DE3118999A1 - Bestimmungsmethode fuer vitamin b(pfeil abwaerts)1(pfeil abwaerts)(pfeil abwaerts)2(pfeil abwaerts) - Google Patents

Description

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Dipi.-Jng. feiner FJVSeyer-Roxlau .: —/. ■.-.:— .- . ■ μ ,

München 80 : . ": ' : : * ": - :* ; : ' ^'3/

Uiclle-Grahn-Str. 22, Tel, (089) 472947 .:."-- -- ..."^ "--ί :.

F.Hoffmann-La Roche & Co.Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

und

The Ideal/Wilson Medical Center, 33 Harrison Street, Johnson City, Broome County, USA

RAN 4093/55

Bestimmungsmethodo für Vitamin B,₂

■^5 Frühe Verfahren zur Bestimmung von Vitamin B._? (ebenfalls als Cobalamin oder Cyanocobalamin bezeichnet) bedienten sich Bakterienspezies, wie Euglena gracius oder Lactobacillus leichmannie, welchen die innerliche Fähigkeit zur Synthese von Vitamin B₁₉ fehlt. Nach diesen mikrobiologischen Methoden werden die Vitamin B.„-Spiegel in einer Plasmaprobe eines Menschen bestimmt, wobei das Wachstum der Vitamin B₁„-sensitiven Organismen in einem Vitamin B₁ -freiem Medium bestimmt wird, zu welchem eine bekannte Menge eines Plasmaprobenextraktes zugegeben wird. Da das Wachstum der Vitamin B₁„-sensitiven Organismen - innerhalb gewisser Grenzen - proportional zur Vitamin B₁„-Konzentration im Medium ist, war es möglich, durch Messen geeigneter Wachstumsparameter, wie optische Dichte der Testlösung, nach Inkubation während einer bestimmten Zeit und bei einer bestimmten Temperatur unter Vergleich dieses Parameters mit Werten, die man mit Hilfe desselben Tests mit Proben enthaltend verschiedene, bekannte Konzentrationen an Vitamin B««, die Konzentration des Vitamin B.„ in Plasmaprobenextrakt zu bestimmen.

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Klt/6.5.1981

»j ι ι

Diese mikrobiologische Bestimmung, obwohl sie selektiv und sensitiv ist, ist schwierig in der Durchführung, indem sie sterile Techniken und dadurch hoch qualifizierte Techniker verlangt. Darüber hinaus ist es schwierig, Kolonien der benötigten Vitamin B₁„-sensitiven Mikroorganismen aufrechtzuerhalten. Im weitern sind die Testergebnisse erst nach einigen Tagen erhältlich und zudem kann der Test bei Patienten nicht durchgeführt werden, die Antibiotika oder andere Arzneimittel eingenommen haben. Nach der Entwicklung der Radiorezeptorbestimmung wurden demnach die mikrobiologischen Methoden gestoppt und man wechselte zur bequemeren Bestimmungsmethode.

Die Radiorezeptorbestimmung verwendet die kompetitive Bindungsinhibition durch Vitamin B_{1 2}/ das in der Plasmaprobe eines Patienten enthalten ist, zur Bindung bekannter Konzentrationen eines.radioaktiv markierten Vitamin B₁₉-

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Derivates, d.h. Co-Vitamin B₁„, zu den Rezeptorstellen an einem Intrinsik-Faktor (IF)-Präparat. Die Intrinsik-Faktorpräparate wurden hergestellt aus den Mägen höherer Säugetiere, vorwiegend Schweine. Diese Präparate waren in dem Sinne unrein, dass sie mit erheblichen, wenn nicht sogar grösseren Mengen von R-Proteinen verunreinigt waren. Verschieden vom Intrinsink-Faktor, welcher Vitamin B₁₇ in einer hoch selektiven Art bindet, haben die R-Proteine eine nicht spezifische Bindungscharakteristik und binden an die natürlichen Analogen von Vitamin B..-, welche dem Vitamin B₁P strukturell sehr verwandt aber biologisch inaktiv sind.

Von dieser Verunreinigung des Intrinsink-Faktors mit R-Proteinen wurde nicht angenommen, dass sie die Bestimmungs methode beeinflusst, da bekannt war, dass die natürlichen Analogen von Vitamin B₁₂ normalerweise im menschlichen Darm · vorhanden sind und man nicht glaubte, dass diese absorbiert und im Blutstrom und Gewebe vorhanden seien. Demgegenüber wurde in einer Arbeit von Kolhouse et al., in The New England' Journal of Medicine, Vol. 299, No. 15, Seiten 785-789 "(12. Oktober 1978) gezeigt, dass solche biologisch in-

BAD JORIGINAL

aktiven Analogen von Vitamin B₁^ in der Tat natürlich im menschlichen Blutstrom existieren. Diese Analogen wurden durch die kommerziell erhältlichen Radioligandverfahren für Vitamin B₁₉ als wahres Cobalamin gemessen, und es wurde angenommen, dass dies der Grund für beobachtete Diskrepanzen sei, wonach Vitamin B._ Serumwerte gemäss Radioligandverfahren wesentlich höher waren als diejenigen, die mit mikrobiologischen Verfahren gemessen wurden.

Die klinischen Implikationen dieser Diskrepanzen wurden von Cooper and Whitehead in derselben Nummer of The New England Journal of Medicine, Seiten 816-818 in einem Artikel mit dem Titel "Evidence That Some Patients With Pernicious Anemia Are Not Recognized By Radiodilution Assay For Cobalamin In Serum" beobachtet. Nachdem diese beiden Arbeiten erschienen waren, setzte bei den Herstellern der kommerziell erhältlichen Vitamin B.„-Radioligandverfahren intensive Arbeit ein, ihre Kits derart zu modifizieren, um diese schwerwiegenden Probleme zu lösen. Wie von Kubasik et al. in Clin. Chem. 2§/5 , 598 (1980) beschrieben, gab es zwei Hauptwege, um dieses Ziel zu erreichen:

1. Unwirksammachen der R-Proiein-Bindungsstellen: Dies kann bewirkt werden durch Ueberfluten des IP-R-Protein-Kombinationsbinder mit einem Analogen wie Cobinamid. Cobinamid bindet nicht an IF, bindet aber an die R-Proteine. Falls Cobinamid in grossem Uoberschuss ( > als 100 mal) zugesetzt wird, unterdrückt es alle nicht-spezifischen Cobalamin-Bindungsstellen.

2. Reinigen des IF; IF-Konzentrate können durch ausejedehnte Behandlung mit proteoIytischen Enzymen, wie Trypsin oder Chymotrypsin oder bnidrn oder durch Af finitätschrom.itographii:=· gereinigt wordon.

BAD ORIGINAL

Eine Evaluation dieser beiden Wege durch die Autoren führte zum Schluss, dass - obwohl der "Cobinamid"-blockierte Binder verwendet werden kann - reines oder gereinigtes IF aus analytischen 'Gründen der bessere Binder sei. So würden alle möglichen nicht-spezifischen Kffekte bedingt durch andere BLnder eliminiert werden.

Die Kriterien, welche zur Etablierung der Reinheit von Intrinsik-Faktor-Präparaten verwendet wurden waren die folgenden:

1. Die Bindung von bioaktivem Cobalamin wird vollständig inhibiert, wenn aktiver IF zuerst mit Antikörper gegen IF inkubiert wird.

2. Vergleich der liin<k;r in Vorfahren, die bei sauren und basischem pH in Gec/enwart von CobaJ amin-Analogen durchgeführt werden. Ein gereinigtes IF-Präparat zeigt sehr geringes Bindungsvermögen für Cobalamin bei saurem pH und die Bindung bei basischem pH wird durch die Gegenwart von Cobalamin-Analogen wenig beeinflusst.

3. Gereinigtes IF misst "Cobinamid" (Cyanohydroxycobinamid) nicht und dies sogar bei extrem hohen Konzentrationen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Radioligandverfahren für Vitamin Β.« , welches dadurch gekennzeichnet ist, dass als Instrinsik-Faktor-Präparat ein Kochsalzlösungs-Extrakt von Maus- oder Rattenmägen verwendet wird. Solche Intrinsik-Faktoren von Mäusen oder Ratten sind - im Gegensatz zu Intrinsik-Faktor-Präparaten von höheren Säugetieren, wie Schweinen - im wesentlichen frei von R-Proteinen. Die Verwendung von Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor-Präparaten in einem Radioligandverfahren für Vitamin B₁₉ verdeckt Cobalamin-Mängel in der zu bestimmenden Person nicht, da diese Intrinsik-Faktor-Präparate spezifisch für wahres Cobalamin sind. Im weitern wird durch

BAD ORIGINAL

die Verwendung von Maus oder Ratten Intrinsik-Faktor die Notwendigkeit der uneffizienten, zeitaufwendigen und teuren Reinigung/ z.B. durch Affinitätschromatographie, für Intrinsik-Faktor-Präparate anderer Säugetiere zur Entfernung von R-Proteinen vermieden. Nach einem weitern Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass die grösste Effizienz der Bestimmungsmethode erhalten wird, wenn die Extraktion der Serun.probe mit Cyanidpuffer bei pH 4,5 erfolgt und wenn das Rad.oligandverfahren bei pH 7,2 durchgeführt wird.

Maus- und Ratten-Intrinsik-Faktor-Präparate zeigen die Eigenschaften von reinem Intrinsik-Faktor ohne das Reinigungsverfahren notwendig sind. So werden die Intrinsik-Faktor-Präparate, welche gemass vorliegender Erfindung verwendet werden, bei der Bindung an bioaktives Cobalamin zu mehr als 98% inhibiert, wenn sie vorher mit Antikörper zu Intrinsik-Faktor inkubiert worden sind. Die Zugabe von 10 000 pg Cobinamid zu einer Probe führt nicht zu einer beobachtbaren Inhibition der Bindung von wahrem Cobalamin, wenn beim Verfahren Ratten- oder Maus-Intrinsik-Faktor verwendet wird. Schliesslich erhält man durch Gelchromatographie von Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor, welcher mit radioaktivwmarkiertem B.„ markiert ist, einen einzigen scharfen Peak entsprechend einem offensichtlichen Molekulargewicht von ungefähr 55 000. Dieser Peak wird durch Vorinkubation mit Antikörper gegen Intrinsik-Faktor meistens vollständig inhibiert.

Die Maus- und Ratten-Intrinsik-Fatkor-Präparate können von Maus- oder Rattenmägen nach an sich bekannten Verfahren erhalten werden. So z.B. können Maus- oder Rattenmägen in kalter Kochsalzlösung homogenisiert werden, und der Ueberstand kann durch Zentrifugation oder Filtration von der überbleibenden Gewebemasse entfernt werden. Es ist erwünscht, dass der erhaltene Kochsalzlösungs-Extrakt mit wässriger, verdünnter Base, wie Alkalihydroxyd, vorzugsweise Natriumhydroxyd, auf pH 10 qjestellt wird, um all-

BAD ORIGiNAL

- V

fälliges Pepsin, welches im Magen vorhanden und in den Extrakt übergegangen ist, zu inaktivieren. Pepsin kann zur Verringerung des Intrinsik-Faktors führen, wenn es nicht durch Denaturierung in basischer Lösung inaktiviert wird.

Eine repräsentative Herstellung von Maus-Intrinsik-Faktor ist anschliessend beschrieben:

1 Teil (150 g) von sauberen, kleingeschnittenen Mäusemägen wird mit 4 Teilen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,2) während 5 Minuten bei 4° in einem Homogenisator homogenisiert. Das Homogenisat wird während 30 Minuten bei 4°C und 30 000 g zentrifugiert. Der Ueberstand wird dekantiert und mit IN Natriumhydroxyd auf pH 10 gestellt. Nach 20-minütigem Rühren wird der pH mit IN SaIzsäure auf pH 5,0 gestellt. Zur Entfernung von Prezipitat wird erneut während 3 0 Minuten bei 30 000 g zentrifugiert. Der Ueberstand wird mit IN Natriumhydroxyd auf pH 7,2 gestellt.

Der Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor kann bei jedem bekannten Standard-Radioligandverfahren für Vitamin B₁„ verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Vitamin B₁„-Bestimmung mit Maus-Intrinsik-Faktor A. Extraktion von endogenem Cobalamin aus Serum:

1. 0,5 ml Serum werden in ein 12 ml-"red-top"-Vacutainerrohrchen pipettiert.

2. Nach Zugabe von 4,5 ml Cyanidpuffer wird gut gemischt.

3. Das Röhrchen wird mit dem Originalstopfen verschlossen, und der Stopfen wird mit einer Blutentnahmenadel durchstos.'ien. Aus Lüftungszwcckon wird die Nadel im Stopfen belassen.

4. Das Röhrchen wird während 30 Minuten in ein Wasserbad gestellt.

BAD ORIGINAL

5. Das Röhrchen wird durch Einstellen in ein Eis/-Wasserbad gekühlt.

6. ils wird rasch in einem Vortex-Mischer gemischt. Vollständiges Mischen ist entscheidend.

7. Die Nadel wird entfernt und das Röhrchen während 20 Minuten bei 15 000 χ G zentrifugiert.

8. Die entsprechenden Kontrollseren werden nach einer ähnlichen Methode extrahiert.

B₁ Wiederauffindungskontrolle des Extraktionsverfahrens:

1. 0,5 ml Serum werden in ein 12 ml "red-top"-Vacutainerröhrchen pipettiert.

2. 100 ul ⁵⁷Co-Cyanocobalamin (ungefähr 14 000 CPM) werden zugeführt.

3. 4,4 ml Cyanidpuffer werden zugegeben und es wird gut gemischt.

4. Es wird wie in den Schritten 3 bis 7 gemäss Extrak tionsverfahren vorgegangen.

5. Der Ueberstand wird in entsprechend markierte Vacutainerröhrchen gegeben. Es ist wichtig, dass der Niederschlag und der Ueberstand in identischen Röhrchen sind. Beide Röhrchen, das eine enthaltend den Niederschlag und das andere enthaltend den Ueberstand werden aufbewährt.

6. Eine Wiederauffindungskontrolle ist ebenfalls für die Kontroliseren erforderlich.

C. Ligandverfahren

1. Es werden im Doppel Standardröhrchen durch Mischen von Arbeitsstandard und Puffer wie folgt hergestellt:

ORIGINAL

	10	Standarfpuffer	3118999
	1100 μΐ	Arbeitsstandard
ndard	1100	0 μΐ
O	1100	5
5	1075	10
10	1050	25
25	1025	50
50	1000	75
75	950	100
100	1100	150
150	1100	0
"NSB"	0
"Total"

2. 1,0 ml des klaren Ueberstandes des Serumextraktes wird in jedes der 12 χ 75 ml Polystyrolröhrchen gegeben. 3.Zu jedem Extrakt werden 100 μΐ Phosphathydroxydlösung gegeben.

4. Zu allen Röhrchen werden 100 μΐ Co-B-12 gegeben.

5. Der Inhalt der Röhrchen wird gründlich gemischt.

6. Zu allen Röhrchen mit Ausnahme von "nicht-spezi-

fische Bindung" (NSB) und "Total" werden 200 μΐ von Maus-IF (1:1000 in 0,5 ml Phosphatpuffer vom pH 7,2). Von ¹¹NSB" und "Total" werden 200 bzw. 400 ml 0,5 ml Phosphatpuffer vom pH 7,2 gegeben.

7. Es wird im Vortex-Mischer gemischt.

8. Die Röhrchen werden während 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen.

9. Zu allen Röhrchen mit Ausnahme von "Total" werden 200 μΐ Albumin-beschichtete Aktivkohle gegeben. Während des Pipettierens muss die Aktivkohle konstant gemischt werden.

10. Jedes Röhrchen wird erneut kurz im Vortex-Mischer gemischt.

11. Die Röhrchen werden während 20 Minuten bei 1500 χ G zentrifugiert.

12. Die Ueberstände werden in geeignet marktierte Röhrchen gegeben und in einen Gammazähler gebracht.

a. "Total"

b. ¹¹NSB"

c. ¹O¹ St.indard

BAD ORIGINAL

■·'■ - 3118993 - sr"-

Reaqentien:

Cyanidpuffer 0,2 ml pH 4,6
CH₃COO Na .3H₂O
B. CH₃COOH 11,5 gm/1

A. CH₃COO Na .3H₂O 27,2 gm/1

480 ml A und 520 ml B werden gemischt. Falls nötig wird der pH auf 4,6 gestellt. 1 ml 0,4% KCN (40 mg/10 cc H„O) werden zugefügt.

Acetatpuffer:

0,1 m pH 4,6 werden mit Phosphat/Hydroxydlösung auf pH 7,2 gestellt.

■J5 Phosphatpuffer 0,5 m pH 7,2:

A. Na₃HPO 35,5 gm/500 cc

B. Na₂HPO₄-H₂O 34,5 gm/500 cc

Der pH wird auf 7,2 gestellt.

Phosphat/Hydroxydpuffer:

3,8 g NaOH werden in 100 cc Puffer vom pH 7,2 gelöst. ml Acetat-CN-Extraktionspuffer werden mit 1 ml PO./OH auf pH 7-7,2 titriert und der Extraktionspuffer wird mit Natriumhydroxyd oder Phosphatpuffer falls nötig eingestellt.

Radioaktives B₁₉: Amersham Searle (10 uCo/ml) 75 μΐ werden in 10 cc verdünnt und mit Phosphatpuffer, 0,5 m auf pH 7,2 gestellt.

Standard Vitamin B_1?:

Vitamin B₁₇ wurde von Parke-Davis (Betalin) erhalten (100 ug Cyanocobalamin pro ml):

Man verdünnt 1:1000 zu niner Konzentration von 0,1 ug/ ml in 0,5M Phosphatpuffer von pH 7,2.

Durch Verdünnen der obiqen Lösung auf 1:1000 in 0,5 m Phosphatpuffer vom pH 7,2 stellt man Arbeitsstandard

(1 ng/ml) her.

Albuminpuffer:

2 ml 22%iges Rinderaibumm werden mit 15 ml 0,5 m
Phosphatpuffer vom pH 7,2 verdünnt.

Maus-Intrinsik-Faktor:

Mausemagenextrakt wird mit 0,5 m Phosphat-Albumin-Puffer vom pH 7,2 auf 1:1000 verdünnt.

Handberechnungen:

"15 1. Prozentsatz-Bindung = cpm Ueberstand (e) - cpm NSB χ 100

cpm Total

2. Prozent der Bindung wird gegen pg B₁₉ pro Röhrchen auf Millimeterpapier aufgetragen, das Unbekannte gegen die

Standardkurve abgelesen und mit 10 multipliziert = pg/ml
Serum.

3. Das Wiederauffinden wird wie folgt berechnet:

Wiederauffindung = cpm Ueberstand

cpm Niederschlag (f) + cmp Ueberstand (g)

Das obige Verfahren verwendet spezifisch Maus-Intrinsik-Faktor, doch kann ein analoges Vorgehen verwendet werden für Ratten-Intrinsik-Faktor oder für einen Intrinsik-Faktor von anderen Säugetieren, deren Magen frei von endogenen R-Proteinen ist. In ähnlicher Weise ist die oben erwähnte Bestimmung mit Co durchgeführt worden, doch ist es möglich, auch ein anderes geeignetes markiertes Cyano-

125
cobalamin, wie z.B. J-markiertes Cyanocobalamin in einer an sich bekannten Wc-ise 7.11 verwenden.

BAD

Die Affinität des Maus-Intrinsik-Faktors für Cobalamj_n wurde bestimmt, indem man 200 μΐ der Primärverdünnung des Mäusemagenextraktes ins Reaktionsröhrchen gab, wobei gefunden wurde, dass diese Primärverdünnung in der Lage war, 50% einer Spur des radioaktiv markierten Liganden zu binden. Diese Menge von Mäusemagenextrakt (MSE) wurde für alle anschliessenden Experimente verwendet. Inkubation vor-

57
schiedenor Mengen von Co-Cobalamin mit einer konstanten Menge von Intrinsik-Faktor erlaubt Bestimmungen der Affir.itätskonstante (K) bei pH 7,2 und beträgt 1,21 χ 10" Liter pro Mol.

Die Titrationsdaten wurden bestätigt durch Reaktion einer bekannten Menge von Intrinsik-Faktor, 200 μΐ der

-|5 Primärverdünnung mit verschiedenen Konzentrationen von

Co-Cyanocobalamin mit dem Zweck, die optimale Menge an Radioligand zu bestimmen, welche im Bestimmungsverfahren verwendet werden soll. 100 ml Arbeitslösung enthaltend 45 pg radioaktives Cyanocobalamin wurden als optimal bestimmt. Mit dem im obenerwähnten Verfahren verwendeten Materialien ergibt diese Menge an Co-Cyanocobalamin ungefähr 14 000 cpm in dem "Total"-Röhrchen.

Standardkurven für das Inhibitionsverfahren zur Verwendung in der Bestimmung von Vitamin B₁„ in klinischen Proben können vom oben beschriebenen Verfahren abweichen. Die Konzentrationen vom Standard, die zur Schaffung von Standardkurven verwendet werden, sollten mit den Mengen an Vitamin B₁„ korrespondieren, die üblicherweise in klinischen Proben gefunden werden. Die endgültigen Reaktionsbedingungen sind: Intrinsik-Faktor, 200 μΐ Primärverdünnung, radioaktiver Ligand, 100 μΐ Arbeitsverdünnung, 30 Minuten Zeil;, pH 7,2 und nicht radioaktiver Standard, 50-150 pg pro Röhrchen oder das Aequivalente von 50 bis 1500 pg von Vitamin B₁₂ pro ml Serum.

AO i'l^ BAD ORIGINAL

Dass Intrinsik-Faktor (frei von R-Proteinen ) aus Extrakten von Mäusemäcjen gewonnen werden kann, wird durch verschiedene experimentelle Beobachtungen bestätigt. Wenn radioaktiv markiertes Cobalamin mit MSE unter den oben erwähnten Bedingungen inkubiert wird und das Gemisch in einer mit Sephadex G-150 gepackten Kolonne getrennt wird, eluiert der radioaktive Komplex als eine einzige Linie mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 54 900. In derselben Kolonne eluiert der Komplex Radiocobalamin-R-Proteine (menschlicher Speichel oder Konzentrat von Schweinemagenextrakt) mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von 101 000.

Die Bildung des Komplexes Radiocobalamin und Mäuse- -|5 Intrinsik-Faktor wird durch Vorinkubation des MSE mit Humananti-Intrinsik-Faktor-Antikörper vollständig inhibiert. Die Daten werden in Tabelle 1 wiedergegeben:

Tabelle 1

Inhibition von Mäuse-Intrinsik-Faktor -Co-Cobalamin Reaktion durch menschliche Anti-Intrinsik-Faktor-Äntikö'rper

Intrinsik-Faktor- Menschlicher

Zubereitung Speichel

Total Cobalamin im Reaktionsgemisch (ng) 15 15

(a) (b) (a) (b) Cobalamin gebunden durch

Binder allein (ng) 8,1 8,0 5,2 5,3

Cobalamin gebunden nach

Vorinkubation mit Anti- 0,6 0,8 5,8 6,0

körper (ng) 0,5 0,7 6,2 6,2

Cobalamin gebunden durch 0,8 0,6 Antiserum allein (ng) 0,6 0,6

Inhibition durch Antiserum (a) = 9 7,5%

98,8%

Antiserum (b) = 98,8%

97,5%

" 4S

Wenn 15 ng Radiocoba Larnin mit der entsprechenden Menge von MSE inkubiert werden, werden 8,1 ng des Liganden gebunden. Vorinkubation mit zwei verschiedenen Antikörpern bewirkt eine im wesentlichen vollständige Inhibition der Bindung. Im Gegensatz dazu zeigt Vorinkubation von menschlichem Speichel mit Anti-Intrinsik-Faktor-Antikörper dass die Bildung des Komplexes R-Proteine -Co-Cobalamir durch den Antikörper nicht inhibiert wird.

Wenn das mit Antikörper vorinkubierte Gemisch Intrinsik-Faktor/Radiocobalamin wie vorher beschrieben durch eine Sephadex G-150-Kolonne gegeben wird, zeigt sich dass die Linie beim offensichtlichen Molekulargewicht von 54 900 vollständig verschwunden ist.

Cobinamid ist wertvoll als ein Modell für die biologisch inaktiven Vitamin B.„-Analoge. Die Fähigkeit der Analogen die Bindung von echtem B₁₇ an Maus-Intrinsik-Faktor zu inhibieren, kann durch Zugabe verschiedener Mengen von Cobinamid zu den Reaktionsröhrchen enthaltend MSE oder menschlichem Speichel und Co-Cobalamin studie-t werden. Die Reaktionsbedingungen sind wie oben erwähnt. Die Zahlen zeigen, dass 643 738 Pjcogramm an Cobinamid notwendig sind, um dasselbe Ausmass an Inhibition (50%) zu erreichen wie 60 Picogramm Cobalamin, was eine berechnete Kreuzreaktion von weniger als 0,1 bei pH 7,2 anzeigt. Wenn die Experimente bei pH 4,5 durchgeführt werden, sind die Zahlen 49,1 pg/ml Cobalamin und 7 355 pg/ml Cobinamid für eine berechnete Kreuzreaktion von 0,66%.

Wenn anstelle von MSE menschlicher Speichel im gleichen Experiment verwendet wird, sind die Ergebnisse in scharfem Gegensatz. In einem solchen Experiment bewirken 112 pg Cobinamid dasselbe Ausmass an Inhibition (50%) wie 58,9 pg Vitamin B.„ oder eine berechnete Kreuzreaktion von 52,6%. Dass die Inhibition kompotitiv ist, kann aus dem ähnlich'.-n und nahezu parallel verlaufenden Anstiegen der Inhibitionskurven geschlossen werden, speziell im Experiment mit men-

BAD ORIGINAL

schlichem Speichel.

Weitere Daten aus denen hervorgeht, dass Cobinamid nicht in der Lage ist, die Reaktion von Maus-Intrinsik-Faktor mit Cobalamin zu hindern, geht aas Tabelle 2 hervor, wo die Resultate gezeigt werden, wenn 10 000 pg Cobinamid zu einem Kontrollröhrchen gegeben werden, mit dem das ganze Verfahren durchgeführt wird.

:0 Tabelle 2

Kreuzreaktion von Cobinamid mit Cobalamid im Ligand-Maus-Intrinsik-Faktor-Verfahren

Auffindung von 10 000 pg von Cobinamid als Cobalamin

pq/ml

9 5 0

10 5

24

24

Durchschnittliches Auffinden 8,5 pg/ml Kreuzreaktion 0,085%

Die verbesserte Bestimmungsmethode gemäss vorliegender Erfindung ist von genügender Empfindlichkeit, dass 5 pg von Cobalamin in Reaktionsröhrchen von 0 mit statistischer Signifikanz unterschieden werden können, was einer Grenze der Sensibilität für die klinische Bestimmung von 50 pg/ml entspricht. Sensitivitatsdaten dieser Bestimmung sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

	Tag	B/Bö %
15
	1	98
	2	99
	4	101
20	7	98
	8	99
	9	97
	10	104
	11	101
25	15	95

3118993

'MabelIe

Sensitivität des Maus-Intrinsik-Faktor-Ligandverfahren für Serum-Cobalamin

Gebundene "Counts" pro Minute

0	50	pg/ml
6514	5657
6130	5715.
6274	5791
6252	5827

Durchschnitt 6307 5

t = 6,128 ρ = < 0.01

Diese Bestimmung wurde wiederholt durchgeführt, um die Abweichungen von Bestimmung zu Bestimmung zu ermitteln. Die Resultate dieser Experimente sind in Tabelle 4 zusammengefasst, 20

Tabelle

	Reproduzierbarkeit	des Maus-Intrinsik-Faktor-Ligand-	Probe Cobalamin, pg/ml	249,7
	verfahren bei Serum-Cobalamin	11	243,3
Probe	Cobalamin, pg/ml	12	266,6
1	252,4	13	246,6
2	263,1	14	263,9
3	255,2	15	241,0
4	241,0	16	241,6
5	263,5	17	256,0
6	289,3	18	247,7
7	263,4	19	248,0
8	272,3	20
9	271,8	254,26
10	242,9	10,68
	Durchschnitt	4,2%
	Standardabweichung
	Variantskoeffizient

AB

Tag-zu-Tag-Abweichungen und so die Genauigkeit des Tests' wird durch die in Tabelle 5 angegebenen Zahlen reflektiert.

Tabelle 5

Tag-zu-Tag-Reproduktion des Maus-Intrinsik-Faktor-Ligandverfahrens für Serum-CobalamLn*

Probe 1

Extraktion Wiederauf-

Resultate in pg/ml

Probe 2

Extraktion Resultate Wiederauf- in pg/ml

	0	findung %	4 20	Probe	findung %	709
1		86	505	Probe	86	696
2		86	435	86	677
5 3	86	428	86	648
4	87		88	686 + 24
	86,2		86,4	Durchschnitts
	Durchschn.		Durchschn.	resultat
	Wiederauf		Wiederauf
findung		findung
	444 + 34	1 = 7,7%
Durchschnitts	2 = 3,5%
resultat
Variantskoeffizient

* Alle Extraktionen bei 4,6 und alle Bestimmungen bei pH 7,2

Das Wiederauffinden von Cobalamin, welches zu natürlichen Serumproben gegeben wurde, nach der erfindungsgemassen Bestimmungsmethode zeigt die Genaugikeit, welche durch diese Bestimmungsmethode erreicht wird. Die Resultate solcher Experimente sind in Tabelle 6 angegeben.

3118939

	Mau	...»	~ - i/r -	Cobalamin,	ben	Endogenes Cobalaiü	in	welches zu normalem	93
			1%	menschlicham Serum gegeben wurde					103
	Wie		Tabelle) (			Theoretisch	Gefunden	2 52 pg/ml	95
	i-lntrinsik-Fakt"		Hinzu		352	345	Wi ed er au ffi ndung
	PH 7,		lege		452	458	in %	97
	lerauffLndung von		10 100		652	632
5	r-Cobal an in-Verf ahren	200	Durchschnitt.
	2	400	Wiederauffinden

■ EH 4,5

Endogenes CobaLamin 3 82 pg/ml

100 482 492 110

200 582 569 94

400 782 759 94

Durchschnitt.

Wiederauffinden 9 9,33

Eir Testkit, welches für d.is verbesserte Radioligan lverfahren gemäss vorliegander Erf; ndung verwendet werden kann, erthält einzelne Fläschchen enthaltene genügende Mengen von Reagentien. Solch ein ^estkit enthält:

1. Ein Fläschchen mit radical·tiv markierter Cyanocobalamin-Lösung, vorzugsweise C'o-Cyanocobalamin. 2. Ein Fläschchen mit Maus- cder Ratten-Intrinsik-Faktor in gepui ferter Lösung.

3. Je ein Fläschchen mit Cob;lamin-Stardarc zwische ι 0 und 150 pg, "orzugsweise je ein Fläschchen mit 0, 5, 1), 25, 50, 75, 100 und 150 pg.

SoJ :h ein Testk.it kann woiheihin ein ocier mehrere Flasche^'in mit den folgenden Reagan I ien enthalten:

bad original

(a) Cyanidpuffer pH 4,6

(b) Acetatpuffer pH 7,2

(c) Phosphatpuffer pH 7,2

(d) Phosphat/Hydroxydpuffer

(e) Albumin-be;schichteto Aktivkohle,

Claims (8)

Patentansprüche

1.J Radioligandverfahren zur Bestimmung von Vitamin L -, bei dem eine Serumprobe oder eine Probe von Gewebeextrakt mit einer bekannten Menge von radioaktiv markiertem Vitamin B₁„ und einem Intrinsik-Faktor-Präparat gemischt wird, das durch den Intrinsik-Faktor gebundene radioaktiv markierte Vitamin B₁ „ von uncjebundenem radioaktiv markiertem Vitamin B₁ „ getrennt wird, die Menge an radioaktiv markiertem Vitamin B₁₂ in der gebundenen oder in der ungebundenem Form bestimmt und mit einer Standardkurve verglichen wird, die mit Proben von bekannten, unterschiedlichen Mengen von Vitamin B₁₇ erhalten wird, wobei die Menge an Vitamin B₁₉ in der Probe bestimmt werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass als Intrinsik-Faktor ein Präparat verwendet wird, das Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor enthält.

2. Radioligandverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Maus-Intrinsik-Faktor verwendet wird.

3. Radioligandverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Serumextraktprobe durch Extraktion bei pH 4,5 erhalten wird und dass die Bestimmung bei pH 7,2 durchgeführt wird.

4. Radioligandverfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktiv markierte Vitamin B₁₇ Co-Cyanocobalamin ist.

5. Testkit zur Durchführung eines Radioligandverfahrens für Viamin B₁₃, welches einzelne Fläschchen enthaltend eine Lösung von radioaktiv markiertem Vitamin B₁~, Lösungen von Vitamin B₁₂~Standard und von Intrinsik-Faktor-Präparat enthält, dadurch gekennzeichnet, dass das Intrinsik-Faktor-Präparat Maus- oder Ratten-Intrinsik-Faktor ist.

BAQ ORIGINAL

6. Testkit gemäss Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Intrinsik-Faktor-Präparat Maus-Intrinsik-Faktor ist.

7. Testkit gemäss Anspruch 5, enthaltend zusätzlich ein Fläschchen mit -Cyanidextraktionspuf fer vom pH 4,5 und ein Fläschchen mit Phosphatpuffer vom pH 7,2.

8. Radioligandverfhren für Vitamin B₁₂, bei dem eine Serum- oder Gewebe-Extraktprobe mit einer bekannten Menge von radioaktiv markiertem Vitamin B₁₂ und einem Intrinsik-Faktor-Präparat gemischt wird, das durch den Intrinsik-Faktor gebundene radioaktiv markierte Vitamin B₁₂ vom ungebundenen radioaktiv markiertem Vitamin B₁₂ getrennt wird, die Menge von radioaktiv markiertem B₁₂ in der gebundenen oder ungebundenen Form bestimmt und mit einer Standardkurve verglichen wird, welche mit bekannten Proben enthaltend verschiedene Mengen an Vitamin B₁₂ erhalten wurde, mit der die Menge an Vitamin B₁₂ in der Probe bestimmt werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass als Intrinsik-Faktor-Präparat ein Extrakt von Säugetiergewebe verwendet wird, welches von R-Proteinen frei ist.

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