DE3107268A1 - Reagenz und verfahren zur bestimmung von human-muskeltyp-aldolase - Google Patents
Reagenz und verfahren zur bestimmung von human-muskeltyp-aldolaseInfo
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Description
HOFFMANN · EITIJ3 <& PARTNER
DIPl.-ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN
ARABEUASTRASSE 4 ■ D-8000 MÖNCHEN Bl . TE LE FON (089) 911087 · TE LEX 05-29619 (PATH E)
34 679 o/fi
EISAI CO.,Ltd.
Tokyo / Japan
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Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase
Die Erfindung betrifft ein Reagenz und ein Verfahren zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase.
Aldolase ist der allgemeine Ausdruck für Enzyme, die die
Aldolkondensation und Spaltung zwischen Dihydroxyazetonphosphat und einer Vielzahl von Aldehyden katalysieren,
Aldolase gemäß der Erfindung ist Fruktosediphosphat-Aldolase (E.C. 4.1.2.13. Fruktose-1 / 6t-Phosphat-D-glycelaldehyd-3-phosphat-lyase),
die reversibel Fruktose-1 ,6-diphosphat in Dihydroxyazetonphosphat und D-Glycelaldehyd-3-phosphat spaltet. Dieses Enzym besetzt
den Hauptpfad im Glykolysesystem und ist insbesondere im Muskel verteilt und trägt deshalb wesentlich
zum Energiemetabolismus bei.
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Säugetier -Aldolase besteht aus drei Isoenzymtypen, nämlich Muskeltyp (A-Typ), Lebertyp (B-Typ) und Gehirntyp (C-Typ).
Es ist bekannt/ daß das Aufbauverhältnis dieser Enzyme je nach der Metamorphose im lebenden Körper varriert,
wie bei einer Veränderung der Fötal-Leber in Ratten, bei einer Krebsbildung im menschlichen Organismus, von
Ratten und dergleichen.
Es sind zwei Methoden zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase
bekannt und zwar einmal die elektrophoretische Methode und andererseits die Methode, bei der man die
Zersetzungsaktivitäten von zwei Substraten, nämlich von Fruktose-1,6-diphosphat (FDP) und Fruktose-1-Phosphat
(FIP) in Aldolase mißt, (GDP-ALD-Aktivität und FIP-ALD-Aktivitat)
und dadurch wird das Aktivitätsverhältnis (FDP/FIP) bestimmt.
Diese Methoden sind aber mit einer Reihe von Problemen behaftet.
Bei der elektrophoretischen Methode besteht das Problem darin, daß die gewanderten Punkte der Human-Aldolase-Isoenzyme
so dicht beieinander liegen, daß eine Unterscheidung schwierig wird, und deshalb kann man keine
genaue quantitative Bestimmung vornnehmen.
Bei der Meßmethode für das Aktivitätsverhältnis (FDP/FIP) ist festzuhalten, daß die Bestimmungsmethode zur Messung
der FIP-ALD-Aktivität sehr komplizierter Messungen bedarf, und das keine quantitative Bestimmung dabei erfolgt.
Kürzlich ist ein Verfahren zur Bestimmung von Aldolase durch Radioimmunoassay mittels der Wettbewerbsmethode
(Doppel-Antikörper-Methode) bekannt geworden. Vergleicht man diese mit den vorerwähnten .Methoden, so stellt sie
eine wesentlich bessere und empfindlicher Methode dar,
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die auch für eine quantitative Bestimmung möglich ist.
Diese Methode hat aber gewisse Nachteile, weil es erforderlich ist, daß große Mengen eines zweiten Antikörpers
für die Trennung von B und F erforderlich sind, und auch das Trennverfahren ist sehr kompliziert und benötigt
lange Zeit, und ist mit erheblichen Arbeiten und Kosten verbunden. Außerdem hat man auch nichtspezifische Reaktionen beobachtet.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit radioisotopmarkierten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und einem Verfahren
zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase mittels Radioimmunoessay gemäß der sogenannten "Sandwich
-Methode" unter Verwendung des vorerwähnten Aldolase-Antikörpers
als Reagenz. Gemäß diesem Verfahren kann man eine Reihe von Nachteilen der Verfahren des
Standes der Technik vermeiden oder vermindern. Insbesondere ist das erfindungsgemäße Verfahren wegen
seiner Empfindlichkeit, und der Möglichkeit, quantitative
Bestimmungen vorzunehmen, bemerkenswert. Im Vergleich zu der Doppel-Antikörper-Methode zeichnet sich das erfindungsgemäße
Verfahren dadurch aus, daß ein zweiter Antikörper nicht benötigt wird, und das Trennungsverfahren
von B und F ist einfach durchzuführen und nichtspezifische Reaktionen sind im wesentlichen nicht vorhanden
.
Bei dem sogenannten "Sandwich-Verfahren" gemäß der Erfindung wird die Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase
nach den folgenden Stufen durchgeführt:
(a) Kontaktieren einer Probe mit einem unlöslich gemachten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper und
anschließender Abtrennung der festen Phase;
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(b) Kontaktieren der festen Phase mit radioisotopen markierten Muskeltyp-Aldolase-Antikörper mit
anschließender Abtrennung der festen Phase und
(c) Bestimmung der Radioaktivität der.festen Phase.
Nachfolgend wird dieses Verfahren näher erläutert.
In der Stufe (a) wird ein Antikörper, der durch Kombination mit einem träger unlöslich gemacht worden ist,
zusammen mit einer Probe, wie Serum und dergleichen, inkubiert, so daß das Antigen (Human-Muskeltyp-Aldolase)
in der Probe mit dem unlöslich gemachten Antikörper reagieren kann. Nach Beendigung der Umsetzung wird die
Reaktionslösung entfernt und die feste Phase wird mit einer Pufferlösung, destilliertem Wasser, physiologischer
Kochsalzlösung und dergleichen gewaschen.
In Stufe (b) wird die in Stufe (a) erhaltene feste Phase zusammen mit einem radioisotopen Antikörper inkubiert,
wobei sich der radioisotop—markierte Antikörper mit
dem zuvor mit dem unlöslich gemachten Antikörper vereinten Antigen kombiniert. Nach Beendigung der Umsetzung
wird die Reaktionslösung entfernt und die feste Phase
wird mit einer Pufferlösung, destilliertem Wasser, physiologischer
Kochsalzlösung und dergleichen gewaschen. In Stufe (c) wird die Radioaktivität der in Stufe (b) erhaltenen
festen Phase durch bekannte Scintilationszähler und dergleichen bestimmt.
Zuvor wird die Radioaktivität eines Standardantxgens nach diesem Bestimmungssystem gemessen, so daß man eine
Standardkurve erhält, in welcher die Menge des Antigens gegen die Radioaktivität aufgetragen ist. Die Radioaktivität
einer Probe wird nach dem gleichen Bestimmungs-
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system gemessen und dann kann man aus der Standardkurve die Menge des Antigens in der Probe bestimmen.
Fig. 1 zeigt eine Standardkurve von Human-Muskeltyp-Aldolase
durch Radioimmunoassay gemäß dem folgenden Beispiel 2.
Nachfolgend wird ein Reagenz für die erfindungsgemäße
Bestimmungsmethode und der Muskeltyp-Aldolase-Antikörper,
der bei der Herstellung des Reagenz verwendet wird, erläutert .
(A) Der Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
Antiserum erhält man durch Immunisierung von Muskeltyp-Aldolase
von Säugern, wie von Menschen, Kaninchen, Hunden, Affen und dergleichen oder anderen Tieren.
Als Immuntier wird vorzugsweise ein Vogel verwendet, weil die Muskeltyp-Aldolase sich nicht wesentlich immunologisch
unter den Säugern unterscheidet. Beispiele für bevorzugte Vögel sind beispielsweise Hühner, Truthähne,
Enten und dergleichen.
Bei der Reinigung des erhaltenen Antiserums kann man ein Verfahren
anwenden, bei dem man inaktiviertes Serum zu dem Tier, das als Quelle der Muskeltyp-Aldolase dient, gibt
und die anderen unreinen Antikörper durch Absorption entfernt, oder beispielsweise Affinitätschromatographie,
bei der man einen Träger in Kombination mit Muskeityp-Aldolase verwendet.
(B) Radioisotoper markierter Muskel-Aldolase-Antikörper
Die Markierung des Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers durch
Radioisotope kann man in üblicher Weise bewirken.
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Zum Beispiel kann man die Markierung durch die Chloramin-T-Methode
unter Verwendung von J, J und dergleichen als Radioisotope oder durch ähnliche Verfahren durchführen.
(C) Der unlöslich gemachte Muskeltyp-Äldolase-Antikörper
Als Träger wird ein unlöslicher Feststoff, der mit einem Antikörper kombinierbar ist, verwendet. Beispiele für
solche Feststoffe sind Polystyrol, Zellulose, Agarose, Glas, überbrücktes Dextran, Metall und dergleichen. J
Diese können als Röhrchen, Mikrotiterplatte, Pulver, Kugel, Scheibe,Platte, . Folie und dergleichen vorliegen.
Bei der Verwendung von Polystyrol-Mikrotiterplatten kann sich der Antikörper mit der Wandoberfläche der Platte
kombinieren, wobei der Antikörper zunächst mit einer Pufferlösung oder dergleichen gleichmäßig verdünnt wird
und die verdünnte Lösung dann auf die Platte gegeben wird, und das ganze läßt man dann stehen.
Die vorhergehende Beschreibung bezieht sich auf die Sandwich-Methode, aber die Human-Muskeltyp-Aldolase
kann auch durch immunoradiometrische Assay unter Verwendung eines radioisotopen markierten Muskeltyp-Aldolase-Antikörpers,
der das Reagenz der vorliegenden Erfindung ist, bestimmt werden. Bei diesem Verfahren setzt man den
radioisotopen markierten Antikörper mit einer Probe (Antigen) um und trennt anschließend den radioisotopen
markierten Antikörper-Antigen-Reaktantcn (B) von dem
nicht umgesetzten radioisotopen markierten Antikörper (F) ab und bestimmt die Radioaktivität von entweder (B)
oder (F). Zum Abtrennen von (B) von (F) kann man eine Gelfiltration oder eine Absorptionsmethode mittels eines
unlöslich gemachten Antigens verwenden.
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Die Erfindung wird in den Beispielen näher erläutert.
VERSUCH 1
Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
Die Human-Muskeltyp-Aldolase (1 mg) wird in einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung (0,5 ml) gelöst und zu
der Lösung gibt man das äquivalente Volumen von Freund-Adjuvant (Freund complete adjuvant). Das Produkt wird
durch subkutanes Injizieren in Hühner (weiße Leghorn) in Intervallen von einer Woche immunisiert, wobei man
fünfmal injiziert.Eine Woche nach der letzten Immunisierung
wird das Blut der Hühner zur Gewinnung des Antiserums gesammelt.
TM
Sepharose 4B— (Pharmacia Fine Chemicals AB; Agarose)
(10 g), die mit Bromcyanid aktiviert worden war, und die Human-Muskeltyp-Aldolase (10 mg) wurden in 15 ml
einer 0,1M Natriumcarbonat-Pufferlösung (pH 9,0) bei 40C über Nacht stehengelassen.
Das gebildete Sepharose 4B-GeI, kombiniert mit der Human-Muskeltyp-Aldolase,
wurde auf eine Säule gegeben und mit einer 0,05 M Tris-chlorwassersäure-Pufferlösung (pH
8,0),enthaltend 0,5 N Natriumchlorid, gewaschen. Auf diese Säule wurde das vorerwähnte Human-Muskeltyp-Aldolase-Antiserum
gegeben und das Antiserum wurde mit einer 0,5 N Tris-chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung (pH 8,0),
enthaltend 0,5 N Natriumchlorid ausgewaschen. Anschließend wurde eine 0,1 M widrige 'Watxiuncarbonatlösung auf die S-'iule
gegeben, um den Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
zu eluieren. Die Fraktion des Antikörper-Eluats wurde mit einer 0,05 M Tris-chlorwasserstoffsäure-Pufferlösung
(pH 8,0) dialysiert, wobei man 3 mg Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
erhielt.
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VERSUCH
Unlöslich gemachter Human-Muskeltpy-Aldolase-Antikörper
In die Löcher einer Polystyrol-Mikrotiterplatte wurden jeweils 200 μΐ einer Lösung von Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper,
die auf OD28O mu~ °'10' eingestellt worden
war, gegeben, und das Ganze wurde bei 40C über Nacht stehengelassen. Die Lösung wurde von der Platte entfernt,
die Platte wurde mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei man eine Mikrotiterplatte, kombiniert mit dem
Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper,erhielt.
J-markierter Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
Na125J mit 250 μΟ^ίε (10 μΐ) , 0,5 M Phosphatpuffer
(pH 7,4) (12,5 μΐ), Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
(1,85 mg/ml) (10 μΐ) und Chloramin-T (3 mg/ml) (12,5 μΐ)
wurden 20 Sekunden in einem kleinen Reagenzglas, das mit Silikon beschichtet war, umgesetzt. Nach Beendigung
der Umsetzung wurde zu dem Gemisch Natriummetabisulfit (6 mg/ml) (25 μΐ) zugegeben, um die Umsetzung zu beenden.
Zu dem erhaltenen Gemisch wurde Kaliumjodid (50 mg/ml) (12,5 μΐ) gegeben, sowie 2 % Eieralbumin (250 μΐ) in
0,05 M Phosphatpuffer. Das Ganze wurde dann mittels
TM
Sephadex G-25— (Pharmacia Fine Chemicals AB; überbrücktes Dextran) einer Gelfiltration unterworfen, um
Sephadex G-25— (Pharmacia Fine Chemicals AB; überbrücktes Dextran) einer Gelfiltration unterworfen, um
1 25
das freie J zu entfernen. Man erhielt auf diese Weise
das freie J zu entfernen. Man erhielt auf diese Weise
125
einen J-markierten Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper, dessen spezifische Aktivität 11,6 uCurie^g betrug.
einen J-markierten Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper, dessen spezifische Aktivität 11,6 uCurie^g betrug.
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Radioimmunoassay (Sandwich-Methode) S S = s s = s s s = s: S s s s s s s S s s s si s s s s s S s S s ss s
In jedes der Löcher in einer Mikrotiterplatte, in denen
Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper enthalten war, wurden
100 μΐ einer Standardlösung von Human-Muskeltyp-Aldolase
gegeben. Das Ganze wurde 2 Stunden bei 370C umgesetzt.
Nach Beendigung der Umsetzung wurde die überstehende Schicht entfernt und der Rest wurde dreimal mit physiolo- '
gischer Kochsalzlösung gewaschen. In die ausgewaschenen
125 Löcher wurden dann jeweils 100 μΐ J-markierter Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
(etwa 200.000 cpm) gegeben. Das Ganze wurde 16 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt.
Nach Beendigung der Umsetzung wurde die überstehende Flüssigkeit entfernt. Der Rest wurde dreimal mit physiologischer
Kochsalzlösung gewaschen. Nachdem das vorhandene Wasser völlig verdampft war, wurde die Platte zerschnitten
und die jeweiligen Lochanteile wurden voneinander getrennt. Die individuellen Aliquote wurden jeweils in kleine Reagenzgläser
gegeben und die Radioaktivität wurde mittels eines Scintilationszählers bestimmt.
Wie in der Figur gezeigt,erhielt man eine Standardkurve ,
in welcher 8 bis 1000 ng/ml als Meßbereich aufgetragen sind.
In der Figur gibt die horizontale Achse (logarithmisch) die Konzentration (ng/ml) von Human-Muskeltyp-Aldolase
an und die vertikale Achse zeigt die Radioaktivität (cpm) .
Dann wurde Human-Muskeltyp-Aldolase von verschiedenen Humanseren nach dem obigen Assaysystem bestimmt. Es wurde
dabei festgestellt, daß die Human-Muskeltyp-Aldolase von 25 normalen Menschen 165 - 40 ng/ml betrug, und daß sie
bei allen weniger als 210 ng/ml ausmachte. Dann wurde die
130061/0528
- 12 -
Human-Muskeltyp-Aldolase von 20 Krebspatxenten gemessen
und diese zeigte höhere Werte von 210 ng/ml mit Ausnahme
von zwei Fällen. Bei den 20 Krebspatienten handelt es sich um 7 Leberkrebse, 8 Magenkrebse, 3 Eingeweidekrebse
und 2 Pancreaskrebse.
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Claims (4)
1. Reagenz zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldolase,
dadurch gekennzeichnet, daß es radioisotop — markierten Muskeltyp~Aldolase~Antikörper
darstellt.
2. Reagenz gemäß Anspruch 1,. dadurch g e k
e ι
ist.
1 25 kennzeichnet, daß das Radioisotop J
3. Reagenz gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , · daß der Muskeltyp-Aldolase-Antikörper
Human-Muskeltyp-Aldolase-Antikörper ist.
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4. Verfahren zur Bestimmung von Human-Muskeltyp-Aldoläse,
gekennzeichnet durch die folgenden Stufen:
(a) Kontaktieren einer Probe mit unlöslich gemachtem Muskeltyp-Aldolase-Antikörper mit anschließender Abtrennung
der festen Phase;
(b) Kontaktieren der festen Phase mit radioisotopmarkierten Muskeltyp-Aldolase-Äntikörper und
anschließende Abtrennung der festen Phase;
(c) Bestimmung der Radioaktivität der festen Phase.
130061/0528
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|---|---|---|---|
| JP2799680A JPS56125667A (en) | 1980-03-07 | 1980-03-07 | Reagent for measurement and measuring method for human muscle type aldolase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE3107268A1 true DE3107268A1 (de) | 1982-01-07 |
Family
ID=12236425
Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE19813107268 Withdrawn DE3107268A1 (de) | 1980-03-07 | 1981-02-26 | Reagenz und verfahren zur bestimmung von human-muskeltyp-aldolase |
Country Status (10)
| Country | Link |
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| BE (1) | BE887828A (de) |
| CA (1) | CA1141291A (de) |
| CH (1) | CH651933A5 (de) |
| DE (1) | DE3107268A1 (de) |
| FR (1) | FR2477573A1 (de) |
| GB (1) | GB2071318B (de) |
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| NL (1) | NL8101068A (de) |
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