分散液中分离出来，并且将颗粒1-22-3再分散在甲醇中；将该操作重复三次以制备其中颗粒1-22-3的浓度最终调节至1wt％的颗粒1-22-3的甲醇分散液。在200ml圆底烧瓶中称量63g的颗粒1-22-3的甲醇分散液和2.77g琥珀酸酐(Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.)。此后，将圆底烧瓶的内容物升温至30℃，同时将内容物以100rpm搅拌。将内容物在该状态下保持5小时以提供颗粒1-22的分散液。用离心分离机将颗粒1-22从分散液中分离出来，并且将颗粒1-22再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒1-22，以其中颗粒1-22的浓度最终调节至1.0wt％的水分散液的状态保存。
[比较例1-6]
(颗粒1-23的合成)
将在实施例1-1中获得的粒状共聚物1-1的2.5wt％水分散液用离心分离机浓缩为10wt％水分散液以得到浓缩分散液。在200ml圆底烧瓶中称量20g浓缩分散液。在将浓缩分散液保持在4℃的状态下，将相对于20g浓缩分散液中含有的源自GMA的环氧基的理论量为10倍摩尔的甘氨酸(Kishida Chemical Co.,Ltd.)添加至其中，并且通过使用0.1N盐酸水溶液和0.1N氢氧化钠水溶液将混合物的pH调节至11。此后，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃，同时将内容物以100rpm搅拌。将内容物在该状态下保持24小时以提供颗粒1-23的分散液。用离心分离机将颗粒1-23从分散液中分离出来，并且将颗粒1-23再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒1-23，以其中颗粒1-23的浓度最终调节至10wt％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。
[实施例1-21]
(对颗粒的非特异性吸附的评价)
将颗粒1-1至颗粒1-23各自以0.1wt％分散在磷酸缓冲液(包含0.01％吐温20)中以制备分散液(P液)。接下来，将51μL由人正常试样(血清试样，1μL)和磷酸缓冲液(50μL)形成的试样稀释液(Q液)添加至50μL各分散液中，并且在搅拌之后立即测量混合液在572nm的波长处的吸光度。将由Biochrom制造的分光光度计GeneQuant 1300用于吸光度测量。然后，将各混合液在37℃下静置5分钟，然后再次测量其在572nm的波长处的吸光度，然后计算吸光度的变化量ΔABS×10,000的值。结果总结于表1-1中。应当理解的是，随着该值变大，更大程度地发生非特异性吸附。然而，当具有较大羧基密度的颗粒或[水中粒径/干燥粒径]的值较大的颗粒具有大的值时，颗粒可以检测到渗透压凝集而不是由非特异性吸附导致的凝集。在任何情况下，当在试样检测中使用该评价中吸光度的变化量ΔABS×10,000的值较大的颗粒作为胶乳凝集法用颗粒时，担心由于噪音而将正常试样解释为假阳性。Q液包含1μL人正常试样的情况表示为“人正常试样浓度×1”。Q液包含2.5μL人正常试样的情况表示为“人正常试样浓度×2.5”。Q液包含5μL人正常试样的情况表示为“人正常试样浓度×5”。正常试样量分别为1倍、2.5倍和5倍。表1-1中的优、良、中和差的阈值为由通过胶乳凝集法检测低浓度的目标物质时的噪音风险(noise risk)来确定的基准。
[实施例1-22]
(通过对颗粒进行抗体敏化(antibody sensitization)来生产亲和颗粒)
将颗粒1-1至1-23中的每一者的0.1mL(颗粒1mg)的颗粒分散液(浓度为1.0wt％的溶液，10mg/mL)转移至微量管(体积：1.5mL)中，将0.12mL活化缓冲液(25mM MES，pH：6.0)添加至其中，并且将混合物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟。离心后，将上清液弃去。将0.12mL活化缓冲液(25mM MES，pH：6.0)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒再分散。重复进行离心和再分散一次。
接下来，将60μL WSC溶液(通过将50mg WSC溶解于1mL活化缓冲液中而获得的溶液，术语“WSC”意指1-[3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]盐酸盐)和Sulfo NHS溶液(通过将50mg Sulfo NHS溶解于1mL活化缓冲液中而获得的溶液，术语“Sulfo NHS”意指磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)各自添加至所得物中，并且用超声波分散。将分散液在室温下搅拌30分钟以将其颗粒的羧基转化为活性酯。将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.2mL固定化缓冲液(25mM MES，pH：5.0)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将分散液在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将50μL固定化缓冲液添加至残余物中，并且用超声波使羧基经活化的颗粒分散。
将50μL抗体溶液(通过用固定化缓冲液稀释抗CRP抗体以使其浓度成为25μg/50μL而获得的溶液)添加至50μL羧基经活化的颗粒的溶液中，并且用超声波使颗粒分散。负载的抗体量为每1mg颗粒25μg(25μg/mg)。抗体终浓度为0.25mg/mL，并且颗粒终浓度为10mg/mL。将微量管中的内容物在室温下搅拌60分钟以使抗体与颗粒的羧基结合。接下来，将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.24mL掩蔽缓冲液(通过在pH为8.0的1M Tris中包含0.1％吐温20而获得的缓冲液)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将分散液在室温下搅拌1小时，然后在4℃下静置过夜以使Tris与残余的活化羧基结合。接下来，将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.2mL洗涤缓冲液(10mM HEPES，pH：7.9)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将使用洗涤缓冲液(10mM HEPES，pH：7.9)的洗涤操作(离心和再分散)重复一次。使用0.2mL保存缓冲液(10mM HEPES，pH：7.9，包含0.01％吐温20)进行一次洗涤操作。将1.0mL保存缓冲液添加至洗涤产物中，并且用超声波使颗粒分散。分散液的颗粒浓度最终变为0.1wt％(1mg/mL)。将分散液保存在冰箱中。下文中，亲和颗粒的名称直接沿袭颗粒名称，表示为“亲和颗粒1-1”等。
[实施例1-23]
(亲和颗粒的抗体敏化率的评价)
通过蛋白定量来测定实施例1-21中生产的亲和颗粒的抗体敏化率(％)。本文中，术语“抗体敏化率(％)”意指与颗粒结合的抗体量相对于在与颗粒的反应中使用的抗体量(抗体负载量)的比例。以下描述蛋白定量的评价例。
首先，将PROTEIN ASSAY BCA KIT(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的7mLA液和140μL B液混合，并且采用所制备的液体作为AB液。接下来，取25μL(颗粒量：25μg)亲和颗粒的分散液(0.1％溶液)，并且将其装入1.5mL管中。接下来，将200μL AB液添加至分散液(25μL)中，并且将混合物在60℃下温育30分钟。将所得物溶液在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且用移液管将200μL上清液上样至96孔微孔中。使用酶标仪、与标准样品(通过用10mM HEPES稀释抗体以使其浓度落在0μg/mL至200μg/mL的范围内来获得数个样品)一起测量上清液在562nm处的吸光度。由标准曲线计算抗体量。颗粒的抗体敏化量(每颗粒重量的抗体结合量(μg/mg))通过用算出的抗体量除以颗粒重量(本文中，0.025mg)来确定。最终，算出敏化率。在抗体负载量为每1mg颗粒25μg的情况下，当抗体敏化量为12.5μg/mg时，敏化率为50％。结果总结于表1-1中。
[实施例1-24]
(亲和颗粒的胶乳凝集灵敏度的评价)
将1μL人CRP(Denka Seiken Co.,Ltd.，C反应性蛋白，源自人血浆，40μg/ml)和50μL缓冲液(包含0.01％吐温20的PBS)混合以制备混合液(下文中表示为R1+)，并且在37℃下保温。此外，将1μL生理盐水和50μL缓冲液(包含0.01％吐温20的PBS)混合以制备混合液(下文中表示为R1-)作为对照，并且同样在37℃下保温。接下来，将50μL包含在实施例1-21中制备的各亲和颗粒的溶液(颗粒浓度：0.1wt％，称为R2)与R1+或R1-混合，并且在搅拌后即刻测量混合液(体积：101μL)在572nm的波长处的吸光度。将由Biochrom制造的分光光度计GeneQuant 1300用于吸光度测量。然后，将混合液在37℃下静置5分钟，然后再次测量其在572nm的波长处的吸光度，然后计算吸光度的变化量ΔABS×10,000的值。针对以下中的每一者进行这一系列的评价：实施例1-21中制备后即刻的R2；制备后经过24小时后的R2；和制备后经过72小时后的R2。结果总结于表1-1中。表1-1中的R-的值越大意味着在亲和颗粒中发生的由非特异性吸附导致的凝集或渗透压凝集越多。因此，当在试样检测中使用该颗粒作为胶乳凝集法用颗粒时，担心由于噪音而将正常试样解释为假阳性。同时，期望表1-1中R+值更大的亲和颗粒在试样检测中用作胶乳凝集法用颗粒时能够以更高的灵敏度检测目标物质。表1-1中R-的优、良、中和差的阈值为由通过胶乳凝集法检测低浓度的目标物质时的噪音风险来确定的基准。此外，R+的优、良、中和差的阈值为参考通过使用由Denka SeikenCo.,Ltd制造的作为CRP检测用试剂盒的CRP-L Auto“TBA”和胶乳用CRP标准液“TBA”获得的以下值来确定的基准。
0μg/ml(生理盐水)的ΔABS×10,000：-80
5μg/ml的ΔABS×10,000：1,410
20μg/ml的ΔABS×10,000：3,530
40μg/ml的ΔABS×10,000：5,130
160μg/ml的ΔABS×10,000：9,750
320μg/ml的ΔABS×10,000：12,150
Figure BDA0003522627970000571
Figure BDA0003522627970000581
Figure BDA0003522627970000591
[实施例1-25]
(针对KL-6的亲和颗粒的生产)
除了将实施例1-22的抗体由抗CRP抗体改变为抗KL-6抗体并且将负载的抗体量由25改变为100以外，以与实施例1-22中相同的方式用抗KL-6抗体将颗粒1-5、颗粒1-6和颗粒1-7敏化。所得针对KL-6的亲和颗粒分别表示为“亲和颗粒1-5K”、“亲和颗粒1-6K”和“亲和颗粒1-7K”。
以与实施例1-23中相同的方式来评价亲和颗粒1-5K、亲和颗粒1-6K和亲和颗粒1-7K的抗体敏化率。结果，发现抗体敏化率分别为93％、100％和94％。
[实施例1-26]
(对KL-6的胶乳凝集灵敏度的评价)
除了将实施例1-24的人CRP改变为人KL-6以外，以与实施例1-24中相同的方式来评价亲和颗粒1-5K、亲和颗粒1-6K和亲和颗粒1-7K的胶乳凝集灵敏度。
用亲和颗粒1-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-140
500U/mL：410
1,000U/mL：1,380
2,000U/mL：4,840
5,000U/mL：7,520
用亲和颗粒1-6K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-240
500U/mL：-90
1,000U/mL：480
2,000U/mL：3,320
5,000U/mL：6,160
用亲和颗粒1-7K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-320
500U/mL：-50
1,000U/mL：-340
2,000U/mL：550
5,000U/mL：1,200
所有颗粒相对于KL-6的浓度呈线性吸光度变化量。发现当KL-6的浓度恒定时，随着粒径变得更大，吸光度变化量增大。可以通过控制粒径来控制胶乳凝集灵敏度。
[实施例1-27]
(敏化剂对胶乳凝集灵敏度的影响)
除了将实施例1-24的人CRP改变为人KL-6并且将缓冲液(包含0.01％吐温20的PBS)改变为包含敏化剂的缓冲液(包含0.58％PVP K90或0.68％海藻酸钠80-120并且包含0.01％吐温20的PBS)以外，以与实施例1-24中相同的方式来评价亲和颗粒1-5K和亲和颗粒1-6K的胶乳凝集灵敏度。
在使用海藻酸作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒1-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-240
500U/mL：1,090
1,000U/mL：2,780
2,000U/mL：9,960
5,000U/mL：11,520
在使用海藻酸作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒1-6K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-50
500U/mL：420
1,000U/mL：1,260
2,000U/mL：6,590
5,000U/mL：8,720
在使用PVP作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒1-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-70
500U/mL：480
1,000U/mL：1,020
2,000U/mL：3,860
5,000U/mL：5,970
在使用PVP作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒1-6K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-280
500U/mL：-60
1,000U/mL：670
2,000U/mL：4,080
5,000U/mL：6,820
对于亲和颗粒1-5K和亲和颗粒1-6K，确认了PVP和海藻酸的敏化效果。特别地，发现海藻酸具有高的敏化效果。
[实施例1-28]
(针对IgE的亲和颗粒的生产)
除了将实施例1-22的抗体由抗CRP抗体改变为抗IgE抗体并且将负载的抗体量由25改变为100以外，以与实施例1-22中相同的方式用抗IgE抗体将颗粒1-5敏化。所得针对IgE的亲和颗粒表示为“亲和颗粒1-5I”。
以与实施例1-23中相同的方式来评价亲和颗粒1-5I的抗体敏化率。结果，发现抗体敏化率为80％。
[实施例1-29]
(对IgE的胶乳凝集灵敏度的评价)
除了将实施例1-24的人CRP改变为人IgE以外，以与实施例1-24中相同的方式来评价亲和颗粒1-5I的胶乳凝集灵敏度。将试样量设定为1.5μL，将试样稀释液(Good's缓冲液，LT Auto Wako IgE，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的量设定为75μL，并且将亲和颗粒分散液的量设定为25μL。
用亲和颗粒1-5I获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0IU/mL(生理盐水)：-60
100IU/mL：-50
300IU/mL：100
1,000IU/mL：200
2,000IU/mL：510
3,000IU/mL：1,790
亲和颗粒5I相对于IgE的浓度呈线性吸光度变化量。此外，以与实施例1-27中相同的方式用包含敏化剂的缓冲液(使用包含0.045％海藻酸的Good’s缓冲液作为试样稀释液)来评价亲和颗粒1-5I的胶乳凝集灵敏度。
在使用海藻酸作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒1-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0IU/mL(生理盐水)：30
100IU/mL：140
300IU/mL：300
1,000IU/mL：1,130
2,000IU/mL：3,870
3,000IU/mL：5,910
对于亲和颗粒1-5I，确认了海藻酸的敏化效果。
现在，通过对应于第二实施方案的实施例的方式详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
(实施例2-1：粒状共聚物的合成)
在2L四颈可分离烧瓶中称量以下材料以提供混合液。
·22.7g苯乙烯(St，由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)
·33.9g甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA，由Tokyo Chemical Industry Co.,Ltd.制造)
·0.86g二乙烯基苯(DVB，由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)
·2,168.6g离子交换水
此后，将混合液保持在70℃，同时以200rpm搅拌，并且使氮气以200mL/min的流量流过以从三颈可分离烧瓶内部除去氧。接下来，将另外制备的通过将1.13g聚合引发剂(商品名：V-50，由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)溶解于30g离子交换水中来获得的溶解液添加至混合液中以引发无皂乳液聚合。聚合开始2小时后，将5.8g GMA添加至四颈可分离烧瓶中，并且将混合物保持在70℃同时以200rpm搅拌22小时。由此，获得包含粒状共聚物2-1的水分散液。
在将分散液逐渐冷却至室温之后，收集一部分分散液，并且其聚合转化率通过使用质子NMR、气相色谱法和凝胶渗透色谱法来评价。结果，确认到聚合转化率基本为100％。粒状共聚物的干燥粒径为196.6nm并且水中粒径为206.9nm。
对粒状共聚物进行超滤浓缩，或者通过添加离子交换水来稀释，以成为2.5质量％的水分散液，并且将分散液在遮光条件下、在4℃下保存。
(实施例2-2：颗粒2-1的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·202mg(1.30mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.119mL(1.30mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持18小时以提供颗粒2-1的分散液。用离心分离机将颗粒2-1从分散液中分离出来，并且将颗粒2-1再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-1，以其中颗粒2-1的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-1的颗粒物性。
(实施例2-3：颗粒2-2的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·40mg(0.26mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.214mL(2.34mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持6小时以提供颗粒2-2的分散液。用离心分离机将颗粒2-2从分散液中分离出来，并且将颗粒2-2再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-2，以其中颗粒2-2的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-2的颗粒物性。
(实施例2-4：颗粒2-3的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·40mg(0.26mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.214mL(2.34mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持8小时以提供颗粒2-3的分散液。用离心分离机将颗粒2-3从分散液中分离出来，并且将颗粒2-3再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-3，以其中颗粒2-3的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-3的颗粒物性。
(实施例2-5：颗粒2-4的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·40mg(0.26mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.214mL(2.34mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持12小时以提供颗粒2-4的分散液。用离心分离机将颗粒2-4从分散液中分离出来，并且将颗粒2-4再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-4，以其中颗粒2-4的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-4的颗粒物性。
(实施例2-6：颗粒2-5的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·40mg(0.26mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.214mL(2.34mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持18小时以提供颗粒2-5的分散液。用离心分离机将颗粒2-5从分散液中分离出来，并且将颗粒2-5再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-5，以其中颗粒2-5的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-5的颗粒物性。
(实施例2-7：颗粒2-6的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至11。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·40mg(0.26mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.214mL(2.34mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持30小时以提供颗粒2-6的分散液。用离心分离机将颗粒2-6从分散液中分离出来，并且将颗粒2-6再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-6，以其中颗粒2-6的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-6的颗粒物性。
(实施例2-8：颗粒2-7的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·81mg(0.52mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.191mL(2.08mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持18小时以提供颗粒2-7的分散液。用离心分离机将颗粒2-7从分散液中分离出来，并且将颗粒2-7再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-7，以其中颗粒2-7的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-7的颗粒物性。
(实施例2-9：颗粒2-8的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·323mg(2.08mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.047mL(0.52mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持18小时以提供颗粒2-8的分散液。用离心分离机将颗粒2-8从分散液中分离出来，并且将颗粒2-8再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-8，以其中颗粒2-8的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-8的颗粒物性。
(实施例2-10：颗粒2-9的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·282mg(1.82mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.071mL(0.78mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持18小时以提供颗粒2-9的分散液。用离心分离机将颗粒2-9从分散液中分离出来，并且将颗粒2-9再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-9，以其中颗粒2-9的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-9的颗粒物性。
(实施例2-11：颗粒2-10的合成)
在100ml圆底烧瓶中称量以下材料，并且将三乙胺(由Kishida Chemical Co.,Ltd.制造)添加至混合物中以将其pH调节至10。
·24g的粒状共聚物2-1的2.5质量％水分散液
·3.3g离子交换水
·242mg(1.56mmol)巯基琥珀酸(由FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation制造)
·0.095mL(1.04mmol)3-巯基-1,2-丙二醇(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)
接下来，将圆底烧瓶的内容物升温至70℃同时以200rpm搅拌内容物。此外，将内容物在该状态下保持18小时以提供颗粒2-10的分散液。用离心分离机将颗粒2-10从分散液中分离出来，并且将颗粒2-10再分散在离子交换水中；将该操作重复8次以纯化颗粒2-10，以其中颗粒2-10的浓度最终调节至1.0质量％的水分散液的状态保存。将保存条件设定为在遮光条件下4℃。表2-1总结了颗粒2-10的颗粒物性。
(实施例2-12：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-1至2-6)
将0.1mL(颗粒1mg)的颗粒2-1至2-6中的每一者的颗粒分散液(浓度为1.0质量％的溶液，10mg/mL)转移至微量管(体积：1.5mL)中。此后，将0.12mL活化缓冲液(25mM MES，pH：6.0)添加至其中，并且将混合物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟。离心后，将上清液弃去。将0.12mL活化缓冲液(25mM MES，pH：6.0)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒再分散。重复进行离心和再分散一次。
接下来，将60μL以下各材料添加至所得物中，并且用超声波分散在其中。
·1-[3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]盐酸盐(WSC)溶液(通过将50mg WSC溶解于1mL活化缓冲液中获得的溶液)
·磺基-N-羟基琥珀酰亚胺(SulfoNHS)溶液(通过将50mg SulfoNHS溶解于1mL活化缓冲液中获得的溶液)
将分散液在室温下搅拌30分钟以将其颗粒的羧基转化为活性酯。将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.2mL固定化缓冲液(25mMMES，pH：5.0)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将分散液在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将50μL固定化缓冲液添加至残余物中，并且用超声波使羧基经活化的颗粒分散。
将50μL抗体溶液(通过用固定化缓冲液稀释抗C反应性蛋白(CRP)抗体以使其浓度成为25μg/50μL而获得的溶液)添加至50μL羧基经活化的颗粒的溶液中，并且用超声波使颗粒分散。负载的抗体量为每1mg颗粒25μg(25μg/mg)。抗体终浓度为0.25mg/mL，并且颗粒终浓度为10mg/mL。将试管的内容物在室温下搅拌60分钟以使抗体与颗粒的羧基结合。
接下来，将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.24mL掩蔽缓冲液(通过在pH为8.0的1M Tris中包含0.1％吐温20而获得的缓冲液)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将分散液在室温下搅拌1小时，然后在4℃下静置过夜以使三羟基甲基氨基甲烷(Tris)与残余的活化羧基结合。接下来，将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.2mL洗涤缓冲液(10mM羟基乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)，pH：7.9)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将使用洗涤缓冲液(10mM HEPES，pH：7.9)的洗涤操作(离心和再分散)重复一次。用0.2mL保存缓冲液(10mMHEPES，pH：7.9，包含0.01％吐温20)进行洗涤操作一次。将1.0mL保存缓冲液添加至洗涤产物中，并且用超声波使颗粒分散。分散液的颗粒浓度最终变为0.1质量％(1mg/mL)。将所得的颗粒的分散液保存在冰箱中。
在该实施例中获得的亲和颗粒如下所述来命名。当使用的颗粒为颗粒2-1时，亲和颗粒表示为亲和颗粒2-1。此外，当使用的颗粒为颗粒2-2时，亲和颗粒表示为亲和颗粒2-2。当使用的颗粒为颗粒2-3时，亲和颗粒表示为亲和颗粒2-3。当使用的颗粒为颗粒2-4时，亲和颗粒表示为亲和颗粒2-4。当使用的颗粒为颗粒2-5时，亲和颗粒表示为亲和颗粒2-5。当使用的颗粒为颗粒2-6时，亲和颗粒表示为亲和颗粒2-6。表2-1总结了亲和颗粒2-1至2-6的颗粒物性。
(实施例2-13：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-7至2-12)
将所使用的颗粒改变为颗粒2-5，并且将实施例2-12的负载的抗体量由25μg/mg分别改变为48μg/mg、41μg/mg、31μg/mg、25μg/mg、18μg/mg和11μg/mg。除此以外，以与实施例2-12中相同的方式获得亲和颗粒2-7、亲和颗粒2-8、亲和颗粒2-9、亲和颗粒2-10、亲和颗粒2-11和亲和颗粒2-12的0.1质量％水分散液。表2-1总结了亲和颗粒2-7至2-12的颗粒物性。
(实施例2-14：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-13)
除了将所使用的颗粒改变为颗粒2-7并且将实施例2-12的负载的抗体量由25μg/mg改变为54μg/mg以外，以与实施例2-12中相同的方式获得亲和颗粒2-13的0.1质量％水分散液。表2-1总结了亲和颗粒2-13的颗粒物性。
(实施例2-15：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-14)
将所使用的颗粒改变为颗粒2-5，将实施例2-12的抗体由抗CRP抗体改变为抗前列腺特异性抗原(PSA)抗体，并且将实施例2-12的负载的抗体量由25μg/mg改变为20μg/mg。除此以外，以与实施例2-12中相同的方式获得亲和颗粒2-14的0.1质量％水分散液。表2-1总结了亲和颗粒2-14的颗粒物性。
(实施例2-16：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-15)
将所使用的颗粒改变为颗粒2-5，将实施例2-12的抗体由抗CRP抗体改变为抗牛血清白蛋白(BSA)抗体，并且将实施例2-12的负载的抗体量由25μg/mg改变为23μg/mg。除此以外，以与实施例2-12中相同的方式获得亲和颗粒2-15的0.1质量％水分散液。表2-1总结了亲和颗粒2-15的颗粒物性。
(比较例2-1：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-16至2-18)
除了将实施例2-12使用的颗粒分别改变为颗粒2-8、颗粒2-9和颗粒2-10以外，以与实施例2-12中相同的方式获得亲和颗粒2-16、亲和颗粒2-17和亲和颗粒2-18的0.1质量％水分散液。表2-1总结了亲和颗粒2-16至2-18的颗粒物性。
(比较例2-2：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-19)
除了将所使用的颗粒改变为颗粒2-5并且将实施例2-12的负载的抗体量由25μg/mg改变为5μg/mg以外，以与实施例2-12中相同的方式获得亲和颗粒2-19的0.1质量％水分散液。表2-1总结了亲和颗粒2-19的颗粒物性。
(比较例2-3：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-20和2-21)
除了将所使用的颗粒改变为颗粒2-5并且将实施例2-12的负载的抗体量由25μg/mg分别改变为64μg/mg和56μg/mg以外，以与实施例2-12中相同的方式获得亲和颗粒2-20和2-21的0.1质量％水分散液。表2-1总结了亲和颗粒2-20和2-21的颗粒物性。
(实施例2-17：亲和颗粒的抗体敏化率的评价)
通过蛋白定量来测定实施例2-12至2-16和比较例2-1至2-3中生产的亲和颗粒2-1至2-21的抗体敏化率(％)。本文中，术语“抗体敏化率(％)”意指与颗粒结合的抗体量相对于在与颗粒的反应中使用的抗体量(抗体负载量)的比例。以下描述蛋白定量的评价例。
首先，将PROTEIN ASSAY BCA KIT(由FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)的7mL A液和140μL B液混合，并且采用所制备的液体作为AB液。接下来，取25μL(颗粒量：25μg)亲和颗粒的分散液(0.1％溶液)，并且将其装入1.5mL管中。接下来，将200μL AB液添加至分散液(25μL)中，并且将混合物在60℃下温育30分钟。将所得物溶液在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且用移液管将200μL上清液上样至96孔微孔中。使用酶标仪、与标准样品(通过用10mM HEPES稀释抗体以使其浓度落在0μg/mL至200μg/mL的范围内来获得数个样品)一起测量上清液在562nm的波长处的吸光度。由标准曲线计算抗体量。颗粒的抗体敏化量(每颗粒重量的抗体结合量(μg/mg))通过用算出的抗体量除以颗粒重量(本文中，0.025mg)来确定。最终，算出敏化率。在抗体负载量为每1mg颗粒25μg的情况下，当抗体敏化量为12.5μg/mg时，敏化率为50％。结果总结于表2-1中。
(实施例2-18：使用乳糜液评价对亲和颗粒的非特异性吸附)
将亲和颗粒2-1至2-21各自以0.1质量％分散在磷酸缓冲液中以制备分散液(A液)。接下来，将60μL由三油精、卵磷脂、游离脂肪酸、牛白蛋白和Tris缓冲液形成的乳糜液(B液)添加至30μL各分散液中，并且测量搅拌后即刻的混合液在572nm的波长处的吸光度。将由Biochrom制造的分光光度计GeneQuant 1300用于吸光度测量。然后，将各混合液在37℃下静置5分钟，然后再次测量其在572nm的波长处的吸光度，然后计算吸光度的变化量ΔABS×10,000的值。结果总结于表2-1中。
应当理解的是，随着该值变大，更大程度地发生非特异性吸附。然而，可能检测到渗透压凝集而不是由非特异性吸附导致的凝集。在任何情况下，当在试样检测中使用该评价中吸光度的变化量ΔABS×10,000的值较大的亲和颗粒作为胶乳凝集法用颗粒时，担心由于噪音而将正常试样解释为假阳性。表2-1中的优、良、中和差的阈值为由通过胶乳凝集法检测低浓度的目标物质时的噪音风险来确定的基准。
(实施例2-19：亲和颗粒的分散稳定性的评价)
用超声波将亲和颗粒2-1至2-21各自充分分散，然后在4℃下保存。随时间推移目测观察到颗粒的沉降。结果总结于表2-1中。如实施方案中所述，具有小的zeta电位差的颗粒或者抗体的占有面积率落在适当范围内的亲和颗粒具有令人满意的分散稳定性。表2-1中的优、良、中和差的阈值为由要用于胶乳凝集法的试剂的储存期和粒度(这是因为，在该实施例的溶液组成的情况下，虽然缓慢，但是颗粒不可避免地经历自然沉降)确定的基准。
(实施例2-20：亲和颗粒的胶乳凝集灵敏度的评价1)
将1μL人CRP(由Denka Seiken Co.,Ltd.制造，源自人血浆，40μg/ml)和50μL缓冲液(包含0.01％吐温20的磷酸缓冲生理盐水(PBS))混合以制备混合液(下文中表示为R1+)，并且在37℃下保温。此外，将1μL生理盐水和50μL缓冲液(包含0.01％吐温20的PBS)混合以制备混合液(下文中表示为R1-)作为对照，并且同样在37℃下保温。接下来，50μL各自包含在各实施例和比较例中制备的亲和颗粒2-1至2-13和亲和颗粒2-16至2-21的溶液(颗粒浓度：0.1质量％，称为R2)与R1+或R1-混合，并且对混合物进行搅拌。测量混合和搅拌后即刻的混合液(体积：101μL)在572nm的波长处的吸光度。将由Biochrom制造的分光光度计GeneQuant 1300用于吸光度测量。然后，将混合液在37℃下静置5分钟，然后再次测量其在572nm的波长处的吸光度，然后计算吸光度的变化量ΔABS×10,000的值。针对以下中的每一者进行这一系列的评价：各实施例和比较例中制备后即刻的R2；制备后经过24小时后的R2；和制备后经过72小时后的R2。结果总结于表2-1中。表2-1中的R-的值越大意味着在亲和颗粒中发生的由非特异性吸附导致的凝集或渗透压凝集越多。因此，当在试样检测中使用该颗粒作为胶乳凝集法用颗粒时，担心由于噪音而将正常试样解释为假阳性。同时，期望表2-1中R+值较大的亲和颗粒在试样检测中用作胶乳凝集法用亲和颗粒时能够以较高的灵敏度检测目标物质。表2-1中的R-的优、良、中和差的阈值为由通过胶乳凝集法检测低浓度的目标物质时的噪音风险来确定的基准。此外，R+的优、良、中和差的阈值为参考通过使用由Denka Seiken Co.,Ltd制造的作为CRP检测用试剂盒的CRP-L Auto“TBA”和胶乳用CRP标准液“TBA”获得的以下值来确定的基准。
0μg/ml(生理盐水)的ΔABS×10,000：-80
5μg/ml的ΔABS×10,000：1,410
20μg/ml的ΔABS×10,000：3,530
40μg/ml的ΔABS×10,000：5,130
160μg/ml的ΔABS×10,000：9,750
320μg/ml的ΔABS×10,000：12,150
(实施例2-21：亲和颗粒的胶乳凝集灵敏度的评价2)
除了将实施例2-20的人CRP改变为PSA并且将亲和颗粒改变为亲和颗粒2-14以外，以与实施例2-20中相同的方式来评价亲和颗粒2-14的胶乳凝集灵敏度。结果在表2-1中示出。发现与亲和颗粒2-1至2-13对CRP具有高灵敏度同样地，亲和颗粒2-14为对PSA具有高灵敏度的亲和颗粒。
(实施例2-22：亲和颗粒的胶乳凝集灵敏度的评价3)
除了将实施例2-20的人CRP改变为BSA并且将亲和颗粒改变为亲和颗粒2-15以外，以与实施例2-20中相同的方式来评价亲和颗粒2-15的胶乳凝集灵敏度。结果在表2-1中示出。发现与亲和颗粒2-1至2-13对CRP具有高灵敏度同样地，亲和颗粒2-15为对BSA具有高灵敏度的亲和颗粒。
Figure BDA0003522627970000771
Figure BDA0003522627970000781
Figure BDA0003522627970000791
(实施例2-23：颗粒2-23的合成)
除了在实施例2-1中将22.7g St改变为12.0g、将33.9g GMA改变为17.9g、将0.86g二乙烯基苯改变为0.45g并且将聚合开始2小时后要添加至三颈可分离烧瓶中的GMA的量由5.8g改变为3.1g以外，以与实施例2-1中相同的方式获得粒状共聚物2-2的水分散液。在将分散液逐渐冷却至室温之后，收集一部分分散液，并且其聚合转化率通过使用质子NMR、气相色谱法和凝胶渗透色谱法来评价。结果，确认到聚合转化率基本为100％。粒状共聚物2-2的干燥粒径为151.4nm并且水中粒径为160.2nm。对粒状共聚物2-2进行超滤浓缩，或者通过添加离子交换水来稀释，以成为2.5wt％的水分散液，并且将分散液在遮光条件下、在4℃下保存。
除了将实施例2-6的粒状共聚物2-1改变为粒状共聚物2-2以外，以与实施例2-6中相同的方式获得颗粒2-23的1.0wt％水分散液。颗粒2-23的干燥粒径为161.6nm、水中粒径为202nm并且zeta电位为-16mV。
(实施例2-24：颗粒2-24的合成)
除了在实施例2-1中将22.7g St改变为5.0g、将33.9g GMA改变为7.5g、将0.86g二乙烯基苯改变为0.19g并且将聚合开始2小时后要添加至三颈可分离烧瓶中的GMA的量由5.8g改变为1.3g以外，以与实施例2-1中相同的方式获得粒状共聚物2-3的水分散液。在将分散液逐渐冷却至室温之后，收集一部分分散液，并且其聚合转化率通过使用质子NMR、气相色谱法和凝胶渗透色谱法来评价。结果，确认到聚合转化率基本为100％。粒状共聚物2-3的干燥粒径为96.8nm并且水中粒径为105.2nm。对粒状共聚物2-3进行超滤浓缩，或者通过添加离子交换水来稀释，以成为2.5wt％的水分散液，并且将分散液在遮光条件下、在4℃下保存。
除了将实施例2-6的粒状共聚物2-1改变为粒状共聚物2-3以外，以与实施例2-6中相同的方式获得颗粒2-24的1.0wt％水分散液。颗粒2-24的干燥粒径为119nm、水中粒径为144nm并且zeta电位为-15mV。
(实施例2-25：通过对颗粒进行抗KL-6抗体的抗体敏化来生产亲和颗粒2-5K至2-7K)
除了将实施例2-12使用的颗粒分别改变为颗粒2-5、颗粒2-23和颗粒2-24并且将实施例2-12的抗体由抗CRP抗体改变为抗KL-6抗体以外，以与实施例2-12中相同的方式用抗KL-6抗体将颗粒2-5、颗粒2-23和颗粒2-24敏化。将所得的针对KL-6的亲和颗粒分别称为亲和颗粒2-5K、亲和颗粒2-6K和亲和颗粒2-7K。以与实施例2-17中相同的方式来评价亲和颗粒2-5K、亲和颗粒2-6K和亲和颗粒2-7K的抗体敏化率。结果，发现抗体敏化率分别为93％、100％和94％。抗体的占有面积率分别为20.3％、17.3％和12.4％。抗KL-6抗体的zeta电位为-14mV。因此，亲和颗粒2-5K、亲和颗粒2-6K和亲和颗粒2-7K的zeta电位差(mV)分别为2、2和1。
(实施例2-26：亲和颗粒对KL-6的胶乳凝集灵敏度的评价)
除了将实施例2-20的人CRP改变为人KL-6以外，以与实施例2-20中相同的方式来评价亲和颗粒2-5K、亲和颗粒2-6K和亲和颗粒2-7K的胶乳凝集灵敏度。
用亲和颗粒2-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-140
500U/mL：410
1,000U/mL：1,380
2,000U/mL：4,840
5,000U/mL：7,520
用亲和颗粒2-6K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-240
500U/mL：-90
1,000U/mL：480
2,000U/mL：3,320
5,000U/mL：6,160
用亲和颗粒2-7K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-320
500U/mL：-50
1,000U/mL：-340
2,000U/mL：550
5,000U/mL：1,200
所有颗粒相对于KL-6的浓度呈线性吸光度变化量。发现当KL-6的浓度恒定时，随着粒径变得更大，吸光度变化量增大。可以通过控制粒径来控制胶乳凝集灵敏度。
(实施例2-27：敏化剂对胶乳凝集灵敏度的效果)
除了将实施例2-20的人CRP改变为人KL-6并且将缓冲液(包含0.01％吐温20的PBS)改变为包含敏化剂的缓冲液(包含0.58％PVP K90或0.68％海藻酸钠80-120并且包含0.01％吐温20的PBS)以外，以与实施例2-20中相同的方式来评价亲和颗粒2-5K和亲和颗粒2-6K的胶乳凝集灵敏度。
在使用海藻酸作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒2-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-240
500U/mL：1,090
1,000U/mL：2,780
2,000U/mL：9,960
5,000U/mL：11,520
在使用海藻酸作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒2-6K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-50
500U/mL：420
1,000U/mL：1,260
2,000U/mL：6,590
5,000U/mL：8,720
在使用PVP作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒2-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-70
500U/mL：480
1,000U/mL：1,020
2,000U/mL：3,860
5,000U/mL：5,970
在使用PVP作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒2-6K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0U/mL(生理盐水)：-280
500U/mL：-60
1,000U/mL：670
2,000U/mL：4,080
5,000U/mL：6,820
对于亲和颗粒2-5K和亲和颗粒2-6K，确认了PVP和海藻酸的敏化效果。特别地，发现海藻酸具有高的敏化效果。
(实施例2-28：通过对颗粒进行抗IgE抗体的抗体敏化来生产亲和颗粒2-5I)
除了将实施例2-12的抗体由抗CRP抗体改变为抗IgE抗体以外，以与实施例2-12中相同的方式用抗IgE抗体将颗粒2-5敏化。将所得针对IgE的亲和颗粒称为亲和颗粒2-5I。
以与实施例2-17中相同的方式来评价亲和颗粒2-5I的抗体敏化率。结果，发现抗体敏化率为80％。抗体的占有面积率为18％。抗IgE抗体的zeta电位为-6mV。因此，亲和颗粒2-5I的zeta电位差(mV)为10。
(实施例2-29：亲和颗粒对IgE的胶乳凝集灵敏度的评价)
除了将实施例2-20的人CRP改变为人IgE以外，以与实施例2-20中相同的方式来评价亲和颗粒2-5I的胶乳凝集灵敏度。将试样量设定为1.5μL，将试样稀释液(Good's缓冲液，LT Auto Wako IgE，Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)的量设定为75μL，并且将亲和颗粒分散液的量设定为25μL。
用亲和颗粒2-5I获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0IU/mL(生理盐水)：-60
100IU/mL：-50
300IU/mL：100
1,000IU/mL：200
2,000IU/mL：510
3,000IU/mL：1,790
亲和颗粒2-5I相对于IgE的浓度呈线性吸光度变化量。
此外，以与实施例2-27中相同的方式用包含敏化剂的缓冲液(使用包含0.045％海藻酸的Good’s缓冲液作为试样稀释液)来评价亲和颗粒2-5I的胶乳凝集灵敏度。
在使用海藻酸作为敏化剂的情况下，用亲和颗粒2-5K获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)如下所示。
0IU/mL(生理盐水)：30
100IU/mL：140
300IU/mL：300
1,000IU/mL：1,130
2,000IU/mL：3,870
3,000IU/mL：5,910
对于亲和颗粒2-5I，确认了海藻酸的敏化效果。
(实施例2-30：通过对颗粒进行抗体敏化来生产亲和颗粒2-22及其评价)
除了将实施例2-12的掩蔽缓冲液中的1M Tris改变为1M乙醇胺以外，以与实施例2-12中相同的方式用抗CRP抗体将颗粒2-5敏化。将所得针对CRP的亲和颗粒称为亲和颗粒2-22。与亲和颗粒2-5的区别在于重复单元A的一部分羧基在亲和颗粒2-5中为Tris，而在亲和颗粒2-22中为乙醇胺。因此，亲和颗粒2-22在抗体敏化率和抗体的占有面积率方面与亲和颗粒2-5相同。
以与实施例2-20中相同的方式来评价亲和颗粒2-22的胶乳凝集灵敏度。
用亲和颗粒2-22获得的吸光度变化量(ΔABS×10,000)相对于亲和颗粒2-5的相对值如下所示。
5μg/mL：1.11
20μg/mL：1.17
40μg/mL：1.13
160μg/mL：1.09
320μg/mL：1.10
发现与亲和颗粒2-5相比，亲和颗粒2-22使吸光度变化量增加。能够通过将掩蔽的化学结构改变为乙醇胺来控制对CRP的胶乳凝集灵敏度。
下文中，通过对应于第三实施方案的实施例的方式详细地描述本发明。然而，本发明不限于这些实施例。
(实施例3-1：颗粒3-1的合成)
在200mL烧瓶中称量1.2g苯乙烯(Kishida Chemical Co.,Ltd.)、1.8g甲基丙烯酸缩水甘油酯(Kishida Chemical Co.,Ltd.)、0.04g二乙烯基苯(Kishida Chemical Co.,Ltd.)和100g离子交换水以提供混合液。此后，将混合液保持在40℃同时以200rpm搅拌，并且进行氮气鼓泡30分钟。接下来，用氮气流替换氮气鼓泡。然后，将另外制备的通过将0.06gV-50(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.)溶解于3g离子交换水中获得的溶解液添加至混合液中以引发自由基聚合(无皂乳液聚合)。聚合开始2小时后，将0.3g甲基丙烯酸缩水甘油酯添加至自由基聚合反应场中，并且将混合物保持在70℃，同时以200rpm搅拌8小时，然后逐渐冷却至室温以提供颗粒分散液(工序1)。此时，对200mL烧瓶的内容物进行取样，并且通过使用质子NMR、气相色谱法和凝胶渗透色谱法来评价它们的自由基聚合转化率。结果，确认到自由基聚合转化率基本上为100％。在将工序1中获得的颗粒分散液在冰浴中冷却并且进行搅拌的同时，制备通过将2.2g巯基琥珀酸(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.：巯基琥珀酸的总摩尔数等于甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数)和3.0g三乙胺添加至40g离子交换水中获得的水溶液并且将其滴加至颗粒分散液中。在完成滴加之后，通过使用三乙胺和2N盐酸水溶液将反应液的pH调节至10.3。此后，将所得物升温至70℃并且在搅拌的同时保持4小时，以使源自甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基和源自巯基琥珀酸的硫醇基进行化学反应以提供具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-1(工序2)。在化学反应期间未出现凝集块等。通过离心操作来纯化颗粒3-1，并且，在保存之前，用纯水替换分散介质(分散介质的替换也通过离心操作来进行)。通过使用动态光散射(DLS-8000：OtsukaElectronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-1发现它们的数均粒径为214nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为130[nmol/mg]。
(实施例3-2：颗粒3-2的合成)
除了将实施例3-1的工序2中的反应液的pH由10.3改变为10.7以外，通过与实施例3-1中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-2。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：Otsuka Electronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-2的粒径发现它们的数均粒径为226nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为200[nmol/mg]。
(实施例3-3：颗粒3-3的合成)
除了将实施例3-1的工序2中的2.2g巯基琥珀酸改变为1.6g巯基丙酸(Wako PureChemical Industries,Ltd.：巯基丙酸的摩尔数等于甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数)并且将要添加至水溶液中的三乙胺的量改变为1.6g以外，通过与实施例3-1中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-3。与实施例3-1中同样地，在化学反应期间未出现凝集块等。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：OtsukaElectronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-3的粒径发现它们的数均粒径为211nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为120[nmol/mg]。
(实施例3-4：颗粒3-4的合成)
除了在实施例3-1的工序2中在不添加三乙胺的情况下进行反应以外，通过与实施例3-1中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-4。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：Otsuka Electronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-4的粒径发现它们的数均粒径为209nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为20[nmol/mg]。
(实施例3-5：颗粒3-5的合成)
除了将实施例3-1的工序2中的反应液的pH由10.3改变为9.9以外，通过与实施例3-1中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-5。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：Otsuka Electronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-5的粒径发现它们的数均粒径为216nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为80[nmol/mg]。
(实施例3-6：颗粒3-6的合成)
在将实施例3-5中获得的颗粒3-5在冰浴中冷却并且进行搅拌的同时，制备通过将0.9g氨基乙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.：氨基乙醇的总摩尔数等于甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数)和0.6g氢氧化钠(Kishida Chemical Co.,Ltd.：以与氨基乙醇的摩尔数相等的量)添加至40g离子交换水中而获得的水溶液并且将其滴加至颗粒分散液中。在完成滴加之后，通过使用氢氧化钠和1N盐酸将反应液的pH调节至10.0。此后，将所得物升温至70℃并且在搅拌的同时保持4小时，以使源自甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基和源自氨基乙醇的氨基进行化学反应以提供环氧基开环的颗粒3-6。在化学反应期间未出现凝集块等。通过离心操作来纯化颗粒3-6，并且，在保存之前，用纯水替换分散介质(分散介质的替换也通过离心操作来进行)。通过使用动态光散射(DLS-8000：Otsuka ElectronicsCo.,Ltd.)评价颗粒3-6发现它们的数均粒径为214nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为80[nmol/mg]。
(实施例3-7：颗粒3-7的合成)
在将实施例3-5中获得的颗粒3-5在冰浴中冷却并且进行搅拌的同时，制备通过将1.4g 3-巯基-1-丙醇(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.：巯基丙醇的总摩尔数等于甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数)和1.5g三乙胺(Kishida Chemical Co.,Ltd.：以与3-巯基-1-丙醇的摩尔数相等的量)添加至40g离子交换水中获得的水溶液并且将其滴加至颗粒分散液中。在完成滴加之后，通过使用三乙胺和1N盐酸将反应液的pH调节至10.0。此后，将所得物升温至70℃并且在搅拌的同时保持4小时，以使源自甲基丙烯酸缩水甘油酯的环氧基和源自巯基丙醇的巯基进行化学反应以提供环氧基开环的颗粒3-7。在化学反应期间未出现凝集块等。通过离心操作来纯化颗粒3-7，并且，在保存之前，用纯水替换分散介质(分散介质的替换也通过离心操作来进行)。通过使用动态光散射(DLS-8000：OtsukaElectronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-7发现它们的数均粒径为220nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为80[nmol/mg]。
(比较例3-1：改性SG颗粒3-1的合成)
除了将实施例3-1的工序2中的2.2g巯基琥珀酸改变为1.1g甘氨酸(Wako PureChemical Industries,Ltd.：甘氨酸的摩尔数等于甲基丙烯酸缩水甘油酯的摩尔数)并且将要添加至水溶液中的三乙胺的量改变为1.6g以外，通过与实施例3-1中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的改性SG颗粒3-1。与实施例3-1中同样地，在化学反应期间未出现凝集块等。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：OtsukaElectronics Co.,Ltd.)评价改性SG颗粒3-1的粒径发现它们的数均粒径为211nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为120[nmol/mg]。
(亲和颗粒的合成：抗体的结合)
将颗粒3-1至3-7和改性SG颗粒3-1各自以1.0wt％分散在MES缓冲液中以制备1μL各分散液。将通过将0.055mg 1-[3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺](Wako PureChemical Industries,Ltd.)溶解于10μL磷酸缓冲液中来获得的溶解液添加至这些分散液中的每一者中。此后，将单克隆小鼠抗人C反应性蛋白(下文中称为CRP抗体)的克隆C5(Funakoshi Co.,Ltd.)的4.9mg/mL分散液5μL及其克隆C6(Funakoshi Co.,Ltd.)的5.8mg/mL分散液5μL添加至混合物中。然后，将混合物在室温下振摇180小时以合成亲和颗粒。接下来，通过进行离心纯化(15,000rpm)三次来纯化亲和颗粒，并且最终以分散在1mL磷酸缓冲液中的状态保存。由颗粒3-1至3-7获得的亲和颗粒在下文中分别称为亲和颗粒3-1至3-7。此外，由改性SG颗粒3-1获得的亲和颗粒称为CRP固定化改性SG颗粒3-1。
基于以下指标来评价亲和颗粒3-1至3-7和CRP固定化改性SG颗粒3-1的敏化率。结果在表3-1中示出。
A：80％以上
B：60％以上且小于80％
C：小于60％
(对人CRP抗原的抗原抗体反应性的评价)
将1μL人CRP(由Sigma-Aldrich制造的C4063，C反应性蛋白，源自人血浆，32mg/dl)和50μL缓冲液(CRP-L Auto“TBA”的缓冲液(R-1)，Denka Seiken Co.,Ltd.)混合以得到混合液，并且将混合液在37℃下加温5分钟。接下来，将50μL在实施例3-1至3-7和比较例3-1中获得的亲和颗粒的各分散液与混合液混合，并且测量搅拌之后即刻的分散液在572nm的波长处的吸光度。将由Biochrom制造的分光光度计GeneQuant 1300用于吸光度测量。然后，将分散液在37℃下静置5分钟，然后再次测量其在572nm的波长处的吸光度，然后计算吸光度的变化量ΔABS×10,000。对于吸光度的变化量ΔABS×10,000的值，基于以下指标来分别评价亲和颗粒3-1至3-7和CRP固定化改性SG颗粒3-1。结果在表3-1中示出。
A：变化量为10,000以上。
B：变化量为5,000以上且小于10,000。
C：变化量小于5,000。
(非特异性吸附性评价)
此外，除了使用生理盐水而不是添加1μL人CRP(由Sigma-Aldrich制造的C4063，C反应性蛋白，源自人血浆，32mg/dl)以外，通过以相同的方式进行评价来评价非特异性吸附性，并且计算吸光度的变化量ΔABS×10,000。对于吸光度的变化量ΔABS×10,000的值，基于以下指标来分别评价亲和颗粒3-1至3-7和CRP固定化改性SG颗粒3-1。结果在表3-1中示出。
A：变化量小于1,000。
B：变化量为1,000以上。
[表3-1]
表3-1
Figure BDA0003522627970000901
如上所述，可以提供如下颗粒，所述颗粒由于具有在侧链中隔着硫醚基具有羧基的结构，因此抑制非特异性吸附的能力优异，具有在免疫胶乳凝集法中高度灵敏的敏化性，并且以高收率使配体与颗粒表面化学结合。
(实施例3-8：具有小粒径的颗粒3-8的合成)
除了在实施例3-1中将苯乙烯的量改变为0.5g、将甲基丙烯酸缩水甘油酯的量改变为0.8g、将二乙烯基苯的量改变为0.02g并且将聚合开始2小时后要添加至三颈可分离烧瓶中的GMA的量改变为0.13g以外，以与实施例3-1的工序1中相同的方式获得颗粒分散液。除了将实施例3-1的工序2中的反应液的pH由10.3改变为10.7以外，通过与实施例3-1的工序2中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-8。对颗粒进行离心纯化，然后，在保存之前，用纯水替换分散介质。通过使用动态光散射(DLS-8000：OtsukaElectronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-8发现它们的数均粒径为184nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为215[nmol/mg]。
(实施例3-9：羧基量不同的具有小粒径的颗粒3-9的合成)
除了将实施例3-8的工序2中的反应液的pH由10.3改变为9.98以外，通过与实施例3-8中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-9。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：Otsuka Electronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-9的粒径发现它们的数均粒径为153nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为96[nmol/mg]。
(实施例3-10：羧基量不同的具有小粒径的颗粒3-10的合成)
除了将实施例3-8的工序2中的反应液的pH由10.3改变为2.3(不使用三乙胺)以外，通过与实施例3-8中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-10。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：Otsuka Electronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-10的粒径发现它们的数均粒径为149nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为22[nmol/mg]。
(实施例3-11：具有大粒径的颗粒3-11的合成)
除了在实施例3-1中将苯乙烯的量改变为2.27g、将甲基丙烯酸缩水甘油酯的量改变为3.4g、将二乙烯基苯的量改变为0.08g并且将聚合开始2小时后要添加至三颈可分离烧瓶中的GMA的量改变为0.56g以外，以与实施例3-1的工序1中相同的方式获得颗粒分散液。除了将实施例3-1的工序2中的反应液的pH由10.3改变为11.3以外，通过与实施例3-1的工序2中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-11。对颗粒进行离心纯化，然后，在保存之前，用纯水替换分散介质。通过使用动态光散射(DLS-8000：OtsukaElectronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-11发现它们的数均粒径为309nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为266[nmol/mg]。
(实施例3-12：羧基量不同的具有大粒径的颗粒3-12的合成)
除了将实施例3-11的工序2中的反应液的pH由11.3改变为11.0以外，通过与实施例3-11中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-12。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：Otsuka Electronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-12的粒径发现它们的数均粒径为280nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为239[nmol/mg]。
(实施例3-13：羧基量不同的具有大粒径的颗粒3-13的合成)
除了将实施例3-11的工序2中的反应液的pH由10.3改变为2.4(不使用三乙胺)以外，通过与实施例3-11中相同的实验操作来获得具有羧基作为反应性官能团的颗粒3-13。纯化和保存方法也相同。通过使用动态光散射法(DLS-8000：Otsuka Electronics Co.,Ltd.)评价颗粒3-13的粒径发现它们的数均粒径为247nm。此外，对它们的每单位质量的羧基量进行定量，为16[nmol/mg]。
(实施例3-14：亲和颗粒的合成)
将颗粒3-8至3-13中的每一者的0.1mL(颗粒1mg)颗粒分散液(浓度为1.0wt％的溶液，10mg/mL)转移至微量管(体积：1.5mL)中，将0.12mL活化缓冲液(25mM MES，pH：6.0)添加至其中，并且将混合物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟。离心后，将上清液弃去。将0.12mL活化缓冲液(25mM MES，pH：6.0)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒再分散。重复进行离心和再分散一次。
接下来，将60μL WSC溶液(通过将50mg WSC溶解于1mL活化缓冲液中而获得的溶液，术语“WSC”意指1-[3-(二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺]盐酸盐)和Sulfo NHS溶液(通过将50mg Sulfo NHS溶解于1mL活化缓冲液中而获得的溶液，术语“Sulfo NHS”意指磺基-N-羟基琥珀酰亚胺)各自添加至所得物中，并且用超声波分散。将分散液在室温下搅拌30分钟以将其颗粒的羧基转化为活性酯。将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.2mL固定化缓冲液(25mM MES，pH：5.0)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将分散液在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将50μL固定化缓冲液添加至残余物中，并且用超声波使羧基经活化的颗粒分散。
将50μL抗体溶液(通过用固定化缓冲液稀释抗CRP抗体以使其浓度成为25μg/50μL而获得的溶液)添加至50μL羧基经活化的颗粒的溶液中，并且用超声波使颗粒分散。负载的抗体量为每1mg颗粒25μg(25μg/mg)。抗体终浓度为0.25mg/mL，并且颗粒终浓度为10mg/mL。将微量管中的内容物在室温下搅拌60分钟以使抗体与颗粒的羧基结合。接下来，将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.24mL掩蔽缓冲液(通过在pH为8.0的1M Tris中包含0.1％吐温20而获得的缓冲液)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将分散液在室温下搅拌1小时，然后在4℃下静置过夜以使Tris与残余的活化羧基结合。接下来，将所得物在4℃和15,000rpm(20,400g)下离心5分钟，并且将上清液弃去。将0.2mL洗涤缓冲液(10mM HEPES，pH：7.9)添加至残余物中，并且用超声波使颗粒分散。将使用洗涤缓冲液(10mM HEPES，pH：7.9)的洗涤操作(离心和再分散)重复一次。用0.2mL保存缓冲液(10mM HEPES，pH：7.9，包含0.01％吐温20)进行洗涤操作一次。将1.0mL保存缓冲液添加至洗涤产物中，并且用超声波使颗粒分散。分散液的颗粒浓度最终变为0.1wt％(1mg/mL)。将分散液保存在冰箱中。由颗粒3-8至3-13获得的亲和颗粒在下文中分别称为亲和颗粒3-8至3-13。
(实施例3-15：亲和颗粒3-8至3-13的抗原抗体反应性评价)
以与上述实施例相同的方式来评价对人CRP抗原的抗原抗体反应性。亲和颗粒3-8至3-13相对于人CRP(32mg/dl)的吸光度的变化量ΔABS×10,000的值分别为3,430、4,330、6,930、2,250、6,750和12,400。在所有颗粒中均确认到对人CRP抗原的抗原抗体反应性。
(实施例3-16：亲和颗粒3-8至3-13的非特异性吸附性评价)
以与上述实施例中相同的方式来进行使用生理盐水的非特异性吸附性的评价。亲和颗粒3-8至3-13的吸光度的变化量ΔABS×10,000的值分别为40、80、120、-240、0和260。在任何颗粒中均未发现非特异性吸附性。
(实施例3-17：抗体结合量增加的亲和颗粒的合成)
除了将负载的抗体量改变为每1mg颗粒200μg(200μg/mg)以外，以与实施例3-14中相同的方式通过使抗CRP抗体与颗粒3-8结合来合成抗体结合量增加的亲和颗粒3-14。评价所得亲和颗粒3-14对人CRP抗原的抗原抗体反应性。结果，发现亲和颗粒3-14相对于人CRP(32mg/dl)的吸光度的变化量ΔABS×10,000的值为10,440。进行使用生理盐水的非特异性吸附性的评价。结果，发现亲和颗粒3-14的吸光度的变化量ΔABS×10,000的值为600。发现通过增加与颗粒结合的抗体量能够提高吸光度的变化量，即，灵敏度。
(实施例3-18：人血清试样对颗粒的非特异性吸附的评价)
将由人血清试样(1μL，NHS-9，Tennessee Blood Services)和磷酸缓冲液(50μL)形成的51μL试样稀释液添加至颗粒3-8至颗粒3-12中的每一者的50μL分散液中，并且测量搅拌后即刻的混合液在572nm的波长处的吸光度。将由Biochrom制造的分光光度计GeneQuant 1300用于吸光度测量。然后，将各混合液在37℃下静置5分钟，然后再次测量其在572nm的波长处的吸光度，然后计算吸光度的变化量ΔABS×10,000的值。应当理解的是，随着该值变得越大，发生非特异性吸附越多。颗粒3-8至3-12的吸光度的变化量ΔABS×10,000的值分别为-70、-20、60、-50和40。在任何颗粒中均未发现对人血清试样的非特异性吸附性。
本发明不限于上述实施方案，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以做出各种改变和修改。因此，所附权利要求附加于此以公开本发明的范围。
本申请基于2019年8月30日提交的日本专利申请No.2019-158952、2019年8月30日提交的日本专利申请No.2019-158962和2019年8月30日提交的日本专利申请No.2019-158138要求优先权，并且其全部内容通过引用并入本文。

Claims (42)

1.一种颗粒，所述颗粒在其表层中包含具有重复单元A和重复单元B的共聚物，
其特征在于，所述重复单元A具有侧链A，并且所述侧链A在其末端具有要与配体结合的羧基，
其中所述重复单元B具有侧链B，并且所述侧链B在其末端具有羟基，
其中所述颗粒构成为使得当所述颗粒分散在离子交换水中时，所述颗粒的表层含水以形成溶胀层，
其中所述溶胀层中包含的羧基的密度满足式(1-1)，和
其中当所述颗粒干燥时测得的干燥粒径和当所述颗粒分散在离子交换水中时测得的水中粒径满足式(1-2)，
0.04≤[羧基密度(个/nm3)]≤0.15…式(1-1)
1.10≤[水中粒径/干燥粒径]≤1.40…式(1-2)。
2.根据权利要求1所述的颗粒，其中所述颗粒的zeta电位满足式(1-3)，
-30≤[Zeta电位(mV)]≤-10…式(1-3)。
3.根据权利要求1或2所述的颗粒，其中所述重复单元A的摩尔数和所述重复单元B的摩尔数满足式(1-4)，
0.05≤[重复单元A的摩尔数]/[重复单元B的摩尔数]≤1.00…式(1-4)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的颗粒，其中所述重复单元A由式(1-5)表示：
[化学式1]
Figure FDA0003522627960000011
其中R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以被取代的具有1至15个碳原子的亚烷基或氧化烯基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的颗粒，其中所述重复单元B由式(1-6)表示：
[化学式2]
Figure FDA0003522627960000021
其中R1表示甲基或氢原子，L2表示可以被取代的具有2至15个碳原子的亚烷基或氧化烯基，并且具有[L1的碳原子数]+2≥[L2的碳原子数]的关系，并且X表示硫原子或可以被取代的氮原子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的颗粒，其中所述式(1-5)中的L1表示具有1个碳原子的亚烷基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的颗粒，其中所述式(1-6)中的L2表示具有2个碳原子的亚烷基。
8.根据权利要求1至6中任一项所述的颗粒，其中在所述式(1-6)中，X表示硫原子，L2表示具有3个碳原子的亚烷基，并且所述亚烷基的一个氢原子被羟基取代。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒具有选自由苯乙烯类和(甲基)丙烯酸酯类组成的组中的至少一种作为重复单元C。
10.一种亲和颗粒，其特征在于，其包括：
权利要求1至9中任一项所述的颗粒；和
与所述颗粒结合的配体。
11.根据权利要求10所述的亲和颗粒，其中所述配体为抗体或抗原。
12.一种亲和颗粒，其特征在于，其包括：
颗粒；和
所述颗粒表面上的配体，
其中所述配体相对于所述颗粒表面的占有面积率满足式(2-1)的关系，
其中所述颗粒和所述配体的zeta电位满足式(2-2)的关系，和
其中所述颗粒具有由式(2-3)表示的重复单元A：
10≤[占有面积率(％)]≤40…式(2-1)
0≤[||颗粒的Zeta电位(mV)|-|配体的zeta电位(mV)||]≤20…式(2-2)
[化学式3]
Figure FDA0003522627960000031
在所述式(2-3)中，R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以具有取代基的具有1至15个碳原子的亚烷基或可以具有取代基的具有1至15个碳原子的氧化烯基。
13.根据权利要求12所述的亲和颗粒，其中所述颗粒具有重复单元B，所述重复单元B在其侧链末端具有羟基。
14.根据权利要求12或13所述的亲和颗粒，其中所述式(2-3)中的L1表示亚甲基。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的亲和颗粒，其中所述式(2-3)中的R2表示羧基。
16.根据权利要求13所述的亲和颗粒，其中所述重复单元B由式(2-4)表示：
[化学式4]
Figure FDA0003522627960000041
在所述式(2-4)中，R1表示甲基或氢原子，L2表示可以具有取代基的具有2至15个碳原子的亚烷基或可以具有取代基的具有2至15个碳原子的氧化烯基，X表示硫原子或可以具有取代基的氮原子，并且所述式(2-3)中的L1和所述式(2-4)中的L2满足[L1的碳原子数]+2≥[L2的碳原子数]的关系。
17.根据权利要求16所述的亲和颗粒，其中所述式(2-4)中的L2表示具有2个碳原子的亚烷基。
18.根据权利要求16所述的亲和颗粒，其中所述式(2-4)中的X表示硫原子，所述式(2-4)中的L2表示具有3个碳原子的亚烷基，并且由L2表示的所述亚烷基的一个氢原子被羟基取代。
19.根据权利要求13所述的亲和颗粒，其中所述颗粒的表层包含具有所述重复单元A和所述重复单元B的共聚物，并且当所述颗粒分散在水溶液中时，所述表层含水以形成溶胀层。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的亲和颗粒，其中当所述颗粒干燥时测得的所述颗粒的干燥粒径和当所述颗粒分散在离子交换水中时测得的所述颗粒的水中粒径满足式(2-5)，
1.1≤[水中粒径/干燥粒径]≤1.4…式(2-5)。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的亲和颗粒，其中所述亲和颗粒具有由式(2-6)表示的化学结构，所述化学结构通过将所述重复单元A的羧基的一部分通过使用化学反应来转化而获得：
[化学式5]
Figure FDA0003522627960000051
在所述式(2-6)中，R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以具有取代基的具有1至15个碳原子的亚烷基或可以具有取代基的具有1至15个碳原子的氧化烯基。
22.根据权利要求12至21中任一项所述的亲和颗粒，其中所述颗粒具有选自由苯乙烯类和(甲基)丙烯酸酯类组成的组中的至少一种作为重复单元C。
23.根据权利要求12至22中任一项所述的亲和颗粒，其中所述配体为抗体或抗原。
24.一种试剂，其用于通过体外诊断检测试样中的目标物质，其特征在于，所述试剂包含权利要求11至23中任一项所述的亲和颗粒。
25.根据权利要求24所述的试剂，其中所述试剂用于通过凝集法检测所述试样中的目标物质。
26.一种试剂盒，其用于通过体外诊断检测试样中的目标物质，其特征在于，所述试剂盒至少包括权利要求24或25所述的试剂。
27.一种检测方法，其为通过体外诊断检测试样中的目标物质的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求11至23中任一项所述的亲和颗粒与可能包含所述目标物质的试样混合。
28.根据权利要求27所述的检测方法，其中所述检测方法为通过凝集法检测所述试样中的目标物质的方法。
29.一种颗粒，其特征在于，其包括包含由下式(3-1)表示的重复单元A的共聚物：
[化学式6]
Figure FDA0003522627960000061
在所述式(3-1)中，R1表示甲基或氢原子，R2表示羧基或氢原子，并且L1表示可以被取代的具有1至15个碳原子的亚烷基或可以被取代的具有1至15个碳原子的氧化烯基。
30.根据权利要求29所述的颗粒，其中所述颗粒的每单位质量的羧酸量为5[nmol/mg]以上。
31.根据权利要求29或30所述的颗粒，其中所述颗粒的每单位质量的羧酸量为100[nmol/mg]以上。
32.根据权利要求29至31中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒的每单位质量的羧酸量为300[nmol/mg]以下。
33.根据权利要求29至32中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒的数均粒径为0.05μm以上且1μm以下。
34.根据权利要求29至33中任一项所述的颗粒，其中所述颗粒的每单位面积的羧酸量为0.1至20[个分子/nm2]。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的颗粒，其中所述式(3-1)中的L1表示具有1个碳原子的亚烷基。
36.根据权利要求29至35中任一项所述的颗粒，其中所述式(3-1)中的R2表示羧基。
37.根据权利要求29至36中任一项所述的颗粒，其中所述共聚物进一步具有疏水性重复单元C，并且所述重复单元C为选自由苯乙烯类和(甲基)丙烯酸酯类组成的组中的至少一种。
38.一种亲和颗粒，其特征在于，其包括：
权利要求29至37中任一项所述的颗粒；和
与所述颗粒化学结合的配体。
39.根据权利要求38所述的亲和颗粒，其中所述配体为抗体或抗原。
40.一种试剂，其用于通过体外诊断检测试样中的目标物质，其特征在于，所述试剂包含权利要求39所述的亲和颗粒。
41.根据权利要求40所述的试剂，其中所述试剂用于通过凝集法检测所述试样中的目标物质。
42.一种试剂盒，其用于通过体外诊断检测试样中的目标物质，其特征在于，所述试剂盒至少包括权利要求40或41所述的试剂。
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