DE2936540C2 - Trockene Radioimmunoassay-Test-Zusammensetzung, deren Anwendung und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents

Trockene Radioimmunoassay-Test-Zusammensetzung, deren Anwendung und Verfahren zu deren Herstellung

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DE2936540C2 DE2936540A DE2936540A DE2936540C2 DE 2936540 C2 DE2936540 C2 DE 2936540C2 DE 2936540 A DE2936540 A DE 2936540A DE 2936540 A DE2936540 A DE 2936540A DE 2936540 C2 DE2936540 C2 DE 2936540C2
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Description

4. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß sie in lyophilisierter Form vorliegt.
S Verfahren zur Herstellung einer trockenen Radioimmunoassay-Test-Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4. dadurch gekonnzeichnet daß man folgende Stufen durchführt:
(a) Herstellen tiner wäßrigen Flüssigmischung aus dem iddiomarkierien Liganden, dem Antikörper und einem Schwermetallkation, das in einer ausreichenden Menge vorliegt, um die Koniplexbildungsreaktion zwischen dem radiomarkierten Liganden und dem Antikörper zu inhibieren, und
(b) Trocknen der Flüssigmischung.
IO
15
20
25
30
35
(e) Messen der Radioaktivität in einer der abgetrennten Fraktionen als Funktion der Gegenwart oder der Menge des Liganden in der Flüssigkeitsprobe.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10,_ dadurch gekennzeichnet, daß der Chelatbildner Äthylendiamintetraessigsäure ist.
IZ Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) die rekonstituierte Flüssigzusammenseizung zuerst mit dem Chelatbildner und dann mit der Flüssigprobe vereint wird.
13. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (b) die rekonstituierte Flüssigzusammensetzung gleichzeitig mit der Flüssigprobe und dem Chelatbildner vereint wird.
14. Verfahren gemäß Ansprüchen 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand Thyroxin ist.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß das Metallkation ein Cupriion ist.
7. Verfahren liemäß Ansprüchen 5 oder 6. dadurch gekennzeichnet, daß die Trocknungsstule durch Lyophihsierung der Flüssigmischung erfolgt. -to
8. Verfahren gemäß Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, dall die Stufe (a) durchgeführt wird, indem man eine wäßrige Losung, enthaltend ein Schwermetallation und den Antikörper, herstellt und anschließend zu der Losung den radiomarkierten Liganden gibt
9 Verfahren gemäß Anspruch 5. dadurch gekenn zeichnet, daß der l.ig.ind Thyroxin ist
10 RadioimmunoassayVerfahrcn /ur Bestimmung eines l.igandcn. ausgewählt aus Haptenen und Antigene!· in einer Flussigprobc. gekennzeichnet durch folgende Stufen:
(a) Rekonstituieren einer trockenen Tcstzusam menset/iing gemäß Ansprüchen 1 bis 4 mit einem vorbestimmten Volumen einer wäßrigen
I lussigkeit:
(b) Vereinen der rekonstruierten Flussig/usam mensci/ung mit der I lussigprobe und mit einem ( heliithikiner fur das Schwermelallkation in so einer Menge. Jie ausreicht, um im wesentlichen das gesamte vorhandene Kation ?u binden;
(e) ifikubiefeffi-dcp erhaltenen flüssigen Reäktions·1 mischung;
(dj Trennen der fraktion des radiöffiärkierten Ligandcn, der an den Antikörper während der ifiktibationszcU gebunden wurde, von dem Teil, der nicht so gebunden würde, und Die Erfindung betrifft eine trockene Radioimmunoas-S3y-Testzusammensetzung gemäß dem Oberbegriff de? Anspruchs 1 zur Verwendung in Radioimmunoassays für die Bestimmung von Haptenen und Antigenen (nachfolgend als »Liganden« bezeichnet) in Flüssigkeitsproben, einschließlich Körperflussigkeiten. wie Serum. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung solcher Testzusammensetzungen und ein RadioimmunoassayVerfahren unter Verwendung einer solchen Testzusammensetzung.
Zur Erhöhung der Genauigkeit von Radioimmunoas sav-Verfahren und auch /ur Vereinfachung und Abkürzung des Verfahrens in medizinischen Laboruntersuchungen hat man schon Reaktionsmischungen (oder Inkubierungsmischungen) in Gefäßen bereuet, die bereits die cforderlichen vorbestimmten Mengen entweder des zu untersuchen 1en radioaktiv markierten Liganden oder des spezifischen Bindungsmitlels dafür enthielten Sätze fur spezifische ImmunoassayBestim mtingen aus einer Anzahl von Reagensgläsern, die jeweils vorgemessene Mengen der vorher erwähnten Komponenten enthalten, sind im Handel erhältlich ("iir eine bessere l.agerstabilital und wegen des einfacheren Transportes enthalten die Reagensglaser in diesen Sätzen die Radioimmun'»ass,i\ Komponenten in lyophilisierter I orm und der Satz enthält m.j allgemeinen auch eine geeignete Pufferlösung zi;m Auflosen (Rckonsti tigeren) der Ivophilisicnen Komponenten in den Reagersglasci n. bevor die .wideren Reaktanten zugegeben werden Obwohl die Menge der Pufferlosung. d:e zum Rekonstruieren der Ivophilisierten Komponenten in dem Reagensglas verwendet wird, nicht mit einem sehr hohen Genauigkeitsgrad gemessen werden muß. erfordert die Verwendung sol'her Satze doch eine genaue Messung, im allgemeinen durch Pipettieren wenigstens zweier Losungen durch einen Laboranten i-alls die lyophihiierie jCumpuntMUe in dem Reagenzglas der radioaktiv markierte Ligand ist, so ist es erforderlich, außer der vorerwähnten Pufferlösung genaue Mengen von sowohl dem spezifischen Bindungsmi'ftei als auch def Zu üntefsuehenden Probe zuzugeben*
In US'PS 40(7 597, GB-PS 14 11 381 und BE-PS 8 52 990 Wird schon beschrieben, daß man sowohl den
radiomarkierten Liganden als auch das Bindungsmittel in dem gleichen Gefäß lyophilisieren kann. Die bisher beschriebenen Verfahren erfordern eine sorgfältige Schichtung des radiomarkierten Liganden und des Bindungsmittels oder ein sofortiges Gefrieren einer Mischung, wobei nicht sicher ist, ob nirht eine gewisse Komplexbildung zwischen dem markierten Liganden und dem Bindungsmittel während des Herstellungsverfahrens, der Lagerung oder nach dem Rekonstituieren und vor der Zugabe der Probe stattfindet.
Aus US-PS 41 07 284 ist ein stabilisiertes Radioimmunoassay-Reagens bekannt, wobei der radiomarkierte Ligand und das Bindungsmittel in Form ihres Komplexes vorliegen. Beim Rekonstituieren und bei der Verwendung für eine Untersuchung wird eine erhebliche Inkubationszeit benötigt, um eine Dissoziierung bei der Konkurrenz zwischen dem markierten Liganden und der Probe des nativen Liganden zu ermöglichen.
Es besteht somit ein Bedürfnis nach einem stabilisierten, trockenen Radioimmunoassay-Reagens, in welchem der markierte Liganr* und der Antikörper nicht in Form ihres Komplexes gebunden sind. Ein solches Reagens würde ein einziges Reagens zum Einführen sowohl der Markierung als auch des Antikörpers in eine Reaktionsmischung in ihrer freien, oder nicht komplexgebundenen Form ermöglichen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein solches Reagens zu schaffen, um eine Radioimmunoassuy-Methode zu ermöglichen, die genauer und gleichzeitig einfacher in einem medizinischen Laboratorium durchzuführen ist als bisher. Diese Aufgabe wird durch eine Radioimmunoassay-Test-Zusammensetzung gemäß dem Palentanspruch 1 gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungei der Z- .,ammensetzung sind in den Patentansprüchen 2 bi' 4 beschrieben.
Das Verfahren zur Herstellung iner solchen trockenen Testzusammensetzung ist dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Stufen durchführt:
(a) Herstellung einer wäßrigen Flüssigmischung aus dem radiomarkierten Liganden, dem Antikörper und dem Schwermetallkation, das in einer ausreichenden Menge vorliegt, um die Komplexbildungsreaktion /wischen dem markierten Liganden und dem Antikörper zu inhibieren, und
(b) Trocknen der Flüssigmischung.
Bevorzugte Ausgestaltungen des Herstellungsverfahrens ergeben sich aus den Palentansprüchen 6 — 9.
Das Radioimmunoassay-Verfahren /ur Bestimmung eines Liganden, ausgewählt aus Haptenen und Antigenen. in einer Hüssigkeitsprobe ist gckern/eichnet durch folgende Stufen:
(a) Rekonstituieren einer erfindiing'.gemäßen Feslzus,immenset/ung mit einem vorbestimmten Volumen eirer wäßrigen F lüssigkeit:
(b) Vereinen der rekonstituierten Flüssigzusammenset/iing mit der I liissigprobe und mit einem Chelatbildner fur das Schwermetallkation in einer Menge, die aiisreiiht. um im wesentlichen das gesamte vorhandene Katiun zu binden;
(c) ; Inkubieren: der, eriialteriert.'fiüssigen Reaktfönsmi-
scliüngi
(d) Trennen der Fraktion des radiomarkierten Ligändenf der an den Antikörper während der Inkubationszeit gebunden Würde, Von dom Teil, der nicht so gebunden wurde, und
(e) Messen der Radioaktivität in einer der abgetrennten Fraktionen als Funktion der Gegenwart oder der Menge des Liganden in der Flüssigkeitsprobe.
Bevorzugte Ausgestaltungendes Radioimmunoassay-Verfahrens ergeben sich aus den Patentansprüchen H-H.
jedes Schwermetallkation oder ein Äquivalent davon, das im wesentlichen die Ligand-Antikörper-Reaktion
ίο inhibiert, kann verwendet werden. Zahlreiche Stc'fe sind aus der Literatur und dem Stand der Technik bekannt. Entsprechende Chelatbildner sind dem Fachmann auf diesem Gebiet gleichfalls bekannt. Ist das Schwermetallkation ein Cupriion, so ist der bevorzugte
Chelatbildner Äthylendiaminutraessigsäure.
EsP bevorzugter Ligand ist Thyroxin.
Bei der ersten Stufe des Verfahrens zur Herstellung der Testzusammensetzung stellt man ein bekanntes Volumen einer wäßrigen Flüssigkeitsmischung, gewöhniich einer Pufferlösung, weiche den radioaktiv markierten Liganden, den spezifischen Antikörper für den Liganden und wenigstens ein Schwermetallkation in einer ausreichenden Menge, um die Komplexbildungsreaktion zwischen dem Antikörper und dem Liganden zu inhibieren, her. Alternativ kann man auch zuerst das oder die Metallkationen in einer wäßrigen Lösung, welche den spezifischen Antikörper enthält, lösen und die entstandene Lösung wird dann mit einer wäßrigen Lösung des radioaktiv markierten Liganden vermischt.
Bei diesem Verfahren hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, die Mischung aus dem Antikörper mil dem Schwermetallkatiuii eine Weile stehenzulassen, vorzugsweise mehr als eine halbe Stunde, um eine vollständige Inhibicrung des Antikörpers durch das Schwermetallkation zu bewirken, bevor die Lösung mit der Lösung des radioaktiv markierten Liganden in dem Gefäß vermischt wird.
Die Lyophilisierung der vorerwähnten wäßrigen Mischung wird in bekannter Weise durch Frieren der Mischung in einem Gefäß bei sehr niedrigen Temperaturen, z. B. - 70 C oder bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff, wobei man das Gefäß an eine Hochvakuumquelle anschließt, durchgeführt. Nach »ollständiger l.vophilisierung laßt man das Gefäß und dessen Inhalt auf Raumiemperatur erwärmen, lost das Gefäß von der Vakuumquelle und verschließt es dicht, um den Eintritt von Wasserdampf zu vermeiden.
Die verschlossenen Gefäße, welche die lyophilisierie Mischung aus radioaktiv markierten Liganden, spezifi sehen Antikörper dafür und ein Schwermetallkation enthalten, können über längere Zeiträume gelagert werden, bis man sie zur Durchfuhrung eines Radioim munoassav in einem medizinischen Laboratorium benötigt. Fur die Durchführung der eigentlichen Untersuchung ist es erforderlich, /ti der kophilisierter Mischung in dem Gefall genau abgemessene Volumir.t von nur zwei Losungen zuzugehen, nämlich der Standardlösung oder einer Probelosung die Jen zu unterem lii-nden l.igandcn enthalt und des ( hel,i'^il<l nerv gewöhnlich gelost in einer t'ee.gneien l'uffi-rU, sung, und die dazu dient, einen ν ihtien keupk \ tu ■ dem iiLhvvcrmeuillkdtiun /.u bilüui, uiii dadiuüi tiusscn lnhibicrungswirkung auf das Ligand-Antikörpcr-Sysicm aufzuheben. Diese beiden Lösungen können gleichzeitig, z. B. mittels einer sogenannten »Verdünnef'Zugabe«'Vorrichtung zugegeben werden. Alternativ kann man die beiden Lösungen auch manuell, z. B. durch Pipettiefefti zugeben, wobei es vorteilhaft ist.
gensglaser ließ man diese auf Raumtemperatur erwärmen. Jedes Reagensglas wurde dann dicht verschlossen.
B. Testverfahren
1. Manuelle Methode
25 μΙ einer Serumprobe oder einer wäßrigen
zunächst die Lösung des Standards oder der Probe zuzugeben, umi <i;e lyophiüs'crte Mischung darin vollständig auflösen läßt, bevor man den Chelatbildner zugibt. Diese Reihenfolge stellt sicher, daß die Komplexbildungsreaktion zwischen dem Antikörper
und dem radioaktiv markierten Liganden einerseits und dem nativen Liganden in der Probe andererseits gleichzeitig abläuft
Nach einer geeigneten Inkubationszeit bei Raumtemperatur oder einer anderen geeigneten Temperatur, io T-4-Standardlösung wurden in ein Reagensglas, enthalwährend welcher ein Teil des Liganden (sowohl des tend die vorher beschriebene lyophilisierte Mischung,
gegeben. Das Reagensglas wurde schwach geschüttelt, um das gesamte iyophilisierte Material mit der Serumprobe oder der Standardlösung anzufeuchten und um dessen vollständige Auflösung darin zu ermöglichen. Zu dem Reagensglas wurden 300 μΐ einer wäßrigen Tris-maleatpufferlösung, pH 7,4 (hergestellt durch Auflösen von 2,85 gTris-(hydroxymethyI)-aminomethan und 1,2 g Maleinsäure in 290 m) destilliertem Wasser), enthaltend
markierten als auch des nativen) einen Liganden-Antikörper-KompIex mit dem spezifischen Antikörper büdet, wird der freie, ungebundene Ligand von dem Ligand-Antikörper-Komplex abgetrennt. Um dies durchzuführen, können alle bekannten Verfahren auf dem Radioimmunoassay-Gebiet angewendet werden.
Die Trennung des freien Liganden von dem Ligand-Antikörper-Komplex wird bevorzugt durch sogenannte »aufsteigende Chromatographie«, durchgeführt.
Es können aber auch andere Verfahren zum Trennen des freien Liganden von dem Ligand-Antikörper-Komplex unter Anwendung der Erfindung angewendet werden.
Für die Durchführung der Radioimmunoassay-Methode kann man einen Test-Satz verwenden, der wenigstens aus einem verschlossenen Gefäß besteht, welches eine erfindungsgemäße trockene Test-Zusammensetzung enthält.
Der Test-Satz kann gewünschtenfalls auch noch eine verpackte Menge einer wäßrigen Pufferlösung zum Auflösen der lyophilisierten Mischung während der eigentlichen Radioimmunoassay-Bestimmung enthüllen. Diese Pufferlösung kann gewünschtenfalls einen starken Chelatbildner, der in der Lage ist. einen stabilen Komplex mit dem Schwermetalikation zu bilden, enthalten. Alternativ kann eine Lösung des Cheiatbildners in getrennt abgepackter Form in dem Test-Sat/ vorhanden sein. Eine weitere gewünschte Komponente in dem Test-Sat/ ist ein bekannter nativer Ligand. der zum Hin" chten einer Standardkurve dienen kann, wie vorher schon ausgeführt wurde.
Beispiel
Riidioimmunoassay von Thvroxm (T-4) A. Herstellung der lyophilisierten Mischung
Die folgenden Lösungen wurden mittels einer Verdiinnungs-Zugabe-Vorrichtung in eine Reihe von Reagensgläser aus Polystyrol mit einem Durchmesser von 12 mm und einer i.ange von 75 mm gegeben:
0,15% w/v Äthylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugegeben. Das Reagensglas wurde wiederum zum Vermischen des Inhalts schvch geschüttelt
2. Verdünnungs-Zugabemethode
(Diluter-dispenser method)
25 μΐ der Serumprobe oder einer wäßrigen Τ-4-Standardlösung und 300 μΙ der vorerwähnten Tris-maleatpufferlösung, enthaltend EDTA. wurden gleichzeitig mittels eines automatischen Verdünnungs-Verteilungsapparates in ein die lyophilisiene Mischung enthaltendes Reagensglas gegeben. Das Reagensglas wurde zum Auflösen der Ijophilisierten Mischung in der vereinten Lösung schwach geschüttelt.
Die Mischung im Reagensglas wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
1. 100 Mikrohtcr (μ!) einer Lösung von |';'-T-4 (Aktivität pro 100 μΙ 90 Tausend Counts pro Minute (kcpm) enthaltend 0.25°/" von Polyvinylalkohol ah Füllstoff und J mg/ml 8-AniIino-I-naphthalinsulfonsaure-Ammoniunisal/C\NS).
2. 100 μΙ einer wäßrigen Lösung von T-4 Antiserum. verdünnt mit 0.0067 m-Fssigsäure. wozu I Milliliter (ml) pro 10 ml einer wäßrigen Lösung aus 3.4 mg/ml Cupnai'ctat [Cu(C'H ;();)_■ H;O] wenigstens eine halbe Stunde vor Einfüllen in Reagens* glaser zugegeben worden war.
Die Reagensgläscr wurden bei -7O0C eingefroren und anschließp.rid eine kurze. Zeit in flüssigen Stickstoff getauchte Nach ISstündigem Lyophilisiereri der Ren?
C. Trennung der Komponenten durch aufsteigende
Chromatographie
Eine chromatographische Säule wurde mit trockenem granuliertem vernetzten Polyvinylalkohol gefüllt und in °in Rcagensglas getaucht, und die inkubierte Mischung wurde in der Säule aufsteigen gelassen. Nach 'ollständiger Absorption wurde eine zusätzliche Menge von 500 μΙ der Tris-maleatpufferlösung in d&j Reagensglas gegeben und in der Säule aufsteigen gelassen, um die Trennung von freiem T-4 von dem T-4-Antikörper-Komplex /u vervollständigen.
Die Radioaktivität in der Lintauchregion der Säule wurde bestimmt, indem man die Säule in die entsprechende Bohrung eines Ih>rimeter® Gamma-Counters (Ames Company Division of Miles Laboratories. Inc.. Flkhart. IN)einführte.
Per Prozentsatz der Zurückhaltung der Säule wurde
nach folgender Gleichung berechnet:
Prozent Zurückhaltung =
Teil-CoiKit
Gesamt-Count
x IOC,
wobei »Teil-C unt« die tatsächliche Radioaktivität in der Fimauchregion der Säule ist und der »Gesamt-Count« die Radioaktivität der Iiintauchrcgion der Säule ist, bet welcher kein Antikörper ir; ,'Jcr Rcaktionsml· schung im Reaklionsglas zugegeben worden war, so daß die gesamte Menge an l25J-T-4 in der Eintaüchregion der Absorptiörisjäule absorbiert wurde.
Eine StandardjKurve wurde hergestellt, indem man
V..:, U
»■"■ i.
den Prozentsatz der Zurückhaltungswerte gegen die entsprechenden Konzentrationen des Thyroxin-Slandards aufzeichnete. Typische Ergebnisse sind die folgenden:
2Ö Wiederholungenj bestimmt £)ie ßurchschnittsergebnisse wären die folgenden:
Konzentration an Τ^4 ίιί Serum
T-4 Konzert If ation
μg/100ml
Prozent Zurückhaltung
3.0
6,0
12,0
18,0
13,49 19,01 30,67 60,12 73,61
Test-Verfahren Erwarteter Beobachteier
Wert») Wert
ug/100 ml ug/iOO ml
Manuell
Verdünner/Verteiler
Unbekannte Mengen an T-4 in Serum kanri riian in der vorerwähnten Weise mit Hilfe der Standärd-kiirve bestimmen. Unter Anwendung einer solchen Standard-Kurve wurden 3 klinische SerümDroben. jeweils mit 3,8 8
16-M7
3,8 8
16-17
3,60
8,83
16,72
3,45
8,32 16,74
*) Bestimmt ürttef Verwendung von »Sefalüte T-4« Untefsuchungssätzen hergestellt durch die Anmelderin (US-PS 36 59 1041.
230253/427

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Trockene Radioimmunoassay-Test-Zusammensetzung, enthaltend eine Mischung aus (1) einer radiomarkierten Form eines Liganden, ausgewählt aus Haptenen und Antigenen und (2) einem Antikörper für den Liganden, dadurch gekennzeichnet, daß sie (3) ein Schwermetallkation in einer Menge, die ausreicht, um die Komplexbildungsreaktion zwischen dem radiomarkierten Liganden und dem Antikörper zu inhibieren, umfaßt.
2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Schwermetallkation ein Cupriion isL
3. Zusammensetzung gemäß Ansprüchen 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Ligand Thyroxin
DE2936540A 1978-09-13 1979-09-10 Trockene Radioimmunoassay-Test-Zusammensetzung, deren Anwendung und Verfahren zu deren Herstellung Expired DE2936540C2 (de)

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