CH651933A5 - Reagenz zur bestimmung von aldolase vom humanmuskeltyp. - Google Patents
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Description
Diese Erfindung betrifft ein Reagenz und ein Verfahren zur Bestimmung von Humanmuskel-Aldolase.
Aldolase ist eine allgemeine Bezeichnung für Enzyme, welche sowohl die Aldokondensation katalysieren wie auch die Aufspaltung in Dihydroxyacetonphosphat und einer Anzahl von Aldehyden bewerkstelligen.
Aldolase im Sinne dieser Erfindung ist Fructose-Diphos-phataldolase (E.C. 4.1.2.13. fructose-1-6-phosphat -D- glyc-aldehyd -3- phosphat-lyase), die Fructose 1,6-diphosphat reversibel in Dihydroxyacetonphosphat und D-glycaldehyd -3-phosphat zersetzt. Dieses Enzym bestimmt die Hauptumsetzungsrichtung im Glycolysesystem und, verteilt, hauptsächlich in den Muskeln. Seine Wirkung trägt deshalb hauptsächlich zur Funktion des Energiemetabolismus bei.
Aldolase von Säugern umfasst drei Typen von Isoenzymen, das sind der Muskeltyp (auch A Typ genannt), der Lebertyp (auch B Typ genannt) und der Hirntyp (auch C Typ genannt). Es ist bekannt, dass die Zusammensetzungsverhält-nisse dieser Isoenzyme gemäss der Metamorphose des lebenden Körpers variiert. Solche Änderungen in der Metamorphose von lebenden Körpern sind z.B. die Differentiation der fötalen Leber bei Ratten, die Geschwulstbildung in Organismen bei Menschen oder Ratten und ähnliche.
Bekannt sind bis anhin vor allem zwei Methoden für die Bestimmung von Humanmuskeltyp-Aldolase. Eine davon ist die elektrophoretische Methode und die andere ist eine Methode, welche die Zersetzungsaktivitäten von zwei Substraten, nämlich Fructose-1,6-diphosphat (FDP) und Fructose-1-phosphat (FIP) bezüglich Aldolase misst, und dann das Aktivitätsverhältnis (FDP/F1P) bestimmt. Die genannten Aktivitäten werden mit FDP-ALD-Aktivität und FIP ALD-Aktivität bezeichnet.
Bei der Ausführung der genannten Methoden zeigen sich aber verschiedene Probleme.
Bei der elektrophoretischen Methode besteht das Problem hauptsächlich darin, dass die migrierten Flecken der verschiedenen Humanaldolaseisoenzyme so nahe zueinander liegen, dass ihre Unterscheidung sehr schwierig ist, wodurch die quantitative Bestimmung der Aldolase nicht möglich ist.
Bei der Bestimmung des Aktivitätsverhältnisses FDP/F1P ist vor allem die genaue Messung der F1P-ALD-Aktivität sehr schwierig. Auch diese Methode führt daher kaum zu quantitativen Bestimmungen der Aldolase.
In neuester Zeit wurde eine Methode zur Bestimmung der Aldolase bekannt, die auf «radioimmunoassay through compétition» beruht. Die Methode wird auch mit «double antibody method» bezeichnet. Verglichen mit den zuvor genannten Methoden führt diese neue Methode zu genaueren Resultaten und erlaubt auch in gewissen Fällen eine quantitative Bestimmung. Aber auch diese neue Methode hat Nachteile, indem dafür eine grosse Menge des zweiten Antikörpers für die Trennung von gebundenem und ungebundenem Antikörper benötigt wird. Auch stellt die Ausführung der Methode grosse Ansprüche, da die Trennung sehr kompliziert und daher zeit- und arbeitsaufwendig ist. Auch werden dabei verschiedene, nicht spezifische Reaktionen beobachtet.
Das erfindungsgemässe Verfahren geht vor nach der «radioimmunoassay» und speziell nach der sog. «sandwich»-Methode und verwendet den oben genannten Aldolaseantikörper als Reagenz. Die neue Methode weist verschiedene Nachteile von bekannten Verfahren entweder nicht mehr oder nur noch in abgeschwächter Form auf. Speziell ist die Empfindlichkeit der neuen Methode zur Bestimmung von Aldolase bemerkenswert, die auch eine quantitative Bestimmung erlaubt. Verglichen mit der «double-antibody method» ist die neue Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass der zweite Antikörper nicht benötigt wird. Ebenso ist die Trennung von gebundenem und ungebundenem Antikörper einfach und leicht auszuführen, und nicht spezifische Reaktionen werden kaum beobachtet.
Das erfindunggemässe Bestimmungsverfahren ist im vorangehenden Patentanspruch 4 charakterisiert.
Im folgenden werden die einzelnen Verfahrensschritte detailliert erläutert.
Im Schritt (a) wird ein Antikörper insolubilisiert, indem er mit einem Träger kombiniert und darauf immobilisiert wird. Dieser insolubilisierte Antikörper wird nun zusammen mit einer Probe, beispielsweise Serum, inkubiert. Dabei reagiert das Antigen, in diesem Fall also Aldolase - vom Humanmuskeltyp mit dem genannten insolubiüsierten Antikörper. Nach Abschluss der Reaktion wird die Reaktionslösung entfernt und die feste Phase gewaschen, beispielsweise mit einer Pufferlösung, mit destilliertem Wasser oder mit einer physiologischen Salzlösung.
Im Schritt (b) wird die im Schritt (a) erhaltene feste Phase zusammen mit dem Antikörper, der mit einem radioaktiven Isotop markiert ist, inkubiert. Dabei erhält man eine Verbindung des genannten markierten Antikörpers mit dem zuvor am insolubiüsierten Antikörper gebundenen Antigen. Nach Abschluss dieser Reaktion wird wiederum die Reaktionslösung entfernt und die feste Phase mit einer Pufferlösung, mit destilliertem Wasser, mit einer physiologischen Salzlösung oder ähnlichem gewaschen.
Im Schritt (c) schliesslich wird die Radioaktivität der erhaltenen festen Phase aus dem Schritt (b) bestimmt, beispielsweise unter Benützung der bekannten Scintillationszähler.
Vor den genannten Bestimmungen wird mittels Lösungen mit bekanntem Antigengehalt eine entsprechende Eichkurve aufgestellt.
Fig. 1 in der beigelegten Zeichnung zeigt eine Standardkurve für Aldolase vom Humanmuskeltyp, die mittels dem «radioimmunoassay»-Versuch des folgenden Beispiels 2 erhalten wird.
Die folgende Beschreibung erläutert das Reagenz für die Bestimmung von Aldolase vom Humanmuskeltyp und den Antikörper von Muskeltyp-Aldolase, der im genannten Reagenz verwendet wird.
A. Antikörper von Muskeltyp-Aldolase.
Das Antiserum wird erhalten durch Immunisierung von Aldolase vom Muskeltyp von Säugern wie beispielsweise Menschen, Kaninchen, Hunde, Affen gegenüber anderen Tieren. Das immune Tier ist vorteilhafterweise eines aus der Spezies der Vögel, da die Muskeltyp-Aldolasen von Säugern keinen signifikanten immunologischen Unterschied zeigen. Vö-
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gel, die zur Immunisierung bevorzugt verwendet werden, sind ferlösung bei pH 8,0 mit 0,5 N Natriumchlorid gewaschen. Huhn, Truthahn, Ente und ähnliche. Dann erst wurde mittels einer 0,1 M wässrigen Natriumcar-
Bei der Reindarstellung des erhaltenen Antiserums kön- bonatlösung der Antikörper von Humanmuskeltyp-Aldolase nen bekannte Methoden verwendet werden, beispielsweise die eluiert. Das Antikörpereluat wurde gegen eine 0,05 M Tris-jenige, bei der inaktiviertes Serum desjenigen Tiers, welches 5 Salzsäurepufferlösung bei pH 8,0 dialysiert. Erhalten wurden die Quelle der Aldolase vom Muskeltyp ist, zugegeben wird so 3 mg Antikörper von Humanmuskeltyp-Aldolase.
und bei der dann mittels Adsorption der andere, unreine Antikörper entfernt wird. Ebenso kann eine affinitätschroma- Experiment 2
tographische Methode eingesetzt werden, bei der Aldolase Insolubilisierter Antikörper von Humanmuskeltyp-Al-
vom Muskeltyp an einer Feststoffphase gebunden eingesetzt io dolase.
wird. Auch andere Methoden sind möglich. In jede der Öffnungen auf einer Polystyrolmicrotiterplatte
B. Mit einem radioaktiven Isotop markierter Antikörper wurden 200 jxl einer Lösung von Antikörper von Humanmus-von Muskeltyp-Aldolase. keltyp-Aldolase gegeben. Die Lösung war auf einen Titer von
Die Markierung vom Antikörper von Muskeltyp-Aldo- OD2go Mm = 0,10 eingestellt und war über Nacht bei 4 °C ste-lase mittels radioaktiven Isotopen kann durch bekannte Me- 15 hengelassen worden. Dann wurde die Lösung wieder von der thoden bewerkstelligt werden. Beispielsweise kann die Mar- Platte entfernt. Die Platte wurde mit destilliertem Wasser ge-kierung bei der Chloramin-T-Methode unter Verwendung waschen. Erhalten wurde so eine Mikrotiterplatte, an der An-von 125I, l3lI usw. als radioaktives Isotop ausgeführt werden. tikörper von Humanmuskeltyp-Aldolase mit bekanntem Ti-
C. Insolubilisierter Antikörper von Muskeltyp-Aldolase. ter kombiniert war.
Als Träger wird ein unlöslicher Feststoff eingesetzt, wel- 20
eher eine Kombination mit dem Antikörper erlaubt. Beispiele solcher Feststoffe umfassen Polystyrol, Cellulose, Agarose, Beispiel 1
Glas, vernetztes Dextran und Metall. Der Feststoff kann in Mit I125 markierter Aldolaseantikörper vom Humanmus-
verschiedenen Formen vorliegen, beispielsweise als Rohr, als keltyp
Mikrotiterplatte, als Pulver, als Kugel, als Scheibe, als Platte, 25 10 (il Na125I von 250 ncurie Aktivität, 12,5 jj.1 einer 0,5 M als Folie usw. Phosphatpufferlösung von pH 7,4 und 10 |il einer Lösung
Im Falle der Polystyrolmicrotiterplatte kann der Antikör- von Antikörper von Humanmuskeltyp-Aldolase mit einer per mit der Plattenoberfläche verbunden werden, wenn der Konzentration von 1,85 mg/ml, wurden zusammen mit genannte Antikörper in einer Pufferlösung genügend ver- 12,5 (il einer Chloramin-T-Lösung der Konzentration dünnt ist. Die verdünnte Lösung wird dann auf die Platte ge- 30 3 mg/ml 20 Sekunden lang in einem kleinen, innen mit Sili-geben und das ganze wird bis zum Abschluss der Kombina- kon beschichteten Reagenzglas umgesetzt. Nasch Abschluss tion stehen gelassen. der Reaktion wurden 25 jo.1 einer Natriummetabisulfltlösung
Die obige Beschreibung betrifft die «sandwich»-Methode. der Konzentration 6 mg/ml zugegeben. Die Reaktion wurde Die Aldolase vom Humanmuskeltyp kann aber auch nach ei- dadurch abgebrochen. Die erhaltene Mischung wurde nun ner immunoradiometrischen Methode unter Verwendung des 35 mit 12,5 |il einer Kaliumjodidlösung der Konzentration gleichen, markierten Aldolaseantikörpers bestimmt werden. 50 mg/ml und mit 250 [il einer 2%igen Eigelbalbuminlösung Diese Methode umfasst die Reaktion des markierten Anti- in einer 0,05 M Phosphatpufferlösung versetzt. Das Ganze körpers mit der Probe (Antigen), gefolgt von der Abtrennung wurde nun der Gelfiltration unterzogen, wobei die feste Phase des Antikörper-Antigen-Produktes (B) vom nichtreagierten aus Sephadex-G-25™.(Pharmacia Fine Chemicals AB; verAntikörper (F) und die Bestimmung der Radioaktivität von -»o netztes Dextran) eingesetzt wurde. Das nicht reagierte 125I (B) oder (F). Als Methode für die Auftrennung von (B) und wurde dadurch aus der Lösung entfernt. Erhalten wurde so (F) kann die Gelfiltrationsmethode, Adsorptionsmethode der mit 125I-markierte Antikörper von Humanmuskeltyp-Al-mittels immobilisierten Antigen usw. verwendet werden. dolase mit einer spezifischen Aktivität vom 11,6 ncurie/(ig.
Die folgenden Experimente und Beispiele illustrieren die Erfindung weiter. 45
Beispiel 2
Experiment 1 Radioimmunoassay (Sandwichmethode).
Antikörper von Humanmuskeltyp-Aldolase In jede der gemäss Beispiel 1 präparierten Aussparungen in ei-
1 mg Aldolase vom Humanmuskeltyp wurde in 0,5 ml einer ner Mikrotiterplatte wurden 100 (il einer Standardlösung ei-physiologischen, wässrigen Salzlösung gelöst. Zur Lösung 50 ner Aldolase vom Humanmuskeltyp gegeben. Das Ganze wurde das gleiche Volumen «Freund complete adjuvant» Lö- wurde 2 Stunden lang auf 37 °C gehalten. Nach Abschluss der sung gegeben. Die Lösung wurde subkuntan einer Henne Reaktion wurde die überliegende Flüssigkeit entfernt und die
(«White Leghorn») injiziert, die so immunisiert wurde. 5 Wo- Platte dreimal mit einer wässrigen, physiologischen Salzlö-chen lang wurden dem Tier je eine solche Injektion pro Wo- sung gewaschen. In die ausgewaschenen Aussparungen wur-che verabreicht. Eine Woche nach der letzten Immunisierung 55 den nun je 100 (il einer Lösung mit ,25I-markiertem Antikör-wurde aus dem Blut des Tieres das Antiserum gewonnen. per von Humanmuskeltyp-Aldolase mit einer Aktivität von
10 g Sepharose 4B™ (Pharmacia Fine Chemicals AB; ungefähr 200 000 cpm gegeben. Das Ganze wurde 16 Stunden Agarose) wurden vorerst mit Bromcyan aktiviert und dann lang bei Raumtemperatur belassen. Nach Abschluss der Remit 10 mg Aldolase vom Humanmuskeltyp gemischt. Die Mi- aktion wurde die überliegende Flüssigkeit entfernt. Die Platte schung wurde in 15 ml einer 0,1 M Natriumcarbonatpufferlö- 60 wurde dreimal mit einer wässrigen, physiologischen Salzlösung bei pH 9,0 bei 4 °C über Nacht stehengelassen. sung gewaschen. Nach möglichst vollständiger Entfernung
Das erhaltene Sepharose-4B-Gel kombiniert mit der AI- des Wassers aus den Aussparungen wurden die Aussparungen dolase vom Humanmuskeltyp wurde in eine Kolonne gepackt portionenweise voneinander getrennt. Aliquote Teile wurden und mit einer 0,05 M Tris-Salzsäurepufferlösung bei pH 8,0, in kleine Reagenzgläser gegeben. Die Radioaktivität der Pro-die 0,5 N Natriumchlorid enthielt, gewaschen. Auf diese Ko- 65 ben wurde in einem Scintilationszähler vom Hohraumtyp be-lonne wurde dann das oben aus dem Blut der Henne erhaltene stimmt.
Antiserum von Humanmuskeltyp-Aldolase gegeben. Das Wie in Fig. 1 gezeigt wird, konnte so eine Standardkurve
Antiserum wurde dann mit einer 0,05 M Tris-Salzsäurepuf- aufgestellt werden, mittels der ein Gehalt von 8 bis
651933
10 000 ng/ml bestimmt werden kann. Die horizontale Achse zeigt in logarithmischer Skala die Konzentration im ng/ml der Aldolase vom Humanmuskeltyp und die vertikale Achse die entsprechende Radioaktivität in cpm.
Mit der oben erwähnten Bestimmungsmethode wurden-nun in verschiedenen Humansera die Gehalte an Aldolase vom Humanmuskeltyp bestimmt. So konnte festgestellt werden, dass der Gehalt an Aldolase vom Humanmuskeltyp in
Serum von 25 gesunden Menschen bei 165 ± 40 ng/ml lag. Alle Gehalte lagen unter 210 ng/ml. Im Gegensatz dazu zeigten Sera von 20 Tumorpatienten einen Gehalt an Aldolase vom Humanmuskeltyp, der mit Ausnahme von zwei Fällen 5 höher als 210 ng/ml lag. Die 20 Tumorpatienten setzten sich zusammen aus 7 Patienten mit Hepatomae, 8 Patienten mit gastrischen Tumoren, 3 Patienten mit grossen Darmtumoren und 2 Patienten mit Pancreastumoren.
C
1 Blatt Zeichnungen
Claims (4)
1. Reagenz zur Bestimmung von Humanmuskel-Aldolase, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem radioaktiven Isotop markierten Antikörper von Muskel-Aldolase enthält.
2. Reagenz gemäss Patentanspruch 1, in dem das radioaktive Isotop 125I ist.
3. Reagenz gemäss Patentanspruch 1, in dem der Antikörper von Muskel-Aldolase der Antikörper von Humanmuskel-Aldolase ist.
4. Verfahren zur Bestimmung von Humanmuskel-Aldo-lase, gekennzeichnet durch die folgenden Verfahren:
a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem insolubilisier-ten Antikörper von Muskel-Aldolase und anschliessende Abtrennung der festen Phase,
b) Inkontaktbringen der festen Phase mit dem mit einem radioaktiven Isotop markierten Antikörper von Muskel-Aldolase und anschliessende Abtrennung der festen Phase und c) Bestimmung der Radioaktivität der festen Phase.
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