DE2402546A1

DE2402546A1 - Verfahren zur radioimmunologischen bestimmung von kleinen molekuelen

Info

Publication number: DE2402546A1
Application number: DE2402546A
Authority: DE
Inventors: Matti Antero Reunanen
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1973-01-25
Filing date: 1974-01-19
Publication date: 1974-08-01
Also published as: GB1428306A; US3981981A; FR2215621B3; JPS49102833A; FI49086C; FI49086B; FR2215621A1

Description

Andrejewski, Honke & Gesthuysen Patentanwälte

Diplom-Physiker Dr. Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur Dr.-lng. Manfred Honke Diplom-Ingenieur Anwaltsakte: 4? 210/Er-ltw Hans Dieter Gesthuysen

4300 Essen 1, denl8. Jan. Theaterplatz 3

Patentanmeldung des
Lic.Med. Matti Antero Reunanen
Kupittaankatu 11-13 C 38 ·
20520 Turku 52 / Pinnland

Verfahren zur radioimmunologischen Bestimmung von kleinen Molekülen

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur radioimmunologischen Be-; Stimmung von kleinen Molekülen, beispielsweise von Peptidhormonen, wobei einer zu untersuchenden Probe zu bestimmende Moleküle in radioaktiv markierter Form zugegeben werden, wobei ein mit den zu bestimmenden Molekülen reagierender Antikörper in bei der Reaktion vollständig umgesetzter Menge zugegeben wird, und wobei ein aus den zu bestimmenden Molekülen und dem. Antikörper "gebildeter Komplex abgetrennt und seine Radioaktivität gemessen wird. - Die Zu-

409831/0792

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplafz 3

gäbe des Antikörper in bei.der Reaktion vollständig umgesetzter Menge hat zur Folge, daß radioaktive und nichtradioaktive Moleküle des Komplexes entsprechend der Proportion gebildet werden, in der radioaktiv markierte und nichtradioaktive zu bestimmende Moleküle vorliegen. Nach Abtrennung kann daher aus der Radioaktivität der insgesamt gebildeten Menge des Komplexes und aus der Menge der zugegebenen radioativ markierten Moleküle die Menge der zu bestimmenden, nichtradioaktiven Moleküle ermittelt werden. Dabei besteht im allgemeinen eine besondere Schwierigkeit darin, den bei der Reaktion gebildeten Komplex hinreichend genau und nach einem für Massenarbeit geeigneten Verfahren quantitativ abzutrennen.

Aus der Praxis sind verschiedene Verfahren der eingangs beschriebenen Gattung bekannt. Die hierbei verwendeten Abtrennungsmethoden werden in der folgenden Zusammenstellung kurz beschrieben:

1. Elektrophorese bedingt erheblichen Arbeitsaufwand und erlaubt nur die Untersuchung kleiner Proben (max. 200 /Ul).

2. Gelfilterung ist gleichfalls außerordentlich arbeitsintensiv.

3. Unspezifische Fällung durch Proteinfällungsmittel verlangt zahlreiche Waschstufen und gewährleistet keine vollständige Abtrennung.

4. Immunoprazipitation, d. h. Fällung des Komplexes durch den Antikörper des Antikörpers, verlangt außerordentliche Sorgfalt bei der Ausführung, damit die entstehende schwache Ausfällung mit den Waschflüssigkeiten nicht verloren geht.

5. Durch Adsorption an einer festen Phase können nichtgebundene zu bestimmende Moleküle entfernt und der in der flüssigen Phase verbleibende Komplex bestimmt werden.

409831/0792

240254a

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaferplafz 3

6. Die Reaktion der zu bestimmenden Moleküle mit dem Antikörper kann in fester Phase durchgeführt werden, wobei nichtgebundene Moleküle ausgewaschen werden.

Die bei den letztgenannten Abtrennungsmethoden werden in zunehmendem Maße angewandt. Aber auch diese bekannten Verfahren weisen erhebliche Nachteile auf, da eine hinreichend genaue Abtrennung das Arbeiten in mehreren genau einzuhaltenden Dosierungsstufen voraussetzt. Weiter sind diese bekannten Verfahren jeweils nur für eine begrenzte Zahl verschiedener Moleküle geeignet, so daß beispielsweise bei der Hormonbestimmung verschiedene Verfahren nebeneinander angewendet Werden müssen. Darüber hinaus besteht ein besonderer Nachteil der Adsorption an einer festen Phase darin, daß der Gesamtproteingehalt der Probe kritisch ist und genau normiert werden muß. Insgesamt stellt keines der bekannten Verfahren der eingangs beschriebenen Gattung ein Standardverfahren dar, das eine universelle Anwendung ohne umfassende Fachkenntnis ermöglicht.

Daher besteht die Aufgabe der Erfindung darin, ein Verfahren der eingangs beschriebenen Gattung anzugeben, das einfach und zuverlässig durchzuführen ist und die Bestimmung eines breiten Spektrums verschiedener Moleküle ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch die Erfindung dadurch gelöst, daß der Antikörper eingeschlossen zwischen Dialysiermembranen zugesetzt wird und daß der zwischen den Membranen gebildete Komplex durch Auswaschen von den zu bestimmenden Molekülen abgetrennt wird. - Unter Dialysiermembran ist eine halbdurchlässige Membran zu verstehen, durch welche zwar die kleinen zu bestim-

409831/0792

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz 3

Moleküle, nicht jedoch die großen Moleküle des Antikörpers hindurchdiffundieren können. Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die zu bestimmenden Moleküle, und zwar die radioaktiv markierten ebenso wie die nichtradioaktiven, ohne weiteres durch die Dialysiermembran hindurch zu dem Antikörper diffundieren und mit diesem reagieren können. Der durch die Reaktion gebildete Komplex ist gleichfalls nicht diffusionsfähig und verbleibt beim anschließenden Auswaschen in dem durch die Dialysiermembranen umschlossenen Raum. Dagegen werden bei Auswaschen nichtgebundene und daher diffusionsfähige zu bestimmende Moleküle quantitativ entfernt. Nach dem Waschen liegt folglich im Inneren der Dialysiermembranen nur noch die Radioaktivität des Komplexes, nicht jedoch von ungebundenen Molekülen vor. Die nach bekannten "Verfahren zu ermittelnde Größe dieser Radioaktivität erlaubt in Verbindung mit der Menge der zugegebenen radioaktiv markierten Moleküle die Angabe der Menge der zu bestimmenden, nichtradioaktiven Moleküle.

In weiterer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Antikörper in vorbestimmter Dosis in einer porösen Scheibe aufgesogen, und wird die Scheibe in einem schmalen Raum zwischen zwei an ihrem Rand allseitig verbundenen Dialysiermembranen angeordnet. Das gewährleistet eine einfache und zuverlässige Dosierung des Antikörpers und sichert zugleich einen schnellen Verlauf der Reaktion durch ein günstiges Verhältnis zwischen Oberfläche und Volumen. Zur Durchführung einer Untersuchung wird eine in dieser Weise vorbereitete Dosis des Antikörpers in einen Reaktionsbehälter eingesetzt, in dem vorzugsweise bereits eine vorbestimmte Substanzmenge mit radioaktiv markierten Molekülen vorgesehen ist. Eine sorgfältige und genaue Arbeitsweise ist hierbei nur noch bei Dosierung der zu untersuchenden

409831/0792

Proben notwendig. Darüber hinaus verlangt die Untersuchung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren nur noch leicht ausführbare, rein mechanische Maßnahmen.

Diese Maßnahmen werden beträchtlich erleichtert, wenn - bei Durchführung des Verfahrens in Reaktionsbehaltern - die Reaktionsbehälter während der Reaktion und des Waschens in einer Kassette gehalten werden, wodurch eine sichere Manipulation auch mehrerer Reaktionsbehälter gewährleistet ist. Eine weitere vorteilhafte Ausbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß zum Rühren der Probenflüssigkeit während der Reaktion und des Waschens die Kassette mit den Reaktionsbehältern auf einem schwingenden Boden gehalten wird. Schließlich hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Reaktionsbehälter während des Waschens mit seitlich liegender öffnung zu halten und die Höhe der Waschflüssigkeit in einem umgebenden Gefäß zu senken und zu heben. Auf diese Weise wicd ein wirkungsvoller Flüssigkeitsaustausch bei bestmöglicher Schonung der Proben erreicht.

Die durch die Erfindung erreichten Vorteile bestehen im wesentlichen darin, daß ein Verfahren der eingangs beschriebenen Gattung geschaffen wird, das sich als Standardverfahren in einem breiten Anwendungsbereich einsetzen läßt. Das erfindungsgemäße Verfahren ist für die Bestimmung eines breiten Spektrums verschiedener Moleküle geeignet. Darüber hinaus stellt es nur geringe Anforderungen an Ausbildung und Sorgfalt des ausführenden Personals, da die bei der Untersuchung zuzugebenden Substanzen weitgehend vordosiert werden können, und die verbleibenden Arbeitsgänge einfach auszuführen sind. Im Ergebnis ist ein Verfahren geschaffen worden, das sich durch breite Anwendung und einfache Ausführung auszeichnet*

409831/0792

24025Λ6

Nachfolgend wird das erfindungsgemäße Verfahren anhand einer ' lediglich Ausführungsbeispiele darstellenden Zeichnung ausführlicher beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1 einen Reaktionsbehälter mit zwischen Dialysiermembranen eingeschlossenem Antikörper im Längsschnitt,

Fig. 2 den Gegenstand nach Fig. 1 im Querschnitt,

Fig. 3 einen in einer Kassette angeordneten Reaktionsbehälter während der Reaktion,

Fig. 4 einen in einer Kassette angeordneten Reaktionsbehälter während des Waschens.

In einem durch einen Deckel 2 abgedeckten Reaktionsbehälter 1 befindet sich eine poröse Scheibe 3 (z· B. aus Zelluloseazetat), in der der Antikörper aufgesogen und getrocknet ist. Die Scheibe 3 ist zwischen Dialysiermembranen 4 (beispielsweise aus Zellophan) eingeschlossen, die an ihrem Rand allseitig durch eine Leimfuge 5 verbunden sind. Am Boden des Reaktionsbehälters 1 ist eine vorbestimmte Menge 6 der zu bestimmenden Moleküle in radioaktiv markierter Form vorgesehen. Zur Ausführung einer Untersuchung braucht lediglich die Probe, beispielsweise Blutplasma eines Patienten in verdünnter oder auch unverdünnter Form, im Reaktionsbehälter 1 so dosiert zu werden, daß der Flüssigkeitsspiegel 7 der Probe höher liegt als die obere Grenze der den Antikörper aufnehmenden Scheibe 3· Die Probenflüssigkeit dringt durch die Membranen 4 hindurch, so daß die Scheibe 3 feucht wird. Zugleich diffundieren die zu bestimmenden Moleküle aufgrund ihrer geringen Molekülgröße durch die Dia-

409831/0792

Andrejewski, Honke & Gesfhuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz 3

lysiermembranen 4 hindurch und reagieren mit dem in der Scheibe 3 aufgesogenen Antikörper. In dem Maße, in dem zu bestimmende Moleküle durch den Antikörper gebunden werden, sinkt ihre Konzentration im Flüssigkeitsraum- 8 außerhalb der Dialysiermembranen 4. Während der Reaktion sind die Reaktionsbehälter 1 mit nach oben gerichteten öffnungen 9 in den Räumen 11 einer Kassette 10 angeordnet. Die Kassette 10 befindet sich dabei auf einem schwingenden Boden, so daß aufgrund der durch die Schwingung bewirkten Bewegung des zwischen den Dialysiermembranen 4 eingeschlossenen Antikörpers ein lebhafter Flüssigkeitsaustausch zwischen den seitlichen Flüssigkeitsräumen 12, 1J> eintritt. Das Ergebnis ist eine wirkungsvolle Durchmischung der Probenflüssigkeit und damit eine Beschleunigung des Reaktionsablaufes. Nach Abschluß der Reaktion wird die Kassette 10 um 90° so gedreht, daß die öffnungen 9 der Reaktionsbehälter 1 seitlich liegen. Darauf wird in ein - nicht dargestelltes eine Kassette 10 umgebendes Gefäß pulsierend eine Waschflüssigkeit, beispielsweise Wasser, zugeführt, so daß die Höhe der Waschflüssigkeit abwechselnd gesenkt und gehoben wird. Damit werden die Behälter 1 abwechselnd gefüllt und entleert, so daß sich eine wirkungsvolle Spülung ergibt. Soweit im Inneren der Dialysiermembranen noch ungebundene, zu untersuchende Moleküle vorhanden sind, diffundieren diese beim Waschen heraus, so daß schließlich zwischen den Dialysiermembranen nur noch der durch die Reaktion gebildete Komplex vorhanden ist, dessen Radioaktivität anschließend in bekannter Weise gemessen werden kann.

Die Dialysiermembranen 4 mit Inhalt sowie die Reaktionsbehälter 1 mit den radioaktiv markierten Molekülen werden vorzugsweise als eine Einheit hergestellt, wobei der Verwender nur noch die zu untersuchende Probe dosieren muß. Für jedes einzelne, zu bestimmende Molekül wird vorteilhaft je eine eigene Kombination

409831/0792

Andrejewski, Honlce & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz

eines Reaktionsbehälters mit in Dialysiermembranen eingeschlossenem Antikörper verwendet.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Bestimmung einer Vielzahl von kleinmolekularen Stoffen, beispielsweise Steroidhormonen, Peptidhormonen oder auch Arzneimitteln. Im folgenden wird als Ausführungsbeispiel die Bestimmung von Insulin nach dem erfindungsgemäßen Verfahren beschrieben. Ein einen Antikörper des Insulins enthaltendes Antiserum wird durch Immunisierung eines Meerschweinchens durch mehrmalige Einspritzung von reinem Insulin erhalten. Radioaktiv markiertes

125

Insulin wird durch Jodierung mit J ^ hergestellt. Diese Reagenzien werden je in 25 /Ul einer Pufferlösung dosiert, die

/
in 1 Liter Wasser 40 Mmol vom Phosphatpuffer (NaHpPO^ und NapHPOj.) ph ΊΛ, 5 g vom Plasmaalbumin der Kuh, J5Q Mmol von EDTA und 0,6 Mmol vom Thiomersalat enthält.

In Probegefäßen wird die Verdünnung des Antiserums auf die Zelluloseacetatscheiben (15 x 15 mm) dosiert, die nach Eintrocknen zwischen Dialysiermembranen aus Zellophan eingeschlossen werden. Die richtige Verdünnung des Antiserums wird durch vorhergehende Tests ermittelt, indem man aufgrund einer Dosierungsserie eine Verdünnung wählt, die 50-60 % von dem zu dosierenden radioaktiv markierten Insulin bindet. Dieses wird am Boden des Reaktionsgefäßes der Größe 25 χ 20 χ 2,5 mm 20 pg dosiert.

Daneben werden Kontrollgefäße präpariert, in dem anstatt einer aus dem Serum von mit Insulin immulisierten Meerschweinchen hergestellten Verdünnung im gleichen Verhältnis das verdünnte Serum eines nicht immunisierten Meerschweinchens verwendet und am Boden 100 /Ul Menschenserum, aus dem das Insulin durch Ad-

4 0 9 831/0792

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz

sorption mit Aktivkohle.entfernt ist, dosiert werden.

Weiter werden Standardgefäße präpariert, in denen wie in den Kontrollgefäßen 100 /ul Aktivkohle behandeltes Mensohenserum dosiert sind, und in denen das nichtradioaktive Insulin entsprechend der geometrischen Reihe 0, 5, 10, 20, 40, 80, l60 und J20 pg am Boden dosiert ist.

Nach diesen Vorbereitungen stehen die beschriebenen Reagenzien in den jeweiligen Gefäßen in trockener Form zur Verfügung, wobei vorteilhaft jeweils eine größere Zahl von Gefäßen präpariert wird. Zur Ausführung einer Bestimmung werden je Patientenprobe zwei Probegefäße, zwei Kontrollgefäße sowie eine Standardreihe benötigt. Den Probegefäßen werden je 100 /ul Patientenserum, den Kontrollgefäßen und den Gefäßen der Standardreihe je 100 /Ul Wasser sowie allen Gefäßen 900 /ul der oben beschriebenen Pufferlösung, der hier jedoch zusätzlich 9 g Kochsalz je Liter zugesetzt sind,zugegeben.

Nach l6 Stunden dauernder Reaktion wird anschließend 6 Stunden gewaschen und anschließend die Radioaktivität mit einem Gammarechner bestimmt. Die Radioaktivität der Kontrollgefäße zeigt einen unspezifischen, von den Antikörpern unabhängigen Untergrund, der von allen erhaltenen Resultaten abgezogen wird. Aus den Ergebnissen der Standardreihe wird eine Standardkurve ermittelt, aus der in bekannter Weise die Insulingehalte der Proben entnommen werden können.

409831/0792

Claims

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Thealeiplafz

JO

- 10 -

Ansprüche,

Γ I^ Verfahren zur radioimmünologischen Bestimmung von kleinen Molekülen, beispielsweise von Peptidhormonen, wobei einer zu untersuchenden Probe zu bestimmende Moleküle in radioaktiv markierter Form zugegeben werden, wobei ein mit den zu bestimmenden Molekülen reagierender Antikörper in bei der Reaktion vollständig umgesetzter Menge zugegeben wird, und wobei ein aus den zu bestimmenden Molekülen und dem Antikörper gebildeter Komplex abgetrennt und seine Radioaktivität gemessen wird, d adurch gekennzeichnet, daß der Antikörper eingeschlossen zwischen Dialysiermembranen zugesetzt wird und daß der zwischen den Dialysiermembranen gebildete Komplex durch Auswaschen von den zu bestimmenden Molekülen abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper in vorbestimmter Dosis in einer porösen Scheibe aufgesogen und die Scheibe in einem schmalen Raum zwischen zwei an ihrem Rand allseitig verbundenen Dialysiermembranen angeordnet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, durchgeführt in Reaktionsbehältern, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbehälter während der Reaktion und des Waschens in einer Kassette gehalten werden.
4. Verfahren nach Anspruch J, dadurch gekennzeichnet, daß zum Rühren der Probenflüssigkeit während der Reaktion und des Waschens die Kassette mit den Reaktionsbehältern auf einem schwingenden Boden gehalten wird.
5. Verfahren nach Anspruch J oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsbehälter während des Waschens mit seitlich

409831/0792

Andrejewski, Honke & Gesthuysen, Patentanwälte, 4300 Essen 1, Theaterplatz 3

- 11 -

liegender öffnung gehalten werden und die Höhe der Waschflüs sigkeit in einem umgebenden Gefäß gesenkt und gehoben wird.

409831/0792

Leerseite