JP6683907B2 - 免疫凝集用粒子及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ポリスチレンよりも高感度な担体素材として、非晶性の酸化チタンからなる粒子を備える免疫凝集用粒子及びその製造方法を提供することを課題とする。また本発明は、免疫凝集用粒子を用いる免疫凝集測定試薬及び係る試薬を用いる免疫凝集測定方法を提供することを課題とする。
[1]非晶性の酸化チタンからなる粒子を含有し、平均粒子径が140nm以下である、免疫凝集用粒子。
[2]粒子の表面に結合した分散剤をさらに備える、[1]記載の免疫凝集用粒子。
[3]分散剤がポリエチレングリコール(PEG)である、[2]に記載の免疫凝集用粒子。
[4]粒子の結晶子サイズ0Å〜99Åである、[1]〜[3]のいずれか1項に記載の免疫凝集用粒子。
[5]免疫凝集用粒子の粒径が120nm以下である、[1]〜[4]のいずれか1項に記載の免疫凝集用粒子。
[6]粒径が140nm以下、結晶子サイズ0Å〜99Åである非晶性の酸化チタンからなる粒子の表面に、ポリエチレングリコール(PEG)を結合させる工程と、前記工程後に、抗体または抗原を結合させる工程と、を備える、免疫凝集用粒子の製造方法。
[7][1]〜[6]のいずれか1項に記載の免疫凝集用粒子を用いる、免疫凝集測定試薬。
[8][7]に記載の免疫凝集測定試薬を用いる、免疫凝集測定方法。
ポリスチレンの屈折率は1.58程度であるのに対して酸化チタンの屈折率は2以上あることから、酸化チタン粒子はポリスチレンよりも高感度な担体素材として期待されていたが実用化には至っていなかった。そこで、本発明者らは酸化チタン粒子の担体素材としての実用化に向けて、酸化チタンの問題点を洗い出した結果、酸化チタン自身がポリスチレンよりも重く、この為に、抗原又は抗体と感作粒子が接触しても免疫複合体を形成できないことを見出した。これを踏まえ、感作粒子自身の重量を軽くするために、粒子の粒径に着目し、鋭意検討した結果、後述の図1A、図1Bの感度曲線に見られるように、酸化チタン粒子の粒径が小さいほど感度が良好になることを知見した。この知見は、担体粒子の粒径が大きくなるほど感度が向上するというこの技術分野における技術常識に反するものであった。また本発明者らは酸化チタン粒子の結晶子サイズ0Å〜99Åが免疫凝集反応に最適な範囲であることを見出した。本発明は上記知見に基づくものである。
即ち、本発明は、非晶性の酸化チタンからなる粒子を含有し、粒子の平均粒子径が140nm以下である、免疫凝集用粒子に関する。
結晶子サイズ D(Å)=K x λ/(β x cosθ)
(式中、K:Scherrer定数、λ:使用X線管球の波長、β:結晶子のサイズによる回析線の広がり、θ:回析角 2θ/θを意味する。)
本発明の粒子は、免疫凝集反応を惹起させかつ感度を高める最適な割合になるように、非晶性の状態に調整されていることが好ましい。これらの粒子の調製は、ゾルゲル法を用いることができる。
本発明における非晶性の酸化チタンは、結晶子サイズが0Å以上99Å以下であることが好ましく、更に好ましくは、0Å以上50Å以下、更により好ましくは0Å以上40Å以下である。尚、本発明における結晶子サイズは、X線回折法による測定結果からシェラーの式を用いて算出されるアナターゼ(101)面の結晶子サイズによって定義づけられる値であり、酸化チタンの非晶性を示す尺度である。
粒子径の変動係数(CV値)=粒子径の標準偏差/平均粒子径
免疫凝集用粒子の製造方法は、(イ)粒径が140nm以下、結晶子サイズ0Å〜99Åである酸化チタンからなる粒子の表面に、PEGを結合させる工程と、(ロ)前記工程後に、抗体または抗原を粒子の表面に結合させる工程と、を備える。
PEGの結合は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、物理吸着やカテコール等のアンカーを介した化学結合が挙げられる。免疫凝集反応を阻害せず、かつ脱離の問題が少ないと考えられる化学結合が好ましい。
また、抗体または抗原の結合は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、物理吸着やクリック反応を用いた化学結合が挙げられる。操作の簡便さから、物理吸着が好ましい。化学結合を用いる場合は、酸化チタン表面の水酸基に化学結合するリンカー分子を介して、抗体または抗原のアミノ基、カルボキシル基、チオール基等を利用し結合することができる。そのようなリンカー分子としては、カルボキシル基、アミノ基、リン酸基、ホスホン酸基、シラノール基、サリチル酸基、ジオール基等を有する分子があげられ、具体的な例としては、コハク酸、ポリアクリル酸、エチレンジアミン、ポリエチレンイミン、リンゴ酸、ポリリン酸、アミノアルキルホスホン酸、3−アミノプロピルメトキシシラン、アミノサリチル酸、ドーパミン、ジヒドロキシフェニルエタノール、ジヒドロキシフェニルプロピオン酸、ジヒドロキシフェニル酢酸等が挙げられる。
前記免疫凝集用粒子を用いる免疫凝集測定試薬及び免疫凝集測定方法も本発明の1つである。該免疫凝集粒子を用いることで、従来のポリスチレン粒子では得られない高感度が得られ、より低濃度の被検物質を検出する診断が可能となる。
チタンテトラエトキシドをアセトニトリル/エタノール溶液に加えて、0.1Mチタンテトラエトキシド溶液を調整した。この溶液にエタノールおよび0.1Mアンモニア水を混合し、室温で60分間攪拌して十分に加水分解を行った。このとき、目的の平均粒子径に応じてアンモニア水量を溶液の0.01〜1%の範囲で調節した。加水分解後、80℃で3時間以上攪拌を行い、加熱還流した。さらに、20000g、10分間で遠心分離を行い固形成分約20%に濃度調整して4種の粒子(1)の分散液を得た。
4種の粒子(1)について、超純水を用いて固形成分0.01%に濃度調整し、動的光散乱測定装置(スペクトリス社製、ゼータサイザーナノZS)を用い、動的光散乱法でキュミュラント解析により平均粒子径を測定した結果、それぞれおよそ(i)70nm、(ii)110nm、(iii)140nm、(iv)290nmであった。また、粒子(1)について粉末X線回折法で測定し、シェラーの式を用いて算出されるアナターゼ(101)面の結晶子サイズを測定したところ、0Å〜20.4Åであった((i)(平均粒子径70nm):0Å、(iv)(平均粒子径290nm):20.4Å)。また、National Institute of Standards and Technology製のシリコン標準試料(SRM640c、結晶子サイズ140000Å)を内部標準試料として5重量%となるよう混合して粉末X線回折法で測定した結果、シリコン(111)面の回折角2θ=28.4°付近のピーク高さに対して、アナターゼ(101)面の回折角2θ=25.4°付近のピーク高さの比率(相対強度)はそれぞれ50%以下であった。((i)(平均粒子径70nm):1%未満、(iv)(平均粒子径290nm):3%)。
PEGとしてポリオキシエチレン−モノアリル−モノメチルエーテルと無水マレイン酸の共重合体(平均分子量;33659−日油製)1gに水5mlを添加し加水分解後得られた溶液と1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩(同仁化学製)を、超純水を用いてそれぞれ濃度が50mg/mlおよび50mMとなるように混合し調整した。調整した溶液に4−アミノサリチル酸(和光純薬工業)を濃度0.1Mになるよう混合し、室温にて24時間振とう撹拌して反応させた。反応後、得られた溶液をスペクトラ/ポア CE 透析用チューブ(分画分子量=3500、Spectrum Laboratories,Inc.)に移し、室温で24時間透析を行った。透析後、凍結乾燥して得られた粉末に25mg/mlとなるようジメチルホルムアミド(DMF:和光純薬工業)を添加して混合し、4−アミノサリチル酸結合PEG溶液とした。
次にDMFを用いて4−アミノサリチル酸結合PEG溶液が終濃度0.6mg/ml、操作1で得られた平均粒子径の異なる粒子(1)が終濃度で固形成分0.5%となるよう調整し、20mlの反応溶液とした。この反応溶液を130℃で16時間加熱反応を行った。反応終了後、反応容器温度が50℃以下になるまで冷却し、エバポレータでDMFを除去した後に、蒸留水を添加して粒子の表面に分散剤を結合させた粒子(2)を得た。このように操作1で得られた平均粒子径の異なる粒子(1)をもとにして作製した免疫凝集用粒子(2)について、超純水を用いて固形成分0.01%に濃度調整し、動的光散乱測定装置(スペクトリス社製、ゼータサイザーナノZS)を用い、動的光散乱法でキュミュラント解析により平均粒子径を測定した結果、それぞれ粒子(1)の、(i)(平均粒子径70nm)から作製した粒子:80nm、(ii)(平均粒子径110nm)から作製した粒子:120nm、(iii)(平均粒子径140nm)から作製した粒子:150nm、(iv)(平均粒子径290nm)から作製した粒子:300nm、であった。
操作2で得られた、粒子の表面に分散剤を結合させた粒子(2)が固形成分0.5%となるよう20mMのHEPES緩衝液(pH7.0)で調整した。さらに、特開2011−209140号公報に記載の方法で作製した抗CRPモノクローナル抗体を終濃度0.25mg/mlとなるよう混合して、4℃にて24時間振とう撹拌して抗体を感作させた。感作後、20000g、10分間で遠心分離を行い、溶液の90%を除去して超純水に交換する操作を3回繰り返した。氷冷下で超音波分散を繰り返し、抗CRP抗体を結合させた免疫凝集用粒子(3)を得た。
得られた免疫凝集用粒子(3)を5mMのMOPS緩衝液(pH7.0)で、580nm波長の吸光度が1になるように希釈調整し、測定試薬(第2試薬)を作製した。
得られた第2試薬を用いてCRP抗原標準液を測定し感度曲線(検量線)を作成した。得られた感度曲線を図1A、感度曲線の拡大図(低CRP濃度領域)を図1Bに示す。なお、測定条件は以下の通りである。
(測定条件)
装置:日立7180型自動分析装置
使用波長:570/800nm
測光ポイント:19−34(エンドポイントアッセイ)
測定温度:37℃
測定試料(0〜42mg/dLのCRP標準液):2.4uL
各CRP標準液のCRP濃度:0.3mg/dL、0.6mg/dL、3mg/dL、18mg/dL、42mg/dL
第1試薬:ナノピア(登録商標)CRP緩衝液100μL(積水メディカル社製)
第2試薬:100μL(免疫凝集用粒子(3)液)
図1Bより明らかなように、粒径が80nm、120nmの両粒子では、低値検体(0.3mg/dL)においてナノピアCRP試薬よりも非常に高い感度が得られた。一方、150nm、300nmではナノピアCRP試薬よりも低い感度となった。推測の域を脱しえないが、これらの結果は、粒子の重量すなわち粒径を調整したことによって、免疫凝集反応が惹起されるようになったと考えられる。
以上から、本発明の粒子を用いることで、従来のポリスチレンでは測定できなかった領域の低濃度検体を測定できることが明らかとなった。
Claims (8)
- 非晶性の酸化チタンからなる粒子を含有し、平均粒子径が80nm以上140nm以下である、免疫凝集用粒子。
- 前記免疫凝集用粒子がその表面に結合した分散剤をさらに備える、請求項1記載の免疫凝集用粒子。
- 前記分散剤がポリエチレングリコール(PEG)である、請求項2に記載の免疫凝集用粒子。
- 前記免疫凝集用粒子の結晶子サイズが0Å〜99Åである、請求項1から3のいずれか1項に記載の免疫凝集用粒子。
- 前記免疫凝集用粒子の平均粒子径が120nm以下である、請求項1から4のいずれか1項に記載の免疫凝集用粒子。
- 平均粒子径が140nm以下、結晶子サイズが0Å〜99Åである非晶性の酸化チタンからなる粒子の表面に、ポリエチレングリコール(PEG)を結合させる工程と、
前記工程後に、前記粒子の表面に抗体または抗原を結合させる工程と、を備える、免疫凝集用粒子の製造方法。 - 請求項1〜6のいずれか1項に記載の免疫凝集用粒子を用いる、免疫凝集測定試薬。
- 請求項7に記載の免疫凝集測定試薬を用いる、免疫凝集測定方法。
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