CZ296736B6

CZ296736B6 - Zpusob merení rychlosti resorpce kosti

Info

Publication number: CZ296736B6
Application number: CZ20003578A
Authority: CZ
Inventors: Halleen@Jussi; Väänänen@Kalervo
Original assignee: Immunodiagnostic Systems Limited
Priority date: 1998-04-01
Filing date: 1999-03-30
Publication date: 2006-06-14
Also published as: DE69921107T2; EP1068533A2; DE69921107D1; JP3523200B2; FI980748A0; DK1068533T3; ES2232124T3; ATE279728T1; JP2002510050A; AU748663B2; CZ20003578A3; PT1068533E; AU3149199A; WO1999050662A3; WO1999050662A2; CN1145030C; FI980748A; EP1068533B1; CN1295667A

Abstract

Imunochemický zpusob (imunotest) merení rychlostiresorpce kosti, spocívá ve specifickém urcení kyselé fosfatázy rezistentní na tartarát TRAP 5b ve vzorku telesné tekutiny pacienta, napr. séra, pricemz mnozství TRAP 5b odrází rychlost resorpce kosti. Pro specifické urcení TRAP 5b se pouzívají napr.monoklonální protilátky schopné rozlisení mezi TRAP 5b a TRAP 5a. Zpusob je pouzitelný pro diagnostiku onemocnení spojených se zmenou rychlosti resorpce kosti, jako je osteoporóza. Testovací soupravak provádení zpusobu obsahuje bud protilátku, která váze celkovou TRAP a pufr o pH 5,7 az 6,3, nebo protilátky specifické pro TRAP 5a a protilátky rozpoznávající celkovou TRAP.

Description

Způsob měření rychlosti resorpce kosti

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu měření rychlosti resorpce kosti a zejména imunotestu ktomu určeného. Vynález se dále týká způsobu zjišťování nemoci spojené se změnou rychlosti resorpce kosti, jako je osteoporóza, a testovací soupravy použitelné pro uvedené způsoby. Vynález se také týká způsobu sledování účinku léku pro léčení nemoci spojené se zvýšením rychlosti resorpce kosti na pacienta a způsobu pro screening pacientů na vnímavost k uvedené nemoci. Je popsáno použití specifického markéru pro určení rychlosti resorpce kosti.

Dosavadní stav techniky

Existuje několik nemocí spojených se změnami v rychlosti resorpce kosti, nejrozšířenější je osteoporóza, nemoc častá u žen po menopauze. Osteoporóza je způsobována ztrátou kostní masy, z čehož vyplývá křehký skelet, který je náchylný ke zlomeninám. Léčení zlomenin a dalších příznaků vyvolaných osteoporózou je pro společnost drahé, nemluvě o utrpení pacientů. Je proto potřeba diagnostikovat osoby, které trpí osteoporózou, aby se zabránilo vážným následkům tohoto onemocnění. Osteoporóza byla úspěšně léčena např. substitucí estrogenů nebo léčbou bifosfonáty.

Denzitu kostí lze měřit pomocí několika přístrojů a metod. Ale použité přístroje a výkony jsou drahé, protože vyžadují mnoho místa a personálu, měření je pomalé a musí být přítomen pacient. Protože věková distribuce populace se stává nepříznivější, co se týče osteoporózy, je důležité vyvinout specifickou, rychlou, jednoduchou a levnou in vitro metodu pro měření rychlosti resorpce kosti.

Kost se skládá v podstatě ze dvou hlavních buněčných typů, osteoblastů, které kost tvoří, a osteoklastů, které ji resorbují. Normálně jsou tyto dva buněčné typy v rovnováze, osteoklasty resorbují stejné množství kosti, které je osteoblasty tvořeno. Osteoporóza je výsledek zvýšené aktivity osteoklastů, což má za následek poruchu, kdy osteoklasty resorbují více kosti, než produkují osteoblasty.

Kyselá fosfatáza rezistentní na tartarát (TRAP, EC 3.1.3.2) patří podle své elektroforetické mobility do třídy kyselých fosfatáz typu 5 a je proto také nezývána kyselá fosfatáza typu 5. Pomocí elektroforézy v kyselém polyakrylamidovém gelu může být identifikováno přinejmenším 7 kyselých fosfatáz. Nejkyselejší z nich je pás kyselé fosfatázy 5 (Acp5) a tato je jediná rezistentní na inhibici tartarátem, proto je nazývána TRAP. Tento enzym je bazický glykoprotein, který obsahuje v aktivním místě molekuly spinově navázanou jednotku železa. Binukleámí jednotka železa TRAP obsahuje dva železité ionty, které propůjčují proteinu purpurovou barvu, a je proto také nazýván purpurová kyselá fosfatáza. Tento protein má molekulou hmotnost 32 kD. Když je enzym redukován např. β-merkaptoetanolem, jeden ze železitých iontů je redukován a enzym zrůžoví. TRAP může působit in vitro jako proteinová tyrosinfosfatáza a její aminokyselinová sekvence obsahuje oblasti homologní k oblastem fosfoproteinových fosfatáz. Ale její přirozené substráty jsou stále neznámé.

Fosforylace tyrosinu je důležitý regulační mechanizmus pro funkci a diferenciaci mnoha buněk. Má se za to, že TRAP má důležitou úlohu v regulaci funkce osteoklastů. Je známo, že TRAP je schopná tvořit hydroxylove radikály, které jsou v přírodě schopné reagovat s chemickými sloučeninami a ničit je. Osteoklasty produkují během resorpce kosti volné kyslíkové radikály a je zřejmé, že ty jsou pro resorpci kosti významné. Jejich původ je neznámý, ale zdá se, že alespoň část hydroxylových radikálů je tvořena TRAP. Oba buněčné typy, které normálně TRAP obsahu

-1 CZ 296736 B6 jí, tj. osteoklasty a alveolární makrofágy, vychytávají chemické sloučeniny a degradují je. Tento společný rys silně podporuje předpoklad, že se TRAP účastní resorpce kosti.

Hayman, A. R. et al. (Development, 122, 3151-3162, 1996) zkoumali úlohu TRAP cíleným 5 poškozením TRAP genu u myší. Zjistili, že myši postrádající tento gen měly porušenou enchondrální osifikaci a mírnou osteoporózu. Učinili závěr, že TRAP je nezbytná pro normální mineralizaci chrupavky ve vyvíjejících se kostech a že také rozhodujícím způsobem přispívá k resorpci kostní matrix, a tím k udržení integrity a metabolického obratu dospělého skeletu.

Jediné normální lidské buňky, které obsahují významné množství TRAP, jsou osteoklasty a aktivované makrofágy. Za určitých patologických stavů může být TRAP také nalezena v dalších buňkách. Bylo objeveno, že TRAP je secernována osteoklasty do krevního oběhu během resorpce kostí. Proto bylo navrženo sledovat koncentraci TRAP v séru jako markér resorpce kosti a zjistilo se, že koncentrace TRAP v séru koreluje s rychlostí resorpce kosti (Kreanzlin, Μ. E, et al., 15 Joumal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 71(2), 442-451, 1990, Cheung, C. K., et al., Clin. Chem., 41(5), 679-686, 1995, Camberlain, P. et al., Clin. Chem., 41(10), 1495-1499 1995, a Halleen, J. et al., Joumal of Bone and Minerál Research, 11(10), 1444-1452, 1996).

Vr. 1978 Lam, W. K. W., et al. (Clin. Chem. 24(7), 1105-1108, 1978) publikovali studii bio20 chemických vlastností TRAP v séru dospělých a dětí. Zlepšenou elektroforetickou metodou nalezli dva odlišné pásy TRAP, které označili 5a a 5b. TRAP 5a má nižší pH optimum než TRAP 5b. V lidském séru byly nalezeny obě enzymové formy, TRAP 5a a TRAP 5b. Bylo zjištěno, že množství TRAP 5a je u dospělých a dětí konstantní, ale u dětí bylo zvýšeno množství TRAP 5b.

V dalším článku (Chen et al., Clin. Chem., 25, 719-722, 1979) stejná skupina vědců studovala význam vysoké aktivity kyselé fosfatázy v séru normálních dětí. Prokázali, že aktivita sérové TRAP, odpovídající pásu 5, se vyskytovala u nádorů tvořených obrovskými buňkami a ne u osteogenních sarkomů, což svědčilo pro to, že TRAP by pocházela z osteoklastů.

Lam, W. K. W., et al. (Clin. Biochem., 14, 177-181, 1981) izolovali TRAP ze séra a sleziny pacientů postižených Gaucherovou nemocí. Prokázali, že sérum u Gaucherovy nemoci obsahovalo pás 5b, zatímco slezina pacientů s Gaucherovou nemocí obsahovala pás 5a. Pásy 5a, a 5b měly totožnou proteinovou strukturu, a odstranění uhlovodíku z 5a prostřednictvím sialidázy konvertovalo 5a na 5b, což nasvědčovalo, že jediná strukturální odlišnost mezi 5a a 5b by byla 35 přítomnost zbytků kyseliny sialové v 5a, které se nevyskytují v 5b. Optimální pH pro tyto dvě formy bylo odlišné, pro 5a bylo 5,0 a pro 5b bylo 5,5-6,0.

Lam, W. K. W., a Desnick, R. J. (Progress in Clinical and Biological Research, 95, 267-278, 1982) dále studovali formy pásu 5 u Gauchery nemoci. Také shrnuli elektroforetické profily 40 kyselých fosfatáz v normálních a patologických vzorcích. Prokázali, že v normálním séru jsou přítomná stopová množství obou forem 5a a 5b a v žádném patologickém séru nepozorovali elevaci 5a. Místo toho nalezli zvýšené množství 5b u osteoklastických kostních nádorů, v séru pacientů s malignitami metastazujícími do kosti a v séru pacientů s Gaucherovou nemocí. Na základě těchto výsledků autoři uzavřeli, že výsledky mohou naznačovat, že hladina sérové kyselé 45 fosfatázy, a zejména formy 5b, je primárně závislá na fyziologické aktivitě osteoklastů. Ale prohlásili, že pro podporu této hypotézy je nutný další důkaz. Další důležité pozorování publikace je tvrzení autorů, že enzymy (pásy 5a a 5b) jsou blízce příbuzné a antigenně totožné. Podle tohoto údaje by nebylo možné vyvinout imunotest, který by specificky měřil buď 5a, nebo 5b. Po roce 1982 původ sérových TRAP 5a a 5b nebyl dále studován a naznačovaný původ 5b 50 z osteoklastů nebyl verifikován.

Aktivita TRAP může být určena spektrofotometricky, např. podáním p-nitrofenylfosfátu (pNPP) jako substrátu v přítomnosti tartarátu, který inhibuje většinu dalších kyselých fosfatáz. Ale tato metoda není příliš specifická, a proto byly pro určování TRAP vyvinuty specifičtější metody, tj. 55 imunochemické testy, dále zkráceně jen imunotesty.

-2CZ 296736 B6

Stepán, J. J. et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 165,1027-1034, 1989) a Kraenzlin, Μ. E., et al. (Joumal of Clinical Endocrinology and Metabolism, 71(2), 442-451, 1990) vyvinuli imunotest pro TRAP s použitím polyklonálních protilátek tvořících se proti TRAP purifikovanému ze sleziny pacienta s leukémií z vlasatých buněk. Naznačovali, že jejich test by mohl být použitelný pro detekci pacientů s poruchami metabolizmu minerálů.

Cheung, C. K., et al. (Clin. Chem., 41(5), 679-686, 1995) popsali imunotest pro TRAP s použitím polyklonálních protilátek připravených proti TRAP izolovanému zpupečníkové plazmy. Objevili, že koncentrace TRAP byla významně vyšší u dětí a u žen po menopauze a diskutovali možnost použití TRAP jako markéru pro stanovení metabolického obratu kostí.

Proti TRAP izolovanému a purifikovanému z lidské kosti byly také připraveny polyklonální protilátky. Opět bylo prokázáno, že děti a ženy po menopauze mají zvýšené koncentrace TRAP v séru (Halleen, J. et al., Joumal of Bone and Minerál Research, 11(10), 1444-1452, 1996).

Chamberlain, P. et al. (Clin. Chem., 41(10), 1495-1499, 1995) popsali dvoustupňový sérový imunotest pro TRAP používající pár monoklonálních protilátek, které byly vypěstovány proti rekombinantně vytvořenému TRAP. Monoklonální protilátky rozpoznávají odlišné epitopy TRAP a umožňují citlivý test.

Všechny imunotesty doposud publikované měří celkový obsah TRAP v séru. Avšak předkládaný vynález je založen na zjištění, že TRAP 5b je specifičtější biochemický markér resorpce kosti než celková TRAP. V tomto spojení by mělo být zdůrazněno, že izoformy TRAP publikované autory Stepán et al. a Kraenzlin et al. (výše) by neměly být zaměněny za izoformy publikované autory Lam et al. (výše), ačkoliv jsou obě označené 5a a 5b.

Jedním předmětem předkládaného vynálezu je tedy využít TRAP 5b jako specifický markér resorpce kosti.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout specifickou a jednoduchou metodu pro měření rychlosti resorpce kosti a obzvláště poskytnout diagnostický způsob pro rozpoznání nemoci spojené s významnou změnou v rychlosti resorpce kosti, jako je osteoporóza nebo další metabolická onemocnění kosti, kostní léze nebo metastázy do kostí.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob, který umožňuje monitorovat resorpci kosti u pacientů náchylných k těmto onemocněním nebo těmito nemocemi trpícím a sledovat účinek jejich léčby.

Ještě dalším předmětem vynálezu je poskytnout testovací soupravu použitelnou při uvedených způsobech.

Podstata vynálezu

Předmětů předkládaného vynálezu může být dosaženo použitím kyselé fosfatázy5b rezistentní na tartarát (TRAP 5b) jako markéru rychlosti resorpce kosti v imunotestu.

Vynález tudíž poskytuje ímunochemický způsob, neboli imunotest pro měření rychlosti resorpce kosti u pacienta, který je charakterizován tím, že se ve vzorku tělesné tekutiny od uvedeného pacienta určuje kyselá fosfatáza 5b rezistentní na tartrát (TRAP 5b), přičemž množství TRAP 5b odráží rychlost resorpce kosti.

Je zejména poskytnut imunotest pro měření rychlosti resorpce kosti u pacienta, obsahující kroky

-3CZ 296736 B6

a) zjištění kyselé fosfatázy 5b rezistentní na tartarát (TRAP 5b) ve vzorku tělesné tekutiny od uvedeného pacienta vazbou TRAP přítomné ve vzorku tělesné tekutiny na protilátku, která váže celkovou TRAP (TRAP 5b a TRAP 5b), a

b) určení aktivity navázané TRAP při pH mezi 5,7 a 6,3, přičemž množství aktivity TRAP, což je hlavně TRAP 5b, odráží rychlost resorpce kosti.

Předkládaný vynález také poskytuje diagnostický způsob nemoci spojené se změnou rychlosti resorpce kosti u pacienta, charakterizovaný tím, že se ve vzorku tělesné tekutiny od uvedeného pacienta určuje pomocí imunotestu kyselá fosfatáza 5b rezistentní na tartarát (TRAP 5b), přičemž abnormální množství TRAP 5b indikuje onemocnění spojené se změnou rychlosti resorpce kosti.

Vynález dále poskytuje způsob sledování účinku léku pro léčení nemoci spojené se zvýšením rychlosti resorpce kosti na pacienta, charakterizovaný tím, že se ve vzorku tělesné tekutiny od uvedeného pacienta určuje pomocí imunotestu kyselá fosfatáza 5b rezistentní na tartarát (TRAP 5b), přičemž snížené množství TRAP 5b ukazuje účinek daného léku.

Ještě dále se poskytuje způsob screeningu pacientů na vnímavost k onemocněním spojeným se zvýšením rychlosti resorpce kosti, charakterizovaný tím, že se ve vzorcích tělesné tekutiny od uvedených pacientů určuje pomocí imunotestu kyselá fosfatáza 5b rezistentní na tartarát (TRAP 5b), přičemž zvýšená hladina TRAP 5b ukazuje vnímavost kuvedené nemoci.

Vynález dále poskytuje testovací soupravu obsahující protilátky schopné rozlišení mezi kyselou fosfatázou 5b rezistentní na tartarát (TRAP 5b) a kyselou fosfatázou 5b rezistentní na tartarát (TRAP 5a). Tato testovací souprava je použitelná při provádění způsobů podle vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje účinek léčby estrogeny na množství celkové TRAP a TRAP 5b v séru.

Obrázek 2 ukazuje negativní korelaci mezi sérovou TRAP 5b a denzitou kostních minerálů (BMD).

Podrobný popis vynálezu

Když se specificky určuje TRAP 5b místo celkové TRAP ve vzorku tělesné tekutiny pacienta, dosáhne se významně lepší korelace mezi obsahem TRAP a rychlostí resorpce kosti. Nečekaně bylo zjištěno, že je možné určovat imunotestem specificky TRAP 5b použitím protilátek proti TRAP. Překvapivě byly nalezeny protilátky rozlišující mezi TRAP 5b a TRAP 5b. Ale protilátky použité v předkládaném vynálezu nemusí být nezbytně specifické buď pro TRAP 5b, nebo TRAP 5b, ale mohou být také použity protilátky rozpoznávající celkovou TRAP. V tomto případě je pak po reakci s nespecifickými protilátkami anti-TRAP dosaženo rozlišení mezi těmito dvěma formami enzymu jinými prostředky. Bylo např. nalezeno, že aktivita TRAP může být měřena v rozmezí pH, kdy prakticky všechna aktivita TRAP pochází od TRAP 5b. Tyto nálezy mohou poskytnout vylepšený způsob diagnostiky primárních a sekundárních onemocnění kostí spojených se změnami rychlosti resorpce kosti, jako jsou metabolická onemocnění kostí nebo kostní leze či metastázy, a zejména osteoporóza. Způsob měření množství TRAP 5b může být také použit pro sledování účinku léčby kostních onemocnění, např. účinek estrogenové nebo bifosfonátové léčby osteoporózy. Může být také použit pro screening lidí na vnímavost ke zvýšené resorpci kosti, a tím umožnit léčbu zaměřenou na prevenci fraktur kostí.

Termín „pacient“, se v popisu předkládaného vynálezu používá k označení savce, obzvláště člověka.

-4CZ 296736 B6 „TRAP“, jak se používá v předkládané přihlášce, se týká kyselé fosfatázy rezistentní na tartarát (EC 3.1.3.2), která patří do třídy kyselých fosfatáz typu 5 včetně obou forem enzymu 5a a 5b.

„TRAP 5b“ se týká formy b enzymu TRAP postrádající ve svém uhlovodíkovém řetězci kyselinu sialovou a mající optimum pH mezi 5,7 a 6,0.

„TRAP 5a“ se týká formy a enzymu TRAP obsahující ve svém uhlovodíkovém řetězci kyselinu sialovou a mající optimum pH přibližně 4,9.

Uvedené enzymy jsou dále popsány např. v pracích Lam, W. K. W., et al. (Clin. Chem., 24(7), 1105-1108,1978) a Lam, W. K.W., etal. (Clin. Biochem., 14, 177-181, 1981).

Vzorek tělesné tekutiny je výhodně, ale ne nezbytně, vzorek krve, jako je plazma nebo zejména sérum.

V imunotestů podle vynálezu jsou použity protilátky proti TRAP. V tomto spojení je „imunotestem“ míněn způsob testu, kdy je zjišťovaná sloučenina detekována reakcí antigen-protilátka. Imunotest může být přímý nebo nepřímý, kompetitivní nebo nekompetitivní test. Může být použita technika „sendviče“ nebo jednoduchá. Pro zesílení detekce může být značen buď antigen, nebo protilátka. Principy této metody jsou v oboru dobře známy.

Termín „protilátky proti TRAP“, jak se používá v předkládaném vynálezu, zahrnuje jak nespecifické protilátky 5a a 5b, tak specifické anti-TRAP protilátky.

Protilátky proti TRAP jsou výhodně monoklonální protilátky. Uvedené monoklonální protilátky mohou být protilátky, které jsou schopné rozlišení mezi TRAP 5b a TRAP 5a. Protilátky „schopné rozlišení mezi TRAP 5b a TRAP 5a“ mohou být specifické buď pro TRAP 5b, nebo TRAP 5a nebo se mohou skládat z jakékoliv kombinace uvedených specifických protilátek s protilátkami rozpoznávajícími celkovou TRAP, tj. obě TRAP 5b a TRAP 5a.

Protilátky schopné rozlišení mezi TRAP 5a a TRAP 5b mohou být použity několika způsoby pro určení koncentrace TRAP 5b v tělesné tekutině. Jestliže jsou použity protilátky specifické pro TRAP 5b, mohou být použity samozřejmě přímo k detekci TRAP 5b. Ale je výhodné, že je použita protilátka specifická pro TRAP 5b v kombinaci s protilátkou, která rozpoznává obě formy enzymů, tj. celkovou TRAP. V tomto případě může být nejdříve navázána celková TRAP z tělesné tekutiny na protilátku rozpoznávající obě enzymové formy a pak je k detekci navázané TRAP 5b použita značená protilátka, která je specifická pro TRAP 5b, ale která nereaguje s TRAP 5a.

Dále je možné použít kombinaci protilátek specifických pro TRAP 5a a protilátek rozpoznávajících celkovou TRAP. V tomto případě je nejdříve navázána TRAP 5a na protilátky specifické pro TRAP 5a a pak je zbývající aktivita nenavázané TRAP, která musí být ve formě 5b, určována s použitím protilátek rozpoznávajících obě formy enzymu.

Protilátky použité ve způsobu podle vynálezu mohou být pro zesílení detekce značeny každou obvyklou metodou, např. radioaktivně, enzymově, chemiluminiscenčním nebo fluorescenčním značením. Senzitivní detekci poskytuje streptavidin-biotinylový systém. Obzvláště dobré výsledky byly dosaženy při použití systému Delfia, což je imunotest s časově rozloženou fluorescencí (fluoroimunotest) popsaný např. v pracích autorů Hellman, J., et al. (J. Bone Miner. Res., 11, 1165-1175, 1996) a Hemmilá, I., et al. (Anal. Biochem., 137, 335-343, 1984). Dále je výhodné použít alespoň dvě odlišné protilátky, které rozpoznávají odlišné epitopy TRAP. To umožňuje vysoce senzitivní a reprodukovatelný dvouvazebný fluoroimunotest.

-5CZ 296736 B6

Testovací souprava podle předkládaného vynálezu obsahuje protilátky schopné rozlišení mezi TRAP 5b a TRAP 5a. Tato testovací souprava je použitelná pro stanovení rychlosti resorpce kosti a pro diagnostiku onemocnění spojených se změnami rychlosti resorpce kosti podle vynálezu. Testovací souprava může obsahovat protilátky specificky rozpoznávající TRAP 5b, volitelně 5 vedle protilátek rozpoznávajících celkovou TRAP. Alternativně může testovací souprava obsahovat protilátky specificky rozpoznávající TRAP 5a spolu s protilátkami rozpoznávajícími celkovou TRAP nebo může obsahovat protilátky specifické pro TRAP 5b a protilátky specifické pro TRAP 5a. Protilátky jsou výhodně monoklonální protilátky.

ío Další možnost jak měřit aktivitu TRAP 5b podle předkládaného vynálezu je provádění obvyklé spektrofotometrické metody pro určení aktivity kyselé fosfatázy v přítomnosti tartarátu (viz např. Halleen, J. et al., Joumal of Bone and Minerál Research, 11(10), 1444-1452, 1996) v rozmezí pH, které je ve vrcholu enzymové aktivity TRAP 5b, ale mimo rozmezí pro TRAP 5a. Optimum pH pro TRAP 5a je přibližně 4,9 a optimum pro TRAP 5b je přibližně 5,7 až 6,0, jak změřili 15 původci vynálezu. Celková TRAP se normálně měří při pH 5,5. Ale bylo objeveno, že vhodné rozmezí pH pro určení TRAP 5b v přítomnosti TRAP 5a je 5,7 až 6,3, výhodně 5,8 až 6,2 a zejména 6,0 až 6,2. Nejvýhodnější je pH 6,1. Ačkoliv spektrofotometrická metoda nerozliší mezi TRAP 5a a TRAP 5b, aktivita měřená v uvedeném rozmezí pH je v podstatě TRAP 5b. Aktivita TRAP 5a při pH 6,1 je pouze přibližně 20 až 30 % aktivity při pH 4,9. (Jestliže je TRAP 5b 20 určována v nepřítomnosti TRAP 5a, dosáhne se nepatrně vyšší aktivity při pH přibližně 5,9). Při pH6,l je poměr aktivity 5a k celkové aktivitě TRAP menší než 10 %. Tedy, více než 90% měřené aktivity TRAP při pH 6,1 je způsobeno formou 5b.

Využití odlišného optima pH pro TRAP 5b a TRAP 5a v imunotestu poskytuje levný a jednodu25 chý způsob určování TRAP 5b. Tento postup umožňuje použití nespecifických anti-TRAP protilátek (vážou obě 5a a 5b), které jsou nejdříve použity pro vazbu celkové TRAP v tělesné tekutině. Poté je měřena aktivita TRAP např. spektrofotometricky v rozmezí pH mezi 5,7 a 6,3, což je příznivé pro aktivitu TRAP 5b.

Pro rozlišení mezi TRAP 5b a TRAP 5a může být také použit rozdíl v obsahu uhlovodíků. Například celková TRAP je nejdříve vázána protilátkami rozpoznávajícími obě 5a a 5b. Navázaná celková TRAP pak reaguje se značeným aglutininem Galanthus Nivalis (GFNA) nebo lektinem konkavalinu A (ConA), které se vážou na uhlovodíky mající koncovou manózu, jako v TRAP 5b, ale nevážou se na TRAP 5a, protože má ve svém uhlovodíkovém řetězci koncovou kyselinu 35 sialovou.

Ve způsobech podle předkládaného vynálezu je samozřejmě možné k určení TRAP 5b použít každou kombinaci výše popsaných postupů. Vynález je dále popsán v následujících příkladech, které vynález nijak neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

S použitím standardních protokolů byly tvořeny monoklonální protilátky. Myším BALB/c byla podávána čtyřikrát ve 2-týdenních intervalech injekce (20 pg/myš) puntíkované TRAP z lidské kosti (Halleen, J. et al., Joumal of Bone and Minerál Research, 11(10), 1444-1452, 1996), emul50 gované ve Freundově adjuvans, a poté byla zvířata utracena. Buňky sleziny byly hybridizovány s myelomovou buněčnou linií p3-X63-Ag8.653, a hybridomy se pěstovaly v médiu HAT. Byl prováděn screening klonů pomocí inkubace 100 μΐ supematantu v jamkách mikrotitračních destiček potažených anti-myším IgG, a poté následovala inkubace s puntíkovanou TRAP z lidské kosti. Nakonec byla určována aktivita navázaného enzymu pomocí inkubace 200 μΐ reakční 55 směsi (0,lM acetát sodný, pH 6,0, 8mM pNPP a 40mM tartrát sodný) v jamkách po dobu 1 hodi

-6CZ 296736 B6 ny. Reakce byly zastaveny přidáním 16 μΐ 0,5M hydroxidu sodného. Byla měřena absorbance ve 405 nm na čtecím zařízení pro destičky s testem ELISA. Byly získány dvě monoklonální protilátky TRAP, O1A a J1B. Obě protilátky rozpoznávaly obě TRAP 5a a TRAP 5b, ale odlišné epitopy.

Bylo objeveno, že monoklonální protilátka 4E6 vytvořená s použitím rekombinantní TRAP jako antigenem (Chamberlain, P. et al., Clin. Chem., 41(10), 1495-1499, 1995) nereagovala s TRAP izolovanou a purifikovanou z kosti. Místo toho bylo nalezeno, že specificky rozpoznávala formu 5a TRAP obsahující kyselinu sialovou. 400 ng 4E6 se inkubovalo 1 hodinu v jamkách mikrotitračních destiček potažených anti-myším IgG. V jamkách pak byly 1 hodinu inkubovány vzorky séra (200 μΐ). Jako kontrola byly inkubovány vzorky téhož séra v prázdných jamkách mikrotitračních destiček potažených anti-myším IgG. Z jamek bylo trojmo odebráno 50 μΐ, které se smísily se 100 μΐ testovacího pufru Delfia obsahujícího 400 ng O1A značené europiem a biotinylované J1B. Směsi byly inkubovány 2 hodiny v jamkách mikrotitračních destiček potažených streptavidinem za stálého třepání na třepačce destiček Delfia (1296-001 Delfia Plateshaker, Wallac, Oy, Turku, Finsko), a pak promyty promývacím pufrem Delfia. Nakonec byly jamky naplněny zesilovacím roztokem Delfia, 5 minut třepány a byla měřena navázaná fluorescence. Tato metoda je dále popsána např. v práci autorů Hellman, J. et al. (J. Bone Miner. Res., 11, 1165-1175,1996) aHemmila, I., et al. (Anal. Biochem., 137, 335-343,1984).

Výsledky jsou shrnuty vtabulce 1. Bylo zjištěno, že množství TRAP 5a bylo u žen před menopauzou a po menopauze téměř stejné, ale mezi oběma skupinami byl významný rozdíl vmnožství TRAP 5b. Specifické určení TRAP 5b srovnané s celkovou TRAP tak významně zlepšilo použitelnost TRAP jako markéru resorpce kosti. Bylo také potvrzeno, že hladina TRAP 5b je významně vyšší u dětí než u dospělých, zatímco hladina TRAP 5a je téměř konstantní.

Tabulka 1

Množství TRAP (pg/l) v séru

Měřený enzym	Ženy před menopauzou.	Ženy po menopauze	Děti	Po/Před^l	Děti/Před²
Celková TRAP	12, 44	18,06	30, 89	1,45	2, 48
TRAP 5a	6,42	6,76	7,22	1,05	1,12
TRAP 5b	6, 03	11,29	23, 67	1,87	3, 93

’Ρο/Před = poměr forem enzymu TRAP u žen po menopauze a před menopauzou ²Děti/Před = poměr forem enzymu TRAP u dětí a žen před menopauzou

Příklad 2

Jamky mikrotitračních destiček potažené anti-myším IgG byly předem promyty a v jamkách za stálého třepání byla 1 hodinu inkubována monoklonální TRAP protilátka Ol A (400 ng protilátky/jamku). Jamky byly promyty a za stálého třepání v nich byly 1 hodinu inkubovány vzorky séra od 40 zdravých dospělých. Jamky byly promyty a byla měřena aktivita navázané TRAP inkubací 200 μΐ reakční směsi (0,lM acetát sodný, pH 5,9, 8mM pNPP a 40mM tartarát sodný) v jamkách po dobu 1 hodiny. Reakce byly zastaveny přidáním 25 μΐ 0,32M hydroxidu sodného. Byla měřena absorbance ve 405 nm na čtecím zařízení pro destičky s testem ELISA.

Na základě výsledků byly vytvořeny dvě skupiny: „vysoká“, která obsahovala 8 vzorků majících nejvyšší celkovou aktivitu TRAP a „nízká“, která obsahovala 8 vzorků majících nejnižší celkovou aktivitu TRAP. V těchto dvou skupinách byly specificky určovány TRAP 5a a TRAP 5b nejdříve vazbou 5a na protilátku 4E6, a pak určováním aktivity nenavázaného enzymu, tj. TRAP 5 5b, s protilátkou Ol A, jak je popsáno výše. Aktivita TRAP 5a byla měřena při pH 5,0 a aktivita

TRAP 5b při pH 5,9. Výsledky (absorbance ve 405 nm) jsou ukázány v tabulce 2. Je možné pozorovat, že obě skupiny obsahovaly přibližně totéž množství TRAP 5a, zatímco množství TRAP 5b bylo nápadně vyšší ve „vysoké“ skupině.

io Tabulka 2

Aktivita TRAP v sérech s vysokou a nízkou aktivitou

Forma TRAP	Vysoká (průměr ± SD)	Nízká (průměr ± SD)	Vysoká/nízká
5a	0,414 + 0,139	0,415 ± 0,089	0, 998
5b	0,610 ± 0,227	0,171 ± 0,043	3, 550

Nakonec byla určována celková TRAP u obou skupin prostřednictvím vazby na protilátku Ol A a 15 aktivita navázané TRAP byla měřena při různých hodnotách pH, jak je popsáno výše. Výsledky (absorbance ve 405 nm) jsou ukázány v tabulce 3. Výsledky jasně ukazují, že když se zvýší pH, zvyšují se rozdíly mezi těmito dvěma skupinami. Nejlepšího rozdílu (2,46) bylo dosaženo vpH 6,1.

Tabulka 3

Aktivita TRAP při různých hodnotách pH

PH	Vysoká (průměr ± SD)	Nízká (průměr ± SD)	Vysoká/nízká
5,0	0, 786 ± 0,200	0, 683 ± 0,116	1, 15
5,5	0,738 ± 0,236	0,455 ± 0,078	1, 62
5,9	1, 085 ± 0,332	0,538 ± 0,088	2, 02
6, 1	0, 931 + 0,298	0, 377 ± 0,085	2, 46

Příklad 3

Byla studována aktivita séra TRAP 5a a TRAP 5b při různém pH. To se provádělo vazbou TRAP 5a ze vzorků séra při použití protilátky 4E6, a pak vazbou zbylé TRAP 5b při použití protilátky 30 Ol A. Aktivita navázané TRAP byla měřena tak, jak je popsáno v prvním odstavci příkladu 2, kromě toho, že pH acetátového pufru se měnilo, jak je uvedeno. Tabulka 4 ukazuje hodnoty absorbance (A₄₀₅) získané pro TRAP 5a a TRAP 5b při různých pH s použitím pNPP jako substrátu. Sloupec % 5a ukazuje poměr aktivity 5a k celkově aktivita TRAP (5a + 5b) při každém pH, například v pH 4,7 je % 5a 0,256/0,354 = 72 %.

-8CZ 296736 B6

Tabulka 4

pH	Aktivita 5a	Aktivita 5b	% 5a	5a+5b
4, 1	0	0	-	0
4,3	0, 032	0, 023	58 %	0, 055
4,5	0, 187	0, 045	80 %	0,232
4,7	0,256	0,098	72 %	0, 354
4,9	0, 317	0, 188	62 %	0, 505
5,1	0,266	0, 477	35 %	0, 743
5, 3	0,243	0, 504	32 %	0, 747
5, 5	0,211	0,549	27 %	0, 760
5,7	0, 158	0,570	21 %	0, 728
5,9	0, 103	0, 583	15 %	0, 686
6,1	0,057	0,552	9,3 %	0, 609
6,3	0, 033	0, 308	9,6%	0, 341
6, 5	0,016	0,143	10 %	0, 159

Na základě tabulky 4 se jeví pH 6,1 jako nejlepší hodnota pH pro specifickou detekci TRAP 5b, protože interference TRAP 5a je velmi nízká (9,3 %), zatímco TRAP 5b je téměř tak aktivní jako v optimálním rozmezí pH (5,7-5,9). Aktivita TRAP v séru je obvykle detekována při použití pH 5,5, protože to je optimální hodnota pH pozorovaná při měření aktivity celkové TRAP v séru (což je díky faktu, že kombinovaná aktivita TRAP 5a a TRAP 5b je nejvyšší při pH 5,5, jak lze vidět v tabulce výše, sloupec 5a + 5b).

Příklad 4

TRAP 5b specifická metoda z příkladu 3, kdy je měřena aktivita sérové TRAP 5b navázané na Ol A při pH 6,1, pak byla srovnána s dvouvazebným testem, kdy byla určována celková sérová TRAP pomocí vazby TRAP na O1A a detekcí celkové TRAP použitím systému Delfia s J1B značené europiem. Vzorky séra ze skupiny žen po menopauze (ve věku nad 70 let) byly použity ke studiu účinku šestiměsíční estrogenové substituční léčby (hormon replacement therapy = HRT) na množství TRAP v séru. Podle TRAP 5b specifické metody nastal 48% pokles aktivity TRAP 5b po 6 měsících HRT (p=0,001), zatímco v kontrolní skupině (která dostávala placebo místo estrogenu) bylo po 6 měsících pozorovno 2% zvýšení aktivity TRAP 5b. Dvouvazebný test na celkovou TRAP detekoval 15 až 20% pokles po 6 měsících v obou skupinách. Tyto výsledky ukazují, že dvouvazebná metoda měření celkové TRAP není citlivá pro detekci změn rychlosti resorpce kosti po 6 měsících HRT, zatímco způsob měřící specificky TRAP 5b detekuje téměř 50% snížení po 6 měsících HRT, což svědčí pro to, že je velmi užitečný ke sledování HRT léčby pacientů s osteoporózou. TRAP 5b je tedy významně lepší markér pro detekci změn v rychlosti resorpce kosti během estrogenové substituční léčby než dvouvazebný test měřící celkovou TRAP. Výsledky jsou ukázány na obrázku 1.

Příklad 5

Nakonec byla studována korelace množství sérové TRAP 5b a celkové sérové TRAP s denzitou kostních minerálů (BMD) s použitím panelu vzorků séra žen po menopauze. Výsledky ukazují,

-9CZ 296736 B6 že TRAP 5b významně lépe negativně koreluje s BMD (r = -0,540, p = 0,001, ***) než celková TRAP (r = -0,156, p = 0,1488, korelace není významná). Obrázek 2 ukazuje korelační křivku pro TRAP 5b s BMD.

Tato doba přesvědčivě ukazují, že sérová TRAP 5b je významně specifičtější a senzitivnější markér pro rychlost resorpce kosti než celková sérová TRAP.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Imunochemický způsob měření rychlosti resorpce kosti u pacienta založený na tom, že se ve vzorku tělesné tekutiny od pacienta určuje kyselá fosfatáza 5b rezistentní na tartarát (TRAP 5b), přičemž množství TRAP 5 b odráží rychlost resorpce kosti, vyznačující se tím, že imunochemický způsob zahrnuje kroky, kdy se

a) naváže TRAP vyskytující se ve vzorku tělesné tekutiny na protilátku, která váže celkovou TRAP (TRAP 5a a TRAP 5b) a poté se určuje aktivita navázané TRAP při pH mezi 5,7 a 6,3, a

b) naváže TRAP vyskytující se ve vzorku tělesné tekutiny na protilátku specifickou pro TRAP 5a a poté se určuje aktivita nenavázané TRAP.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se používají monoklonální protilátky proti kyselé fosfatáze rezistentní na tartarát (TRAP).
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že aktivita TRAP se v kroku a) určuje spektrofotometricky při pH hodnotě přibližně 6,1.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aktivita nenavázané TRAP se v kroku b) určuje spektrofotometricky nebo imunochemický.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že aktivita TRAP se v kroku b) určuje při pH hodnotě 5,7 až 6,3.
6. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že aktivita TRAP se určuje při pH hodnotě přibližně 6,1.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se používají alespoň dvě odlišné monoklonální protilátky, které rozpoznávají různé epitopy TRAP.
8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se použije fluoroimunochemický test s časově rozloženou fluorescencí.
9. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že vzorek tělesné tekutiny je vzorek séra.
10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž9, vyznačující se tím, že se užije pro diagnostiku nemoci spojené se změnou rychlosti resorpce kosti u pacienta, přičemž abnormální množství TRAP 5a indikuje onemocnění spojené se změnou rychlosti resorpce kosti.
11. Způsob podle nároku 10, vy z n a č uj í c í se t í m , že onemocnění je osteoporóza.

-10CZ 296736 B6
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že se užije pro sledování účinku léku určeného pro léčení nemoci spojené se zvýšením rychlosti resorpce kosti na pacienta, přičemž snížené množství TRAP 5b indikuje účinek léku.
13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že nemoc je osteoporóza.
14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž9, vyznačující se tím, že se užije pro screening pacientů na vnímavost k onemocněním spojeným se zvýšením rychlosti resorpce kosti, přičemž zvýšená hladina TRAP 5b vyjadřuje vnímavost k nemoci.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že onemocnění je osteoporóza.
16. Testovací souprava, vyznačující se tím, že obsahuje

a) protilátku, která váže celkovou TRAP a pufr, jehož pH je 5,7 až 6,3, nebo

b) protilátky specifické pro TRAP 5a a protilátky rozpoznávající celkovou TRAP.