JPS62286533A - 診断用凝集反応試薬の担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は水媒体中で分散安定性のよい親水性の複合重合
体粒子及びその製造方法に関する。特に、酵素や免疫活
性物質などの生理活性物質を固定化して、診断用試薬に
好適に使用し得る複合重合体粒子及びその製造方法を提
供するものである。

〔従来技術及び発明が解決しよ５とする問題点〕複合重
合体粒子は無機化合物粒子が重合体Ｉ−で被覆された構
造であり、電子写真、歯科材料、インキ、イオン交換樹
脂、樹脂成型品。

診断用試薬担体、カラムクロマトグラフィー用担体、あ
るいは医薬投与用担体のように、多くの分野において使
用されている。特に最近では、生化学分野への複合重合
体粒子の進出がめざましく、生理活性物質、特に酵素や
免疫性物質を担持させた診断用試薬、特にマイク−タイ
ター法による診断用試薬としての応用が試みられている
。

従来の複合重合体粒子については、例えば高分子論文集
第４０巻、６９７−７０２頁（１９８１年）Ｋ、ヒドロ
キシプロピルセルロ−ス リカ粒子を核に使用すると、スチレンによるシリカ粒子
のカプセル化が促進することが述べられている。また、
高分子論文集第４０巻２５９−２６６頁（１９８３年）
には、硫酸バリウム粉末の存在下にメタクリル酸メチル
の重合を行い、生成ポリマーにより硫酸バリウム粉末を
カプセル化したことが述べられている。

しかし、これらの方法によると、−粒子の中に複数個の
無機化合物粒子を含んだ複合重合体粒子や無機化合物粒
子を全（含まない重合体のみの粒子が多数生成すること
が、本発明者らの実験により確認された。

ところで、診断用試薬の担体としては、粒度分布が狭く
、また、単粒子性の高い粒子を用いることが、分散安定
性や鋭敏性の上から好ま１−い。従って、複合重合体粒
子を診断用試薬の担体として用いる場合には、元の無機
化合物粒子の粒度分布を狭く、箪粒子性を高く調製する
。しかしながら、このように狭い粒度分布や高〜・単粒
子性を有する無機化合物粒子を用いても、前記した方法
によって重合を行った場合には、重合後に得られた複合
重合体粒子の粒度分布や単粒子性は悪化してしまう。

このような複合重合体粒子に蛋白質．臂素。

抗原，抗体．バクテリア、ウィルス、細胞等の生理活性
物質を吸着させて診断用試薬に応用した場合、分散安定
性が低いために取扱いが困難であり、また、粒度分布が
広く凝集粒子が多いために表面積が小さく吸着効率が低
いという欠点がある。

〔問題を解決するための手段〕

そこで、本発明者らは、診断用試薬の担体として好適に
使用し得る高い単粒子性を有する複合重合体粒子の開発
を続けてきた結果、本発明を完成するに至ったものであ
る。

すなわち、本発明は、無機化合物粒子が、個々に独立し
て重合体層で被覆されてなり、単粒子性が８０％以上で
あることを特徴とする複合重合体粒子である。

本発明の複合重合体粒子は、無機化合物粒子が夫々独立
して重合体層で被覆されている。

すなわち、１個の複合重合体粒子は基本的に１個の無機
化合物粒子を含有していることが重要である。２個以上
の無機化合物粒子を含有すると、複合重合体粒子の粒径
及び粒度分布が大きくなるだけでなく、凝集粒子が生じ
易くなるので、診断用試薬の担体として用いる場合には
、固定化効率が低下し好ましくな℃１。

本発明で使用される無機化合物粒子は、公知のものが何
ら制限なく採用することができる。例えば、シリカ、ア
ルミナ、チタニア。

ジルコニア、酸化第二鉄，四三屯化鉄．酸化コバルト、
酸化ニッケル等の周期律表第１族。

第■族または第１族の金属または半金属の酸化物；水酸
化アルミニウム、水酸化第二鉄。

水酸化クロム等の水散化物；臭化銀，塩化銀等のハロゲ
ン化物；硫化カドミウム等の硫化物；炭酸カルシウム、
炭酸マグネシウム等の炭酸塩；硫酸バリウム、硫酸スト
ロンチウム等の硫酸塩等を何ら制限なく採用することが
できる。

本発明において、特に好適に用いられる無機化合物粒子
としては、シリカ、アルミナ。

チタニア夫々を主な構成成分とする無機酸化物か、ある
いはシリカと結合可能な周期律表第１族、第■族、第■
族及び第■族からなる群より選ばれた少なくとも１群の
金属酸化物及びシリカを主な構成成分とする無機酸化物
を挙げることができる。

上記の各金属償化物とシリカを主な構成成分とする無機
酸化物はシリカのシリコン原子と第１族、第■族、第１
族または第■族の金属酸化物、り１えば酸化リチウム、
酸化ナトリウム、酸化カリウム、！を化マグネシウム、
酸化カルシウム、醸化ス）ｃｙンチウム、１１化バリウ
ム、酸化アルミニウム、［化チタニウム。

酸化ジルコニウム、酸化・・フニウム、酸化錫。

散化鉛等が酸素を仲介に結合してたものであるうそして
上記第■族、ｉｎ族、第１族及び第■族の金Ｆ％酸化物
（以下単に一般式Ｍ２０゜Ｍ”Ｏ，Ｍ２Ｏ、Ｍ’Ｏ，（
ただし、Ｍｌは第Ｉ族の金属９Ｍ３は第「族の金属　Ｕ
ａは第１族の金属１Ｍ′は第■族の金Ｘ）で表示する場
合もある）の構成比率は得られる無機酸化物の形状に大
きな影響を与える。勿論、ＭΔＯ，Ｍ”Ｏ，Ｍ孟Ｏ３，
及びＭ２Ｏ，の種類。

製造方法、調造条件等によってその構成比率が形状に与
える影響は変ってくるが、一般に上記した粒子径の範囲
でかつ球形状の無機酸化物を得ようとする場合は、Ｍ五
〇、Ｍ”０゜Ｍ２Ｏ，、及びＭ　Ｏ，の合計の構成比率
を１〜２０モル％の範囲とすることが好ましく、特に５
〜１５モル％の範囲のＭ’Ｏ，Ｍ　０゜Ｍ”Ｏ及びＭ’
Ｏの合計の構成比率を選択するときは粒子径が揃った真
球に近いものとなる。

本発明で使用される無機化合物粒子は、生理食塩水また
は緩９に液に対して難溶性を示すものであることが好ま
しい。

本発明に便用される無機化合物粒子及び複合重合体粒子
の平均粒径は、特に限定的ではないが、得られる複合重
合体粒子を後述する種々の用途に用いる場合には、Ｏ，
ＯＳ〜２００μｍ、好ましくは０．１〜Ｚｏｏμｍｆ）
範囲から選択されろ。本発明で得られる複合重合体粒子
を診断用試薬に応用する場合には、平均粒径は０．５〜
１０．μ風であることが好ましい。

本発明の複合重合体粒子に生理活性物質を担持させる場
合は、生理活性物質の高い固定化効率を得るために無機
化合物粒子の粒度分布は狭いほどよい。粒度分布を粒子
径の分散値（平均粒径の標準偏差を平均粒径で除して１
００をかげた値、％表示）で示せば、一般に３０％以下
、さらに２０％以下である無機化合物粒子が好ましい、
同様に、本発明の複合重合体粒子の粒径の分散値は３０
％以下、さらに２０％以下であることが好ましい。

さらに、無機化合物粒子の形状は、使用される無機化合
物の結晶構造、＃法によって異なり、多面体、柱体０両
錐体１球体等が存在し、これらすべて使用可能であるが
、好ましくは球体、特に好ましくは真球体がよい。

本発明の複合重合体粒子の単粒子性は８０％以上、好ま
しくは９０％以上である。単粒子性とは非凝集粒子、す
なわち、全粒子中に占める単一粒子の個数の割合である
。無機化合物の粒子は、合成時あるいは保存中に２個あ
るいはそれ以上凝集し、凝集粒子をつくる。

この凝集粒子が増加すると単粒子性が悪化する。単粒子
性は粒子径もしくは粒子体積と粒子個数を同時に測定す
る装賛を利用して測定される。例えばコールタ−カウン
ター社製モデルＺＤ−１等により測定される。

前記した無機化合物粒子を被覆する重合体層は、下記式
（１） （ただし、Ｒ１は水素原子、フルキル基またはカルボキ
シル基書しくけその塩型基であり、Ｒ３は水素原子、フ
ルキル基またはハロゲン原子であり、Ｒ８はカルボキシ
ル基、スルホン酸基、スルホ７リール基、スルホアルキ
ル基若しくはされらの塩型基、カルバモイル基。

Ｎ−ヒドロキシフルキルカルバモイル基、ヒドロキシア
ルフ中ジカルボニル基、ヒドロキシフルキル基またはポ
リエチレングリコールエステル基である。） で示される親水性単量体単位を含んでいることが好まし
い。

前記一般式（！）中、Ｒ１及びＲ３で示されるフルキル
基は、その炭素数に特に制限されないが、無機化合物粒
子の被覆を良好に行うため忙は、炭素数が１〜４である
ことが好ましい、、また、前記一般式（１）中、Ｒ３で
示されるスルホアルキル基９Ｎ−ヒドロキシアルキルカ
ルバモイル基、ヒドロキシアルコキシカルボニル基、ヒ
ドロキシフルキル基の各基の中に含まれるアルキル基ま
たはアルキレン基はその炭素ｅ、　Ｋ　特に制限されな
いが、上記と同様の理由によって炭素数は１〜４である
ことが好ましいう本発明で好適なスルホフルキル基とし
ては、スルホメチル基、スルホエチル基等が挙げられ、
Ｎ−ヒドロキシフルキルカルバモイル基としては、Ｎ−
ヒドロキシメチルカルバモイル基、Ｎ−ヒドロキシエチ
ルカルバモイル基等が挙げられ、ヒドロキシアルコキシ
カルボニル基としては、ヒドロ＋ジメトキシカルボニル
基、ヒドロキシエトキシカルボニル基、ジヒドロキシプ
ーポキシカルボニルＳ等が挙げられ、ヒドロキシフルキ
ル基としては、ヒドロキシメチル基、ヒト−キシエチル
基等が挙げられろう さらに、前記一般式（１）中、Ｒ３で示されるスルホ７
リール基としては、スルホフェニル基、スルホナフチル
基、スルホアントラシル基等が挙げられる。また、ポリ
エチレングリコールエステル基は、ＨＯモＣ）［、ＣＩ
（，０＋ｎＣ０−（ただ１−１ｎは５〜５０）で示され
る基である。

さらに、前記一般式（り中、Ｒ及びＲａで示されるカル
ボキシル基、スル小ン醗基及びスルホ７リール基の塩攪
基としては、これらの各基とナトリウムやカリウム等の
アルカリ金属とで構成された塩凰基が好適である。

さらにまた、本発明の複合重合体粒子に免疫活性物質を
担持させた免疫診断用試薬として用いる場合には、複合
重合体粒子の表面への免疫活性物質の吸着が行いやすい
ように、複合重合体粒子の表面を疎水性としておくこと
が好ましい。このためには、複合重合体粒子の重合体層
が、下記式（２） ％式％（２１ （ただし、Ｒ４は水素原子またはフルキル基であり、Ｒ
５はハロゲン原子、置換若しくは非置換のフェニル基、
フルコキシカルポニル基である。） で示される疎水性単量体単位を含んでいるととが好まし
い。

前記一般式（２）中、Ｒ１で示されるアルキル基は、そ
の炭素数に特に制限されないが、単量体の人手の容易さ
から、通常は１〜４であることか好ましい。また、フェ
ニル基の置換基としては、単量体単位の疎水性を保持す
るものであれば特に制限されないが、一般にはハロゲン
原子、ハロフルキル基、フルキル基等を挙げることがで
きる。

上記の疎水性単量体単位を含む場合には、前記した親水
性単量体単位との比率は、特に制限されるものではない
が、複合重合体粒子の表面を疎水性に保持するためには
、 親水性単量体単位（モル） さらに０．５〜１０の範囲であることが好まし。

い。

本発明の複合重合体粒子の重合体層は、極めて藩いこと
、一般には５〜５００Ａさらに１０〜１００Ａの範囲で
あることが好ましい。

この上、うな薄い重合体層とすることにより、無機化合
物粒子の粒径とほとんど変わらない粒径の複合重合体粒
子とすることができる。

また、本発明の複合重合体粒子の重合体層は、無機化合
物粒子を完全に被うことが好ましい。無機化合物粒子の
表面が一部露出していてもよいが、本発明の複合重合体
粒子を水中で使用した場合に無機化合物の溶出が低い方
がよい。例えば、本発明の複合重合体粒子を蒸留水中に
一定濃度分散させ、２４時間放置後の蒸留水中に溶出し
た無機化合物の濃度が１０００　ｐｐｍ　　以下、特Ｖ
Ｃ１ｏＯｐｐｍ　　以下であることが好ましい。

前記した複合重合体粒子の製造方法としては、特に制限
されるものではないが、次の方法が好適に採用される。

すなわち、無機化合物粒子を分散させた水媒体中で、水
溶性ラジカル開始剤の存在下に水ｔｏｏ！Ｊｋ部に対す
る溶解度が１０重量部以上の親水性単量体の重合を行う
方法である。

本発明で用いられる親水性単量体としては水１００重量
部に対する溶解度が１０重量部以上であれば特に制限さ
れず、公知の単量体が用いられる。特に、水１００重量
部に対する溶解度が１５重量部以上である袈水性単量体
を用いることが好ましい。

本発明において、特に好適に用いられる親水性単量体は
、下記一般式（３）で示される単量体である。

Ｒ。

ＲＲ。

（ただし、Ｒｏは水素原子、アルキル基またはカルボキ
シル基若しくはその塩型基であり、Ｒ３は水素原子、ア
ルキル基またはハロゲン原子であり、Ｒ３はカルボキシ
ル基、スルホン酸基、スルホアリール基、スルホフルキ
ル基若しくはこれらの塩盟基、カルバモイル基。

Ｎ−ヒトミキシアルキルカルバモイル基、ヒトａキシフ
ルコギシ力ルポニル基、ヒト−キシアルキル基またはポ
リエチレングリコールエステル基である。） 具体的には、次のような親水性単量体を例示することが
できる。

アクリル酸、１−クロルアクリル酸、２−メチルアクリ
ル酸、メタクリル酸、マレイン酸、スチレンスルホン酸
、２−７クリルアミドー２−メチルプロパンスルホン駿
、アクリル７ミド、Ｎ−（２−ヒドロキシプシビル）メ
タクリルアミド、２−ヒドロキシエチルメタアクリレー
ト、グリセロールモノメタクリレート、アリルアルコー
ル、ポリエチレングリコールモノメタクリレート等であ
る。

本発明において、無機化合物粒子の水媒体中における濃
度は特に限定的でなく、一般に０、１〜５０重量％、好
ましくは０．５〜２０重量％が好適に採用される。

本発明に用いる水溶性ラジカル開始剤は特に限定的でな
く、公知のものが使用される。

例えば、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム。

過硫酸アンモニウム等の過硫酸塩、または過硫酸塩と千
オ硫酸ナトリウム、チオ硫酸カリウム、千オ硫酸水素ナ
トリウム等の千オ硫酸化合物及び銅イオン、鉄イオン等
の分解促進剤を組み合わせたレドックス系触媒が好適に
使用される。水溶性ラジカル開始剤の濃度は重合温度、
単量体濃度に依存するために限定的でないが、０．０５
乃至５０ミリモル／ｌの範囲が好適に採用される。

また水溶性ラジカル開始剤は、親水性単量体重合時に全
量添加することが望ましい。

乳化剤もしくは安定剤の存在は、無機化合物粒子の分散
安定性を低下させ、凝集粒子をつくりやすく、さらに乳
化重合が無機化合物粒子表面外の水媒体中でおこり、被
覆度が低下する場合があるため、本発明においては乳化
剤や安定化剤を使用しない方が好ましい。

本発明において、重合温度は４０℃〜８０℃、より好ま
しくは５０℃〜７０℃がよい。

不発明において、親水性単量体濃度は、少なくとも無機
化合物粒子の表面を重合体層が一層以上被うことが可能
であるような濃度であることが好ブしい。その濃度は、
無機化合物粒子の濃度に依存するため一層に限定できな
いが、一般的には無機化合物粒子に対して０．０１〜２
０重量％、好ましくは０．１〜５重量％が好適に採用さ
れる。

本発明において、重合時間は０．５〜１００時間、好ま
しくは１〜５０時間が好適に採用される。

さらに、本発明の複合重合体粒子に免疫活性物質を担持
させて免疫診断用試薬として用いる場合は、上記の親水
性単量体の重合に引き続いて、水１００ｉｌ量部に対す
る溶解度が１重量部以下の疎水性単量体の重合を行５こ
とが好ましい。疎水性単量体としては、水１００重量部
に対する溶解度が１重量部以下であれば公知の単量体が
特に制限されず用い得る。本発明において、好適に用い
られる疎水性単量体は、下記式（４）で示されるもので
ある。

Ｒ４ ＣＨ，＝　Ｃ（４１ ｓ （ただし、Ｒ４は水素原子またはフルキル基であり、Ｒ
２はハロゲン原子、置換若しくは非置換のフェニル基ま
たはアルフキジカルボニル基である。） このような疎水性単量体としては、例えばスチレン、ビ
ニルトルエン、クロロメチルスチレン、クールスチレン
、塩化ヒニル、Ａ化ビニル、メチルメタアクリレート、
エチルメタアクリレート、プロピルメタアクリレート。

エチルビニルエーテル、フロビルビニルエーテル等が好
適に用いられ、特に、スチレン。

ビニルトルエン、塩化ビニル、メチルメタアクリレート
が好ましく採用される。

上記した疎水性単量体の重合は、親水性単量体の重合が
５０％以上進行した後に行うことが好ましい。また、疎
水性単量体の濃度は特に制限されないが、一般には無機
化合物粒子に対して０．０１〜ｌ０Ｊｉ量％、好ましく
は０．０５〜５重量％の範囲から採用される。

疎水性単量一体の重合は、前記した親水性単量体の重合
と同様に行うことができる。

本発明で複合重合体粒子に固定化できる生理活性物質は
、特に限定的でなく、公知のものが使用できる。例えば
、酵素として西洋ワク゛−七ｒ゛ サビパーオキシ；！＝、グルコース酸化酵素。

グ′−芝一 スーパーオキサイドデイスム；！４．チトクロームａ、
ｂ、Ｊ、ｃ、ｐ４５０等；ホルモンとして下垂ホルモン
（Ｐｉｔｕｉｔａｒｙｈｏｒｒｎｏｎｅｓ）、インシュ
リン、クルカゴン、サイロイドホルモン等；ノλブテン
とし【オヒアムカロイド（モルフイネ）、７ンチピリン
、バルビッール酸；免疫活性物質として変性ガンマグー
プリン、抗核因子、ヒトアルブミン、抗ヒトフルプミン
抗体、イム／クープリンＧ（ＩｇＧ）、抗ヒトＩｇＧ抗
体、イムノグロブリンＡ（ＩｇＡ）、抗ヒトＩｇＡ抗体
、イムノグロブリンＭ　（Ｉ　ｇ　Ｍ　）　、抗ヒ）Ｉ
ｇＭ抗体、抗ヒ）ＩｇＥ抗体等があげられる。

本発明における複合重合体粒子の生理活性物質の固定化
は、単に粒子分散緩衝液中に生理活性物質を添加し吸着
により固定化する方法や、種々のカップリング刑な用い
表面親水性官能基と共有結合により固定化する方法が採
用される。

〔効果〕

本発明の複合重合体粒子は、無機化合物粒子が夫々独立
して重合体層で被覆されておりしかも、凝集粒子が少な
く単粒子性の高いものである。このため、無機化合物粒
子の粒径。

粒度分布及び単粒子性等の物理的特性が、そのまま複合
重合体粒子に継承される。従って無機化合物粒子の粒径
１粒度分布及び単粒子性、を調製することにより、所望
の粒径１粒度分布及び単粒子性を有する複合重合体粒子
を得ることができる。さらに、特定の粒径な有し、粒度
分布が狭く、かつ単粒子性が高い複合重合体粒子は、生
理活性物質の固定化能が高く、かつ保存性が良好である
。従って、本発明の複合重合体粒子は、生理活性物質の
担体、特に診断用試薬の担体、カラムクーマトグラフィ
ー用担体、あるいは医薬投与用担体として広範囲な応用
が可能である。

以下に、実施例及び比較例を挙げて、本発明をさらに詳
細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される
ものではない。

なお、以下の実施例における無機化合物粒子及び複合重
合体粒子の性状は、以下の方法により測定した。

ｆｌ）　　平均粒径 平均粒径は１００個以上の粒子を透過型電子顕微鏡で観
察して求めた。また、粒度分布は平均粒径の標準偏差を
平均粒径で除して１００．をかげた値である分数値（％
）で表示した。

（２）単粒子性 コールタ−カウンター社製モデルＺＤ−１を用いて測定
した。

なお、単粒子性を示すグラフ（第１図）中、縦軸は、メ
インビークを９９９として表示した粒子の相対的な存在
側合を示す。

（３）重合体層の厚み 光電子分光測定によって求めた。具体的には、実施例１
．２，６，７，９，１０゜１４．１５，１９，２０，２
２．２３については２８３〜２９１　ｅＶの炭素の吸収
と１５５・Ｖのケイ素の吸収の比、実施例５゜１８につ
いては炭素と１２４　＠Ｖのアルミニウムの吸収の比、
実施例３．１６については炭素と５７０　ｓＶのチタン
の吸収の比、実施例４については炭素と４３１　ｅＶの
ジル：ニウムの吸収の比よりＡ単位で求めた。

（４）　　溶出量 各々の複合重合体粒子を蒸留水中に１０重量％となるよ
うに分散し、この分散ｇ１ｔｒｌを取り、２４時間放置
後、上澄液中の溶出した無機化合物に基づくイオンを原
子吸光法より定量した。

（５）　　重合体層の組成 光電子分光測定による２　８３　ｅＶ〜２９１ｅＶの炭
素の吸収に基づいて求めた。実施例１４．２３について
はフェニル基に由来する吸収とエステル基に由来する吸
収の比、実施例１５についてはスルホン酸基に由来する
吸収とエステル基の吸収の比、実施例１６．２０につい
ては７ミド基とフェニル基の吸収の比、実施例１７につ
いてはカルボン醸基と塩素の吸収比、実施例１８はカル
ボン履基とフェニル基の吸収の比、実施例１９について
はスルホン酸基とエーテル基の吸収の比、実施例２１１
Ｃついてはフルキル基とフェニル基の吸収の比、実施例
２３についてはスルホン酸基とフェニル基の吸収の比か
らそれぞれ求めた。

実施例　１ （１１シリカ粒子の合成 攪拌機付きガラス製フラスコ中にメタノールｚｓｏｏｃ
ｃ、７ンモニ７水（２５重量％）６１６ｃｃ、水酸化ナ
トリウム水＠液（５モル／１）２ｔｃｃを加え１０″Ｃ
ＩＣ保った後に、テトラエチルシリケートのメタノール
溶１（２２％　）　１４２　ｓｃｃ′Ｉｔ１９拌しなが
ら２５．５　ｃｃ／ｈｒの滴下速度で添加して反応した
。その後シリカ粒子を大量のメタノール中でデヵンテー
シミンを繰り返してｆｌ製した。得られたシリカ粒子の
平均粒径１分散値及び単粒子性は＠１表に示したとおり
である。

得られたシリカ粒子の単粒子性を示すグラフ、すなわち
、１個の粒子の体積（横軸）と粒子数の割合（縦軸）と
の関係を示すグラフを第１図（ａ）に、また、電子顕微
鏡写真を第２図に示した。

得られたシリカ粒子を沈降させ、上澄をのぞき、Ｘ留水
を加え、分肢させ、さらに沈降させる操作を２回繰り返
し、粒子を洗浄した後、分ｌ＆濃度１０ｗｔ％になるよ
うに蒸留水を添加し、シリカ分散液を得た。

（２）　　親水性単量体の重合 攪拌機付きガラス製フラスコな１素置換した後に、（五
）で得られたシリカ分＆’ｍ、　１００　ａｔを加えて
４０℃に保ち、窒Ａ雰囲気下、攪拌下にロアミリモルの
グリセロールメタクリレートと過Ｖｔ酸カリウムを２．
９ミリモル／ｌとなるように添加した。次いで４０℃に
保温し攪拌下第１表に示す条件で重合を行った。重合後
、遠心分離で上澄を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸
留水に再分散させた。この操作を６回繰り返し、沈澱を
洗浄し、精製した複合重合体粒子を一得た。得られた粒
子の性状をＭ１表に示した。また、単粒子性を示すグラ
フな第１図（ｂ）に、電子顕微鏡写真を第３図に示した
。

実施例　２〜１０ 実施例１と同様にして、第１表に示した種々の無機化合
物粒子を分散させた水媒体中で第１表に示した水溶性ラ
ジカル開始剤と親水性率祉体χ用いて重合を行い、その
後、得られた複合重合体粒子を洗浄、精製した。

得られた複合重合体粒子の性状を第１表に示した。

実施例　１１ 実施例２，６，７，８，９．１０で得られた複合重合体
粒子を１／１５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ＰＨ７，２）で１重
量％濃度となるように分散した。また、市販の西洋ワサ
ビバーオキシダーゼ（和光紬薬Ｊｌｌり（以下、単にＨ
ＲＰともいう）を１／１５Ｍリン酸緩衝液に１０１１９
／ｌとなるように溶解した。次いで、複合重合体粒子の
分散液５Ｌｔと、ＨＲＰ溶液５ｄを混合し、室温で２時
間、５分毎に攪拌しながら固定化した。固定化後、遠心
分離して上澄を除き、沈澱を上記リン酸緩衝液５−に再
分散させ、再度遠心分離し、リン酸緩衝液２ｍｌに再分
散し、ＨＲＰを固定化した複合重合体粒子からなる診断
用試薬を得た。得られた診断用試薬の粒径の分散値及び
単粒子性を第２表に示した。

各診断用に薬の分散液０．５　ｍｌを取って遠心分騙し
、沈澱を乾燥させた後、微ｆ亘素分析機を用いて担体表
面上り窒素量を求め、それをＨＲＰの量に換算して固定
化量を求め、第２表に併記した。

次いで、診断用試薬の分散液１−にグライアコール液及
びＨ２Ｏ，液を加え、４３６ツの吸光度より活性を求め
、上記のＨＲＰの固定化量から比活性を求めた。次いで
、固定化前の１（ＲＰの比活性を同様に求め、固定化前
のＨＲＰ比活性を１００％とした時の固定化後の比活性
をｊｇ２表に示した。

実施例　１２ 実施例３．４で得られた複合重合体粒子を０、ＩＭホウ
散緩衝液（Ｐ　Ｈ８，０）に１％濃度となるように分散
した。この分散液ＩＱｙｒｌに１−シクロヘキシル−３
−（２−モルホリノエチル）−力ルポジイミド２０１１
ｇを加え、さらに２富ｇ／−に溶解した熱変性ヒトＩｇ
Ｇを加え、４℃で振とうしながら１８時間固定化した。

固定化後遠心分離し、上置を除き、沈設を上記ホウ酸緩
衝液に再分散した。この操作を３回繰り返し、Ａｋ後に
、０．０１％牛血清フルプミン（以下、単にＢＳＡとも
いう）及び０、１％界面活性剤を含むｌ／１５ＭＩＪン
酸す漬液に再分散し、熱変性ＺｇＧを固定化した複合重
合体粒子からなる診断用試薬を得た。

診断用試薬の単粒子性９分散値及び熱変性に）ＩｇＧの
固定化量を第２表に示した。次いで、マイクルタイター
プレート上にリウマチ患者のプール血清を２０倍希釈か
ら倍数希釈し、熱変性ＩｇＧを固定化した診断用試薬の
分散液を添加し、攪拌後その凝集像を判定した。それぞ
れの診断用試薬の鋭敏性及び判定時間をｗｃｚ表に示し
た。

実施例　１３ 実施例１で得られた複合重合体粒子５１を５０ＪＥ／の
蒸留水に分散させた。次いで２００ＩＩｇの過ヨウ素酸
ナトリウムを含む酢′ｒＲ浴液を加え、室温で２４時間
反応後、上置のＰＨが中性になるまで遠心分離により洗
浄し、表面にホルミル基を４人した粒子を得た。この表
面にホルミル基を導入した粒子５１を５０１のリン酸緩
衝液（Ｐ　Ｈ７，２”）に分散し、１００１＋９／ｄａ
度のヒト絨毛ゴナドトロピン（以下単にＨＣＧともいう
）１０１Ｅｊを加え、４℃で振とうしながら１８時間固
定化した。固定化後の粒子を遠心分離で洗浄し、ヒ）１
毛ゴナドトロピンを固定化した診断用試薬を得た。

この診断用試薬の粒径の分散値、単粒子性及びヒト絨毛
ゴナドトロピンの固定化量を第２表に示した。

この診断用試薬をカラムにつめ、ウサギにＨＣＧを免疫
して得られた抗ＨＣＧ血清の５０％飽和硫安画分を１／
１５Ｍ！Ｊン酸緩衝液で溶解し、流したところ、極めて
高純度の、抗ＨＣＧ抗体が得られた。

実施上　１４ 実施例１のｉｌｌで得られたシリカ分散１％！１００′
ｄを攪拌機付きガラス製フラスコな宣素置換した後に添
加して４０℃に保ち、５ｊ１素雰囲気下に攪・拌しなが
ら６７ミリ毫ルのグリ七ロールメタクリレートと過硫醗
カリウムを２．９ミリモル／ｌとなるように添加した。

次いで、４０℃に保温し、攪拌しながら第３表に示す条
件でｗｃ１段目１合を行った。その後、７０℃に昇温を
行い、７０℃に加温したスチレン９０ミリモルを滴々添
加した後、所定時間攪拌下に第２段目重合を行った。重
合後、遠心分離で上澄を捨て、沈澱した複合重合体粒子
を蒸留水に再分散した。この操作を６回繰り返し沈澱を
洗浄し、精製した複合重合体粒子を得た。得られた粒子
の性状を第３表に示す。

また、単粒子性を示すグラフを１ｆｃ１図（ｃ）に示し
た。さらに、得られた複合重合体粒子の光電子分光測定
結果を第５図（Ａ）及び（Ｂ）に示した。第５図（Ｂ）
は、諮５図（Ａ）の炭素のピークの部分を拡大したもの
である。

実施例　１５〜２３ 実施例１４と同様にして第３表に示した種々の無機化合
物粒子、親水性単量体及び疎水性単量体を用いて第１段
目重合及び第２段目重合を行った。得られた複合重合体
粒子の性状を第３表に示した。

実施例　２４〜３３ （１）　　熱変性ヒ）ＩｇＧを固定化した複合重合体粒
子の調製 ヒトコーンＦｌ１画分（シグマ社製）を１／１５０Ｍリ
ン酸緩衝液（ＰＨ７，４）Ｋｌ　０ｍ９／ｍ／になるよ
う溶解し、５６℃で２時間加熱することにより熱変性ヒ
トＩｇＧを得た。得られた熱変性ヒ）ＩｇＧをリン酸緩
衝液で４０倍に希釈したものを原液とし、倍数希釈法に
より希釈した。この熱変性ヒトＩｇＧの希釈液１ｙｘｌ
と、実施例１４〜２３で得られたそれぞれの複合重合体
粒子をリン酸緩衝液で１重量％に希釈した分散液１ｄと
を攪拌しながら室温で１時間混合した。次いで、遠心分
離して固型分を０．１％Ｔｗｅ句ｎ８０及び０．５％牛
血清フルブミン（ＢＳＡ）を含むリン酸緩衝液２ｒｍｌ
に再分散した。かくして得られた熱変性ヒトＩｇＧを固
定化した複合重合体粒子の単粒子性と粒径の分散値を第
４表に示す。

（２）　　抗原・抗体反応 リウマチ患者血清のプール血清をリン酸緩衝液で２０倍
に希釈したものを原液とし、倍数希釈法によりリウマチ
患者血清をリン酸緩衝液で希釈して、リウマチ患者血清
希釈液を調製する。抗原・抗体反応を行うためにマイク
ロタイタープレートを用意し、リウマチ患者血清希釈゛
液を各ホールに２５μを加える。

次いで熱変性ヒ）ｒｇＧ固定化した複合重合体粒子の分
散液を各ホールに２５μを加えた後、５分間攪拌し静置
した。次いで抗原・抗体反応による凝集状態を観察し、
熱変性ヒトＩｇＧを固定化した複合重合体粒子の性能を
評価した。反応開始後の凝集状態を第６図に示す。粒子
がスポット状に集まり外周縁が均等でなめらかな円形を
示す場合（−）、粒子が小さなリングを形成し、外周縁
が均等でなめらかなもの（±）、粒子リングが明らかに
大館く、リング内に凝集粒子が膜状に広がっているもの
（＋）、凝集が均一に起こり、凝集粒子が底全体に膜状
に広がっているもの（＋＋）と判定した。図中Ｃは抗原
もしくは抗体を全く含まないことを示す。第６図の明ら
かに（＋）像が認められたホールにおけるリウマチ患者
血清希釈液の最高希釈陪数をもって、鋭敏性を評価した
。迅速性は明らかな陰性（＝）像が現われ、変化しなく
なる時間を尺度とした。また非特異凝集反応は、Ｃ部分
に（±）　、　（＋）　、　（＋＋）のいずれかの凝集
状態が認められたホールの個数を示した。

それぞれの熱変性ヒ）ＩｇＧを固定化した診断用試薬の
鋭敏性、迅速性、及び９６ｆｌｌ中の非特異凝集の個数
を第４表に示した。

実施例　３４〜４３ ＋１１　　アルファーフェトプロティンに体（ＡＦＰ抗
体と略す）を固定化した複合重合体粒子の調製 ヤギの産生じたアルファーフェトプロティン（以下、Ａ
ＦＰともいう）の抗体を７フイニテイクロマトにより精
製して得た精製ＡＦＰ抗体をｘ％ｇ／ｍｚａ度に含有す
るリン酸緩衝液を調製した後、倍数希釈法により希釈し
てＡＦＰ抗体希釈液を調製した。このＡＦＰ抗体希釈液
ＩＭと、実施例１４〜２３で得られたそれぞれの複合重
合体粒子をリン隈緩衝液で１重量％に希釈した分散液１
−とを攪拌しながら室温で１時間混合した。次いで遠心
分離し、固型分を０．２５％Ｔｗｓａｎ８０及び０．２
５％ＢＳＡを含むリン殿緩衝液２−に再分散した。かく
して得られたＡＦＰ抗体を固定化した複合重合体粒子の
単粒子性と粒径の分散値を第５表に示す。次いで、か（
して得られたＡＦＰ抗体を固定化した複合重合体粒子と
患者血清のプール血清との抗原抗体反応を実施例２４の
（２）と同様の方法で調べた。それぞれのＡＦＰ抗体を
固定化した複合重合体粒子の鋭敏性、迅速性及び９６個
中の非特異凝集の個数を第５表に示した。　。

比較例　１ 攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、実施
例１（１）で得られたシリカ分散液１０　Ｑｄを加えて
５０゛Ｃに保ち、窒素雰囲気下、攪拌しながらメチルメ
タクリレートを６７ζ１１モルと過硫震カリウムを２．
９ミリモル／ｌとなるように添加して４時間重合した。

得られた粒子を実施例１（２）と同様に精製した。

得られた粒子の粒子径は１．３２μ風　１粒子径の分散
値は５３．９％、単粒子性は５０．１％であった。また
、単粒子性を示すグラフを第１図（ｄ）に、また電子顕
微鏡写真を第４図に示した。このように、単量体として
水１００重量部に対する溶解度が１０重量部未満のメチ
ルメタクリレートを用いた場合には、元の無機化合物粒
子の単粒子性が良好であっても重合によって凝集粒子が
増加するために単粒子性の良好な複合重合体粒子は得ら
れない。

この複合重合体粒子に、実施例２４及び３４と同様に熱
変性ヒ）ＩｇＧ及びアルファーフェトプロティン抗体を
固定化した。得られた診断用試薬の鋭敏性、迅速性及び
９６個中の非特異凝集の数を第４表及び第５表に併記し
た。

比較例　２ 実施例１（１）で得られたシリカ粒子にヒドロキシプロ
ピルセルロース（以下、ＨＰＣと４゜いう）を１０′を
量％濃度になるよ５に添加し攪拌しながら４５℃に保温
し、４時間吸着した。吸着後遠心分離を６回繰。り返し
、未吸着のＲＰＣを除去し、１０！量％濃度になるよう
に蒸留水゛に分散した。この分散液１０’ｌｊを攪拌機
付ぎガラス製フラスコに取り、７０℃に加温し、窒素置
換後、スチレン９６ミリモルと過Ｆｊｔ酸カリウム２，
９ミリモル／ｌを加え１６時間重合した。重合後、実施
例１（２）と同様に精製し、複合重合体粒子を得た。得
られた複合重合体粒子の分散値は５６％９粒子径は２．
６５μｍ、単粒子性は４２，３％であった。

この複合重合体粒子に実施例２４と同様に熱変性ヒトＩ
ｇＧを固定化し、抗原抗体反応による凝集像を判定した
ところ９６穴すべてが非特Ａ凝集とな′つた。また、実
施例３４と同ａｌＫＡＦＰ抗体を固定化したところ、９
６穴すべてが非特異凝集であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は無機化合物粒子及び複合重合体粒子の単粒子性
を示し、第２図、第３図及び第４図は、夫々実施例１で
得られた無機化合物粒子、複合重合体粒子、及び比較例
１で得られた複合重合体粒子の電子Ｍ＠３１１写真であ
る。 第５図（Ａ）及び（Ｂ）は実施例１４で得られた複合を
一庄粒子の光電子分光＃ｃｒＪ１による測定結果を示し
、゛第６図は実施例２４で得られた診断用試薬の凝集傷
を示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）無機化合物粒子が、個々に独立して重合体層で被
   覆されてなり、単粒子性が８０％以上であることを特徴
   とする複合重合体粒子。
2. （２）無機化合物粒子を分散させた水媒体中で、水溶性
   ラジカル開始剤の存在下に水１００重量部に対する溶解
   度が１０重量部以上の親水性単量体の重合を行うことを
   特徴とする、無機化合物粒子が個々に独立して重合体層
   で被覆されてなり、単粒子性が８０％以上である複合重
   合体粒子の製造方法。
3. （３）無機化合物粒子を分散させた水媒体中で、水溶性
   ラジカル開始剤の存在下に水１００重量部に対する溶解
   度が１０重量部以上の親水性単量体の重合を行い、次い
   で水１００重量部に対する溶解度が１重量部以下の疎水
   性単量体の重合を行うことを特徴とする、無機化合物粒
   子が個々に独立して重合体層で被覆されてなり、単粒子
   性が８０％以上である複合重合体粒子の製造方法。
4. （４）無機化合物粒子が、個々に独立して重合体層で被
   覆されてなり、単粒子性が８０％以上である複合重合体
   粒子からなる診断用試薬の担体。