DE3137668C2 - Verfahren zum Testen auf Vitamin B↓1↓↓2↓ - Google Patents

Verfahren zum Testen auf Vitamin B↓1↓↓2↓

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Abstract

Ein Verfahren zum Testen auf Vitamin B ↓1 ↓2 bewirkt die Denaturierung bindender Serumproteine, die normalerweise das Vitamin B ↓1 ↓2 binden, durch Behandeln mit Alkali bei Raumtemperatur. Der Test zeichnet sich durch die Verwendung eines Dithiopolyols und von Cyanid in der Alkali-Denaturierungsstufe und durch die Verwendung eines Vitamin B ↓1 ↓2-Analogons, wie Cobinamid, während der Intrinsikfaktor-Teststufe zum Binden irgendwelcher verbliebener Serumpro teine aus. Die Erfindung umfaßt auch einen Testsatz, in dem das Dithiopolyol im Gemisch mit dem Alkali vorliegt.

Description

(1) das Abtrennen des Vitamins Bi2 von den Serumproteinen und Denaturieren der Proteine durch Mischen der Probe mit Alkall, Cyanid und einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen und Inkubieren des Gemischs bei einer Temperatur nicht über 50° C erfolgt,
(2) zusammen mit dem radioaktiv markierten Vitamin Bi2 ein Vitamin B,;-Analogon zugesetzt wird, das sich stark an die in der Probe verbliebenen nicht denaturierten Proteine, aber nicht an den Inirinsikfaktor bindet, und
(3) der pH-Wert des Gemischs vor Zugabe des Intrinsikfakors gesenkt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (1) das Alkali und das Dithiopolyol als vorgebildetes Gemisch der Serumprobe zugesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Dithiopolyol Dithioihreit oder Dithioerythrit verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B)2-Analogon Cobinamid ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß Cyanid In Stufe (1) in einer Menge entsprechend 20 bis 200 ng Kaliumcyanld/ml Serum verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Dithiopolyol in Stufe (1) in einer Menge von 4 bis 10 mg/ml Serum verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Vitamin B12-Analogon in der 10- bis lOOOfachen Menge der zum Besetzen aller Bindungsstellen der bindenden Serumproteine, die durch die Inkubationsslufe (1) nicht denaturiert worden sind, erforderlichen Menge verwendet wird.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren der Im Oberbegriff des Anspruchs 1 näher bezeichneten Art, wie es z. B. aus WO 79/00 880. der GB 20 11 070A oder der US-PS 41 46 602 bekannt ist.
Serum-B|2, an Trägerprotein gebunden, muß freigesetzt werden, bevor darauf getestet werden kann. Bei herkömmlichen Methoden wird das Serum 15 bis 30 min in Gegenwart von Cyanid erwärmt. Bei in großen klinischen Chemielaboratorien durchgeführten Tests Ist jedes Erhitzen unerwünscht, da es den Arbeitsfluß unterbricht. Ein Erwärmungsvorgang, der aufgrund der Gegenwart von Cyanid (Insbesondere bei saurer Lösung) die Verwendung eines Abzugs erfordert. Ist höchst unerwünscht.
Ein Aufsatz In Clinical Chemistry. Band 26, Nr. 2, 1980, Seiten 323-326, schlägt einen Test vor, bei dem endogenes Serum-B12 aus seinen Proteinkomplexen bei Raumtemperatur mit NaOH bei pH 13,6 freigesetzt wird. Das Arbeltsprotokoll weist aber auf die Verwendung sehr großer Cyanid-Konzentratlonen (2000 ng/ml Serum) bei der Denaturlerung hin. Auch wird Auster-Krölenflsch-Serum als spezifisches Reagenz für Vitamin Bi2 anstelle des üblicheren Schweine-Intrinslkfaktors verwendet. Soweit bekannt, ist dieser Test nicht gewerblich verwertet worden. Es besteht ein klar erkannter und lange verspürter Bedarf an einem Test auf Vitamin B,2 unter Verwendung des Intrlnslkfaktors, wobei bindende Serumproteine denaturiert werden, ohne Wärme oder hohe Cyanldkonzentratlonen anzuwenden.
Bekannt Ist, daß Dithiopolyole, wie Dlthlothreitol (DTT), die Freisetzung von Vitamin Bi2 aus bindenden Serumproteinen fördern können. Ein Aufsatz Im American Journal of Clinical Pathology, August 1980, Band 74, Nr. 2, Seiten 209 bis 213, vergleicht drei handelsübliche Vitamin B,2-Testsätze, bei denen die Denaturierung von Serumproteinen durch Kochen erfolgt. Ein bei einem der Testsätze auftretendes Problem nlcht-spezlflscher Bindung wurde durch Einbeziehen von DTT und Cobinamid zusammen mit den anderen Testbestandteilen behandelt.
Die Erfindung schafft ein Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 In Serum mit folgenden Schritten:
(a) Abtrennen des Vitamins B,2 von den Serumproteinen, wobei die Proteine im wesentlichen denaturiert werden.
(b) Zugeben einer Standardmenge an radioaktiv markiertem Vitamin B12,
(c) Zugeben einer Standardmenge an Intrinsikfaktor, die nicht ausreicht, um das gesamte Vitamin B12 in der Probe und das radioaktiv markierte Vitamin B12 zu binden, und
(d) Jnkubleren des Gemischs, um einen Teil des Vitamins Bi2 in der Probe und einen Teil des radioaktiv markierten Vitamins B,2 an den Intrinsikfaktor zu binden. Abtrennen des gebundenen vom nichtgebundenen Anteil, Messen des Radioaktivitätswerts wenigstens eines Anteils und Verwerten der Messung zur Bestimmung der Konzentration an Vitamin B12 in der Probe, dadurch gekennzeichnet, daß
(1) das Abtrennen des Vitamins Bi2 von den Serumpioteinen und Denaturieren der Proteine durch Mischen der Probe mit Alkali, Cyanid und einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen und Inkubieren des Geniischs bei einer Temperatur nicht über 50° C erfolgt,
(2) zusammen mit dem radioaktiv markierten Vitamin Bi2 ein Vitamin B|2-Analogon zugesetzt wird, das sich stark an die in der Probe verbliebenen nicht denaturierten Proteine, aber nicht an den Intrinsikfaktor bindet, und
(3) der pH-Wen des Gemischs vor Zugabe des Intrinsikfaktors gesenkt wird.
Ein Merkmal der Erfindung ist das Einbeziehen eines Dilhiopolyols mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen In Stufe (1) zur Förderung der Abtrennung des Vitamins B12 von den bindenden Serumproteinen. Bevorzugte Dithiopolyole sind 1,4-DithIotetrite, einschließlich der beiden Isomeren Dithiothreit und Dithioerythrit. Diese werden vorzugsweise in Anteilen von 2 bis 20, insbesondere 4 bis 10 mg/ml Serumprobe verwendet.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung ist die Verwendung von Cyanid ir. Stufe (1). Cyanid wandelt die verschiedenen vorhandenen Cobalamine in Cyanocobalamin um. Vermutlich fördert das Dithiopolyol die Freisetzung von Cyanocobalamin aus bindenden Serumproteinen. Dithiopolyole sind besonders wirksam in Gegenwart von Cyanid, was vermuten läßt, daß sie besser in der Lage sind, Cyanocobalamine als andere Cobalamine aus bindenden Serumproteinen freizusetzen. Die erfindungsgemäß bevorzugte Cyanidkonzentration ist 10 bis iOOO, insbesondere 20 bis 200 μg/ml Serumprobe.
Cyanid und Dithiopolyole fördern die Abtrennung von Vitamin Bi2 von bindenden Serumproteinen, denaturieren aber selbst nicht die Proleine. Daher besieht, wenn der pH-Wert in Stufe (a) herabgesetzt wird, die Gefahr, daß die bindenden Serumproteine in gewissem Ausmaß mit dem Vitamin Bi2 rekombinieren Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung wird diese Gefahr dadurch vermieden, daß In das Gemisch bei Stufe (2) ein Vitamin B,2-Analogon einbezogen wird, das jegliche verbliebenen nicht-denaturierten bindenden Serumproteine der Probe bindet, nicht aber den zugesetzten Intrinsikfaktor. Die verwendete Menge des Vitamin B12-Analogons sollte wenigstens ausreichen, alle Bindungsstellen der nicht-denaturierten bindenden Serumproteine der Probe zu besetzen, und sie ist das vorzugsweise 10- bis lOOOfache der zum Besetzen aller Bindungsstellen erforderlichen Menge. Ein geeignetes Vitamin B,2-Analogon ist Cobinamid, das fest an bindende Serumproteine gebunden wird, aber überhaupt kaum an den Intrinsikfaktor. Andere Vitamin B,2-Analoga können verwendet werden.
In Stufe (a) erfolgt die Trennung und teilweise Denaturierung von den bindenden Serumproteinen bei einer Temperatur nicht über 50° C und vorzugsweise bei Raumtemperatur. Der pH-Wert der Probe sollte wenigstens 12,0, vorzugsweise 12,5 bis 13,7 Insbesondere 12,9 bis 13,5 sein. Das Alkali, das bequemerweise Natriumhydroxid Ist, wird In einer Menge verwendet, die den gewünschten pH-Wert zu erreichen erlaubt. Die für die Umsetzung erforderliche Zelt Ist im aligemeinen 5 bis 60 min, iypischerwelse etwa 15 min, und kann durch Versuch und Irrtum leicht bestimmt werden.
In Stufe (1) wird das Gemisch der behandelten Probe und des Intrinsikfaktors unter pH- und Temperaturbedingungen inkubiert, bei denen der Intrinsikfaktor Vitamin Bi2 stark bindet. Diese Bedingungen können pH 9,3 bei Raumtemperatur sein.
Der Vitamin B,2-Tracer kann herkömmlicherweise mit Kobalt-57 markiert Sein. Der Tracer kann der Serumprobe entweder vor, während oder nach Stufe (a) zugesetzt werden. Es kann bequem sein, ein einziges Reagenz zur Verfügung zu stellen, das markiertes Vitamin B,2 und Cyanid enthält, zur Zugabe zur Probe In Stufe (1).
Das Vitamin B)2-Analogon, ζ. B. Cobinamid, kann vor, während oder nach Stufe (a) zugesetzi werden. Vorzugsweise wird es nach der Stufe (a) zugesetzt. Es kann bequem sein, ein einziges Reagenz, das Cobinamid und Intrinsikfaktor enthält, in Stufe (c) vorzusehen.
Die Stabilität des Dlthlopolyols ist stets problematisch gewesen. Bei einem handelsüblichen Vitamin Bi2-TeStsatz wird DTT als wäßrige Lösung zugeführt, die bei 4° C bis zu 30 Tagen nach Öffnen des Gefäßes gelagert werden kann. Vor der Verwendung wird die DTT-Lösung mit dem radioaktiven Tracer gemischt, um eine arbeitende Tracerlösung zu ergeben, die nur einen Tag stabil Ist. Bei einem weiteren handelsüblichen Testsatz wird DTT als gefriergetrocknetes Pulver zur Verfügung gestellt, das als solches bei 2 bis 8° C gelagert werden kann. Nach dem Rekonstituieren muß es bei -20° C gelagert werden. Vor dem Gebrauch wird es mit dem markierten Vitamin Bi2 zu einer arbeitenden Tracerlösung gemischt.
Ein weiteres Merkmal der Erfindung liegt darin, daß das Dithiopolyol im Gemisch mit dem zum Denaturieren der Serumproteine verwendeten Alkall vorgesehen werden kann. Dies Ist unerwartet, da es seit langem bekannt 1st, daß Mercaotane durch Luft leicht zum Disulfld oxidiert werden, insbesondere In alkalischer Lösung. Der erfindungsgemäße Test, der ohne ein Dithiopolyol nicht arbeitet, arbeitet mit Lösungen von DTT In NaOH, die über 14 Wochen bei 2 bis 40C oder bis zu 2 Wochen bei 37°C aufbewahrt worden sind, völlig zufriedenstellend.
Die Erfindung ermöglicht somit die Zusammenstellung eines Testsatzes zur Durchführung eines Tests auf Vitamin B,2 In Serum mit Quellen für Alkall, einem Dithiopolyol mit 4 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cyanid, radioaktiv markiertem Vitamin Bi2, Intrinsikfaktor und einem Vitamin B|2-Analogon. das In Serum fest an bindende Serumproteine gebunden wird, nicht aber an den Intrinsikfaktor, wobei die Quellen für Alkall und Dithiopolyol Im Gemisch vorliegen.
Es ist ziemlich üblich, einen Doppeltest auf Vitamin B12 und Folat durchzuführen, und zwar unter Zugabe von mit Kobalt-57 markiertem Vitamin Bu und mit Jod-125 oder Jod-131 markiertem Folat und spezifischen
bindenden Proteinen für beide Materialien zur selben Serumprobe. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Testen auf Vitamin Bi2 kann vorteilhafterweise zusammen mit einem Folat-Test durchgeführt werden. Folat liegt normalerweise in Serum zusammen mit Folat bindenden Proteinen vor. Stufe (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei tiefer Temperatur durchgeführt, um bindende Serumproteine zu entfernen, hat keinen schädlichen Einfluß auf den Folattest.
Die Quelle für den Intrinsikfaktor ist unwichtig. Gewöhnlich wird Intrinsikfaktor vom Menschen oder Schwein verwendet.
Beispiel 1
ReagcAtien und Arbeitsvorschrift für einen erfindungsgemäßen Test.
Reagentien
a) Standards enthalten Vitamin B,2 in geeichten Mengen auf Puffer-Basis, menschliches Serumalbumin enthaltend.
b) Tracer ist "Co-Cyanocobalamin in einem konservierten IO mM Phosphatpuffer, 0,1 Gew\-%/Vol.-% KaIiumcyanid enthaltend.
c) Denaturierungsreagenz ist eine 1,2 m Natriumhydroxidlösung mit 1,0% Dithiothreit.
d) Bindendes Reagenz ist gereinigter intrinsikfaktor vom Schwein in einem konservierten 0,2 m Boratpuffer, menschliches Serumalbumin und 20 μg/f Cobinamid enthaltend.
e) Kohletabletten sind ein Gemisch aus mit Protein überzogener Aktivkohle mit mikrokristalliner Cellulose in einem Gewichtsverhältnis von 1 : 3.
Testarbeitsweise
1. Die Teströhrchen werden markiert und in Gestellen aufgestellt nach dem in Tabelle I wiedergegebenen Protokoll.
2. 200 μΙ-Teilmengen der Standards und unbekannte Sera werden in die geeigneten Röhrchen mit einer frischen Pipettenspitze für jede neue Lösung pipettiert.
3. 100 μΙ-Mengen Tracer werden in alle Röhrebin pipettiert.
4. 100 μΙ-Teilmengen Denaturierungsreagenz werden in alle Röhrchen pipettiert.
5. Gründliches Wirbelmischen aller Röhrchen, damit keine Tropfen unvermischten Reagenz übrigbleiben. Bedecken der Röhrchen mit einem Gewebe und Inkubleren in gedämpftem Licht für 15 min bei Raumtemperatur.
6. 1000 μΙ des bindenden Reagenz werden in alle Röhrchen pipettiert, mit Ausnahme der »Totais« und Blindprobenröhrchen. 1000 μΙ destilliertes Wasser werden in die »Totais« und Blindprobenröhrchen pipettiert.
7. Alle Röhrchen werden gründlich wirbelgemischt und 45 min bei Raumtemperatur in gedämpftem Licht inkubiert.
8. Gegen Ende der Inkubationsperiode wird mit einer Pinzette eine Aktivkohletablette in jedes Röhrchen, mit Ausnahme der »Totais«, gegeben.
9. Die Tabletten können für wenigstens 5 bis 10 s zerfallen. 1 bis 2 s wird durchwirbelt, entfernt und sofort wieder weitere 6 bis 10 s durchwirbelt.
10. Alle Röhrchen werden bei Raumtemperatur 15 min inkubiert.
11. Alle Röhrchen (ausgenommen die »Totais«) werden wenigstens 10 min bis 1500 g zentrifugiert. Das freie Vitamin B,2 wird von der Aktivkohle adsorbiert; das gebundene Vitamin B,2 bleibt in der überstehenden Flüssigkeit.
12. Nach dem Zentrifugieren werden die überstehenden Flüssigkelten in einen klaren Satz markierter Röhrchen dekantiert, die Röhrchenränder leicht aneinander geklopft, um die überstehende Flüssigkeit vollständig zu überführen.
13. Alle Röhrchen werden In einem geeignet programmierten y-Zähler 60 s oder auf wenigstens 10 000 Zählimpulse In den Röhrchen 5 bis 6 gezählt.
Ergebnisse
1. Auf log/lin.-Papier werden zwei Standardkurven erstellt, indem die Zählimpulse pro Zeiteinheit auf der linearen Achse gegen die Konzentration an Vitamin B,2 oder Folat auf der log-Achse aufgetragen werden. Es werden die besten Standardkurven durch das Mittel doppelter Punkte unter Ausschluß stark abweichender Punkte erstellt.
2. Unter Verwendung des Mittels der Zählimpulse für die unbekannten Proben werden deren Vitamin Bi2- oder Folat-Konzentrationen aus der jeweiligen Standardkurve abgelesen.
Der obige Test wurde mit einem führenden kommerziellen Testsatz (der ein Kochen der Probe zwecks Denaturierung erfordert) und mit einem herkömmlichen mikrobiologischen Test (der als eine genaue Bestimmung liefernd anerkannt ist, aber zu langsam und zu schwer zu handhaben Ist) verglichen. In beiden Fällen wurde eine lineare Beziehung mit einem hohen Korrelationskoeffizienten über 0,94 gefunden. Dies zeigt, daß der erfindungsgemäße Test genaue Ergebnisse erzielt, ohne unter den Nachteilen bestehender Tests zu leiden, nämlirh der Notwendigkeit, die Probe in Alkall mit Cyanld zum Denaturieren der Serumoroteine zu kochen.
Die Abkürzung »Totals« steht für die Gesamtradioaktivltüt des radioaktiven Tracers, die in Lösung vorliegt, wenn keine Aktivkohle zur (teilweisen) Ausfüllung den Röhrchen zugesetzt wurde.
Tabelle I in μΙ _ Blindprobe 0 50 150 Standards 1000 2000 Unbekannt _ 2 _
Testprotokoll »Totals« _ 3-4 5-6 7-8 9-10 400 13-14 15-16 1 200 etc. 200
Anmerkung: Alle Volumina 1-2 200 200 200 200 11-12 200 200
Röhrchen 100 _ _ _ _ 200 _ _ 100 100
_ _ 100 100
Standards 100 100 100 100 100 100
Kontrollen oder unbekannte 100 100 100 100 100 100 100
Proben 100
Zweifach-Tracer
Denaturierungsreagens
Wirbelmischen. 15 min Inkubation bei Raumtemperatur Lösung bindenden Proteins
Wasser
1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000
1000
1000
Wirbelmischen. 45 min Inkubation bei Raumtemperatur
Zugabe einer Aktivkohle-Tablette zu allen Röhrchen (ausgenommen den »Totais«), 1-2 s Wirbelmischen, Entfernen und Wirbelmischen für weitere 6 bis 10 s.
15 min Inkubation aller Röhrchen bei Raumtemperatur.
Zentrifugieren aller Röhrchen 10 min bei 1500 g. Dekantieren der überstehenden Flüssigkeiten in einen sauberen Satz markierter Röhrchen und Auszählen.
Beispiel 2
Die folgenden Reagentien und Arbeltsweisen wurden zur Bestimmung der Serum-Bllndproben (nicht-spezifische Bindung von Vitamin B12), erhalten unter verschiedenen Bedingungen In der alkalischen Denaturierungsstufe des Vitamin Bi2-Tests, angewandt. Aus den späteren Daten wird klar, daß einzigartig definierte Bedingungen für die wirksame Denaturierung von Vitamin Bu bindenden Proteinen In menschlichem Serum mit Natriumhydroxid nötig sind.
Reagentten
la. 1,5 n-Natronlauge.
Ib. Destilliertes Wasser.
Tracer-Lösung
1,5 μθ (57Co) Vitamin B12-Tracer in Kaliumphosphatpuffer mit menschlichem Serumalbumin und Konservierungsstoff, so Wie 2a, aber auch KCN (0,5 mg/m!) enthaltend.
Wie 2a, aber auch Dithiothreit (1 Gew.-/Vol.-«) enthaltend.
2d. Wie 2a, aber auch KCN (0,5 mg/ml) und Dithiothreit (1 Gew.-/Vol.-%)-Test1ösung enthaltend.
3a. Natriumborat-Puffer, pH 7,2, mit menschlichem Serumalbumin und Natriumchlorid.
3b. Wie 3a, aber auch Dithiothreit (0,1 Gew.-/Vol.-%) enthaltend.
3c. Wie 3a, aber auch KCN (50 μg/ml) enthaltend.
3d. Wie 3a, aber auch Dithiothreit (0,1 Gew.-/Vol.-%) und KCN (50 iig/ml) enthaltend.
3e. Wie 3a, aber auch Cobinamid (20 ng/ml) enthaltend.
Mit Protein überzogene Kohle-Suspension in 0,9 (Gew.-/Vol.-%) Natriumchloridlösung mit Konservierungsstoff (75 mg Aktivkohle/ml). &°
Arbeitsweise zur Bestimmung Serum-unspezifiseher Bindung
Testbedingiingen
12 3 4 5 6 7 Röhrchen mil
Gesamtnidio-
·) Zwölf menschliche Serumproben wurden unier jeder Bedingung getestet.
5. DTT in Tracer-Lösung (pH 13) KCN in der Testlösung 15,6 (± 3,4) (pH 9,3)
6. DTT und KCN in Tracer-Lösung (pH 13) 8,9 (± 0,8)
5S 7. DTT und KCN in Tracer-Lösung (pH 13) 4,3 (± 0,4)
20 ng/ml Cobinamid in der Testlösung (pH 9,3)
Diskussion
Die Bedingung 1, bei der es keine Denalurlerung gab, zeigt, daß die Masse des Vitamins Bi2 Im Serum in gebundener Form vorliegt. Bei der Bedingung 2 erfolgte die Denaiurlerung durch Kochen mit Cyanld, eine unbequeme Stufe, die aber die nicht-spezifische Bindung auf einen annehmbaren Wert senkte.
Raumtemperatur-Denaturierung, mit oder ohne Cyanid (Bedingung 4 und 3), beließ 20 bis 30% des Vitamins
«•5 Bi2 gebunden an nicht-spezifische Serum-Proteine. Raumtemperatur-Denaturierung in Gegenwart von Dlthiothreit (Bedingung 5) lieferte bessere Ergebnisse, und diese wurden weiter erheblich verbessert, wenn Cyanid auch vor dem Denaturieren zugesetzt wurde (Bedingung 6). Das Ergebnis der Bedingung 6 wurde noch welter verbessert, wenn Cobinamid in der Testlösung zugegen war (Bedingung 7).
aktiviläl sf
Zugabe von 21)0 μΐ Serum*) > jjS
Zugabe von 100 μΐ Reagens 2a 2d 2a 2b 2c 2d 2d 2a ",ί.
Zugabe von 100 μΐ Reagens Ib la la la la la la la. ! ■
Zugabe von 1000 μΙ Reagens -3a------ s*>
Wirbelmischen und Inkubieren tür 15 min bei Raumtemperatur (ausgenommen die j§
Röhrchen unter Ttrsibedingungen 2, die 15 min bei 100° C inkubiert werden). jjr.
Zugabe von 1000 μΐ Reagens 3a - 3d 3b 3c 3a 3e 3a ϊί;
Wirbelmischen und Inkubieren für 45 min bei Raumtemperatur ■;■.'■ Zugabe von 200 μΐ Reagens 4 4 4 4 4 4 4-
Wirbelmischen und 5 min stehenlassen. Zentrifugieren aller Röhrchen ausgenommen %
die »Totais« 10 min bei 1500 g, Dekantieren überstehender Flüssigkeiten in einen kla- $]
ren Satz markierter Röhrchen. Alle überstehenden Flüssigkeiten und der Gesamtge- ig
halt der »Totalw-Röhrchen werden in einem y-Zähler gezählt. S
I'
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt. Die Werte sind die mittleren Zählwerte, erhalten an einzelnen Serumproben, ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtzählimpulse.
Mittlere (« = 12) Serum-Blindwerte, erhalten unter verschiedenen Bedingungen beim Vitamin Bij-Test
Teslbedingungen Serum-Blindwert
(% nicht-spezif. Bindung)
— ■
1. Test ohne Denaturierung endogener bindender Proteine 87,1 (± 7,5)
2. Test mit Wärmedenaturierung (siedendes Wasserbad) 7,2 (± 0,9)
Alkalische Denaturierung:
3. DTT und KCN in der Testlösung (pH 9,3) 23,7 (± 3,2)
4. KCN in Tracer-Lösung (pH 13). DTT in der Testlösung 28,9 (± 3,0)
Die Ergebnisse der Bedingungen 2, 6 und 7 waren unter dem Gesichtspunkt der Genauigkeit aller annehmbar, aber die Bedingungen 6 und 7 hatten gegenüber der Bedingung 2 den grölten Vorteil, daß Ergebnisse unier Anwendung lediglich von Raumtemperaturen erzielt wurden.

Claims (1)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Testen auf Vitamin B12 in Serum mit folgenden Schritten:
(a) Abtrennen des Vitamins B12 von den Serumproleinen, wobei die Proteine im wesentlichen denaturiert werden.
(b) Zugeben einer Standardmenge an radioaktiv markiertem Vitamin Bu,
(c) Zugeben einer Standardmenge an Intrinsikfaktor, die nicht ausreicht, um das gesamte Vitamin Bu in der Probe und das radioaktiv markierte Vitamin Bi2 zu binden, und
(d) Inkubieren des Gemischs, um einen Teil des Vitamins Bi2 in der Probe und einen Teil des radioaktiv markierten Vitamins Bi2 an den Inirinsikfaktor zu binden. Abtrennen des gebundenen vom nichtgebundenen Anteil, Messen des Radioaklivitätswerts wenigstens eines Anteils und Verwerten der Messung zur Bestimmung der Konzentration an Vitamin B,2 in der Probe, dadurch gekennzeichnet, daß
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