DE2930421A1 - Nachweis bzw. bestimmung von digoxin u.a. digitaloiden durch biolumineszenz und inhibierung bzw. inaktivierung der na hoch + , k hoch + -atpase - Google Patents

Nachweis bzw. bestimmung von digoxin u.a. digitaloiden durch biolumineszenz und inhibierung bzw. inaktivierung der na hoch + , k hoch + -atpase

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DE2930421A1 DE19792930421 DE2930421A DE2930421A1 DE 2930421 A1 DE2930421 A1 DE 2930421A1 DE 19792930421 DE19792930421 DE 19792930421 DE 2930421 A DE2930421 A DE 2930421A DE 2930421 A1 DE2930421 A1 DE 2930421A1
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Description

Nachweis bzw. Bestimmung von Digoxin und anderen Digitaloiden durch Biolumineszenz und Inhibierung bzw. Inaktivierung der
Na+, K+-ATPase
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Nachweis bzw. der Bestimmung von Digoxin in Serum, sie betrifft insbesondere ein Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Digoxin und anderen Digitaloiden, das auf ihrer inhibierenden bzw. inaktivierenden Wirkung
Enzym basiert.
renden Wirkung auf das gereinigte Na , K -spezifische ATPase-
Digoxin ist ein Derivat der Digitaloide und es wird in der Regel für die Behandlung von herzkranken Patienten verwendet. Die Wirkung von Digoxin und anderen Digitaloiden, beispielsweise Arzneimitteln, die aus der Pflanze Digitalis vulgaris gewonnen werden,beruht auf ihrer Inhibierung bzw. Hemmung der Aktivität des Natrium-Kalium-spezifischen ATPase-Enzyms. Dieses ATPase-Enzym betätigt die sogenannte Natrium-Kalium-Pumpe, welche die Zellwandpermeabilität der Muskelzellen steuert und an der Kontraktion der Muskelfasern teilnimmt. In der Wand der Blutgefäße befinden sich glatte Muskeln, die durch die ATPase betätigt
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werden. Es wird angenommen, daß die Wirkung der Digitaloid-Arzneimittel auf der reversiblen Inaktivierung der Natrium-Kalium-spezifischen ATPase beruht. Die Inhibierung bzw. Inaktivierung dieses Enzyms setzt die Kontraktion der Coronararterie herab und vermindert somit die Möglichkeit der Blockierung dieser lebenswichtigen Arterie, die dem Herzmuskel sauerstoff reiches Blut zuführt, durch Thromboembolismus.
Digoxin ist derzeit das am häufigsten angewendete Arzneimittel zur Verhinderung der Thrombose. Bei diesem Arzneimittel handelt es sich um ein Herzglycosid. Es wurde bisher in einer genau kontrollierten Dosis angewendet, da sein Spiegel (therapeutischer Dosierungsbereich) sehr eng ist, d.h. die minimal wirksame Behandlungskonzentration und die toxische Konzentration liegen nahe beieinander. Die wirksame Behandlungsdosis variiert von 0,4 bis
toxisch.
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0,4 bis 2 ng/cm und Konzentrationen von mehr als 2 ng/cm sind
Die Digoxinkonzentration in einem Patientenserum wird derzeit bestimmt unter Anwendung des sogenannten Enzym-Immunoassays (Enzym-Immunotests). In diesem Immunoassay werden zwei Meßprinzipien angewendet: die Messung eines radioaktiven Tracers in dem sogenannten Radioimmunoassay (RIA) und die Messung der Enzymaktivität in dem sogenannten Enzym-Immunoassay (EIA). Bei diesen Verfahren wird ein spezifischer Antikörper, der in dem Blut eines Versuchstieres, wie z.B. eines Kaninchens oder Schafs, gebildet worden ist, entweder durch ein Radioisotop, wie Jod-125 ( J) oder Tritium ( H) in dem RIA oder mit einem Enzym, wie z.B. Phosphatase, Dehydrogenase, Peroxidase, das ein Substrat
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bilden kann, das mit chromogenen Reagentien einen gefärbten Komplex bildet, markiert. Die Prinzipien des Immunoassay sind an sich bekannt und ihre Durchführung ist die folgende:
Ia) Ein Digoxin (Antigen) enthaltendes Patientenserum wird mit dem markierten Antikörper gemischt und 2 bis 24 Stunden lang inkubiert, wobei während dieser Zeit das Antigen (Digoxin) in dem Serum mit dem zugesetzten Antikörper einen Komplex bildet;
b) der freie Antikörper, der nicht komplex an das Digoxin gebunden ist, wird abgetrennt, beispielsweise mittels mit Dextran überzogener Aktivkohle, oder der Antigen-Antikörper-Komplex wird beispielsweise mit Polyäthylenglykol ausgefällt;
c) der freie markierte Antikörper oder der markierte Antikörper in dem Komplex wird bestimmt durch Angabe der Digoxinkonzentration in der Probe. Der radioaktiv markierte Antikörper
125
wird mit einem γ-Zähler für J oder mit einem Flüssig-
3
szintillationszähler für H bestimmt und der durch ein Enzym markierte Antikörper wird mittels eines Spektrophotometers bestimmt oder visuell abgeschätzt an Hand der Farbintensität des gebildeten Substrat-Chromogens.
II) Konkurrenzbindungsassay
a) Der Antikörper wird an einer festen Oberfläche, beispielsweise Kunststoffküvetten oder Mikrotiterplatten, fixiert;
b) die Serumprobe mit Digoxin wird in den Behälter mit dem daran fixierten Antikörper eingebracht. Das Digoxin reagiert mit dem Antikörper während der 2- bis 24-stUndigen Inkubation unter Bildung eines Komplexes und ein Teil der Antikörper-
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moleküle bleibt übrig, weil sie im Überschuß vorliegen;
c) die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und der Probenbehälter wird gewaschen;
d) es wird markiertes Antigen (Digoxin) zugegeben und während der 2- bis 24-stUndigen Inkubation reagiert der markierte Antikörper mit dem nicht an Digoxin gebundenen Antikörper aus der Probe während der ersten Inkubation;
e) die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und der Probenbehälter wird gewaschen;
f) das markierte Antigen wird bestimmt und der Wert gibt die Menge des während der zweiten Inkubation gebundenen markierten Digoxins an. Der Digoxingehalt in der ursprünglichen Probe ist der folgende:
Proben-Digoxin = Antikörper-Moleküle - markierte Digoxin-Moleküle.
Ill) Sandwich-Verfahren
a) Der Antikörper wird an einem Probenbehälter (aus Kunststoff) fixiert;
b) es wird Probenserum zugegeben und 2 bis 24 Stunden lang inkubiert;
c) die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und der Behälter wird gewaschen, der Digoxin-Antikörper-Komplex und der fixierte Antikörper bleiben in dem Behälter zurück;
d) es wird markierter Antikörper zugegeben und während der 2-bis 24-stündigen Inkubation wird dieser Antikörper an das Digoxin in dem ersten Antikörper-Digoxin-Komplex gebunden;
e) die überstehende Flüssigkeit wird verworfen zur Eliminierung des freien (nicht komplex gebundenen) markierten Antikörpers, der Behälter wird gewaschen;
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f) der markierte Antikörper wird bestimmt und gibt die Digoxinmenge in der Probe an.
Bei jedem Verfahren wird eine Eichkurve mit abgestuften Digoxinmengen in dem Serum aufgestellt. Aus dieser Eichkurve wird die Digoxinkonzentration in dem Serum errechnet.
Immunoassay-Verfahren haben den Vorteil, daß sie empfindlich und spezifisch sind, wenn reine Antigen- und Antikörper-Reagentien verwendet werden. Diese Verfahren sind jedoch teuer, kompliziert und zeitraubend wegen der langen Inkubationen. Eine weitere Schwierigkeit, die bei dem RIA auftritt, ist die, daß radioaktive Tracer verwendet werden müssen, für deren Verwendung eine spezielle Erlaubnis erforderlich ist und die immer Sicherheitsprobleme und Probleme in bezug auf die Beseitigung des radiaktiven Abfalls mit sich bringen. Das Chromogenverfahren besitzt eine Marginal— Empfindlichkeit für den Digoxin-Test.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, diese Schwierigkeiten der Immunoassay-Verfahren zu überwinden durch Entwicklung eines neuen Verfahrens zur Bestimmung von Digoxin im Serum.
Erfindungsgemäß wird die Konzentration an Digoxin und anderen Digitaloiden bestimmt an Hand der Inhibierung bzw. Inaktivierung des gereinigten Na , K -spezifischen ATPase-Enzyms.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Verwendung der Natrium-Kalium-spezifischen ATPase (Adenosintriphosphatase) als
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Rezeptor für Digoxin. Digoxin inaktiviert dieses System, so daß es möglich ist, eine bekannte Menge ATPase dem Probenserum zuzusetzen und nach einer kurzen Inkubationszeit die Inhibierung bzw. Inaktivierung der Enzymaktivität zu bestimmen. Die Bestimmung der ATPase-Aktivität wird durchgeführt an Hand der Rate bzw. Geschwindigkeit, mit der die ATPase das zugesetzte ATP (Adenosintriphosphat) spaltet (zersetzt). Nach einer kurzen Inkubationszeit mit ATPase wird die ATP-Konzentration bestimmt unter Verwendung des empfindlichen und spezifischen Leuchtkäfer-Systems. Das Luciferin-Luciferase-System ist an sich bekannt (vgl. die US-Patentschrift 3 745 090).
Bei der Natrium-Kalium-spezifischen ATPase handelt es sich um ein System, das mit Adenosintriphosphat (ATP) reagiert unter Bildung von Adenosindiphosphat (ADP) und anorganischem Phosphat (P) in Gegenwart von Natrium- und Kaliumionen entsprechend der Gleichung:
ATP ADP+P
Digitaloide, wie Digoxin, werden selbst an die Na , K -ATPase gebunden nach einem Rezeptor-Prinzip (vgl. T. Akera, "Science", 198, 569-574 {λ977)), ATPase ist der Rezeptor, der Digoxin an einem sättigungsfähigen Bindungszentrum bindet und das EnzymmolekUl mit Digoxin kann mit ATP nicht reagieren und dieses hydrolysieren. Wenn ATPase und Digoxin vorhanden sind, wird das Digoxinmolekül an das ATPase-MolekUl gebunden und die Inaktivierung der ATPase steht in direkter Beziehung zu der Anzahl der vorhandenen Digoxinmoleküle.
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Die ATPase-Aktivität kann bestimmt werden durch Inkubieren des Systems in Gegenwart einer bekannten ATP-Konzentration und Bestimmung der ATP-Menge, die pro Zeiteinheit durch das Enzym hydrolysiert worden ist. Das empfindlichste und spezifischste Verfahren zur Bestimmung von ATP ist das Leuchtkäfer-Biolumineszenzsystem. Durch Zugabe einer bekannten Menge ATP, durch Inkubieren, um die ATPase mit ATP reagieren zu lassen, und durch Messung der verbleibenden ATP unter Anwendung des Leuchtkäfer-Biolumineszenz-Systems, erhält man erfindungsgemäß ein einfaches, schnelles und empfindliches Verfahren zur Bestimmung (Messung) von Digoxin in einer Probe auf der Basis der Inkubation von Na , K -ATPase.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden 10 bis 1000 μΐ, vorzugsweise 100 μΐ Digoxinprobe in Duplikat-Küvetten einpipettiert. Danach werden 0,1 bis 50 |aU, vorzugsweise 1 μϋ Na , K -ATPase in 10 μΐ eines Puffers, wie Tris(tris-Hydroxymethylaminomethan, 0,025 bis 0,5 M, pH 7,4 bis 7,8) und 130 mM
t I I I
Na , 20 mM K , 3 mM Mg für das Probenvolumen zugegeben und damit gemischt. Danach wird die Inkubation 30 bis 120 Minuten lang bei 37 C durchgeführt.
Es werden 10 bis 1000, vorzugsweise 50 bis 100 Picogramm (pg) ATP in 1 bis 1000, vorzugsweise 10 μΐ einpipettiert, danach wird gemischt. Die Probe wird 1 bis 60 Minuten, vorzugsweise 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Küvette wird in ein Lumineszenz-Photometer eingesetzt und die nach der Injektion des Luciferin-Luciferase-Reagens in einer Menge von 10 bis 1000 μΐ, vorzugsweise von 100 μΐ, entstehende Lichtintensität wird bestimmt.
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Es wird eine Eichkurve aufgestellt durch Behandlung einer Gruppe von Standard-Digoxin-Proben nach den oben genannten Meßstufen.
Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens reicht aus für Digoxingehalte zwischen 0,2 und 5 ng/cm . In dem Serum können Enzyme vorhanden sein, die ATP spalten (zersetzen), das Serum muß jedoch 0,5 bis 10 Minuten lang auf 65 C erhitzt werden, um die Enzymaktivität der Phosphatase-, Kinase- und möglichen ATPase-Enzyme vor der Zugabe der Na , K -ATPase zu zerstören.
Gemäß einer bevorzugten Ausgestaltung betrifft die Erfindung ein Verfahren für die quantitative Bestimmung von Digoxin und anderen Digitaloiden im Serum. Das Verfahren beruht auf der Inhibierung bzw. Inaktivierung des Na , K -spezifischen ADPase-Enzyms durch Digitaloide als Folge des Rezeptor-Bindungs-Prinzips und der Bestimmung dieser Inhibierung bzw. Inaktivierung unter Anwendung des Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Biolumineszenz-Assays für ATP. Das Verfahren ist spezifisch und hat eine ähnliche Empfindlichkeit wie der üblicherweise angewendete Radioimmunoassay, es ist jedoch einfacher und kann mit billigeren Apparaturen durchgeführt werden.
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Claims (8)

  1. T 51 928
    Anmelder: l) Seppo Kolehmainen 2) Veikko Tarkkanen Ganzenstraat Π Breulsweg 1
    3540 Zolder/Belgien Wylre/Niederlande
    Patentansprüche
    Ij Verfahren zum Nachweis bzw. zur Bestimmung von Digoxin und anderen Digitaloiden, dadurch gekennzeichnet , daß es beruht auf der Inhibierungs- bzw.Inaktivierungswirkung von Digoxin und anderer Digii
    spezifische ATPase-Enzym«
    Digoxin und anderer Digitaloide auf das gereinigte Na , K -
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibierung bzw. Inaktivierung des ATPase-Enzyms nachgewiesen bzw. bestimmt wird durch gemeinsames Inkubieren der Probe und des Na , K -spezifischen ATPas«
    Zeitraum von 0,1 bis 2 Stunden,
    des Na , K -spezifischen ATPase-Enzyms für einen konstanten
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das ATPase-Enzym nach dem Inkubieren mit einer Digitaloide enthaltenden Probe mit einer konstanten Menge ATP zwischen 10 und 1000 Picogramm (pg) zusammengebracht wird.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibierung bzw. Inaktivierung bestimmt bzw. nachgewiesen wird an Hand der Menge an ATP, das durch Na , K spezifische ATPase hydrolysiert wird, die nach der Inkubation
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    mit Digitaloiden verbleibt.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der ATPase unter Anwendung der Leuchtkäfer-Luciferin-Luciferase-Reaktion bestimmt bzw. nachgewiesen wird.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der ATPase nach der Inkubation mit der Digitaloid-Probe eine konstante Menge ATP zugesetzt wird und daß das verbleibende ATP nach 1-bis 60-minUtiger Inkubation mittels der Leuchtkäfer-Biolumineszenz bestimmt wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der ATPase nach der Inkubation mit der Digitaloid-Probe eine konstante Menge ATP zugesetzt wird und daß die verbleibende Aktivität des ATPase-Enzyms kinetisch bestimmt wird an Hand der kontinuierlich abnehmenden Lichtintensität der Biolumineszenz-Reaktion, während das ATPase-Enzym das während der Messung zugegebene ATP hydrolysiert.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Inhibierung bzw. Inaktivierung des ATPase-Enzyms verwendet wird zur Berechnung der Konzentration der Digitaloide in Serum durch Vergleich der Inhibierung bzw. Inaktivierung der Na , K -spezifischen ATPase in den Proben mit derjenigen in bekannten Digitaloid-Standards.
    Π30007/0798
DE19792930421 1978-07-26 1979-07-26 Nachweis bzw. bestimmung von digoxin u.a. digitaloiden durch biolumineszenz und inhibierung bzw. inaktivierung der na hoch + , k hoch + -atpase Withdrawn DE2930421A1 (de)

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