DE2127510A1

DE2127510A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung einer Komponente in einer biologischen Flüssigkeit

Info

Publication number: DE2127510A1
Application number: DE19712127510
Authority: DE
Inventors: Die Anmelder Sind
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1970-06-04
Filing date: 1971-06-03
Publication date: 1971-12-16
Also published as: FR2096773A1; US3768979A; US3721528A; GB1356847A; FR2096773B1; CA940238A

Description

Louis W. MEAD, Lexington, Massachusetts, VStA und Marshall E. DEUTSCH, Sudbury, Massachusetts, VStA

Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung einer Komponente in einer biologischen Flüssigkeit

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von biologischen Flüssigkeiten, wobei der biologischen Flüssigkeit, die normalerweise ein Bindemittel (Protein) enthält, das sich an die zu bestimmende Komponente binden läßt, eine Kombination aus einer Komponente, die der in der' Flüssigkeit vorhandenen und zu bestimmenden Komponente im wesentlichen gleicht, jedoch im Hinblick auf ihre optischen und radioaktiven Eigenschaften derart abgeändert ist, daß sie als Tracer dienen kann, sowie aus einem Adsorptionsmittel zugesetzt wird. Die als Tracer modifizierte Komponente wird in einer größeren Menge als derjenigen zugesetzt, die · sich von dem in der Flüssigkeit vorhandenen Bindemittel binden läßt. Das Adsorptionsmittel wird zur Beseitigung . der ungebundenen Anteile der Komponente zugesetzt, dann wieder entfernt und die Menge des Tracers in der flüssigen Phase bestimmt. ■>

Bei diesem Verfahren wird ein Doppelröhrchen mit zwei trenn-

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- Z-

baren Einzelröhr chen verwendet, und. zwar einem pjro.'iftn Röhrchen, das eine aus einem Puffer und einem Tracer besteher.de wässrige Phase enthält, und einem kleineren !Röhrchen, dar; in geeigneter Weise behandelte 'Aktivkohle odrr oin Jonomiurjta'uscherharz enthält. Bei drr Durchführung der Bestimmung wird eine Probe der zu unter such ejiden biologischen Flüssigkeit der flüssigen Phase zugesetzt, danach wird dio feste Phase zugegeben, und die Komponenten werden durch Schütteln vermischt. Die dabei verwendeten Röhrchen sind so gebaut, daß der Boden des großen Röhrchens in und die öffnung des großen Röhrchens, um die Öffnung des kleinen Röhrchens, die den Feststoff enthält, passen.

Nach gründlichem Vermischen der Komponenten werden die Röhrchen zentrifugiert, wobei das kurze linde nach unten zeigt; danach werden die Röhrchen umgekehrt, und die Menge des Tracers in der klaren Flüssigkeit wird mit herkömmlichen Mit- . teln bestimmt. Beispiele für verwendbare Bestimmungslösungen und Adsorbenzien sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengefaßt. ' -

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BAD ORf(SfNAl.

- 3 -Tabelle T

Bezeichnung des Versuchs

Literaturan gate Flüssige
Phase

Feste Phase

Aktivkohle/ T-3-Verhältnis (Bestimmung der ungesättigten Thyroxin/-Globulin-F.indef ühigice it)

L.E. Braverman et al JAMA, Vol.

iaa, w

(^967) 2 ml.Wasser enthaltendJ-125 TrijodthyroninpH-7.4-Barbitalpuffer,konservierendes Rinderserumalbumin und Patientenserum (1/2 ml.)

6_f06 mg. teilchenförmige Aktivkohle (400-1000 mesh), überzogen mit 0,54- liig. Hämoglobin und 58.4 mg. Lactose

Ungesättigte Eisenbindefähigkeit des Plasmas

V. Herbert et al; J.Lab. Clin.Med. Mat, 855-862 (1966) 1 ml. pH-7>4-Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Chlorid-Puff er, 0,5 ml. Patientenplasma, 0/5 ml. Ferronammoniufflqsu"¹ fat, mit Fe ^" Cl, markiert ■* (enthaltend 3 Fe)

50 mg. teilchen-

förmige Aktivkohle,

überzogen mit

5 mg. Hämoglobin,

Lactose

Intrinsic Faktor

C. Cottlieb et al, Blood 25, (1965) 50 mg. teilchenför-

>fi ml. Magensaft,mige Aktivkohle,

2 ml. 085% NaGl, 0,1 - -

0/1 ml. Serum, überzogen mit Antikörper gegen 10 mg. Rinderserumden Intrinsic : albumin, Fibrinogen Factor enthaltend,oder Dextran 7,5 mg. Go ^5δ-Vitamin-B-12

Serum

Vitamin

B-12

ICS. Lau et al Blood 26, ΤΪ965) 1/5 ml. 0/9% 50 mg. teilchen-NaCl, 0,5 ml. Pa- förmige Aktivtientenserum, kohle, beschich-0t5^m ml. 0/25 η HCl tet mit 10 mg. 0>5 ml. Lösung Rinderserumalbumin von 500 pg Co 57-Vitamin B-12, 0^5 ml. Lösung von 5/Ug Intrinsic Fügtor

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Bezeichnung
des "Ver- '
suchs

Literaturangabe

• Flüssige Phase Phase

Insulin-Versuch

V. Herbert 2,9 ml einer Lö- et al, J. sung von 350 mg Clin Albumin/100 ml Endocrinol-25 H_pO_v Οι5 ml ei- · 1375 (1965) nsr Lösung von 20/Ug J 131-Insulin, 0/1 ml Patientenserum, 0/5 ml einer Serumlösung enthaltend Antiinsulin-Antikörper in der Verdünnung 1:105

50 mg teilchenförmige Aktivkohle , beschichtet mit Dextran 80-

Gesamt-Thyroxin

B.E.P.Murphy et al,J.Clin Endocrinol 2.6, 24 (1966) Wie oben bei T-3» V/ie bei T-3 jedoch statt Patientenserum getrockneter alkoholischer Extrakt (T-4) aus 0/1 ml Patientenserum
und 0/5 ml einer 1:20-Verdünnung von Standardserum

T-3 mit,
Ionenaustauscherharz

M.L.Mitchell, Wie oben bei Ak-

J.Clin Endocrinol Metab. 68,662-701 CT961) tivkohle/T-3; nur Wasser mit J I3I-Tri j odthyroninpH 7^4-Dreifachpuff er und 0,5 ml Pat i en t en s erum

Amberlite CG 400-Harz (PoIystrol/ quaternäres Ammonium-Harz) in Chloridcyclus .(Rohm & Haas), oder Duolite A-40 (Chem. Process Co.) oder DOWEX 1 (Dow Chemical)

5 -

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Während das bisher angewandte Verfahren gegenüber früheren Methoden eins beachtliche Verbesserung darstellt, hat es doch gewisse Nachteile aufzuweisen.

Eine strenge Einhaltung sowohl der Zeit als auch der Temperatur ist erforderlich, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, und in der Tat sind in den entsprechenden Verfahrensbeschreibungen Methoden angegeben, die eine d^frartige Einhaltung gewährleisten. Der Hauptgrund für die strikte Einhaltung der Zeit liegt darin, daß die verwendeten Adsorptionsmittel sehr stark, d.h. bindefreudig sind, so daß, wenn der Versuch zu lange durchgeführt wird, das Adsorptionsmittel einen Teil der zu bestimmenden Komponente aus der biologischen Flüssigkeit entfernt, so daß keine Reproduzierbarkeit mehr gewährleistet ist. Da ohnehin alle zu bestimmenden Mengen bei diesen Untersuchungen sehr gering sind, kann eine solche Überadsorption sehr leicht zu falschen Ergebnissen führen.

Das Reagenz muß in zwei Phasen transportiert werden. Während es theoretisch möglich v/äre, die Komponenten der flüssigen Phase mit denen der festen Phase zu vereinigen, so ist die Menge des verwendeten festen Adsorptionsmittels so klein, daß die sich daraus ergebende aktive feste Phase nicht so einfach zu handhaben wäre und damit ebenfalls nicht reproduzierbare Ergebnisse herbeigeführt werden könnten.

Angesichts der zu bestimmenden kleinen Mengen bei dem Bestimmungsvorgang des Verfahrens muß beim Zentrifugieren das kurze Ende stets nach unten weisen, um nach Umkehrung des Röhrchens in dem langen Ende Messungen zu ermöglichen, damit Reproduzierbarkeit der Durchlässigkeit gewährleistet ist.

7/as die Art der Verbindung zwischen dem kurzen und dem langen Teilröhrchen der bisherigen Ausführung anbetrifft, so hängt

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die maximale Menge dor gesamten flüssigen Phase, äie bei ·:βη
Versuch verwendet wird, von dem Fassungsvermögen des kurzen
Endes ab, da sonst größere Mengen während des Zentrifugieren auslaufen könnten.

Schließlich erfordert die Ausführung der bisherigen Röhrchen
auch die Verwendung eines Schmiermittels, um die Verbindung
abzudichten. Dies führt zu möglichen Ungenauigkeiten, die
durch eine Verunreinigung mit dem Schmiermittel hervorgerufen werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung der Menge einer Komponente in einer biologischen Flüssigkeit, wobei in einer wässrigen Suspension

1. die Komponente in oder aus einer abgemessenen Probe der
Flüssigkeit,

2. eine abgemessene Menge einer als Tracer markierten Verbindung,

3. eine Verbindung, die die Eigenschaft besitzt, die Komponente und die als Tracer markierte Verbindung an sich zu binden, und deren Menge nicht ausreicht, um die Gesamtmenge der
Komponente und Trac erver bindung zu binden, so daß ein Teil der Tracerverbindung frei und der andere an die Verbindung gebunden ist, und.

4. ein festes_v in Teilchenform vorliegendes Adsorptionsmittel zur selektiven Adsorption der freien, ungebundenen, als
Tracer markierten Verbindung, um das gebundene vom ungebundenen zu trennen,

während· einer vorbestimmten Inkubationszeit in Berührung mit-

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einander gebracht werden, um den Ablauf der Adsorption zu ermöglichen und anschließend die Abtrennung des festen Adsorptionsmittels, das die ungebundene Tracerverbindung enthält, von der Flüssigkeit, die die gebundene Komponente und die gebundene Tracerverbindung enthält, und die Bestimmung der Tracerintensität von mindestens dem abgetrennten Adsorptionsmittel oder der Flüssigkeit erfolgen. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

1. eine wässrige Suspension aus einer als Tracer gekennzeichneten Komponente und eines mäßig aktiven Adsorptionsmittels herstellt,

2. eine vorbestimmte Menge der Suspension zur Herstellung des trockenen Reagenzes gefriertrocknet,

5. eine wässrige Lösung einer kleinen Probe der biologischen Flüssigkeit herstellt und

4·. das Reagenz mit der wässrigen Lösung der biologischen Flüssigkeit mischt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Behälter zur Untersuchung einer Komponente in einer biologischen Flüssigkeit, in dem die zu verwendenden Materialien für die Untersuchung aufbewahrt und transportiert werden können und in dem die Untersuchung durchgeführt weiden kann. Der Behälter ist dadurch gekennzeichnet, daß er aus wenigstens zwei Teilen besteht, von denen ein Teil ein festes Reagenz aus einem Tracer für die zu bestimmende biologische Komponente und einem festen, teilchenförmigen Adsorptionsmittel für die mit dem Tracer markierte Verbindung enthält und jeder der Teilbehälter ein offenes sowie ein für den Transport und das Aufbewahren mit einem Verschluß versehenes geschlossenes Ende aufweist, daß das offene Ende

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eines ersten der Teilbehälter so ausgestaltet ist, daß ec entfernbar über das offene iünde des zweiten der Teilbehälter gepaßt werden kann, wobei das Adsorptionsmittel in einem Abschnitt der zueinander gepazßten Teile enthalten ist, daß der Innenumfang der Öffnung des ersten Teiles kurz vor seinem Ende von einer ringförmigen, als Abdichtung dienenden Ringausbuchtung umgeben ist, daß vor dem Ineinanderfügen der zwei Teile eine wässrige Lösung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit in den zweiten Teilbehälter eingeführt ist und die Flüssigkeit, die sich ,in dem unteren Abschnitt der ineinandergepaßten Teilbehälter befindet, in Berührung mit dem festen Adsorptionsmittel kommt.

Die vorliegende Erfindung besteht also darin, daß anstelle der starken, sehr bindefreudigen Adsorptionsmittel, wie sie bisher verwendet wurden, ein mildes Adsorptionsmittel verwendet.wird, das die zu bestimmende Komponente der biologischen Flüssigkeit nicht entfernt. Damit ist auch die Zeit, während der die Komponenten miteinander in Berührung stehen, nicht mehr ausschlaggebend; selbst ein zwanzigfacher Unterschied in der Berührungszeit hat offensichtlich keinen besonderen Einfluß auf die Versuchsergebnisse. Überraschend und höchst vorteilhaft ist ferner die Tatsache, daß das Verfahren auch von Temperatüränderungen praktisch unabhängig ist. Der Temperaturbereich von 5° bis 37°C hat sich als geeignet erwiesen, ohne daß unerwünschte Veränderungen im Ergebnis aufgetreten wären.

Die Verwendung eines milden Adsorptionsniittels erfordert und ermöglicht seine Anwesenheit in größeren Mengen. Anstelle der Herstellung und des Transportes der Versuchsmaterialien in zwei getrennten Phasen werden die Versuchsmaterialien in einer wässrigen Lösung suspendiert in"ein Röhrchen gegeben und gefriergetrocknet, wobei ein praktisch stabiles, einphasiges, festes Reagenz in handlicher Menge und praktischer Struktur erhalten wird. Auch die Vorrichtung ist gegenüber den bisiieri-

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gen Vorrichtungen verbessert, indem eine Ringausbuchtung um den Innenumfang des kleineren Teilröhrchens vorgesehen'ist, die als hochwirksame Abdichtung dient. Diese Ausführungsform hat zwei bedeutende Vorteile. Die Wirksamkeit der Abdichtung ermöglicht das Zentrifugieren von größeren Flüssigkeitsmen- · gen, als das kleinere Teilröhrchen aufnehmen könnte. Außerdem erlaubt die Art der Ausführung, daß die Abmessungen der axialen Querschnitte von größerem und kleinerem Teilröhrchen gleich sein können, so daß nur die Länge unterschiedlich ist. Auf diese Weise ist es gleichgültig, ob die Röhrchen mit dem kurzen oder langen linde nach unten zentrifugiert werden, da unter, der Voraussetzung, daß die Flüssigkeitsmenge geringer als das Volumen des kürzeren Teilröhrchens ist, gleiche Meßergebnisse erhalten werden, ob nun das lange oder das kurze Teilröhrchen die Meßflüssigkeit enthält.

Ein weiterer Vorteil dieser Ausführungsform ist darin zu sehen, daß der für das lange Teilröhrchen verwendete Verschluß in gleicher Weise ausgebildet sein kann wie das kürzere Teilröhrchen, das als Behälter für das Reagenz verwendet wird.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Zeichnungen näher erläutert, worin

Fig. 1 eine Draufsicht auf eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Behälterpackung, die zur ■Aufbewahrung und zum Transport aus drei Teilen besteht, die zwei abgeschlossene Abteilungen ergeben, in deren einer die Feststoffe enthalten sind und deren andere leer ist;

Fig. 2 einen auseinandergezogenen Aufriß der Behälterpackung

gemäß Figur 1, wobei die drei Teile der Behälterpackung • getrennt voneinander dargestellt sind;

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Pig. 3 eine Draufsicht ähnlich Figur 1, in der jedoch el :r den Feststoff enthaltende Teil der Packung aus seiner Lagerungs- und Transportstellung im Hinblick auf das größere, leere Teilröhrchen entfernt und beide Teilröhrchen zur Durchführung eines Versuchs und.der BiI-. dung einer einzigen Abteilung, an deren oberem Ende der Feststoff festgehalten und in deren unterem Teil eine wässrige Lösung, die die zu untersuchende Flüssigkeit enthält, vorhanden ist, wieder zusammengefügt wurden;

Fig. 4 eine Draufsicht ähnlich Figur 5, in der jedoch die zusammengefügten Teilbehälter umgedreht worden sind, um die Flüssigkeit mit dem Feststoff in Kontakt zu bringen und ihn in ihr zu dispergieren;

Fig. 5 eine perspektivische Ansicht der Flüssigkeit enthaltenden Teile einer Anzahl von Behälterpackungen gemäß Figur 1, die in Vertiefungen eines viele Vertiefungen enthaltenden Ternperaturblocks stehen, nachdem sie zur Durchführung des Versuches auseinandargenommen wurden, wobei das Draufstecken des die Feststoffe enthaltenden Teils einer der Behälterpackungen während des Versuches auf die öffnung des die Flüssigkeit enthaltenden Gegenstücks gezeigt ist; und

Fig. 6 eine Ansicht ähnlich Figur 5 ^i t einer Anzahl von Behälterpackungen mit einer Vergleichsprobe und einer Anzahl zu untersuchender Proben, die sämtlich gleichzeitig umgedreht werden, nachdem sämtliche Feststoff enthaltende Teilröhrchen über die öffnungen der die Flüssigkeit enthaltenden Teilröhrchen gemäß Figur 5 gestülpt wurden,

darstellen.

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Die -behälterpackung 4 besteht gemäß der: Zeichnungen aus einem verhältnismäßig starren, geraden röhrenförmigen Gebilde aus durchsichtigem, oder durchscheinendem geformten Kunststoff, und zwar aus einem kürzeren Teil 6 und einem längeren Teil 8 sowie einer Kappe 6', die in gleicher Weise wie der kürzere Teil 6 ausgeführt ist.

Der kürzere Teil 6 ist an einem Ende 10 durch einen einstückig mit der Röhre ausgebildeten Boden verschlossen und an seinem anderen Ende 12 offen. Er verjüngt sich innen und außen vom offenen zum geschlossenen Ende sehr leicht, und das offene Endstück besitzt bei 23 (Fig. 2) einen leicht vergrößerten Innendurchmesser. Etwas über dem vergrößerten Durchmesser 23, unterhalb der öffnung 12 ist eine ringförmig umlaufende Ausbuchtung 15 angeordnet, die als Dichtung dient, wenn entweder der Endteil 18 oder der Teil mit der Öffnung 20 des längeren Röhrchens 8 eingesetzt wird. Das längere Röhrchen 8 ist ebenfalls an einem Ende 14 mit einem mit ihm einstückig ausgebildeten Boden verschlossen. Das kürzere Röhrchen 6 ist so ausgebildet, daß es entfernbar über den in seinem Durchmesser verringerten, sich leicht verjüngenden, geschlossenen Endabschnitt 18 des langen Röhrchens 8 unter Ausbildung eines dichtschließenden Preßsitzes, wie in Figur 1 gezeigt, gepaßt werden kann, und in dieser Weise können die beiden Röhrchen zusammen trans-.portient und aufbewahrt werden, wobei der dünnere, sich leicht verjüngende, offene Endabschnitt 20 des längeren Röhrchens 8 durch ein zweites entfernbares kurzes Röhrchen 6' mit gleichem Bau wie dem. des kurzen Röhrchens 6 dichtschließend verschlossen ist. Das längere Röhrchen 8 bildet für das kürzere Röhrchen 6 eine Verschlußkappe.

Die öffnung 12 des kürzeren Röhrchens 6 ist außerdem so gestaltet, daß sie abnehmbar über den verengten, sich leicht verjüngenden offenen Endabschnitt 20 des längeren Röhrchens 8

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unter Ausbildung; eines dichtcchl iofionden Prelisi Lzer; (Firvvcn 3, 4- und 5) ι der durch den üichtring 15 hervorgerufen v.-.i :·<: , gestülpt werden kann, nachdem das Röhrchen 6 von dem geüohloG-senen L'.nde des Röhrchens 8 und die Kappe 6' von dem offenen Ende des Röhrchens 8 (Fig. ?) entfernt -worden sind, gestülpt werden kann, und in dieser Weise v/erden die beiden Röhrchen zur Durchführung eines Versuches zusammengepaßt.

In dem kürzeren Röhrchen 6 ist eine abgemessene Menge eines fein verteilten, teilchenförmigen, festen /Vdsorptions- oder Absorptionsmittels 29 enthalten, an das bzw. von dem das Reagenz in einer weiter unten beschriebenen Weise adsorbiert bzw. absorbiert wird.

Die feststoffe im Röhrchen 6 v/erden in dem -behälter, wie er gemäß Figur 1 zusammengesetzt ist, verpackt, transportiert und aufbewahrt, wobei das lange Röhrchen 8 einen dichtschließenden Verschluß des kurzen Röhrchens 6, in dem die Feststoffe enthalten sind, bildet, und das lange Röhrchen 8 von der Kappe 6' fest verschlossen wird.

Eine Anzahl von Behältern 4, von denen jeder, wie beschrieben, feste Komponenten enthält, kann bequem in einem einzigen Packen in einem nicht dargestellten mit Deckel versehenen Behälter transportiert werden.

Die Abmessungen des Bodenteils 19 eier Röhrchen 6 und 6' sind mit denen des Bodenteils 18 vom Röhrchen 8 identisch.

Bei der Herstellung der Reagenzien, die in dem erfinduncys^emäßen Verfahren verwendet werden, wird eine wässrige Suspension der Komponenten bereitet. Diese Suspension enthält die zu bestimmende tracermodifizierte Komponente sowie das Adsorptionsmaterial in geeigneten Mengenverhältnissen. Freibleibend, jedoch vor-

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zugsweise werden ein Puffer und ein Antischaummittel zugesetzt. Die Suspension wird so konzentriert wie möglich hergestellt und in die kleinen !Röhrchen 6 abgefüllt und zur Entfernung des Wassers gefriergetrocknet. Das ^-eagenzpulver v/ird anschließend -.zweckmäßig mit einem dünnen Kunststoffilm - bedeckt und der Bodenabschnitt 14- des längeren Eöhrchens 8 in die Öffnung 12 des kleinen Eöhrchens 6 eingesetzt und die Öffnung 20 mit dem KapprÖhrchen 6¹ verschlossen. Die so zusammengefügten Behälter sind gebrauchsfertig.

Der besondere Vorteil der vorliegenden Verfahrensweise besteht darin, daß ein Adsorptionsmittel mit beliebig niedriger Stärke oder Bindefreudigkeit verwendet werden kann. Beispielsweise können Kalziumkarbonat, Magnesiumkarbonat, Bariumsulfat, pyrogenes Siliciumdyoxid, Kartoffelstärke, Kaolin und andere Adsorbentien ähnlicher Stärke, die nicht wasserlöslich sind, verwendet werden.

Zusätzlich zu den aktiven Komponenten des beschriebenen Reagenzes können bestimmte Konservierungsmittel verwendet werden, . wie beispielsweise Inhibitonen für Bakterienwachstum, wie Parahydroxybenzo^säure, Methyl- oder-Propylester, Abfänger für freie Radikale wie Phenol, Ultraviolett-Absorptionsmittel, wie P^araaminobenzcu^säure und dergleichen.

Als Puffermittel können Natriumbarbital, Natrium- oder Kaliumphosphat, Tris (Hydroxymethyl), Aminomethan und dergleichen verwendet v/erden. Zur Aufrechterhaltung des osmotischen Wertes des Gemisches können Salze hinzugegeben werden, wie Natriumchlorid, Kaliumiodid oder dergleichen.

Zur Erleichterung der Wiederherstellung der Lösung od£r zum Unterdrücken des Schäumens können Netz- oder Antischaummittel zugesetzt werden, wie beispielsweise Alkylphosphate, das'Mittel "General Electric. Antifoam 10" und dergleichen.

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Gleichfalls kann ein die ablaufenden Umsetzungen nicht störendes Färbemittel zugegeben werden, um die Unterscheidung zwischen verschiedenen Reagenzien zu erleichtern, die zu derselben Zeit auf dem Versuchstisch stehen können.

Eine besondere Variante besteht in der Verwendung einen Peagenze's, das den Verlauf des Versuchs nicht ungünstig beeinflußt, jedoch in Gegenwart von Protein einen Farbumschlag hervorruft. Ein derartiger Indikator ist Brom^phenol^blau. Die Farbe aieses Reagenzes dient zur Anzeige^ dafür, ob dem Reagenz das i'estserum zugesetzt wurde, wirkt also als Sicherung gegen zufällige Blindversuche.

Bei der Durchführung der Bestimmung wird in das lange Röhrchen 8 destilliertes V/asser in einer Menge von praktischerweise 3,0 ml gefüllt, dem eine geringe, abgemessene Menge eier zu prüfenden Flüssigkeit, zweckmäßigerweise Serum, oder eine Vergleichsflüssigkeit oder ein Standardserum zugesetzt werden. Hierfür sind 0,2 ml eine zweckmäßige Menge. Das Röhrchen 6 wird anschließend vom Röhrchen 8 entfernt, das mit dem Ends 18 nach unten in ein Loch 40 im Block 42 eingesetzt wird. Von dem Röhrchen 6 wird anschließend die Kunststoffschutzhaut entfernt und das Röhrchen 6 über die Öffnung 20 des Röhrchens 8 gestülpt und soweit geschoben, daß der Flansch 21 auf die Schulter 23 zu sitzen kommt. Nachdem sämtliche Röhrchen des Ansatzes auf diese Weise eingesetzt worden sind, werden sie, wie in Figur 8 dargestellt, geschüttelt, bis das teilchenformige Material 29 offensichtlich gleichförmig verteilt ist. Die ^eit für das Schütteln ist nicht von ausschlaggebender Bedeutung, gewöhnlich sind zwei Minuten Schüttelzeit angemessen.

Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß für die Inkubationszeit und Inkubationstemperatur

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weite Variationsbreiten erlaubt uind, ohne daß die Keprociuzierbarkeit der Ergebnisse beeinträchtigt wird. Es vairde ^efunoen, daß es zweckmäßig ist, die Suspensionen etwa 5 bis etwa 30 Minuten bei etwa 15° bis etwa 30° C stehenzulassen, iiine Inkubation bei kaumtem >eratur während etwa 10 Minuten hat sich als zufriedenstellend erwiesen.

Die vereinigten Röhrchen werden anschließend zentrifugiert, wobei vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise aas lind--.:· 18 nach unten zeigt. Die Röhrchen werden dann umgedreht und die erforderlichen Messungen der Radioaktivität oder optischen Dichte mit der flüssigen Phase in dem langen Röhrchen ausgeführt Überraschenderweise und höchst vorteilhaft braucht auf dieser Stufe das Röhrchen 6 nicht von dem Röhrchen 8 getrennt zu v/erden, wie dies bisher notwendig war, da sich das teilchenförmige Material als hinreichend gut kompaktiert ei-wies.

In einer Abänderung d-:s erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Suspension aus den Reagenzkomponenten in das lange Röhrchen 8 gegeben, gefriergetrocknet und gewünschtenfalls mit einem dünnen Kunststoffilm bedeckt. Das Röhrchen 8 wird dann mit dem leeren Röhrchen 6 verschlossen. Bei der Durchführung der Umsetzung werden Wasser und Testserum in das Röhrchen 8 gegeben, der gegebenenfalls vorhandene Kunststoffilm nach unten in das Röhrchen geschoben, um die wässrigen Komponenten mit dem Reagenz 29 in Berührung treten zu lassen, und der übrige Versuch, wie vorher beschrieben, ausgeführt.

Diese Verfahrensmodifikation eignet sich insbesondere für die Fälle, in denen radioaktive Tracer verwendet v/erden, da durch sie die Möglichkeit der Abfallkontaminierung durch den Kunststoff ilm oder der Lufttcontaminierung durch das pulverförmige Reagenz zwischen dem Entfernen des Kunststoffilms und dem Zusammenfügen der Röhrchen 6 und 8 ausgeschlossen ist.

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Bei einigen Versuchen enthält die zu untersuchende "biologische Flüssigkeit normalerweise nicht das Bindemittel für die zu bestimmende Komponente. In diesen Fällen wird das Bindemittel dem Reagenz 29 zugesetzt. Wie oben erwähnt, ist die Menge an Bindemittel, die in den vorliegenden Versuchen verwendet wird, unzureichend, um sowohl den Tracer als auch die zu bestimmende Komponente zu binden. In den meisten Fällen wird sich ein Gleichgewicht zwischen dem Bindemittel und der markierten und nicht markierten (tagged and un-tagged) Komponente einstellen. In diesen Fällen wird das Bindemittel der wässrigen Suspension, die für die Herstellung des Reagenzes 29 verwendet wird, zugesetzt. In den Fällen, in denen es vorgezogen wird,keine vorgebundene Kombination von Bindemittel und Tracer vorliegen zu ■ haben, wird eine Kombination aus Absorptionsmittel und Bindemittel in ähnlicher Weise, wie oben beschrieben, getrennt hergestellt und die Kombination getrennt, beispielsweise in einem anderen Röhrchen 6, aufbewahrt. Nachdem Reagenz und wässrige Lösung der biologischen Flüssigkeit gemäß einer der oben beschriebenen Modifikationen des Verfahrens miteinander vermischt worden sind, wird die Kombination Bindemittel / Absorptionsmittel zugesetzt und der Versuch, wie oben beschrieben, durchgeführt, d.h., der gebundene Tracer und die zu messende Komponente werden von dem Absorptionsmittel absorbiert und ein Anteil des Tracers, der ungebunden ist, bleibt unabsorbiert.

Die Erfindung wird im folgenden anhand eines Beispiels näher veranschaulicht.

Beispiel

Ein T-3-Test (Bestimmung der ungesättigten Kapazität der Thyroxiii-Bindung an Globulin) zur Bestimmung der Menge an Thyroidhormon im Blutserum einer Anzahl von Patienten wurde wie folgt durchgeführt:

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13,Og Bernsteinsäure, 33,6 S Natriumbarbital und 270 g LIa??;-neaiumkarbonat wurden mit einer Lösung aus 2,86 mg Trijodthyronin, das mit 0,32 millicurie J 125 markiert v/ar, und 1,2 ml "General Electric Antifoam 10" in 1070 ml destilliertem Wasser zersetzt. Die Suspension wurde gründlich, gerührt, um Klumpen aufzubrechen und anschließend in aliquoten Teilen von 2 ml in kleine Röhrchen gefüllt. Der Inhalt der Kleinen Röhrchen wurde danach gefroren und das V/asser durch Gefriertrocknung entfernt.

Nach dem Gefriertrocknen wurden die kleinen Röhrchen verlängert, indem ihre öffnungen mit den geschlossenen Enden der größeren Röhrchen verkorkt wurden. Quadrate mit 25,4 mm Kantenlänge aus einem 0,05 mm dicken Polyethylenfilm wurden zwischen große und kleine Röhrchen gegeben, um den Boden der größeren Röhrchen vor einer möglichen Kontaminierung zu bewahren. Die Aggregate wurden zwei Monate bei Raumtemperatur (15° bis 25° C) aufbewahrt.

Zur Durchführung der Versuche wurden zwölf der Aggregate in ein Reagenzglasgestell gestellt. Jedes Aggregat wurde mit einer Nummer versehen, die das Serum, das in ihm untersucht werden sollte, bezeichnete. In jedes 10 mg-Röhrchen 'wurden danach 0,2 ml des Vergleichsserums oder des Patientenserums sowie 3,0 ml destilliertes Wasser gegeben. Die kurzen Röhrchen v/urden danach von dem Boden der langen Röhrchen entfernt, die Schutzquadrate aus Polyethylen herausgenommen und weggeworfen und die kurzen Röhrchen mit den langen Röhrchen, öffnung an öffnung, verbunden. Nachdem sämtliche Aggregate auf diese V/eise umgeordnet waren, wurden sie in ihrer Gesamtheit geschüttelt, bis die teilchenförmige Masse in ihnen offensichtlich gleichmäßig suspendiert war. Man ließ danach das Reaktionsgemisch etwa 10 Minuten bei Raumtemperatur (20° C)stehen. Danach wurden die Aggregate sämtlich 5 Minuten lang zentrifugiert und umgedreht, so daß die klare Oberphase von dem kompaktier-

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ten festen Material getrennt wurde. Da das kompaktierte feste Material fest auf seinem Platz blieb, war es nicht notwendig, die Röhrchen, wie früher erforderlich, voneinander zu trennen.

Anschließend wurden die Radioaktivität in der klaren überstehenden Flüssigkeit gemessen und die Zählungen aufr;ezeich.^et. Das für die klare, überstehende Flüssigkeit jedes PaticDenver such s erhaltene Zählergebnis wurde anschließend durch das Zählergebnis, das für die klare, überstehende Flüssigkeit beim Versuch mit einem normalen Vergleichsserum erhalten war, dividiert und das erhaltene Verhältnis aufgezeichnet. Dieses Verhältnis ergab für eine Patientenpopulation die "^lVerte 0,36 bis 1,06 für euthyroide Patienten, V/erte über 1,06 für hypothyroide Patienten und Werte unter 0,86 für hyperthyroide Patienten.

Wenn ein normales Vergleichsserum nicht verfügbar ist, wird die Gesamtradioaktivität in jedem Röhrchen gezahlt und die normale oder außernormale Beschaffenheit des Patientenserums wird durch das Verhältnis der Radioaktivität in öeT klaren., überstehenden Flüssigkeit jedes Röhrchens nach dem Zentrifugieren zu der Gesamtradioaktivität in jeder Suspension vor dem Zentrifugieren bestimmt. Für eine untersuchte Patientenpopulation ergab dieses Verhältnis Werte von 0,29 bis 0,33 für euthyroide Patienten, '"erte unter 0,29 für hypothyroide Patienten und V/erte über 0,38 für hyperthyroide Patienten.

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Claims

Patentansprüche Verfahren zur Bestimmung der Menge einer Komponente in einer biologischen Flüssigkeit, wobei in einer wässerigen Suspension (1) die Komponente in oder aus einer abgemessenen Probe der Flüssigkeit, (2) eine abgemessene Menge einer als Tracer markierten Verbindung, (3) eine Verbindung, die die Eigenschaft besitzt, die Komponente und die als Tracer markierte Verbindung an sich zu binden, und deren Menge nicht ausreicht, um die Gesamtmenge der Komponente und Tracerverbindung zu binden, so daß ein Teil der Tracerverbindung frei und der andere an die Verbindung gebunden ist, und (4) ein festes, in Teilchenform vor- | liegendes Adsorptionsmittel zur selektiven Adsorption der freien, ungebundenen, als Tracer markierten Verbindung, um das gebundene vom ungebundenen zu trennen, während einer vorbestimmten Inkubationszeit in Berührung miteinander gebracht werden, um den Ablauf der Adsorption zu ermöglichen und anschließend die Abtrennung des festen Adsorptionsmittels, das die ungebundene Tracerverbindung enthält, von der Flüssigkeit, die die gebundene Komponente und die gebundene Tracerverbindung enthält, und die Bestimmung der Tracerintensität von mindestens dem abgetrennten Adsorptionsmittel oder der Flüssigkeit erfolgen, dadurch gekennzeichnet, daß man

1. eine wässerige Suspension aus einer als Tracer gekennzeichneten Komponente und eines mäßig aktiven Adsorptionsmittels " herstellt,

3. eine wässerige Lösung einer kleinen Probe der biologischen Flüssigkeit herstellt und

4. das Reagenz mit der wässerigen Lösung der biologischen Flüssigkeit mischt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als mit einem Tracer markierte Verbindung eine radioaktiv-markierte Verbindung verwendet.

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3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man als Absorptionsmittel Magnesiumkarbonat, Kalziumkarbonat, Bariumsulfat, pyrogenes Siliciumdyoxid oder Kaolin verwendet.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Reagenz, das zusätzlich ein Puffer, ein Antischaummittel und bzw. oder ein vollständig ionisiertes Salz enthält, verwendet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man ein Reagenz verwendet, das zusätzlich das Bindemittel für die zu bestimmende Komponente enthält.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man zusätzlich in einer fünften Stufe das Bindemittel für die zu bestimmende Komponente zusetzt.

7. Behälter, dadurch gekennzeichnet, daß er aus wenigstens zwei Teilen (6,8) besteht, von denen ein Teil (6) ein festes Reagenz (29) aus einem Tracer für die zu bestimmende biologische Komponente und einem festen, teilchenförmigen Adsorptionsmittel für die mit dem Tracer markierte Verbindung enthält und jeder der Teilbehälter (6,8) ein offenes (12,20) sowie ein für den Transport und das Aufbewahren mit einem Verschluß (6¹) versehenes geschlossenes Ende (10,14) aufweist, daß das offene Ende (12) eines ersten (6) der Teilbehälter so'ausgestaltet ist, daß es entfernbar über das offene Ende (20) des zweiten (8) der Teilbehälter gepaßt werden kann, wobei das Adsorptionsmittel (29) in einem Abschnitt der zueinander gepaßten Teile enthalten ist, daß der Innenumfang der Öffnung (12) des ersten Teiles (6) kurz vor seinem Ende von einer ringförmigen, als Abdichtung dienenden Ringausbuchtung (15) umgeben ist, daß vor dem Ineinanderfügen der zwei Teile eine wässerige Lösung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit in den zweiten Teilbehälter (8) eingeführt ist und die Flüssigkeit, die

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sich in dem unteren Abschnitt der ineinandergepaßten Teilbehälter befindet, in Berührung mit dem festen Adsorptionsmittel (29) kommt.

8. Behälter gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Bodenteil (18) des zweiten Teilbehälters (8) derart abgemessen ist, daß die Öffnung (12) des ersten Teilbehälters -(6) mit ihm zusammenpaßt,. wobei das Bodenteil (18) des zweiten Teilbehälters (8) als Ver-Schluß für den ersten Teilbehälter (6), der das Reagenz vor seiner Verwendung enthält, dient.

9. Behälter gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß er außerdem einen weiteren Teilbehälter (6¹) enthält, der die gleichen Abmessungen wie der erste Teilbehälter (6) besitzt und als Verschluß für den zweiten Teilbehälter (8) dient.

Via/Ma

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