JP3523200B2 - 骨吸収速度を測定する方法 - Google Patents
骨吸収速度を測定する方法Info
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Description
【０００１】［発明の分野］
本発明は、骨吸収速度を測定する方法、特にそのための
免疫測定法に関する。本発明は更に、骨粗鬆症のような
骨吸収速度の変化に関連のある疾患を診断する方法、お
よび前記方法に利用可能なテストキットに関する。更に
本発明は、被検者の骨吸収速度の増加に関連のある疾患
を治療するための薬剤の効果をモニターする方法、およ
び前記疾患に対する感受性について被検者をスクリーニ
ングする方法に関する。骨吸収速度の特異的マーカーを
使用することが開示されている。
免疫測定法に関する。本発明は更に、骨粗鬆症のような
骨吸収速度の変化に関連のある疾患を診断する方法、お
よび前記方法に利用可能なテストキットに関する。更に
本発明は、被検者の骨吸収速度の増加に関連のある疾患
を治療するための薬剤の効果をモニターする方法、およ
び前記疾患に対する感受性について被検者をスクリーニ
ングする方法に関する。骨吸収速度の特異的マーカーを
使用することが開示されている。
【０００２】［技術的背景］
骨吸収速度の変化に関連のある幾つかの疾患があるが、
最も広範囲に広がっているのは骨粗鬆症であり、これは
閉経後の女性にみられる疾患である。骨粗鬆症は、骨質
量が低下し、その結果、骨折しやすい弱い骨格になるこ
とにより引き起こされる。骨粗鬆症により起こる骨折お
よび疾病の治療は、患者の苦悩は言うまでもなく社会に
とっても費用がかかる。従ってその厳しい結果を避ける
ため、骨粗鬆症に罹患する人を診断する必要がある。骨
粗鬆症は、例えばエストロゲン置換もしくはビホスホネ
ート療法による治療が成功している。
最も広範囲に広がっているのは骨粗鬆症であり、これは
閉経後の女性にみられる疾患である。骨粗鬆症は、骨質
量が低下し、その結果、骨折しやすい弱い骨格になるこ
とにより引き起こされる。骨粗鬆症により起こる骨折お
よび疾病の治療は、患者の苦悩は言うまでもなく社会に
とっても費用がかかる。従ってその厳しい結果を避ける
ため、骨粗鬆症に罹患する人を診断する必要がある。骨
粗鬆症は、例えばエストロゲン置換もしくはビホスホネ
ート療法による治療が成功している。
【０００３】骨密度を測定するための幾つかの器械およ
び方法がある。しかし、使用される装置および手法は、
多大な空間および人員を必要とし、測定に時間を要し、
患者が常駐しなければならないため、費用がかかる。骨
粗鬆症に関する限り、その人口の年齢分布が、ますます
望ましくないものになっているため、骨吸収速度を測定
するための、特異的で迅速で簡便で安価なインビトロの
方法を開発することが重要である。
び方法がある。しかし、使用される装置および手法は、
多大な空間および人員を必要とし、測定に時間を要し、
患者が常駐しなければならないため、費用がかかる。骨
粗鬆症に関する限り、その人口の年齢分布が、ますます
望ましくないものになっているため、骨吸収速度を測定
するための、特異的で迅速で簡便で安価なインビトロの
方法を開発することが重要である。
【０００４】骨は、二つの主要な細胞タイプ、骨形成性
骨芽細胞および骨吸収性破骨細胞から実質的に成ってい
る。通常これら二つの細胞タイプはバランスを保ってお
り、破骨細胞は、骨芽細胞が形成したのと同量の骨を吸
収する。骨粗鬆症は、破骨細胞の活性が増大し、その結
果、骨芽細胞が産生するよりも多くの骨を吸収する疾患
に至った結果である。
骨芽細胞および骨吸収性破骨細胞から実質的に成ってい
る。通常これら二つの細胞タイプはバランスを保ってお
り、破骨細胞は、骨芽細胞が形成したのと同量の骨を吸
収する。骨粗鬆症は、破骨細胞の活性が増大し、その結
果、骨芽細胞が産生するよりも多くの骨を吸収する疾患
に至った結果である。
【０００５】酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲ
ＡＰ，ＥＣ 3.1.3.2）は、その電気泳動の移動度により
タイプ５クラスの酸性ホスファターゼに属するため、タ
イプ５酸性ホスファターゼとも称される。少なくとも７
つの酸性ホスファターゼを、酸性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により同定することができる。これらのうち
最も酸性であるのは、バンド５の酸性ホスファターゼ
（Acp５）であり、これだけが酒石酸塩による阻害に対
して唯一抵抗性を示したため、名称はＴＲＡＰである。
この酵素は、その分子の活性部位にスピン結合した鉄ユ
ニットを有する塩基性糖蛋白質である。ＴＲＡＰの二核
の鉄ユニットは、蛋白質を紫色にする二つの第二鉄イオ
ンを有し、紫色酸性ホスファターゼとも称される。この
蛋白質は、分子量３２ｋｄである。この酵素を、例えば
β−メルカプトエタノールにより還元すると、第二鉄イ
オンの一つが還元され、酵素はピンク色になる。ＴＲＡ
Ｐは、インビトロで蛋白質チロシンホスファターゼとし
て機能することができ、そのアミノ酸配列は、リン蛋白
質ホスファターゼのアミノ酸配列と相同な領域を有す
る。しかし、その天然の基質はまだ知られていない。
ＡＰ，ＥＣ 3.1.3.2）は、その電気泳動の移動度により
タイプ５クラスの酸性ホスファターゼに属するため、タ
イプ５酸性ホスファターゼとも称される。少なくとも７
つの酸性ホスファターゼを、酸性ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により同定することができる。これらのうち
最も酸性であるのは、バンド５の酸性ホスファターゼ
（Acp５）であり、これだけが酒石酸塩による阻害に対
して唯一抵抗性を示したため、名称はＴＲＡＰである。
この酵素は、その分子の活性部位にスピン結合した鉄ユ
ニットを有する塩基性糖蛋白質である。ＴＲＡＰの二核
の鉄ユニットは、蛋白質を紫色にする二つの第二鉄イオ
ンを有し、紫色酸性ホスファターゼとも称される。この
蛋白質は、分子量３２ｋｄである。この酵素を、例えば
β−メルカプトエタノールにより還元すると、第二鉄イ
オンの一つが還元され、酵素はピンク色になる。ＴＲＡ
Ｐは、インビトロで蛋白質チロシンホスファターゼとし
て機能することができ、そのアミノ酸配列は、リン蛋白
質ホスファターゼのアミノ酸配列と相同な領域を有す
る。しかし、その天然の基質はまだ知られていない。
【０００６】このチロシンのリン酸化は、多くの細胞の
機能および分化に関して重要な制御メカニズムである。
ＴＲＡＰは、破骨細胞の機能を制御する際に重要な役割
を果たすと考えられる。ＴＲＡＰは、その特質で反応し
たり化合物を破壊したりできる水酸基を産生することが
できる。破骨細胞は、骨吸収の間に酸素遊離基を産生
し、その酸素遊離基が骨吸収において意味のあることは
明らかである。その由来は分からないが、少なくとも一
部の水酸基は、ＴＲＡＰにより形成されると思われる。
ＴＲＡＰを通常含有する細胞タイプ、即ち破骨細胞およ
び肺胞マクロファージはともに、化合物を取り込み、そ
れらを分解する。この共通の特性により、ＴＲＡＰが骨
吸収に関与しているという仮説は強く支持される。
機能および分化に関して重要な制御メカニズムである。
ＴＲＡＰは、破骨細胞の機能を制御する際に重要な役割
を果たすと考えられる。ＴＲＡＰは、その特質で反応し
たり化合物を破壊したりできる水酸基を産生することが
できる。破骨細胞は、骨吸収の間に酸素遊離基を産生
し、その酸素遊離基が骨吸収において意味のあることは
明らかである。その由来は分からないが、少なくとも一
部の水酸基は、ＴＲＡＰにより形成されると思われる。
ＴＲＡＰを通常含有する細胞タイプ、即ち破骨細胞およ
び肺胞マクロファージはともに、化合物を取り込み、そ
れらを分解する。この共通の特性により、ＴＲＡＰが骨
吸収に関与しているという仮説は強く支持される。
【０００７】Hayman, A. R. et al.（Development 122:
3151-3162, 1996）は、マウスでＴＲＡＰ遺伝子を標的
破壊することによりＴＲＡＰの役割を研究した。ＴＲＡ
Ｐ遺伝子を欠損するマウスは、軟骨内骨化が混乱し、軽
度の大理石骨病であることを彼らは見出した。ＴＲＡＰ
が、骨の発達の際の、軟骨の正常な鉱化作用に必要とさ
れること、更にＴＲＡＰが、骨基質の吸収に重大に寄与
することにより、成人骨格の完全性（integrity）およ
び代謝回転を維持していることを彼らは結論づけた。
3151-3162, 1996）は、マウスでＴＲＡＰ遺伝子を標的
破壊することによりＴＲＡＰの役割を研究した。ＴＲＡ
Ｐ遺伝子を欠損するマウスは、軟骨内骨化が混乱し、軽
度の大理石骨病であることを彼らは見出した。ＴＲＡＰ
が、骨の発達の際の、軟骨の正常な鉱化作用に必要とさ
れること、更にＴＲＡＰが、骨基質の吸収に重大に寄与
することにより、成人骨格の完全性（integrity）およ
び代謝回転を維持していることを彼らは結論づけた。
【０００８】相当量のＴＲＡＰを含有する唯一のヒト正
常細胞は、破骨細胞と活性化マクロファージだけであ
る。ある病理学的状況においては、他の細胞にＴＲＡＰ
を見出すこともできる。ＴＲＡＰは、骨吸収の間に破骨
細胞から血液循環に分泌されることが見出された。従っ
て、血清中のＴＲＡＰ濃度が、骨吸収のマーカーとして
提案され、血清中のＴＲＡＰ濃度は、骨吸収速度と互い
に関連があることが見出された（Kraenzlin M. E. et a
l. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolis
m 71(2): 442-451, 1990; Cheung C. K. et al. Clin.
Chem. 41(5): 679-686, 1995; Chamberlain P. et al.
Clin. Chem. 41(10): 1495-1499, 1995およびHalleen
J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11
(10): 1444-1452, 1996）。
常細胞は、破骨細胞と活性化マクロファージだけであ
る。ある病理学的状況においては、他の細胞にＴＲＡＰ
を見出すこともできる。ＴＲＡＰは、骨吸収の間に破骨
細胞から血液循環に分泌されることが見出された。従っ
て、血清中のＴＲＡＰ濃度が、骨吸収のマーカーとして
提案され、血清中のＴＲＡＰ濃度は、骨吸収速度と互い
に関連があることが見出された（Kraenzlin M. E. et a
l. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolis
m 71(2): 442-451, 1990; Cheung C. K. et al. Clin.
Chem. 41(5): 679-686, 1995; Chamberlain P. et al.
Clin. Chem. 41(10): 1495-1499, 1995およびHalleen
J. et al. Journal of Bone and Mineral Research 11
(10): 1444-1452, 1996）。
【０００９】1978年、Lam W. K. W. et al.（Clin. Che
m. 24(7): 1105-1108, 1978）は、成人および子供の血
清中におけるＴＲＡＰの生化学的特性の研究について報
告した。改良した電気泳動法により、彼らは二つの別個
のＴＲＡＰバンドを発見し、これらを５ａおよび５ｂと
名付けた。ＴＲＡＰ ５ａは、ＴＲＡＰ ５ｂより低い最
適ｐＨを有する。両酵素の形態ＴＲＡＰ ５ａおよびＴ
ＲＡＰ ５ｂは、ともにヒト血清中で発見された。ＴＲ
ＡＰ ５ａの量は、成人および子供において一定である
が、ＴＲＡＰ ５ｂの量は、子供で高いことが見出され
た。
m. 24(7): 1105-1108, 1978）は、成人および子供の血
清中におけるＴＲＡＰの生化学的特性の研究について報
告した。改良した電気泳動法により、彼らは二つの別個
のＴＲＡＰバンドを発見し、これらを５ａおよび５ｂと
名付けた。ＴＲＡＰ ５ａは、ＴＲＡＰ ５ｂより低い最
適ｐＨを有する。両酵素の形態ＴＲＡＰ ５ａおよびＴ
ＲＡＰ ５ｂは、ともにヒト血清中で発見された。ＴＲ
ＡＰ ５ａの量は、成人および子供において一定である
が、ＴＲＡＰ ５ｂの量は、子供で高いことが見出され
た。
【００１０】別の論文（Chen et al., Clin. Chem. 25,
719-722, 1979）において、同グループの研究者らは、
正常な子供の血清で酸性ホスファターゼ活性が高いこと
の意義を研究した。彼らは、バンド５に相当する血清Ｔ
ＲＡＰの活性が、巨細胞腫にはあるが、骨原性肉腫には
存在しないことを示し、このことは、ＴＲＡＰが破骨細
胞に由来することを示唆している。
719-722, 1979）において、同グループの研究者らは、
正常な子供の血清で酸性ホスファターゼ活性が高いこと
の意義を研究した。彼らは、バンド５に相当する血清Ｔ
ＲＡＰの活性が、巨細胞腫にはあるが、骨原性肉腫には
存在しないことを示し、このことは、ＴＲＡＰが破骨細
胞に由来することを示唆している。
【００１１】W.K.W. Lam et al.（Clin. Biochem. 14,
177-181, 1981）は、ゴシェ病に罹患した患者の血清お
よび脾臓からＴＲＡＰを単離した。彼らは、ゴシェ病の
血清がバンド５ｂを含有し、ゴシェ病の脾臓がバンド５
ａを含有することを示した。バンド５ａおよびバンド５
ｂは同一の蛋白質構造を有し、シアリダーゼにより５ａ
から炭水化物を除去すると５ａは５ｂに変換され、これ
により、５ａと５ｂの構造上の唯一の差異は、５ａにシ
アル酸残基が存在し、５ｂに存在しないことだけである
と示唆された。両形態の最適ｐＨは異なり、５ａでは5.
0、５ｂでは5.5〜6.0であった。
177-181, 1981）は、ゴシェ病に罹患した患者の血清お
よび脾臓からＴＲＡＰを単離した。彼らは、ゴシェ病の
血清がバンド５ｂを含有し、ゴシェ病の脾臓がバンド５
ａを含有することを示した。バンド５ａおよびバンド５
ｂは同一の蛋白質構造を有し、シアリダーゼにより５ａ
から炭水化物を除去すると５ａは５ｂに変換され、これ
により、５ａと５ｂの構造上の唯一の差異は、５ａにシ
アル酸残基が存在し、５ｂに存在しないことだけである
と示唆された。両形態の最適ｐＨは異なり、５ａでは5.
0、５ｂでは5.5〜6.0であった。
【００１２】W.K.W. Lam and R.J. Desnick（Progress
in Clinical and Biological Research 95, 267-278, 1
982）は、ゴシェ病においてバンド５型を更に研究し
た。彼らは、正常検体および病理検体における酸性ホス
ファターゼの電気泳動プロフィールをまとめた。彼ら
は、正常血清に微量の５ａおよび５ｂがともに存在する
ことを示したが、病理血清にバンド５ａの増加は観察さ
れなかった。その代わりに彼らは、破骨細胞性骨腫瘍、
骨に転移した悪性腫瘍を有する患者の血清、およびゴシ
ェ病を有する患者の血清において、５ｂ量が増加するこ
とを見出した。これらの結果に基づいて、血清の酸性ホ
スファターゼレベル、特に５ｂ型は、破骨細胞の生理学
的活性に主として依存していることが示唆されると、著
者らは結論づけた。しかし、その仮説を裏付ける更なる
証拠が必要であると、彼らは述べている。この論文に由
来する他の重要な所見は、両酵素（バンド５ａおよび５
ｂ）は密接に関連があり抗原性としては同じであるとい
う著者の記載である。この記載によれば、５ａもしくは
５ｂの何れかを特異的に測定する免疫測定法を開発する
ことはできないであろう。1982年以降、血清のＴＲＡＰ
５ａおよび５ｂの起源はそれ以上研究されず、示唆され
た５ｂの破骨細胞起源は、確証されていない。
in Clinical and Biological Research 95, 267-278, 1
982）は、ゴシェ病においてバンド５型を更に研究し
た。彼らは、正常検体および病理検体における酸性ホス
ファターゼの電気泳動プロフィールをまとめた。彼ら
は、正常血清に微量の５ａおよび５ｂがともに存在する
ことを示したが、病理血清にバンド５ａの増加は観察さ
れなかった。その代わりに彼らは、破骨細胞性骨腫瘍、
骨に転移した悪性腫瘍を有する患者の血清、およびゴシ
ェ病を有する患者の血清において、５ｂ量が増加するこ
とを見出した。これらの結果に基づいて、血清の酸性ホ
スファターゼレベル、特に５ｂ型は、破骨細胞の生理学
的活性に主として依存していることが示唆されると、著
者らは結論づけた。しかし、その仮説を裏付ける更なる
証拠が必要であると、彼らは述べている。この論文に由
来する他の重要な所見は、両酵素（バンド５ａおよび５
ｂ）は密接に関連があり抗原性としては同じであるとい
う著者の記載である。この記載によれば、５ａもしくは
５ｂの何れかを特異的に測定する免疫測定法を開発する
ことはできないであろう。1982年以降、血清のＴＲＡＰ
５ａおよび５ｂの起源はそれ以上研究されず、示唆され
た５ｂの破骨細胞起源は、確証されていない。
【００１３】ＴＲＡＰ活性は、例えばｐ−ニトロフェニ
ルホスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として供給すること
により、他の多くの酸性ホスファターゼを阻害する酒石
酸塩の存在下で、分光測光法により測定することができ
る。しかしこの方法は、あまり特異的でないため、ＴＲ
ＡＰを測定するためにより特異的な方法、即ち免疫測定
法が開発されている。
ルホスフェート（ｐＮＰＰ）を基質として供給すること
により、他の多くの酸性ホスファターゼを阻害する酒石
酸塩の存在下で、分光測光法により測定することができ
る。しかしこの方法は、あまり特異的でないため、ＴＲ
ＡＰを測定するためにより特異的な方法、即ち免疫測定
法が開発されている。
【００１４】Stepan J.J et al.（Biochem. Biophys. R
es. Commun. 165: 1027-1034, 1989）およびKraenzlin
M.E. et al. （Journal of Clinical Endocrinology an
d Metabolism 71(2): 442-451, 1990）は、ヘアリーセ
ル白血病患者の脾臓から精製したＴＲＡＰに対して産生
されるポリクローナル抗体を用いた、ＴＲＡＰのための
免疫測定法を開発した。彼らは、この測定法は、無機塩
類代謝に疾患をもつ患者を検出する際に有効であると示
唆している。
es. Commun. 165: 1027-1034, 1989）およびKraenzlin
M.E. et al. （Journal of Clinical Endocrinology an
d Metabolism 71(2): 442-451, 1990）は、ヘアリーセ
ル白血病患者の脾臓から精製したＴＲＡＰに対して産生
されるポリクローナル抗体を用いた、ＴＲＡＰのための
免疫測定法を開発した。彼らは、この測定法は、無機塩
類代謝に疾患をもつ患者を検出する際に有効であると示
唆している。
【００１５】Cheung C.K. et al.（Clin. Chem. 41(5):
679-686, 1995）は、策状組織（cord）血漿から単離さ
れたＴＲＡＰに対して調製されたポリクローナル抗体を
用いた、ＴＲＡＰの免疫測定法を開示している。彼ら
は、ＴＲＡＰの濃度が子供および閉経後の女性において
有意に高いことを見出し、骨代謝回転を評価する際のマ
ーカーとしてＴＲＡＰを使用する可能性を述べている。
679-686, 1995）は、策状組織（cord）血漿から単離さ
れたＴＲＡＰに対して調製されたポリクローナル抗体を
用いた、ＴＲＡＰの免疫測定法を開示している。彼ら
は、ＴＲＡＰの濃度が子供および閉経後の女性において
有意に高いことを見出し、骨代謝回転を評価する際のマ
ーカーとしてＴＲＡＰを使用する可能性を述べている。
【００１６】またポリクローナル抗体は、ヒトの骨から
単離、精製されたＴＲＡＰに対しても調製されている。
子供および閉経後の女性は、血清中のＴＲＡＰ濃度が高
いことは再度証明されている（Halleen J. et al. Jour
nal of bone and Mineral Research 11(10): 1444-145
2, 1996）。
単離、精製されたＴＲＡＰに対しても調製されている。
子供および閉経後の女性は、血清中のＴＲＡＰ濃度が高
いことは再度証明されている（Halleen J. et al. Jour
nal of bone and Mineral Research 11(10): 1444-145
2, 1996）。
【００１７】Chamberlain P. et al.（Clin. Chem. 41
(10): 1495-1499, 1995）は、組換えによりつくられた
ＴＲＡＰに対して産生された一対のモノクローナル抗体
を用いた、ＴＲＡＰの二工程の血清免疫測定法を開示し
ている。この一対のモノクローナル抗体により、ＴＲＡ
Ｐの異なるエピトープが認識され、感度の高いＴＲＡＰ
の測定法が可能になった。
(10): 1495-1499, 1995）は、組換えによりつくられた
ＴＲＡＰに対して産生された一対のモノクローナル抗体
を用いた、ＴＲＡＰの二工程の血清免疫測定法を開示し
ている。この一対のモノクローナル抗体により、ＴＲＡ
Ｐの異なるエピトープが認識され、感度の高いＴＲＡＰ
の測定法が可能になった。
【００１８】これまでに発表された免疫測定法は全て、
血清中のＴＲＡＰの全量を測定している。しかし、本発
明は、ＴＲＡＰ５ｂがトータルＴＲＡＰと比べて骨吸収
の特異的な生化学的マーカーであるという発見に基づく
ものである。このことと関連して、５ａ、５ｂと称され
るものであるが、Stepan et al. and Kraenzlin et al.
同上により報告されたＴＲＡＰの異性体を、Lam et a
l. 同上により報告されたものと混同してはいけないこ
とを指摘しておく。
血清中のＴＲＡＰの全量を測定している。しかし、本発
明は、ＴＲＡＰ５ｂがトータルＴＲＡＰと比べて骨吸収
の特異的な生化学的マーカーであるという発見に基づく
ものである。このことと関連して、５ａ、５ｂと称され
るものであるが、Stepan et al. and Kraenzlin et al.
同上により報告されたＴＲＡＰの異性体を、Lam et a
l. 同上により報告されたものと混同してはいけないこ
とを指摘しておく。
【００１９】従って、本発明の目的の一つは、骨吸収の
特異的マーカーとしてＴＲＡＰ ５ｂを利用することで
ある。
特異的マーカーとしてＴＲＡＰ ５ｂを利用することで
ある。
【００２０】本発明の別の目的は、骨吸収速度を測定す
る特異的で簡便な方法を提供すること、特に、骨吸収速
度の有意な変化と関連のある疾患（例えば、骨粗鬆症も
しくは他の骨代謝病、骨障害、または骨転移）を診断す
る診断方法を提供することである。
る特異的で簡便な方法を提供すること、特に、骨吸収速
度の有意な変化と関連のある疾患（例えば、骨粗鬆症も
しくは他の骨代謝病、骨障害、または骨転移）を診断す
る診断方法を提供することである。
【００２１】本発明の別の目的は、前記疾患に罹患しや
すいか、もしくは罹患している被検者の骨吸収をモニタ
ーすることができる方法、および前記疾患の治療効果を
追跡する方法を提供することである。
すいか、もしくは罹患している被検者の骨吸収をモニタ
ーすることができる方法、および前記疾患の治療効果を
追跡する方法を提供することである。
【００２２】本発明の更に別の目的は、前記方法に有効
なテストキットを提供することである。
なテストキットを提供することである。
【００２３】［本発明の概要］
本発明の目的は、免疫測定法において、骨吸収速度のマ
ーカーとして酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ
（ＴＲＡＰ ５ｂ）を使用することにより達成すること
ができる。
ーカーとして酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ
（ＴＲＡＰ ５ｂ）を使用することにより達成すること
ができる。
【００２４】その結果本発明は、被検者の骨吸収速度を
測定するための免疫測定法であって、酒石酸塩抵抗性酸
性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）の量が骨吸収
速度を表していることにより、前記被検者に由来する体
液サンプル中のＴＲＡＰ ５ｂを測定することを特徴と
する方法を提供する。
測定するための免疫測定法であって、酒石酸塩抵抗性酸
性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）の量が骨吸収
速度を表していることにより、前記被検者に由来する体
液サンプル中のＴＲＡＰ ５ｂを測定することを特徴と
する方法を提供する。
【００２５】特に、以下の工程を含む、被検者の骨吸収
速度を測定するための免疫測定法を提供する： （ａ）前記被検者に由来する体液サンプル中に存在する
ＴＲＡＰを、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ ５ａおよびＴＲＡ
Ｐ ５ｂ）を結合する抗体に結合させることにより、体
液サンプル中の酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ
（ＴＲＡＰ ５ｂ）を測定する工程、および （ｂ）主としてＴＲＡＰ ５ｂであるＴＲＡＰの活性量
が骨吸収速度を表していることにより、結合したＴＲＡ
Ｐ活性をｐＨ５．７〜６．３の間で測定する工程。
速度を測定するための免疫測定法を提供する： （ａ）前記被検者に由来する体液サンプル中に存在する
ＴＲＡＰを、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ ５ａおよびＴＲＡ
Ｐ ５ｂ）を結合する抗体に結合させることにより、体
液サンプル中の酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ
（ＴＲＡＰ ５ｂ）を測定する工程、および （ｂ）主としてＴＲＡＰ ５ｂであるＴＲＡＰの活性量
が骨吸収速度を表していることにより、結合したＴＲＡ
Ｐ活性をｐＨ５．７〜６．３の間で測定する工程。
【００２６】本発明は、被検者の骨吸収速度の変化に関
連のある疾患を診断する方法であって、酒石酸塩抵抗性
酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）の異常な量
が骨吸収速度の変化に関連のある疾患を暗示しているこ
とにより、前記被検者に由来する体液サンプル中のＴＲ
ＡＰ ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とす
る方法を更に提供する。
連のある疾患を診断する方法であって、酒石酸塩抵抗性
酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）の異常な量
が骨吸収速度の変化に関連のある疾患を暗示しているこ
とにより、前記被検者に由来する体液サンプル中のＴＲ
ＡＰ ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とす
る方法を更に提供する。
【００２７】本発明は、被検者の骨吸収速度の増加に関
連のある疾患を治療するための薬剤の効果をモニターす
る方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５
ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）量の減少が前記薬剤の効果を示し
ていることにより、前記被検者の体液サンプル中のＴＲ
ＡＰ ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とす
る方法を更に提供する。
連のある疾患を治療するための薬剤の効果をモニターす
る方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５
ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）量の減少が前記薬剤の効果を示し
ていることにより、前記被検者の体液サンプル中のＴＲ
ＡＰ ５ｂを免疫測定法により測定することを特徴とす
る方法を更に提供する。
【００２８】本発明は、骨吸収速度の増加に関連のある
疾患に対する感受性について被検者をスクリーニングす
る方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５
ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）レベルの増大が前記疾患に対する
感受性を示していることにより、前記被検者の体液サン
プル中のＴＲＡＰ ５ｂを免疫測定法により測定するこ
とを特徴とする方法を更に提供する。
疾患に対する感受性について被検者をスクリーニングす
る方法であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５
ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）レベルの増大が前記疾患に対する
感受性を示していることにより、前記被検者の体液サン
プル中のＴＲＡＰ ５ｂを免疫測定法により測定するこ
とを特徴とする方法を更に提供する。
【００２９】本発明は、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファタ
ーゼ５ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）と酒石酸塩抵抗性酸性ホス
ファターゼ５ａ（ＴＲＡＰ ５ａ）とを識別することが
可能な抗体を含むテストキットを更に提供する。本テス
トキットは、本発明の方法を実施する際に有効である。
ーゼ５ｂ（ＴＲＡＰ ５ｂ）と酒石酸塩抵抗性酸性ホス
ファターゼ５ａ（ＴＲＡＰ ５ａ）とを識別することが
可能な抗体を含むテストキットを更に提供する。本テス
トキットは、本発明の方法を実施する際に有効である。
【００３０】［発明の詳細な説明］
被検者の体液サンプル中の全ＴＲＡＰの代わりにＴＲＡ
Ｐ ５ｂを特異的に測定すると、ＴＲＡＰ量と骨吸収速
度との間に有意に優れた相関関係が達成される。ＴＲＡ
Ｐに対する抗体を利用することにより、免疫測定法で特
異的にＴＲＡＰ５ｂを測定できることを予期せず見出し
た。驚くべきことに、ＴＲＡＰ ５ａとＴＲＡＰ ５ｂと
を識別する抗体を見出した。しかし、本発明で使用する
抗体は、必ずしもＴＲＡＰ ５ａもしくはＴＲＡＰ ５ｂ
の何れかに特異的である必要はなく、全ＴＲＡＰを認識
する抗体を使用してもよい。その場合、二つの酵素形態
の識別は、非特異的な抗ＴＲＡＰ抗体との反応の後、他
の手段により成し遂げられる。例えば、全ＴＲＡＰ活性
がＴＲＡＰ ５ｂに由来するｐＨ範囲でＴＲＡＰ活性を
測定できることを見出した。これらの発見により、骨吸
収速度の変化に関連のある一次骨疾患および二次骨疾患
（例えば、骨代謝病、または骨障害もしくは骨転移、特
に骨粗鬆症）を診断する改良方法を提供することができ
る。ＴＲＡＰ ５ｂ量を測定する方法は、骨疾患の治療
効果（例えば、骨粗鬆症のエストロゲンもしくはビホス
フェート療法の効果）をモニターする際に使用すること
もできる。骨吸収の増大に対する感受性ついてヒトをス
クリーニングする際に使用することもでき、これにより
骨折を防ぐ治療が可能になる。
Ｐ ５ｂを特異的に測定すると、ＴＲＡＰ量と骨吸収速
度との間に有意に優れた相関関係が達成される。ＴＲＡ
Ｐに対する抗体を利用することにより、免疫測定法で特
異的にＴＲＡＰ５ｂを測定できることを予期せず見出し
た。驚くべきことに、ＴＲＡＰ ５ａとＴＲＡＰ ５ｂと
を識別する抗体を見出した。しかし、本発明で使用する
抗体は、必ずしもＴＲＡＰ ５ａもしくはＴＲＡＰ ５ｂ
の何れかに特異的である必要はなく、全ＴＲＡＰを認識
する抗体を使用してもよい。その場合、二つの酵素形態
の識別は、非特異的な抗ＴＲＡＰ抗体との反応の後、他
の手段により成し遂げられる。例えば、全ＴＲＡＰ活性
がＴＲＡＰ ５ｂに由来するｐＨ範囲でＴＲＡＰ活性を
測定できることを見出した。これらの発見により、骨吸
収速度の変化に関連のある一次骨疾患および二次骨疾患
（例えば、骨代謝病、または骨障害もしくは骨転移、特
に骨粗鬆症）を診断する改良方法を提供することができ
る。ＴＲＡＰ ５ｂ量を測定する方法は、骨疾患の治療
効果（例えば、骨粗鬆症のエストロゲンもしくはビホス
フェート療法の効果）をモニターする際に使用すること
もできる。骨吸収の増大に対する感受性ついてヒトをス
クリーニングする際に使用することもでき、これにより
骨折を防ぐ治療が可能になる。
【００３１】本発明に関連して使用される「被検者」と
は、哺乳類、好ましくはヒトを意味する。
は、哺乳類、好ましくはヒトを意味する。
【００３２】本出願で使用される「ＴＲＡＰ」とは、タ
イプ５クラスの酸性ホスファターゼに属する酒石酸塩抵
抗性酸性ホスファターゼ（ＥＣ 3.1.3.2.）をいい、こ
れには酵素形態５ａおよび５ｂの両方が含まれる。
イプ５クラスの酸性ホスファターゼに属する酒石酸塩抵
抗性酸性ホスファターゼ（ＥＣ 3.1.3.2.）をいい、こ
れには酵素形態５ａおよび５ｂの両方が含まれる。
【００３３】「ＴＲＡＰ ５ｂ」は、その炭水化物鎖に
おいてシアル酸を欠損し、最適ｐＨが約５．７〜６．０
の間であるＴＲＡＰの酵素形態ｂをいう。
おいてシアル酸を欠損し、最適ｐＨが約５．７〜６．０
の間であるＴＲＡＰの酵素形態ｂをいう。
【００３４】「ＴＲＡＰ ５ａ」は、その炭水化物鎖に
おいてシアル酸を含み、最適ｐＨが約４．９であるＴＲ
ＡＰの酵素形態ａをいう。
おいてシアル酸を含み、最適ｐＨが約４．９であるＴＲ
ＡＰの酵素形態ａをいう。
【００３５】前記酵素は、例えばLam W.K.W. et al.（C
lin. Chem. 24(7): 1105-1108, 1978）およびLam W.K.
W. et al.（Clin. Biochem. 14, 177-181, 1981）に更
に説明されている。
lin. Chem. 24(7): 1105-1108, 1978）およびLam W.K.
W. et al.（Clin. Biochem. 14, 177-181, 1981）に更
に説明されている。
【００３６】体液サンプルは、好ましくは、血漿もしく
は特に血清のような血液サンプルであるが、必ずしもそ
うではない。
は特に血清のような血液サンプルであるが、必ずしもそ
うではない。
【００３７】本発明の免疫測定法において、ＴＲＡＰに
対する抗体が使用される。これに関連して「免疫測定
法」とは、測定すべき化合物が抗原抗体反応により検出
される任意の測定法を意味する。免疫測定法は、直接測
定法でも間接測定法でもよく、競合的測定法でも非競合
的測定法でもよい。免疫測定法は、サンドイッチ技術で
も単純な技術でもよい。抗原もしくは抗体の何れかを標
識して検出を強化することができる。これらの方法の原
理は、当該分野で周知である。
対する抗体が使用される。これに関連して「免疫測定
法」とは、測定すべき化合物が抗原抗体反応により検出
される任意の測定法を意味する。免疫測定法は、直接測
定法でも間接測定法でもよく、競合的測定法でも非競合
的測定法でもよい。免疫測定法は、サンドイッチ技術で
も単純な技術でもよい。抗原もしくは抗体の何れかを標
識して検出を強化することができる。これらの方法の原
理は、当該分野で周知である。
【００３８】本発明で使用される「ＴＲＡＰに対する抗
体」には、５ａおよび５ｂに非特異的な抗体、および特
異的な抗ＴＲＡＰ抗体を含む。
体」には、５ａおよび５ｂに非特異的な抗体、および特
異的な抗ＴＲＡＰ抗体を含む。
【００３９】ＴＲＡＰに対する抗体は、好ましくはモノ
クローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、Ｔ
ＲＡＰ ５ｂとＴＲＡＰ ５ａとを識別することが可能な
抗体であってもよい。「ＴＲＡＰ ５ｂとＴＲＡＰ ５ａ
とを識別することが可能な抗体」とは、ＴＲＡＰ ５ｂ
もしくはＴＲＡＰ ５ａの何れかに特異的であってもよ
く、あるいは前記特異的な抗体と全ＴＲＡＰ（即ち、Ｔ
ＲＡＰ ５ｂとＴＲＡＰ５ａの両方）を認識する抗体と
の任意の組み合わせから成っていてもよい。
クローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、Ｔ
ＲＡＰ ５ｂとＴＲＡＰ ５ａとを識別することが可能な
抗体であってもよい。「ＴＲＡＰ ５ｂとＴＲＡＰ ５ａ
とを識別することが可能な抗体」とは、ＴＲＡＰ ５ｂ
もしくはＴＲＡＰ ５ａの何れかに特異的であってもよ
く、あるいは前記特異的な抗体と全ＴＲＡＰ（即ち、Ｔ
ＲＡＰ ５ｂとＴＲＡＰ５ａの両方）を認識する抗体と
の任意の組み合わせから成っていてもよい。
【００４０】ＴＲＡＰ ５ａとＴＲＡＰ ５ｂとを識別す
ることが可能な抗体は、体液中のＴＲＡＰ ５ｂの濃度
を測定するために幾つかの方法で使用することができ
る。ＴＲＡＰ ５ｂに特異的な抗体を使用する場合、当
然ながら、直接使用してＴＲＡＰ ５ｂを検出すること
ができる。しかし、ＴＲＡＰ ５ｂに特異的な抗体を、
酵素の両形態（即ち、全ＴＲＡＰ）を認識する抗体と組
合わせて使用することが好ましい。その場合、体液の全
ＴＲＡＰを、まず酵素の両形態を認識する抗体に結合さ
せ、次いで、ＴＲＡＰ ５ｂに特異的であるがＴＲＡＰ
５ａとは反応しない標識抗体を使用して、結合したＴＲ
ＡＰ ５ｂを検出する。
ることが可能な抗体は、体液中のＴＲＡＰ ５ｂの濃度
を測定するために幾つかの方法で使用することができ
る。ＴＲＡＰ ５ｂに特異的な抗体を使用する場合、当
然ながら、直接使用してＴＲＡＰ ５ｂを検出すること
ができる。しかし、ＴＲＡＰ ５ｂに特異的な抗体を、
酵素の両形態（即ち、全ＴＲＡＰ）を認識する抗体と組
合わせて使用することが好ましい。その場合、体液の全
ＴＲＡＰを、まず酵素の両形態を認識する抗体に結合さ
せ、次いで、ＴＲＡＰ ５ｂに特異的であるがＴＲＡＰ
５ａとは反応しない標識抗体を使用して、結合したＴＲ
ＡＰ ５ｂを検出する。
【００４１】更に、ＴＲＡＰ ５ａに特異的な抗体と全
ＴＲＡＰを認識する抗体とを組み合わせて使用すること
ができる。その場合、ＴＲＡＰ ５ａを、まずＴＲＡＰ
５ａに特異的な抗体に結合させ、次いで、残りの結合し
なかったＴＲＡＰ活性（これは形態５ｂのはずである）
を、酵素の両形態を認識する抗体を使用して測定する。
ＴＲＡＰを認識する抗体とを組み合わせて使用すること
ができる。その場合、ＴＲＡＰ ５ａを、まずＴＲＡＰ
５ａに特異的な抗体に結合させ、次いで、残りの結合し
なかったＴＲＡＰ活性（これは形態５ｂのはずである）
を、酵素の両形態を認識する抗体を使用して測定する。
【００４２】本発明の方法で使用される抗体は、検出を
高めるために、例えば放射能ラベル、酵素ラベル、化学
発光ラベル、もしくは蛍光ラベルを用いて任意の慣用的
な方法により標識されていてもよい。ストレプタビジン
−ビオチニル（streptavidin-biotinyl）システムは、
感度の高い検出を提供する。例えばHellman J. et al.
J. Bone Miner. Res. 11: 1165-1175, 1996; およびHem
mila I. et al., Anal.Biochem. 137: 335-343, 1984に
記載された時間分解（time-resolved）蛍光免疫測定法
である、Delfiaシステムを用いて、特に優れた結果が得
られた。ＴＲＡＰの異なるエピトープを認識する少なく
とも二つの異なる抗体を使用することが更に好ましい。
これにより、高い感度と再現性を備えた二部位（two-si
te）の蛍光免疫測定法が可能になる。
高めるために、例えば放射能ラベル、酵素ラベル、化学
発光ラベル、もしくは蛍光ラベルを用いて任意の慣用的
な方法により標識されていてもよい。ストレプタビジン
−ビオチニル（streptavidin-biotinyl）システムは、
感度の高い検出を提供する。例えばHellman J. et al.
J. Bone Miner. Res. 11: 1165-1175, 1996; およびHem
mila I. et al., Anal.Biochem. 137: 335-343, 1984に
記載された時間分解（time-resolved）蛍光免疫測定法
である、Delfiaシステムを用いて、特に優れた結果が得
られた。ＴＲＡＰの異なるエピトープを認識する少なく
とも二つの異なる抗体を使用することが更に好ましい。
これにより、高い感度と再現性を備えた二部位（two-si
te）の蛍光免疫測定法が可能になる。
【００４３】本発明のテストキットは、ＴＲＡＰ ５ｂ
とＴＲＡＰ ５ａとを識別することが可能な抗体を含
む。このテストキットは、本発明に従って骨吸収速度を
評価する際、並びに骨吸収速度の変化と関連のある疾患
を診断する際に有効である。このテストキットは、ＴＲ
ＡＰ ５ｂを特異的に認識する抗体を、必要に応じて全
ＴＲＡＰを認識する抗体とともに含んでいてもよい。あ
るいは、このテストキットは、全ＴＲＡＰを認識する抗
体とともに、ＴＲＡＰ ５ａを特異的に認識する抗体を
含んでいてもよいし、あるいはＴＲＡＰ ５ｂに特異的
な抗体およびＴＲＡＰ ５ａに特異的な抗体を含んでい
てもよい。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であ
る。
とＴＲＡＰ ５ａとを識別することが可能な抗体を含
む。このテストキットは、本発明に従って骨吸収速度を
評価する際、並びに骨吸収速度の変化と関連のある疾患
を診断する際に有効である。このテストキットは、ＴＲ
ＡＰ ５ｂを特異的に認識する抗体を、必要に応じて全
ＴＲＡＰを認識する抗体とともに含んでいてもよい。あ
るいは、このテストキットは、全ＴＲＡＰを認識する抗
体とともに、ＴＲＡＰ ５ａを特異的に認識する抗体を
含んでいてもよいし、あるいはＴＲＡＰ ５ｂに特異的
な抗体およびＴＲＡＰ ５ａに特異的な抗体を含んでい
てもよい。抗体は、好ましくはモノクローナル抗体であ
る。
【００４４】本発明に従ってＴＲＡＰ ５ｂ活性を測定
する別の実現性は、ＴＲＡＰ ５ｂの酵素活性ピーク内
であるが、ＴＲＡＰ ５ａの酵素活性ピークの外である
ｐＨ範囲において、酒石酸塩の存在下で酸性ホスファタ
ーゼ活性の慣用的な分光測光法（例えば、Halleen J. e
t al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10):
1444-1452, 1996を参照）を実施することである。本発
明者らが測定したとおり、ＴＲＡＰ ５ａの最適ｐＨ
は、約４．９であり、ＴＲＡＰ ５ｂの最適ｐＨは、約
５．７〜６．０である。全ＴＲＡＰは、通常ｐＨ５．５
で測定される。しかし、ＴＲＡＰ ５ａの存在下でＴＲ
ＡＰ ５ｂを測定するために適切なｐＨ範囲は、５．７
〜６．３、好ましくは５．８〜６．２、特に好ましくは
６．０〜６．２であることを見出した。ｐＨ６．１が最
も好ましい。分光測光法は、ＴＲＡＰ ５ａとＴＲＡＰ
５ｂとを識別していないが、前記ｐＨ範囲内で測定した
活性は、実質的にＴＲＡＰ ５ｂである。ＴＲＡＰ ５ａ
のｐＨ６．１での活性は、ｐＨ４．９における活性のわ
ずか約２０〜３０％である。（ＴＲＡＰ ５ｂをＴＲＡ
Ｐ５ａの非存在下で測定すると、ｐＨ約５．９で僅かに
高い活性が得られる）。ｐＨ６．１において、全ＴＲＡ
Ｐ活性に対する５ａ活性の割合は、１０％未満である。
従ってｐＨ６．１においては、測定されたＴＲＡＰ活性
の９０％以上が、形態５ｂである。
する別の実現性は、ＴＲＡＰ ５ｂの酵素活性ピーク内
であるが、ＴＲＡＰ ５ａの酵素活性ピークの外である
ｐＨ範囲において、酒石酸塩の存在下で酸性ホスファタ
ーゼ活性の慣用的な分光測光法（例えば、Halleen J. e
t al. Journal of Bone and Mineral Research 11(10):
1444-1452, 1996を参照）を実施することである。本発
明者らが測定したとおり、ＴＲＡＰ ５ａの最適ｐＨ
は、約４．９であり、ＴＲＡＰ ５ｂの最適ｐＨは、約
５．７〜６．０である。全ＴＲＡＰは、通常ｐＨ５．５
で測定される。しかし、ＴＲＡＰ ５ａの存在下でＴＲ
ＡＰ ５ｂを測定するために適切なｐＨ範囲は、５．７
〜６．３、好ましくは５．８〜６．２、特に好ましくは
６．０〜６．２であることを見出した。ｐＨ６．１が最
も好ましい。分光測光法は、ＴＲＡＰ ５ａとＴＲＡＰ
５ｂとを識別していないが、前記ｐＨ範囲内で測定した
活性は、実質的にＴＲＡＰ ５ｂである。ＴＲＡＰ ５ａ
のｐＨ６．１での活性は、ｐＨ４．９における活性のわ
ずか約２０〜３０％である。（ＴＲＡＰ ５ｂをＴＲＡ
Ｐ５ａの非存在下で測定すると、ｐＨ約５．９で僅かに
高い活性が得られる）。ｐＨ６．１において、全ＴＲＡ
Ｐ活性に対する５ａ活性の割合は、１０％未満である。
従ってｐＨ６．１においては、測定されたＴＲＡＰ活性
の９０％以上が、形態５ｂである。
【００４５】免疫測定法でＴＲＡＰ ５ａとＴＲＡＰ ５
ｂの最適ｐＨの差異を利用することにより、ＴＲＡＰ
５ｂを測定する安価で簡便な方法が提供される。この手
法により、体液の全ＴＲＡＰを結合させるために最初に
使用される（５ａと５ｂの両方に結合する）非特異的な
抗ＴＲＡＰ抗体の利用が可能になる。その後、ＴＲＡＰ
活性は、ＴＲＡＰ ５ｂ活性に好ましいｐＨ５．７〜
６．３のｐＨ範囲で、例えば分光測光法により測定され
る。
ｂの最適ｐＨの差異を利用することにより、ＴＲＡＰ
５ｂを測定する安価で簡便な方法が提供される。この手
法により、体液の全ＴＲＡＰを結合させるために最初に
使用される（５ａと５ｂの両方に結合する）非特異的な
抗ＴＲＡＰ抗体の利用が可能になる。その後、ＴＲＡＰ
活性は、ＴＲＡＰ ５ｂ活性に好ましいｐＨ５．７〜
６．３のｐＨ範囲で、例えば分光測光法により測定され
る。
【００４６】炭水化物含量の差異は、ＴＲＡＰ ５ｂと
ＴＲＡＰ ５ａとを識別する際に使用することもでき
る。全ＴＲＡＰは、例えばまず５ａと５ｂの両方を認識
する抗体によって結合される。次いで結合した全ＴＲＡ
Ｐは、ＴＲＡＰ ５ｂのような末端マンノースを有する
炭水化物に結合するが、その炭水化物鎖に末端シアル酸
を有するためＴＲＡＰ ５ａに結合しない、標識されたG
alanthus Nivalis Agglutinin（ＧＮＡ）もしくはConca
navalin A（ConA）レクチンと反応する。
ＴＲＡＰ ５ａとを識別する際に使用することもでき
る。全ＴＲＡＰは、例えばまず５ａと５ｂの両方を認識
する抗体によって結合される。次いで結合した全ＴＲＡ
Ｐは、ＴＲＡＰ ５ｂのような末端マンノースを有する
炭水化物に結合するが、その炭水化物鎖に末端シアル酸
を有するためＴＲＡＰ ５ａに結合しない、標識されたG
alanthus Nivalis Agglutinin（ＧＮＡ）もしくはConca
navalin A（ConA）レクチンと反応する。
【００４７】当然、本発明の方法において、ＴＲＡＰ
５ｂを測定するために上述の手法の任意の組み合わせを
使用することができる。本発明は、本発明を限定しない
以下の実施例において更に説明される。
５ｂを測定するために上述の手法の任意の組み合わせを
使用することができる。本発明は、本発明を限定しない
以下の実施例において更に説明される。
【００４８】［例１］
モノクローナル抗体を、標準的プロトコールを用いて作
成した。BALB/cマウスに、フロイントアジュバントで乳
化されたヒト骨ＴＲＡＰ精製物（Halleen J. et al. Jo
urnal of Bone and Mineral Research 11(10): 1444-14
52, 1996）を、（１回に20μｇ/マウス）２週間隔で４
回注射し、その後動物を屠殺した。脾細胞を骨髄腫細胞
株 p3-X63-Ag8.653とハイブリダイズし、そのハイブリ
ドーマをＨＡＴ培地で培養した。抗マウスＩｇＧでコー
トされたマイクロタイターウェル中で100μＬの上清を
インキュベートすることにより、クローンをスクリーニ
ングし、次いでヒト骨ＴＲＡＰ精製物をインキュベート
した。最後に、結合した酵素活性を、200μＬの反応混
合液（０.１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６.０、８ｍＭ
ｐＮＰＰおよび４０ｍＭ酒石酸ナトリウム）をウェル中
で１時間インキュベートすることにより測定した。反応
は、１６μＬの０.５Ｍ 水酸化ナトリウムを添加する
ことにより停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを
用いて405ｎｍの吸光度を測定した。二つのモノクロー
ナルＴＲＡＰ抗体、Ｏ１ＡおよびＪ１Ｂを得た。両抗体
はともに、ＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂの両方を認識す
るが、異なるエピトープを認識した。
成した。BALB/cマウスに、フロイントアジュバントで乳
化されたヒト骨ＴＲＡＰ精製物（Halleen J. et al. Jo
urnal of Bone and Mineral Research 11(10): 1444-14
52, 1996）を、（１回に20μｇ/マウス）２週間隔で４
回注射し、その後動物を屠殺した。脾細胞を骨髄腫細胞
株 p3-X63-Ag8.653とハイブリダイズし、そのハイブリ
ドーマをＨＡＴ培地で培養した。抗マウスＩｇＧでコー
トされたマイクロタイターウェル中で100μＬの上清を
インキュベートすることにより、クローンをスクリーニ
ングし、次いでヒト骨ＴＲＡＰ精製物をインキュベート
した。最後に、結合した酵素活性を、200μＬの反応混
合液（０.１Ｍ 酢酸ナトリウム、ｐＨ６.０、８ｍＭ
ｐＮＰＰおよび４０ｍＭ酒石酸ナトリウム）をウェル中
で１時間インキュベートすることにより測定した。反応
は、１６μＬの０.５Ｍ 水酸化ナトリウムを添加する
ことにより停止させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーを
用いて405ｎｍの吸光度を測定した。二つのモノクロー
ナルＴＲＡＰ抗体、Ｏ１ＡおよびＪ１Ｂを得た。両抗体
はともに、ＴＲＡＰ５ａとＴＲＡＰ５ｂの両方を認識す
るが、異なるエピトープを認識した。
【００４９】抗原として組換えＴＲＡＰを用いて開発さ
れたモノクローナル抗体４Ｅ６（Chamberlain P. et a
l. Clin. Chem. 41(10): 1495-1499, 1995）は、骨から
単離、精製されたＴＲＡＰと反応しないことが見出され
た。その代わり、このモノクローナル抗体は、シアル酸
を含むＴＲＡＰの５ａ型を特異的に認識することが見出
された。400ｎｇの４Ｅ６を、抗マウスＩｇＧでコート
されたマイクロタイターウェル中で１時間インキュベー
トした。次いで、血清サンプル（200μＬ）を、そのウ
ェル中で１時間インキュベートした。コントロールとし
て、同じ血清からのサンプルを、抗マウスＩｇＧでコー
トされていないマイクロタイターウェル中で同様にイン
キュベートした。そのウェルから50μＬの３サンプルを
採取し、400ｎｇのユーロピウム標識Ｏ１Ａとビオチン
標識Ｊ１Ｂを含む100μＬのDelfiaアッセイ緩衝液と混
合した。その混合液を、Delfiaプレートシェーカー（12
96-001 Delfia Plateshaker, Wallac Oy, Turku, Finla
nd）で絶えず振盪しながら、ストレプタビジン（strept
avidin）でコートされたマイクロタイターウェル中で２
時間インキュベートし、次いでDelifa洗浄緩衝液で洗っ
た。最後に、そのウェルを、Delifa増強溶液で満たし
て、５分間振盪し、結合した蛍光を測定した。この方法
は、例えばHellman J. et al. J. Bone Miner. Res. 1
1: 1165-1175, 1996; およびHemmila I. et al., Anal.
Biochem. 137: 335-343, 1984に更に説明されている。
れたモノクローナル抗体４Ｅ６（Chamberlain P. et a
l. Clin. Chem. 41(10): 1495-1499, 1995）は、骨から
単離、精製されたＴＲＡＰと反応しないことが見出され
た。その代わり、このモノクローナル抗体は、シアル酸
を含むＴＲＡＰの５ａ型を特異的に認識することが見出
された。400ｎｇの４Ｅ６を、抗マウスＩｇＧでコート
されたマイクロタイターウェル中で１時間インキュベー
トした。次いで、血清サンプル（200μＬ）を、そのウ
ェル中で１時間インキュベートした。コントロールとし
て、同じ血清からのサンプルを、抗マウスＩｇＧでコー
トされていないマイクロタイターウェル中で同様にイン
キュベートした。そのウェルから50μＬの３サンプルを
採取し、400ｎｇのユーロピウム標識Ｏ１Ａとビオチン
標識Ｊ１Ｂを含む100μＬのDelfiaアッセイ緩衝液と混
合した。その混合液を、Delfiaプレートシェーカー（12
96-001 Delfia Plateshaker, Wallac Oy, Turku, Finla
nd）で絶えず振盪しながら、ストレプタビジン（strept
avidin）でコートされたマイクロタイターウェル中で２
時間インキュベートし、次いでDelifa洗浄緩衝液で洗っ
た。最後に、そのウェルを、Delifa増強溶液で満たし
て、５分間振盪し、結合した蛍光を測定した。この方法
は、例えばHellman J. et al. J. Bone Miner. Res. 1
1: 1165-1175, 1996; およびHemmila I. et al., Anal.
Biochem. 137: 335-343, 1984に更に説明されている。
【００５０】その結果を表１にまとめた。ＴＲＡＰ ５
ａの量は、閉経前の女性と閉経後の女性とでほぼ同じで
あるが、両グループ間のＴＲＡＰ ５ｂ量の差異は有意
であることが分かった。従って、全ＴＲＡＰと比較して
ＴＲＡＰ ５ｂの特異的な測定により、骨吸収のマーカ
ーとしてのＴＲＡＰの有用性が大いに高まった。また、
ＴＲＡＰ ５ｂのレベルは、成人より子供の方が有意に
高いが、ＴＲＡＰ ５ａのレベルはほぼ一定であること
が確認された。
ａの量は、閉経前の女性と閉経後の女性とでほぼ同じで
あるが、両グループ間のＴＲＡＰ ５ｂ量の差異は有意
であることが分かった。従って、全ＴＲＡＰと比較して
ＴＲＡＰ ５ｂの特異的な測定により、骨吸収のマーカ
ーとしてのＴＲＡＰの有用性が大いに高まった。また、
ＴＲＡＰ ５ｂのレベルは、成人より子供の方が有意に
高いが、ＴＲＡＰ ５ａのレベルはほぼ一定であること
が確認された。
【００５１】
【表１】
【００５２】［例２］
抗マウスＩｇＧでコートされたマイクロタイターウェル
を前もって洗浄し、そのウェル中で絶えず振盪しなが
ら、モノクローナルＴＲＡＰ抗体Ｏ１Ａ（400ｎｇ抗体/
ウェル）を１時間インキュベートした。ウェルを洗浄
し、４０人の健康な成人に由来する血清サンプルを、ウ
ェル中で絶えず振盪しながら１時間インキュベートし
た。ウェルを洗浄し、200ｍＬの反応混合液（０.１Ｍ
酢酸ナトリウム、ｐＨ５.９、８ｍＭ ｐＮＰＰおよび
４０ｍＭ酒石酸ナトリウム）をウェル中で１時間インキ
ュベートすることにより、結合したＴＲＡＰ活性を測定
した。反応は、２５ｍＬの０.３２Ｍ 水酸化ナトリウ
ムを添加することにより停止させた。ＥＬＩＳＡプレー
トリーダーを用いて405ｎｍの吸光度を測定した。
を前もって洗浄し、そのウェル中で絶えず振盪しなが
ら、モノクローナルＴＲＡＰ抗体Ｏ１Ａ（400ｎｇ抗体/
ウェル）を１時間インキュベートした。ウェルを洗浄
し、４０人の健康な成人に由来する血清サンプルを、ウ
ェル中で絶えず振盪しながら１時間インキュベートし
た。ウェルを洗浄し、200ｍＬの反応混合液（０.１Ｍ
酢酸ナトリウム、ｐＨ５.９、８ｍＭ ｐＮＰＰおよび
４０ｍＭ酒石酸ナトリウム）をウェル中で１時間インキ
ュベートすることにより、結合したＴＲＡＰ活性を測定
した。反応は、２５ｍＬの０.３２Ｍ 水酸化ナトリウ
ムを添加することにより停止させた。ＥＬＩＳＡプレー
トリーダーを用いて405ｎｍの吸光度を測定した。
【００５３】その結果によると、二つのグループが形成
された：ＴＲＡＰの全活性が最も高い８サンプルを含む
「High」と、ＴＲＡＰの全活性が最も低い８サンプルを
含む「Low」。まず抗体４Ｅ６に５ａを結合させて、次
いで上述の抗体Ｏ１Ａと結合しなかった活性（即ち、Ｔ
ＲＡＰ ５ｂ）を測定することにより、ＴＲＡＰ ５ａお
よびＴＲＡＰ ５ｂを二つのグループで特異的に測定し
た。ＴＲＡＰ ５ａ活性はｐＨ５.０で測定し、ＴＲＡＰ
５ｂ活性はｐＨ５.９で測定した。その結果（405ｎｍ
の吸光度）を表２に示す。両グループはほぼ同量のＴＲ
ＡＰ ５ａを含んでいるが、ＴＲＡＰ ５ｂの量は、High
グループで著しく高いことが分かる。
された：ＴＲＡＰの全活性が最も高い８サンプルを含む
「High」と、ＴＲＡＰの全活性が最も低い８サンプルを
含む「Low」。まず抗体４Ｅ６に５ａを結合させて、次
いで上述の抗体Ｏ１Ａと結合しなかった活性（即ち、Ｔ
ＲＡＰ ５ｂ）を測定することにより、ＴＲＡＰ ５ａお
よびＴＲＡＰ ５ｂを二つのグループで特異的に測定し
た。ＴＲＡＰ ５ａ活性はｐＨ５.０で測定し、ＴＲＡＰ
５ｂ活性はｐＨ５.９で測定した。その結果（405ｎｍ
の吸光度）を表２に示す。両グループはほぼ同量のＴＲ
ＡＰ ５ａを含んでいるが、ＴＲＡＰ ５ｂの量は、High
グループで著しく高いことが分かる。
【００５４】
【表２】
【００５５】最後に、両グループに由来する全ＴＲＡＰ
を、抗体Ｏ１Ａに結合させることにより測定し、結合し
たＴＲＡＰ活性を異なるｐＨ値で上述のとおり測定し
た。その結果（405ｎｍの吸光度）を表３に示す。その
結果は、ｐＨが増加すると両グループ間の差異が増大す
ることを明らかに示している。最も優れた差異（2.46）
は、ｐＨ６.１で達成される。
を、抗体Ｏ１Ａに結合させることにより測定し、結合し
たＴＲＡＰ活性を異なるｐＨ値で上述のとおり測定し
た。その結果（405ｎｍの吸光度）を表３に示す。その
結果は、ｐＨが増加すると両グループ間の差異が増大す
ることを明らかに示している。最も優れた差異（2.46）
は、ｐＨ６.１で達成される。
【００５６】
【表３】
【００５７】［例３］
種々のｐＨにおける血清ＴＲＡＰ ５ａおよびＴＲＡＰ
５ｂの活性を研究した。これは、抗体４Ｅ６を用いて血
清サンプル由来のＴＲＡＰ ５ａを結合させ、次いで抗
体Ｏ１Ａを用いて残りのＴＲＡＰ ５ｂを結合させるこ
とにより行われた。結合したＴＲＡＰ活性は、酢酸緩衝
液のｐＨを表示どおりに変更した以外は、例２の第一段
落で記載されるように測定した。表４は、基質としてｐ
ＮＰＰを用いて種々のｐＨでＴＲＡＰ ５ａおよびＴＲ
ＡＰ ５ｂについて得られた吸光度の値（Ａ405）を示
す。％５ａのカラムは、各ｐＨにおける、全ＴＲＡＰ活
性（５ａ＋５ｂ）に対する５ａ活性の割合を示し、例え
ばｐＨ４.７では、％５ａは0.256/0.354＝72％である。
５ｂの活性を研究した。これは、抗体４Ｅ６を用いて血
清サンプル由来のＴＲＡＰ ５ａを結合させ、次いで抗
体Ｏ１Ａを用いて残りのＴＲＡＰ ５ｂを結合させるこ
とにより行われた。結合したＴＲＡＰ活性は、酢酸緩衝
液のｐＨを表示どおりに変更した以外は、例２の第一段
落で記載されるように測定した。表４は、基質としてｐ
ＮＰＰを用いて種々のｐＨでＴＲＡＰ ５ａおよびＴＲ
ＡＰ ５ｂについて得られた吸光度の値（Ａ405）を示
す。％５ａのカラムは、各ｐＨにおける、全ＴＲＡＰ活
性（５ａ＋５ｂ）に対する５ａ活性の割合を示し、例え
ばｐＨ４.７では、％５ａは0.256/0.354＝72％である。
【００５８】
【表４】
【００５９】表４によると、ｐＨ６.１は、ＴＲＡＰ ５
ａの干渉が非常に低く（９.３％）、ＴＲＡＰ ５ｂの活
性が最適ｐＨの範囲（５.７〜５.９）の活性とほぼ同じ
であるため、ＴＲＡＰ ５ｂを特異的に検出するために
最も優れたｐＨ値であると思われる。通常、血清のＴＲ
ＡＰ活性は、ｐＨ５.５が血清の全ＴＲＡＰ活性を測定
したときに観察される最適ｐＨ値である（これは、上述
の表のカラム５ａ＋５ｂから分かるように、ＴＲＡＰ
５ａとＴＲＡＰ ５ｂの合計活性がｐＨ５.５で最も高く
なるという事実に依るものである）ため、ｐＨ５.５を
用いて検出される。
ａの干渉が非常に低く（９.３％）、ＴＲＡＰ ５ｂの活
性が最適ｐＨの範囲（５.７〜５.９）の活性とほぼ同じ
であるため、ＴＲＡＰ ５ｂを特異的に検出するために
最も優れたｐＨ値であると思われる。通常、血清のＴＲ
ＡＰ活性は、ｐＨ５.５が血清の全ＴＲＡＰ活性を測定
したときに観察される最適ｐＨ値である（これは、上述
の表のカラム５ａ＋５ｂから分かるように、ＴＲＡＰ
５ａとＴＲＡＰ ５ｂの合計活性がｐＨ５.５で最も高く
なるという事実に依るものである）ため、ｐＨ５.５を
用いて検出される。
【００６０】［例４］
Ｏ１Ａに結合した血清のＴＲＡＰ ５ｂ活性をｐＨ６.１
で測定した、例３のＴＲＡＰ ５ｂに特異的な方法を、
今度は、ＴＲＡＰをＯ１Ａに結合させ、Delfiaシステム
を用いてユーロピウム標識Ｊ１Ｂで全ＴＲＡＰを検出す
ることにより血清の全ＴＲＡＰを測定する、二部位（tw
o-site）の測定法と比較する。閉経後の女性グループ
（年齢＞７０）に由来する血清サンプルを使用して、血
清のＴＲＡＰ量に対する６ヶ月のエストロゲン置換治療
（ＨＲＴ）の効果を研究した。ＴＲＡＰ ５ｂに特異的
な方法によれば、６ヶ月ＨＲＴ後にＴＲＡＰ ５ｂ活性
は４８％減少したが（ｐ＝0.001）、（エストロゲンの
代わりにプラシーボを受けた）コントロールグループに
おいては、６ヶ月後にＴＲＡＰ ５ｂ活性の２％増加が
観察された。全ＴＲＡＰに対する二部位（two-site）の
測定法により、両グループとも６ヶ月後に１５〜２０％
の減少が検出された。これらの結果は、全ＴＲＡＰを測
定する二部位法は、６ヶ月のＨＲＴ後の骨吸収速度の変
化を検出する際に感度が高くなく、ＴＲＡＰ ５ｂを特
異的に測定する方法は、６ヶ月ＨＲＴ後のほぼ５０％の
減少を検出することを示しており、このことは、後者の
方法が骨粗鬆症患者のＨＲＴ治療をモニターする際に非
常に有効であることを示唆している。従って、ＴＲＡＰ
５ｂは、全ＴＲＡＰを測定する二部位測定法と比べ
て、エストロゲン置換治療の間の骨吸収速度の変化を検
出するに際し、有意に優れたマーカーである。その結果
を図１に示す。
で測定した、例３のＴＲＡＰ ５ｂに特異的な方法を、
今度は、ＴＲＡＰをＯ１Ａに結合させ、Delfiaシステム
を用いてユーロピウム標識Ｊ１Ｂで全ＴＲＡＰを検出す
ることにより血清の全ＴＲＡＰを測定する、二部位（tw
o-site）の測定法と比較する。閉経後の女性グループ
（年齢＞７０）に由来する血清サンプルを使用して、血
清のＴＲＡＰ量に対する６ヶ月のエストロゲン置換治療
（ＨＲＴ）の効果を研究した。ＴＲＡＰ ５ｂに特異的
な方法によれば、６ヶ月ＨＲＴ後にＴＲＡＰ ５ｂ活性
は４８％減少したが（ｐ＝0.001）、（エストロゲンの
代わりにプラシーボを受けた）コントロールグループに
おいては、６ヶ月後にＴＲＡＰ ５ｂ活性の２％増加が
観察された。全ＴＲＡＰに対する二部位（two-site）の
測定法により、両グループとも６ヶ月後に１５〜２０％
の減少が検出された。これらの結果は、全ＴＲＡＰを測
定する二部位法は、６ヶ月のＨＲＴ後の骨吸収速度の変
化を検出する際に感度が高くなく、ＴＲＡＰ ５ｂを特
異的に測定する方法は、６ヶ月ＨＲＴ後のほぼ５０％の
減少を検出することを示しており、このことは、後者の
方法が骨粗鬆症患者のＨＲＴ治療をモニターする際に非
常に有効であることを示唆している。従って、ＴＲＡＰ
５ｂは、全ＴＲＡＰを測定する二部位測定法と比べ
て、エストロゲン置換治療の間の骨吸収速度の変化を検
出するに際し、有意に優れたマーカーである。その結果
を図１に示す。
【００６１】［例５］
最後に、閉経後の女性の血清サンプルの一団を使用し
て、血清のＴＲＡＰ ５ｂ量および血清の全ＴＲＡＰ量
と骨の無機塩類密度（ＢＭＤ）との相関関係を研究し
た。その結果は、全ＴＲＡＰ（ｒ＝−0.156, ｐ＝0.148
8, 有意な相関関係なし）と比べてＴＲＡＰ ５ｂは、Ｂ
ＭＤに対して有意に優れた負の相関関係を有すること
（ｒ＝−0.540, ｐ＝0.001, ***）を示している。図２
はＴＲＡＰ ５ｂのＢＭＤに対する相関曲線を示す。
て、血清のＴＲＡＰ ５ｂ量および血清の全ＴＲＡＰ量
と骨の無機塩類密度（ＢＭＤ）との相関関係を研究し
た。その結果は、全ＴＲＡＰ（ｒ＝−0.156, ｐ＝0.148
8, 有意な相関関係なし）と比べてＴＲＡＰ ５ｂは、Ｂ
ＭＤに対して有意に優れた負の相関関係を有すること
（ｒ＝−0.540, ｐ＝0.001, ***）を示している。図２
はＴＲＡＰ ５ｂのＢＭＤに対する相関曲線を示す。
【００６２】このデータは、血清の全ＴＲＡＰと比べて
血清のＴＲＡＰ ５ｂが、有意に特異的で感度の高い骨
吸収速度のマーカーであることを確信的に示している。 ［図面の簡単な説明］
血清のＴＲＡＰ ５ｂが、有意に特異的で感度の高い骨
吸収速度のマーカーであることを確信的に示している。 ［図面の簡単な説明］
【図１】 血清中の全ＴＲＡＰ量およびＴＲＡＰ ５ｂ
量に対するエストロゲン治療の効果を示す図。
量に対するエストロゲン治療の効果を示す図。
【図２】 血清ＴＲＡＰ ５ｂと骨の無機塩類密度（Ｂ
ＭＤ）との負の相関関係を示す図。
ＭＤ）との負の相関関係を示す図。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ベーネネン、カレルボ
フィンランド国、エフアイエヌ−90550
オウル、ペイコンティエ ２・ディー
43
(56)参考文献 ＣＬＩＮ ＣＨＥＭ．，ｖｏｌ．41,
Ｎｏ．10（1995） ｐ．1495−1499
ＨＹＢＲＩＤＯＭＡ ｖｏｌ．16，ｎ
ｏ．２（1997） ｐ．175−182
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/48 - 33/98
C12Q 1/42
Claims (17)
- 【請求項１】 被検者の骨吸収速度を測定するための免
疫測定法であって、 ａ）体液サンプル中に存在する酒石酸塩抵抗性酸性ホス
ファターゼ（ＴＲＡＰ）を、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ５ａ
およびＴＲＡＰ５ｂ）を結合する抗体に結合させ、その
後、結合したＴＲＡＰ活性をｐＨ５．７〜６．３の間で
測定し、ここで前記活性が主としてＴＲＡＰ５ｂである
ことにより、あるいは ｂ）体液サンプル中に存在するＴＲＡＰ５ａをＴＲＡＰ
５ａに特異的な抗体に結合させ、その後、結合しなかっ
たＴＲＡＰを測定し、ここで結合しなかったＴＲＡＰの
量がＴＲＡＰ５ｂの量を表し、更にＴＲＡＰ５ｂの量が
骨吸収速度を表すことにより、 前記被検者に由来する体液サンプル中の酒石酸塩抵抗性
酸性ホスファターゼ５ｂ（ＴＲＡＰ５ｂ）を測定するこ
とを特徴とする方法。 - 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、酒石酸
塩抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）に対するモノ
クローナル抗体を使用する方法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の方法であって、体液サ
ンプル中に存在するＴＲＡＰを、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ
５ａおよびＴＲＡＰ５ｂ）を結合する抗体にまず結合さ
せ、その後、結合したＴＲＡＰ活性をｐＨ５．７〜６．
３の間で測定する方法。 - 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、ＴＲＡ
Ｐ活性を、分光測光法によりｐＨ約６．１で測定する方
法。 - 【請求項５】 請求項２に記載の方法であって、ＴＲＡ
Ｐ５ａに特異的なモノクローナル抗体を使用する方法。 - 【請求項６】 請求項５に記載の方法であって、ｂ）で
結合しなかったＴＲＡＰ活性を、分光測光法により測定
する方法。 - 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、ＴＲＡ
Ｐ活性をｐＨ５．７〜６．３の間で測定する方法。 - 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、ＴＲＡ
Ｐ活性をｐＨ約６．１で測定する方法。 - 【請求項９】 請求項１または５に記載の方法であっ
て、ＴＲＡＰの異なるエピトープを認識する、少なくと
も二つの異なるモノクローナル抗体を使用する方法。 - 【請求項１０】 請求項９に記載の方法であって、時間
分解（time-resolved）蛍光免疫測定法を使用する方
法。 - 【請求項１１】 請求項１〜１０の何れか１項に記載の
方法であって、前記体液サンプルが血清サンプルである
方法。 - 【請求項１２】 被検者の体液サンプル中のＴＲＡＰ５
ｂの量を測定することにより骨吸収速度を測定するため
の免疫測定法に使用されるテストキットであって、ＴＲ
ＡＰ５ａに特異的な抗体および全ＴＲＡＰを認識する抗
体を含むテストキット。 - 【請求項１３】 被検者の骨吸収速度の増加に関連のあ
る疾患を治療するための薬剤の効果をモニターする方法
であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（Ｔ
ＲＡＰ５ｂ）量の減少が前記薬剤の効果を示しているこ
とにより、前記被検者の体液サンプル中のＴＲＡＰ ５
ｂを、 ａ）体液サンプル中に存在する酒石酸塩抵抗性酸性ホス
ファターゼ（ＴＲＡＰ）を、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ５ａ
およびＴＲＡＰ５ｂ）を結合する抗体に結合させ、その
後、結合したＴＲＡＰ活性をｐＨ５．７〜６．３の間で
測定し、ここで前記活性が主としてＴＲＡＰ５ｂである
ことにより、あるいは ｂ）体液サンプル中に存在するＴＲＡＰ５ａをＴＲＡＰ
５ａに特異的な抗体に結合させ、その後、結合しなかっ
たＴＲＡＰを測定し、ここで結合しなかったＴＲＡＰの
量がＴＲＡＰ５ｂの量を表し、更にＴＲＡＰ５ｂの量が
骨吸収速度を表すことにより、 測定することを特徴とする方法。 - 【請求項１４】 請求項１３に記載の方法であって、前
記疾患が骨粗鬆症である方法。 - 【請求項１５】 骨吸収速度の増加に関連のある疾患に
対する感受性について被検者をスクリーニングする方法
であって、酒石酸塩抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂ（Ｔ
ＲＡＰ５ｂ）レベルの増大が前記疾患に対する感受性を
示していることにより、前記被検者の体液サンプル中の
ＴＲＡＰ ５ｂを、 ａ）体液サンプル中に存在する酒石酸塩抵抗性酸性ホス
ファターゼ（ＴＲＡＰ）を、全ＴＲＡＰ（ＴＲＡＰ５ａ
およびＴＲＡＰ５ｂ）を結合する抗体に結合させ、その
後、結合したＴＲＡＰ活性をｐＨ５．７〜６．３の間で
測定し、ここで前記活性が主としてＴＲＡＰ５ｂである
ことにより、あるいは ｂ）体液サンプル中に存在するＴＲＡＰ５ａをＴＲＡＰ
５ａに特異的な抗体に結合させ、その後、結合しなかっ
たＴＲＡＰを測定し、ここで結合しなかったＴＲＡＰの
量がＴＲＡＰ５ｂの量を表し、更にＴＲＡＰ５ｂの量が
骨吸収速度を表すことにより、 測定することを特徴とする方法。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、前
記疾患が骨粗鬆症である方法。 - 【請求項１７】 被検者の体液サンプル中のＴＲＡＰ５
ｂの量を測定することにより骨吸収速度を測定するため
の免疫測定法に使用されるテストキットであって、全Ｔ
ＲＡＰを結合する抗体、およびｐＨ５.７〜ｐＨ６.３の
緩衝液を含むテストキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI980748A FI980748A (fi) | 1998-04-01 | 1998-04-01 | Menetelmä luun hajoamisnopeuden määrittämiseksi |
| FI980748 | 1998-04-01 | ||
| PCT/FI1999/000262 WO1999050662A2 (en) | 1998-04-01 | 1999-03-30 | Method of measuring bone resorption rate |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002510050A JP2002510050A (ja) | 2002-04-02 |
| JP3523200B2 true JP3523200B2 (ja) | 2004-04-26 |
Family
ID=8551441
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000541520A Expired - Fee Related JP3523200B2 (ja) | 1998-04-01 | 1999-03-30 | 骨吸収速度を測定する方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP3523200B2 (ja) |
| CN (1) | CN1145030C (ja) |
| AT (1) | ATE279728T1 (ja) |
| AU (1) | AU748663B2 (ja) |
| CZ (1) | CZ296736B6 (ja) |
| DE (1) | DE69921107T2 (ja) |
| DK (1) | DK1068533T3 (ja) |
| ES (1) | ES2232124T3 (ja) |
| FI (1) | FI980748A (ja) |
| PT (1) | PT1068533E (ja) |
| WO (1) | WO1999050662A2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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