DE69921107T2

DE69921107T2 - Verfahren zur messung der knochenresorptionsrate

Info

Publication number: DE69921107T2
Application number: DE69921107T
Authority: DE
Inventors: Jussi Halleen; Kalervo Väänänen
Original assignee: Individual
Current assignee: Immunodiagnostic Systems Ltd
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2005-07-28
Anticipated expiration: 2019-03-31
Also published as: EP1068533A2; DE69921107D1; JP3523200B2; FI980748A0; DK1068533T3; ES2232124T3; ATE279728T1; JP2002510050A; AU748663B2; CZ20003578A3; PT1068533E; AU3149199A; WO1999050662A3; WO1999050662A2; CN1145030C; FI980748A; CZ296736B6; EP1068533B1; CN1295667A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Knochenresorptionsrate und insbesondere einen Immuntest dafür. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Störung, die mit einer Änderung der Knochenresorptionsrate assoziiert ist, wie Osteoporose, und einen Testkit, der bei den Verfahren nützlich ist. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Überwachung der Wirkung eines Medikamentes zur Behandlung einer Störung, die mit einer Erhöhung der Knochenresorptionsrate in einem Probanden assoziiert ist, und ein Verfahren zur Durchmusterung von Probanden auf die Anfälligkeit für die Störung. Die Verwendung eines spezifischen Markers für die Knochenresorptionsrate wird offenbart.
Technischer Hintergrund
Es gibt mehrere Störungen, die mit Änderungen der Knochenresorptionsrate assoziiert sind, wobei die am meisten verbreitete Osteoporose ist, eine Erkrankung, die bei postmenopausalen Frauen verbreitet ist. Osteoporose wird durch den Verlust von Knochenmasse verursacht, was zu einem schwachen Skelett führt, das für Frakturen anfällig ist. Die Behandlung von Frakturen und anderen durch Osteoporose verursachten Erkrankungen ist für die Gesellschaft teuer, ganz zu schweigen vom Leiden der Patienten. Es gibt deshalb einen Bedarf, eine Diagnose bei Personen zu stellen, die an Osteoporose leiden, um schwerwiegende Folgen zu verhindern. Osteoporose wurde bisher z.B. durch Östrogenersatz oder Biphosphonatbehandlung erfolgreich behandelt.
Es gibt mehrere Geräte und Verfahren zur Messung der Knochendichte. Die verwendeten Apparaturen und Verfahren sind jedoch teuer, da sie viel Platz und Personal erfordern, die Messung erfolgt langsam und der Patient muss anwesend sein. Da der Altersklassenaufbau im Bezug auf Osteoporose ungünstiger wird, ist es wichtig, spezifische, schnelle, einfache und billige in-vitro-Verfahren zur Messung der Knochendichte zu entwickeln.
Der Knochen besteht im Wesentlichen aus zwei Hauptzelltypen, den knochenbildenden Osteoblasten und den knochenresorbierenden Osteoclasten. Normalerweise befinden sich diese beiden Zelltypen im Gleichgewicht, die Osteoclasten resorbieren die gleiche Knochenmenge wie sie von den Osteoblasten gebildet wird. Osteoporose ist das Ergebnis einer erhöhten Aktivität der Osteoclasten, was zu einer Störung führt, bei der die Osteoclasten mehr Knochen resorbieren als die Osteoblasten produzieren.
Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP, EC 3.1.3.2.) gehört nach seiner elektrophoretischen Mobilität zur Klasse Typ 5 der sauren Phosphatasen und wird deshalb auch als saure Phosphatase Typ 5 bezeichnet. Es können mindestens sieben saure Phosphatasen durch saure Acrylamidgelelektrophorese identifiziert werden. Die sauerste davon ist die saure Phosphatase von Bande 5 (Acp5), und es ist die Einzige, die gegenüber der Hemmung durch Tartrat resistent ist, deshalb der Name TRAP. Dieses Enzym ist ein basisches Glycoprotein, das eine Spin-gekoppelte Eiseneinheit an der aktiven Stelle des Moleküls enthält. Die zweikernige Eiseneinheit von TRAP enthält zwei Eisen(III)-Ionen, die dem Protein eine violette Farbe verleihen, und es wird auch als violette saure Phosphatase bezeichnet. Dieses Protein besitzt ein Molekulargewicht von 32 kD. Wenn das Enzym z.B. mit β-Mercaptoethanol reduziert wird, wird eines der Eisen(III)-Ionen reduziert und das Enzym färbt sich rosa. TRAP kann in vitro als Proteintyrosinphosphatase fungieren, und seine Aminosäuresequenz enthält Bereiche, die zu denjenigen der Phosphoproteinphosphatasen homolog sind. Jedoch sind ihre natürlichen Substrate immer noch unbekannt.
Die Tyrosinphosphorylierung ist ein wichtiger Regulationsmechanismus für die Funktion und Differenzierung vieler Zellen. Man glaubt, dass TRAP eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Osteoclastenfunktion spielt. Es ist bekannt, dass TRAP Hydroxylradikale produzieren kann, die mit chemischen Verbindungen in der Natur reagieren und sie zerstören können. Die Osteoclasten produzieren während der Knochenresorption freie Sauerstoffradikale und es ist offensichtlich, dass sie bei der Knochenresorption wichtig sind. Ihr Ursprung ist unbekannt, aber es scheint, dass mindestens ein Teil der Hydroxylradikale von TRAP gebildet wird. Beide Zelltypen, die normalerweise TRAP enthalten, d.h. die Osteoclasten und Alveolarmakrophagen nehmen chemische Verbindungen auf und bauen sie ab. Dieses gemeinsame Merkmal unterstützt stark die Annahme, dass TRAP an der Knochenresorption teilnimmt.
Hayman, A.R. et al. (Development 122:3151-3162, 1996) haben die Rolle von TRAP durch gezielte Zerstörung des TRAP-Gens bei Mäusen untersucht. Sie fanden heraus, dass Mäuse, denen das Gen fehlt, unter gestörter endochondraler Ossifikation und leichter Osteopetrose litten. Sie schlossen daraus, dass TRAP für die normale Mineralisierung von Knorpel bei sich entwickelnden Knochen erforderlich ist, und das sie auch die Integrität und den Stoffwechsel im Skelett bei Erwachsenen durch einen wichtigen Beitrag zur Knochenmatrixresorption aufrechterhält.
Die einzigen normalen menschlichen Zellen, die bedeutende TRAP-Mengen enthalten, sind die Osteoclasten und aktivierte Makrophagen. Bei bestimmten pathologischen Zuständen kann man TRAP auch in anderen Zellen finden. Man fand heraus, dass TRAP während der Knochenresorption aus den Osteoclasten in den Blutkreislauf sekretiert wird. Die TRAP-Konzentration im Serum wurde deshalb als Marker der Knochenresorption vorgeschlagen, und man fand heraus, dass die TRAP-Konzentration im Serum mit der Knochenresorptionsrate korreliert (Kraenzlin M. E. et al. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 71(2):442-451, 1990; Cheung C. K. et al. Clin. Chem. 41(5):679-686, 1995; Chamberlain P. et al. Clin. Chem. 41(10):1495-1499, 1995 und Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10):1444-1452, 1996).
1978 berichteten Lam W. K. W. et al. (Clin. Chem. 24(7):1105-1108, 1978) über eine Studie der biochemischen Eigenschaften von TRAP im Serum von Erwachsenen und Kindern. Mit einem verbesserten Elektrophoreseverfahren fanden sie zwei unterschiedliche TRAP-Banden, die sie als 5a und 5b bezeichneten. TRAP 5a besaß ein niedrigeres pH-Optimum als TRAP 5b. Man fand beide Enzymformen, TRAP 5a und TRAP 5b, in menschlichen Seren. Man fand heraus, dass die TRAP 5a-Menge bei Erwachsenen und Kindern konstant, aber die TRAP 5b-Menge bei Kindern erhöht war.
In einem anderen Artikel (Chen et al., Clin. Chem. 25, 719-722, 1979) untersuchte die gleiche Forschergruppe die Signifikanz der hohen Aktivität der sauren Phosphatase im Serum normaler Kinder. Sie zeigten, dass die der Bande 5 entsprechende TRAP-Aktivität im Serum in Riesenzelltumoren und nicht in osteogenen Sarkomen vorhanden war, was nahe legte, dass TRAP von Osteoclasten stammt.
W.K.W. Lam et al. (Clin. Biochem. 14, 177-181. 1981) isolierten TRAP aus dem Serum und der Milz von Patienten, die an der Gaucher-Erkrankung litten. Sie zeigten, dass das Serum bei Gaucher-Erkrankung die Bande 5b enthielt, während die Milz bei Gaucher-Erkrankung die Bande 5a enthielt. Die Banden 5a und 5b besaßen eine identische Proteinstruktur und durch die Entfernung von Kohlenhydrat von 5a durch Sialidase wurde es in 5b umgewandelt, was nahe legte, dass der einzige strukturelle Unterschied zwischen 5a und 5b das Vorhandensein von Sialinsäureresten in 5a ist, die nicht in 5b vorliegen. Die pH-Optima der beiden Formen waren unterschiedlich, wobei das von 5a bei 5,0 und das von 5b bei 5,5–6,0 lag.
W.K.W Lam and R.J. Desnick (Progress in Clinical and Biological Research 95, 267-278, 1982) untersuchten ferner die Bande 5-Formen bei der Gaucher-Erkrankung. Sie fassten auch die elektrophoretischen Profile der sauren Phosphatase in normalen und pathologischen Proben zusammen. Sie zeigten, dass in normalem Serum sowohl Spuren von 5a als auch von 5b vorliegen und sie beobachteten keine Zunahme der Bande 5a in irgendeinem pathologischen Serum. Stattdessen fanden sie erhöhte Mengen von 5b in osteoclastischen Knochentumoren im Serum von Patienten mit Malignitäten, die im Knochen metastasierten, und im Serum von Patienten mit Gaucher-Erkrankung. Basierend auf diesen Ergebnissen schlossen die Autoren, dass die Ergebnisse nahe legen könnten, dass der saure Phosphatase-Spiegel im Serum und insbesondere die 5b-Form hauptsächlich von der physiologischen Aktivität der Osteoclasten abhängt. Sie stellten jedoch fest, dass weitere Beweise erforderlich waren, um diese Hypothese zu unterstützen. Eine weitere wichtige Beobachtung aus dem Artikel ist die Feststellung der Autoren, dass die Enzyme (Bande 5a und 5b) nahe verwandt und im Bezug auf die Antigenizität identisch sind. Nach dieser Feststellung wäre es unmöglich, einen Immuntest zu entwickeln, der 5a oder 5b spezifisch messen würde. Nach 1982 wurde der Ursprung von Serum-TRAP 5a und 5b nicht weiter untersucht und der vorgeschlagene osteoclastische Ursprung von 5b wurde nicht bestätigt.
Die TRAP-Aktivität kann z.B. durch Gabe von p-Nitrophenylphosphat (pNPP) als Substrat in Gegenwart von Tartrat, das die meisten anderen sauren Phosphatasen hemmt, spektrometrisch bestimmt werden. Jedoch ist dieses Verfahren nicht sehr spezifisch, und deshalb wurden spezifischere Verfahren, d.h. Immuntests zur Bestimmung von TRAP entwickelt.
Stepan J. J. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun. 165:1027-1034, 1989) und Kraenzlin M. E. et al. (Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 71(2):442-451, 1990) entwickelten einen Immuntest für TRAP unter Verwendung von gegen TRAP gerichteter polyclonaler Antikörper, die aus der Milz eines Patienten mit Haarzellenleukämie gereinigt wurden. Sie schlagen vor, dass ihr Test beim Nachweis von Patienten mit Störungen beim Mineralstoffwechsel nützlich sein kann.
Cheung C. K. et al. (Clin. Chem. 41(5):679-686, 1995) offenbaren einen Immuntest für TRAP unter Verwendung von gegen TRAP hergestellter, polyclonaler Antikörper, die aus Nabelschnurplasma isoliert wurden. Sie fanden heraus, dass die Konzentration von TRAP bei Kindern und postmenopausalen Frauen signifikant höher war und diskutieren die Möglichkeit der Verwendung von TRAP als Marker bei der Beurteilung des Knochenumsatzes.
Es wurden auch polyclonale Antikörper gegen aus menschlichem Knochen isolierte oder gereinigte TRAP hergestellt. Es wurde wiederum bewiesen, dass Kinder und postmenopausale Frauen erhöhte TRAP-Konzentrationen in ihren Seren aufwiesen (Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10):1444-1452, 1996).
Chamberlain P. et al. (Clin. Chem. 41(10):1495-1499, 1995) offenbaren einen zweistufigen Serum-Immuntest für TRAP unter Verwendung eines Paares monoclonaler Antikörper, die gegen rekombinant hergestellte TRAP gerichtet waren. Die monoclonalen Antikörper erkannten verschiedene TRAP-Epitope und ermöglichten damit einen sensitiven Test.
Alle bisher veröffentlichten Immuntests messen den Gesamtgehalt von TRAP im Serum. Die vorliegende Erfindung basiert jedoch auf dem Befund, dass TRAP 5b ein viel spezifischerer biochemischer Marker für die Knochenresorption ist als Gesamt-TRAP. In diesem Zusammenhang sollte hervorgehoben werden, dass die Isoformen von TRAP, über die von Stepan et al. und Kraenzlin et al. a.a.O. berichtet wurde, nicht mit denjenigen verwechselt werden sollten, über die. von Lam et al. a.a.O. berichtet wurde, obwohl beide als 5a und 5b bezeichnet werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, TRAP 5b als spezifischen Marker für die Knochenresorption zu nutzen.
Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein spezifisches und einfaches Verfahren zur Messung der Knochenresorptionsrate bereitzustellen und insbesondere ein Diagnoseverfahren zur Diagnose einer Störung bereitzustellen, die mit einer signifikanten Änderung der Knochenresorptionsrate assoziiert ist, wie Osteoporose oder andere metabolische Knochenerkrankungen, Knochenläsionen oder Knochenmetastasen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Messung bereitzustellen, das die Überwachung der Knochenresorption in Probanden bereitstellt, die für diese Erkrankungen anfällig sind oder daran leiden, und die Wirkung der Behandlung auf sie zu verfolgen.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen Testkit bereitzustellen, der bei diesen Verfahren nützlich ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgaben der vorliegenden Erfindung können gelöst werden, indem die Tartrat-resistente saure Phosphatase 5b (TRAP 5b) als Marker für die Knochenresorptionsrate in einem Immuntest verwendet wird.
Die Erfindung stellt folglich ein Verfahren zur Messung der Knochenresorptionsrate in einem Probanden bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Tartrat-resistente saure Phosphatase 5b (TRAP 5b) in einer Körperflüssigkeitsprobe aus dem Probanden durch Immuntest bestimmt wird, wobei die TRAP 5b-Menge die Knochenresorptionsrate widerspiegelt.
Insbesondere umfasst der Immuntest zur Messung der Knochenresorptionsrate in einem Probanden die Schritte der

a) Bestimmung von Tartrat-resistenter saurer Phosphatase 5b (TRAP 5b) in einer Körperflüssigkeitsprobe aus dem Probanden, indem die in der Körperflüssigkeitsprobe vorliegende TRAP an einen Antikörper bindet, der Gesamt-TRAP (TRAP 5a und TRAP 5b) bindet, und
b) Bestimmung der Aktivität der gebundenen TRAP bei einem pH-Wert zwischen 5,7 und 6,3, wobei die Menge der TRAP-Aktivität, die hauptsächlich TRAP 5b ausmacht, die Knochenresorptionsrate widerspiegelt.

Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Diagnose einer mit der Änderung der Knochenresorptionsrate assoziierten Störung in einem Probanden bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Tartrat-resistente saure Phosphatase 5b (TRAP 5b) in einer Körperflüssigkeitsprobe aus dem Probanden durch Immuntest bestimmt wird, wobei eine anormale Menge von TRAP 5b einer mit der Änderung der Knochenresorptionsrate assoziierten Störung anzeigt.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Überwachung der Wirkung eines Arzneistoffs zur Behandlung einer mit einer Erhöhung der Knochenresorptionsrate assoziierten Störung in einem Probanden bereit, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Tartrat-resistente saure Phosphatase 5b (TRAP 5b) in Körperflüssigkeitsproben aus dem Probanden durch Immuntest bestimmt wird, wobei eine verringerte Menge von TRAP 5b die Wirkung des Arzneistoffs anzeigt.
Noch weiter bereitgestellt wird ein Verfahren zum Absuchen von Probanden auf die Anfälligkeit für mit einer Erhöhung der Knochenresorptionsrate assoziierte Störungen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Tartrat-resistente saure Phosphatase 5b (TRAP 5b) in Körperflüssigkeitsproben aus dem Probanden durch Immuntest bestimmt wird, wobei eine erhöhte Menge von TRAP 5b die Anfälligkeit für die Störung anzeigt.
Die Erfindung stellt ferner einen Testkit bereit, umfassend Antikörper, die für die Tartrat-resistente saure Phosphatase 5a (TRAP 5a) spezifisch sind, und Antikörper, die Gesamt-TRAP erkennen. Dieser Testkit ist nützlich für die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkung der Östrogenbehandlung auf die Menge von Gesamt-TRAP und TRAP 5b in Seren.
2 zeigt die negative Korrelation zwischen Serum-TRAP-5b und Knochenmineraldichte (KMD).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wenn TRAP 5b an Stelle von Gesamt-TRAP in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Probanden spezifisch bestimmt wird, wird eine signifikant bessere Korrelation zwischen dem TRAP-Gehalt und der Knochenresorptionsrate erreicht. Man fand unerwartet heraus, dass es möglich ist, TRAP 5b in einem Immuntest spezifisch zu bestimmen, indem Antikörper gegen TRAP verwendet werden. Überraschenderweise konnte man Antikörper finden, die zwischen TRAP 5a und TRAP 5b unterschieden. Jedoch müssen die in der vorliegenden Erfindung vorliegenden Antikörper nicht unbedingt entweder für TRAP 5a oder TRAP 5b spezifisch sein, sondern es können auch Antikörper verwendet werden, die Gesamt-TRAP erkennen. In jenem Fall wird dann die Unterscheidung zwischen den beiden Enzymformen durch andere Mittel nach der Reaktion mit nichtspezifischen anti-TRAP-Antikörpern erreicht. Man fand z.B. heraus, dass die TRAP-Aktivität in einem pH-Bereich gemessen werden konnte, bei dem praktisch die gesamte TRAP-Aktivität von TRAP 5b stammte. Durch diese Befunde kann ein verbessertes Verfahren zur Diagnose von primären und sekundären Knochenerkrankungen bereitgestellt werden, die mit Änderungen der Knochenresorptionsrate assoziiert sind, wie metabolische Knochenerkrankungen oder Knochenläsionen oder Metastasen und insbesondere Osteoporose. Das Verfahren zur Messung der TRAP 5b-Menge kann auch bei der Überwachung der Wirkung auf die Behandlung der Knochenerkrankungen verwendet werden, z.B. die Wirkung von Östrogen oder der Biphosphonatbehandlung von Osteoporose. Es kann auch bei der Durchmusterung von Personen verwendet werden, die für erhöhte Knochenresorption anfällig sind, und daher die Behandlung zur Vermeidung von Knochenfrakturen ermöglichen.
„Proband", wie in diesem Zusammenhang verwendet, bedeutet einen Säuger, vorzugsweise einen Menschen.
„TRAP", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich auf die Tartrat-resistente saure Phosphatase (EC 3.1.3.2.), die zur Klasse Typ 5 der sauren Phosphatasen gehört, einschließlich beider Formen 5a und 5b des Enzyms.
„TRAP 5b" bezieht sich auf die enzymatische Form b von TRAP, der Sialsäure in ihrer Kohlenhydratkette fehlt und die ein pH-Optimum zwischen etwa 5,7 und 6,0 besitzt.
„TRAP 5a" bezieht sich auf die enzymatische Form a von TRAP, die Sialsäure in ihrer Kohlenhydratkette enthält und ein pH-Optimum von etwa 4,9 besitzt.
Die Enzyme werden z.B. bei Lam W. K. W. et al. (Clin. Chem. 24(7):1105-1108, 1978) und Lam W. K. W. et al. (Clin. Biochem. 14, 177-181, 1981) weiter beschrieben.
Die Körperflüssigkeitsprobe ist vorzugsweise, aber nicht unbedingt, eine Blutprobe wie Plasma oder insbesondere Serum.
Beim erfindungsgemäßen Immuntest werden Antikörper gegen TRAP verwendet. Mit „Immuntest" ist in diesem Zusammenhang jeder Test gemeint, bei dem die zu bestimmende Verbindung durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion nachgewiesen wird. Der Immuntest kann ein direkter oder indirekter, kompetitiver oder nicht-kompetitiver Test sein. Es kann ein Sandwich-Verfahren oder ein einfaches Verfahren sein. Entweder kann das Antigen oder der Antikörper markiert sein, um den Nachweis zu verstärken. Die Prinzipien dieser Verfahren sind im Fachgebiet gut bekannt.
„Antikörper gegen TRAP", wie in der vorliegenden Erfindung verwendet, schließen sowohl 5a- und 5b-nichtspezifische und 5a-spezifische anti-TRAP-Antikörper ein.
Die Antikörper gegen TRAP sind vorzugsweise monoclonale Antikörper. Die monoclonalen Antikörper können Antikörper sein, die fähig sind, zwischen TRAP 5b und TRAP 5a zu unterscheiden. Antikörper, die zwischen TRAP 5b und TRAP 5a unterscheiden können, können entweder TRAP 5a-spezifisch sein oder sie können aus einer Kombination der spezifischen Antikörper mit Antikörpern, die die Gesamt-TRAP d.h. sowohl TRAP 5b als auch TRAP 5a erkennen, bestehen.
Die Antikörper, die zwischen TRAP 5a und TRAP 5b unterscheiden können, können auf mehrere Arten verwendet werden, um die Konzentration von TRAP 5b in einer Körperflüssigkeit zu bestimmen.
Es ist möglich, eine Kombination von Antikörpern, die für TRAP 5a spezifisch sind, und Antikörpern, die Gesamt-TRAP erkennen, zu verwenden. In jenem Fall wird TRAP 5a zuerst an die TRAP 5a-spezifischen Antikörper gebunden und dann wird die restliche Aktivität von ungebundener TRAP, die die Form 5b sein muss, unter Verwendung der Antikörper, die beide Enzymformen erkennen, bestimmt.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Antikörper können auf jede herkömmliche Weise z.B. mit einer radioaktiven Markierung, einer Enzymmarkierung, einer Chemilumineszenzmarkierung oder einer Fluoreszenzmarkierung markiert werden, um ihren Nachweis zu verstärken. Das Streptavidin-Biotinyl-System stellt einen empfindlichen Nachweis bereit. Besonders gute Ergebnisse wurden unter Verwendung des Delfia-Systems erhalten, was ein zeitaufgelöster Fluorimmuntest ist, der z.B. bei Hellman J. et al. J. Bone Miner. Res. 11:1165-1175, 1996; und Hemmilä I. et al., Anal. Biochem. 137:335-343, 1984 beschrieben wird. Es wird ferner bevorzugt, mindestens zwei verschiedene Antikörper zu verwenden, die verschiedene Epitope von TRAP erkennen. Dies ermöglicht einen hochempfindlichen und reproduzierbaren zweiseitigen Fluorimmuntest.
Der Testkit der vorliegenden Erfindung umfasst Antikörper, die zwischen TRAP 5b und TRAP 5a unterscheiden können. Dieser Testkit ist bei der Beurteilung der Knochenresorptionsrate und bei der erfindungsgemäßen Diagnose von Störungen nützlich, die mit Änderungen der Knochenresorptionsrate assoziiert sind. Der Testkit kann Antikörper umfassen, die TRAP 5a spezifisch erkennen, zusammen mit Antikörpern, die Gesamt-TRAP erkennen, oder können TRAP 5a-spezifische Antikörper umfassen. Die Antikörper sind vorzugsweise monoclonale Antikörper.
Eine weitere Möglichkeit, die TRAP 5b-Aktivität nach der vorliegenden Erfindung zu messen, ist, ein herkömmliches spektrometrisches Verfahren für die saure Phosphatase-Aktivität in Gegenwart von Tartrat (vgl. z.B. Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10):1444-1452, 1996) bei einem pH-Bereich durchzuführen, der innerhalb des Enzymaktivitätspeaks von TRAP 5b, aber außerhalb demjenigen von TRAP 5a liegt. Das pH-Optimum von TRAP 5a beträgt etwa 4,9 und das von TRAP 5b beträgt etwa 5,7 bis 6,0, wie von den Erfindern gemessen. Die Gesamt-TRAP wird normalerweise bei pH 5,5 gemessen. Jedoch fand man heraus, dass ein geeigneter pH-Bereich für die Bestimmung von TRAP 5b in Gegenwart von TRAP 5a 5,7 – 6,3, vorzugsweise 5,8 – 6.2 und besonders 6,0 – 6,2 ist. Ein pH-Wert von 6,1 wird am stärksten bevorzugt. Obwohl das spektrophotometrische Verfahren nicht zwischen TRAP 5a und TRAP 5b unterscheidet, ist die innerhalb des pH-Bereiches gemessene Aktivität im Wesentlichen TRAP 5b-Aktivität. Die Aktivität von TRAP 5a bei pH 6,1 macht nur etwa 20 – 30 % der Aktivität bei pH 4,9 aus. (Falls TRAP 5b in Abwesenheit von TRAP 5a bestimmt wird, wird eine etwas höhere Aktivität bei einem pH-Wert von etwa 5,9 erreicht). Bei einem pH-Wert von 6,1 beträgt das Verhältnis der Aktivität von 5a zur Gesamt-TRAP-Aktivität weniger als 10%. Deshalb macht die Form 5b mehr als 90 % der gemessenen TRAP-Aktivität bei einem pH-Wert von 6,1 aus.
Durch Ausnutzen des Unterschieds im pH-Optimum von TRAP 5b und TRAP 5a im Immuntest, wird ein billiges und einfaches Verfahren zur Bestimmung von TRAP 5b bereitgestellt. Dieses Verfahren ermöglicht die Verwendung von nichtspezifischen TRAP-Antikörpern (binden sowohl TRAP 5a als auch TRAP 5b), die zuerst verwendet werden, um die Gesamt-TRAP der Körperflüssigkeit zu binden.
Danach wird die TRAP-Aktivität z.B. spektrometrisch im pH-Bereich zwischen 5,7 und 6,3 gemessen, der die TRAP 5b-Aktivität begünstigt.
Der Unterschied beim Kohlenhydratgehalt kann auch verwendet werden, um zwischen TRAP 5b und TRAP 5a zu unterscheiden. Gesamt-TRAP wird beispielsweise zuerst von Antikörpern gebunden, die sowohl 5a als auch 5b erkennen. Das gebundene Gesamt-TRAP lässt man dann mit markiertem Galanthus-Nivafis-Agglutinin (GNA) oder Concanavalin A (ConA)-Lektin binden, das an Kohlenhydrate bindet, die eine terminale Mannose besitzen, wie TRAP 5b aber das nicht an TRAP 5a bindet, da es eine terminale Sialinsäure in seiner Kohlenhydratkette besitzt.
Natürlich ist es möglich, jegliche Kombinationen der vorstehend beschriebenen Verfahren zu verwenden, um TRAP 5b in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Die Erfindung wird ferner in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen beschrieben.
Beispiel 1
Monoclonale Antikörper wurden unter Verwendung von Standdardvorschriften hergestellt. BALB/c-Mäusen wurde viermal in zweiwöchigen Intervallen (jeweils 20 μg/Maus) gereinigte menschliche Knochen-TRAP (Halleen J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10):1444-1452, 1996), emulgiert in Freud'schem Adjuvans, injiziert, und anschließend wurden die Tiere getötet. Milzzellen wurden mit der Myelomzelllinie p3-X63-Ag8.653 hybridisiert und die Hybridome wurden in HAT-Medium gezüchtet. Die Clone wurde durch Inkubieren von 100 μl Überstand in mit anti-Maus-IgG beschichteten Mikrotiterplattenvertiefungen durchmustert, gefolgt von einer Inkubation von gereinigter menschlicher Knochen-TRAP. Schließlich wurde die Aktivität des gebundenen Enzyms durch 1-stündige Inkubation von 200 μl Reaktionsgemisch (0,1 M Natriumacetat, pH 6,0, 8 mM pNPP und 40 mM Natriumtartrat) in den Vertiefungen bestimmt. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 16 μl 0,5 M Natriumhydroxid gestoppt. Die Absorption bei 405 nm wurde mit einem ELISA-Plattenlesegerät gemessen. Zwei monoclonale TRAP-Antikörper, O1A und J1B, wurden erhalten. Beide Antikörper erkannten sowohl TRAP 5a als auch TRAP 5b, jedoch verschiedene Epitope.
Man fand heraus, dass ein monoclonaler Antikörper 4E6, der unter Verwendung von rekombinanter TRAP als Antigen entwickelt wurde (Chamberlain P. et al. Clin.
Chem. 41(10):1495-1499, 1995), nicht mit aus Knochen isolierter und gereinigter TRAP reagierte. Man fand heraus, dass er stattdessen die Sialinsäure-enthaltende 5a-Form von TRAP spezifisch erkannte. 400 ng 4E6 wurden 1 Std. in mit anti-Maus-IgG beschichteten Mikrotiterplattenvertiefungen inkubiert. Serumproben (200 μl) wurden dann 1 Std. in den Vertiefungen inkubiert. Als Kontrolle wurden Proben aus denselben Seren gleichermaßen in leeren mit anti-Maus-IgG beschichteten Mikrotiterplattenvertiefungen inkubiert. Dreifache Ansätze mit 50 μl wurden aus den Vertiefungen entnommen und mit 100 μl Delfia-Testpuffer, enthaltend 400 ng Europium-markiertem O1a und biotinyliertem J1B, gemischt. Das Gemisch wurde 2 Std. in Streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatten unter konstantem Schütteln in einem Delfiaplatten-Schüttler (1296-001 Delfiaplatten-Schüttler, Wallac Oy, Turku, Finnland) inkubiert und dann mit Delfia-Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Vertiefungen mit Delfia-Verstärkerlösung gefüllt, 5 Minuten geschüttelt und die gebundene Fluoreszenz wurde gemessen. Dieses Verfahren ist z.B. bei Hellmann J. et al. J. Bone Miner. Res. 11:1165-1175, 1996 und Hemmilä I. et al., Anal. Biochem. 137:335-343. 1984 genauer beschrieben.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Man fand heraus, dass die TRAP 5a-Menge fast dieselbe bei prämenopausalen und postmenopausalen Frauen war, aber der Unterschied bei der TRAP 5b-Menge zwischen den beiden Gruppen signifikant war. Die spezifische Bestimmung von TRAP 5b im Vergleich zu Gesamt-TRAP verbesserte somit signifikant die Nützlichkeit von TRAP als Marker für die Knochenresorption. Es wurde auch bestätigt, dass der TRAP 5b-Spiegel bei Kindern signifikant höher ist als bei Erwachsenen, während der TRAP 5a-Spiegel fast konstant ist.
Beispiel 2
Mit anti-Maus-IgG beschichtete Mikrotiterplattenvertiefungen wurden vorgewaschen und der monoclonale TRAP-Antikörper O1A (400 ng Antikörper/Vertiefung) wurde 1 Stunde in den Vertiefungen unter konstantem Schütteln inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen und Serumproben von 40 gesunden Erwachsenen wurden 1 Stunde in den Vertiefungen unter konstantem Schütteln inkubiert. Die Vertiefungen wurden gewaschen und die Aktivität von gebundener TRAP wurde gemessen, indem 200 ml eines Reaktionsgemisches (0,1 M Natriumacetat, pH 5,9, 8 mM pNPP und 40 mM Natriumtartrat) 1 Stunde in den Vertiefungen inkubiert wurden. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 25 ml 0,32 M Natriumhydroxid gestoppt. Die Absorption bei 405 nm wurde mit einem ELISA-Plattenlesegerät gemessen.
Basierend auf den Ergebnissen wurden zwei Gruppen gebildet: „Hoch", die jene acht Proben mit der höchsten Gesamtaktivität von TRAP enthielt, und „Niedrig", die jene acht Proben mit der niedrigsten Gesamtaktivität von TRAP enthielt. TRAP 5a und TRAP 5b wurden in den beiden Gruppen spezifisch bestimmt, indem zuerst 5a an Antikörper 4E6 gebunden und dann die nicht gebundene Aktivität bestimmt wurde, d.h. TRAP 5b mit Antikörper O1A, wie vorstehend beschrieben. Die TRAP 5a-Aktivität wurde bei einem pH-Wert von 5,0 und die TRAP 5b-Aktivität bei einem pH-Wert von 5,9 gemessen. Die Ergebnisse (Absorption bei 405 nm) sind in Tabelle 2 dargestellt. Man kann sehen, dass beide Gruppen etwa dieselbe Menge TRAP 5a enthielten, während die TRAP 5b-Menge in der „Höher"-Gruppe bemerkenswert höher war. Tabelle 2. TRAP-Aktivität in den Seren mit hoher und niedriger Aktivität
Schließlich wurde Gesamt-TRAP aus beiden Gruppen durch Bindung an Antikörper O1A bestimmt, und die Aktivität von gebundener TRAP wurde bei unterschiedlichen pH-Werten gemessen, wie vorstehend beschrieben. Die Ergebnisse (Absorption bei 405 nm) sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass beim Anstieg des pH-Wertes der Unterschied zwischen den beiden Gruppen zunimmt. Der beste Unterschied (2,46) wurde bei einem pH-Wert von 6,1 erreicht. Tabelle 3. Die TRAP-Aktivität bei verschiedenen pH-Werten
Beispiel 3
Die Aktivität von Serum-TRAP 5a und -TRAP 5b wurde bei verschiedenen pH-Werten untersucht. Dies erfolgte durch Bindung von TRAP 5a aus Serumproben unter Verwendung von Antikörper 4E6 und dann durch Bindung der restlichen TRAP 5b unter Verwendung von Antikörper O1A. Die Aktivität von gebundener TRAP wurde gemessen, wie im ersten Abschnitt von Beispiel 2 beschrieben, mit Ausnahme, dass der pH-Wert des Acetatpuffers wie angegeben geändert wurde. Tabelle 4 zeigt die Absorptionswerte (A₄₀₅), die für TRAP 5a und TRAP 5b bei unterschiedlichen pH-Werten unter Verwendung von pNPP als Substrat erhalten wurden. Die Spalte % 5a gibt das Verhältnis der 5a-Aktivität zur Gesamt-TRAP-Aktivität (5a + 5b) bei jedem pH-Wert an, beispielsweise bei einem pH-Wert von 4,7 ist % 5a 0,256/0,354 = 72%. Tabelle 4
Basierend auf Tabelle 4 scheint pH 6,1 der beste pH-Wert zum spezifischen Nachweis von TRAP 5b zu sein, da TRAP 5a nur sehr geringfügig stört (9,3%), während TRAP 5b fast genauso aktiv ist wie im pH-Optimumbereich (5,7-5,9). Gewöhnlich wird die Serum-TRAP-Aktivität unter Verwendung eines pH-Wertes von 5,5 nachgewiesen, da dies der optimale pH-Wert ist, der beobachtet wird, wenn die Gesamtserum-TRAP-Aktivität gemessen wird (was auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die kombinierte Aktivität von TRAP 5a und TRAP 5b bei pH 5,5 am höchsten ist, wie in der vorstehend Tabelle zu sehen ist, Spalte 5a + 5b).
Beispiel 4
Das TRAP 5b-spezifische Verfahren von Beispiel 3, bei dem Serum-TRAP-5b-Aktivität, gebunden an O1A, bei einem pH-Wert von 6,1 gemessen wird, wird dann mit einem zweiseitigen Test verglichen, bei dem Gesamtserum-TRAP durch Bindung von TRAP an O1A bestimmt wurde, und Gesamt-TRAP unter Verwendung des Delfia-Systems mit Europium-markiertem J1B verwendet wurden. Serumproben aus einer Gruppe postmenopausaler Frauen (unter 70 Jahren) wurden verwendet, um die Wirkung einer 6-monatigen Östrogenersatztherapie (HRT) auf die Serum-TRAP-Menge zu untersuchen. Gemäß dem TRAP 5b-spezifischen Verfahren gab es nach 6 Monaten HRT einen 48%-igen Abfall bei der TRAP 5b-Aktivität (p = 0,001), während in der Kontrollgruppe (die Placebo anstelle von Östrogen erhielt) nach 6 Monaten ein 2%-iger Anstieg bei der TRAP 5b-Aktivität beobachtet wurde. Der zweiseitige Test für Gesamt-TRAP wies nach 6 Monaten einen 15 – 20%-igen Rückgang in beiden Gruppen nach. Diese Ergebnisse zeigen, dass das zweiseitige Verfahren zur Messung von Gesamt-TRAP beim Nachweis von Änderungen der Knochenresorptionsrate nach 6 Monaten HRT nicht empfindlich ist, während das Verfahren, das TRAP 5b spezifisch misst, nach 6 Monaten HRT einen fast 50%-igen Rückgang nachweist, was nahe legt, dass es äußerst nützlich bei der Überwachung der HRT-Behandlung von Osteoporosepatienten ist. Daher ist TRAP 5b ein signifikant besserer Marker zum Nachweis von Änderungen der Knochenresorptionsrate während der Östrogenersatztherapie als der zweiseitige Test, der Gesamt-TRAP misst. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Beispiel 5
Schließlich wurde die Korrelation der Serum-TRAP-5b-Mengen und von Gesamtserum TRAP zur Knochenmineraldichte (KMD) unter Verwendung einer Reihe von Serumproben postmenopausaler Frauen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass TRAP 5b eine signifikant bessere negative Korrelation mit KMD (r = –0,540, p = 0,001, ***) aufweist als Gesamt-TRAP (r = –0,156, p = 0,1488, keine signifikante Korrelation). 2 zeigt die Korrelationskurve für TRAP 5b mit KMD.
Diese Daten zeigen überzeugend, dass TRAP 5b ein signifikant spezifischerer und sensitiverer Marker der Knochenresorptionsrate als Gesamt-Serum-TRAP ist.

Claims

Verfahren zum Bestimmen der Knochenresorptionsrate, indem ein Immuntest zum Bestimmen von tartratbeständiger saurer Phosphatase 5b (TRAP 5b) in einer Körperflüssigkeitsprobe eines Objekts durchgeführt wird, wobei die Menge von TRAP 5b die Knochenresorptionsrate widerspiegelt, in welchem Immuntest: a) die in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltene TRAP zuerst mit einem Antikörper gebunden wird, der die gesamte TRAP (TRAP 5a und TRAP 5b) bindet, nachdem die gebundene TRAP-Aktivität bei einem pH-Wert von 5,7 bis 6,3 bestimmt wird; oder b) die in der Körperflüssigkeitsprobe enthaltene TRAP zuerst mit einem TRAP 5a -spezifischen Antikörper gebunden wird, nachdem die ungebundene TRAP-Aktivität bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei monoklonale Antikörper gegen tartratbeständige saure Phosphatase (TRAP) benutzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die TRAP-Aktivität im Punkt (a) spektrofotometrisch bei einem pH-Wert von ca. 6,1 bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ungebundene TRAP-Aktivität im Punkt (b) spektrofotometrisch oder in einem Immuntest bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die ungebundene TRAP-Aktivität im Punkt (b) bei einem pH-Wert von 5,7 bis 6,3 bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die ungebundene TRAP-Aktivität bei einem pH-Wert von ca. 6,1 bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei zumindest zwei verschiedene monoklonale Antikörper benutzt werden, die verschiedene Epitope von TRAP erkennen.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei ein zeitlich aufgelöster Fluoroimmuntest angewandt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Körperflüssigkeitsprobe eine Serumprobe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung beim Diagnostizieren einer mit einer Änderung der Knochenresorptionsrate in einem Objekt zusammenhängenden Funktionsstörung, wobei eine anormale Menge von TRAP 5b eine mit einer Änderung der Knochenresorptionsrate zusammenhängende Funktionsstörung indiziert.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die besagte Funktionsstörung Osteoporose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung bei der Überwachung der Wirkung eines Medikaments zur Behandlung einer mit einem Anstieg der Knochenresorptionsrate in einem Objekt zusammenhängenden Funktionsstörung, wobei eine verminderte Menge von TRAP 5b die Wirkung des besagten Medikaments indiziert:
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Funktionsstörung Osteoporose ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Verwendung beim Sieben von Objekten in Bezug auf Anfälligkeit für mit einer angestiegenen Knochenresorptionsrate zusammenhängende Funktionsstörungen, wobei ein erhöhtes TRAP 5b -Niveau Anfälligkeit für die besagte Funktionsstörung indiziert.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die besagte Funktionsstörung Osteoporose ist.
Testverpackung umfassend TRAP 5a -spezifische Antikörper und Antikörper, die die gesamte TRAP erkennen.