ES2232124T3 - Metodo de medida del indice de resorcion osea. - Google Patents
Metodo de medida del indice de resorcion osea.Info
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Abstract
Un método para determinar el índice de resorción ósea llevando a cabo un inmunoensayo para determinar la fosfatasa ácida resistente al tartrato 5b (TRAP 5b), en una muestra de fluido corporal proveniente de un sujeto, por el que la cantidad de TRAP 5b refleja el índice de resorción ósea, comprendiendo dicho inmunoensayo: (a) unir primero la TRAP presente en la muestra de fluido corporal a un anticuerpo que se une a la TRAP total (TRAP 5a y TRAP 5b), después de lo cual la actividad de la TRAP unida se determina a un pH de entre 5, 7 y 6, 3; o (b) unir primero la TRAP presente en la muestra de fluido corporal a un anticuerpo específico de la TRAP 5a, después de lo cual se determina la actividad de la TRAP no unida.
Description
Método de medida del índice de resorción
ósea.
La presente invención se refiere a un método para
medir el índice de resorción ósea y, en particular, a un
inmunoensayo para el mismo. La invención se refiere asimismo a un
método para diagnosticar un trastorno asociado con un cambio en el
índice de resorción ósea, tal como la osteoporosis y a un equipo de
pruebas que resulta de utilidad en los citados métodos. La invención
también se refiere a un método para monitorear el efecto de una
droga para el tratamiento de un trastorno asociado con un aumento
del índice de resorción ósea en un sujeto y con un método para
analizar a los sujetos para determinar su susceptibilidad a dicho
trastorno. Se revela el uso de un marcador específico para el índice
de resorción ósea.
Hay varios trastornos asociados con los cambios
en índice de resorción ósea, siendo el más ampliamente conocido la
osteoporosis, que es una enfermedad común en las mujeres
posmenopáusicas. La osteoporosis es la consecuencia de la pérdida de
masa ósea, lo cual resulta en un esqueleto débil, que es susceptible
a las fracturas. El tratamiento de las fracturas y de otras
enfermedades causadas por la osteoporosis es costoso para la
sociedad, sin mencionar el sufrimiento de los pacientes. Por lo
tanto, existe una necesidad para diagnosticar a las personas que
sufren de osteoporosis para prevenir las consecuencias severas de la
misma. La osteoporosis se ha tratado con éxito, por ejemplo,
mediante un tratamiento de reemplazo de estrógeno o bifosfonato.
Hay varios instrumentos y métodos para medir la
densidad ósea. No obstante, los aparatos y las operaciones
utilizadas son costosos, porque requieren mucho espacio y personal;
además, la medición es lenta y el paciente tiene que estar presente.
Como la distribución edad-clase de la población está
tornándose más desfavorable en cuanto a la osteoporosis compete, es
importante desarrollar métodos in vitro específicos, rápidos,
simples y económicos para medir el índice de resorción ósea.
El hueso consiste sustancialmente en dos tipos de
células principales, los osteoblastos formadores del hueso y los
osteoclastos que resorben el hueso. Normalmente, estos dos tipos de
células están equilibrados: los osteoclastos resorben la misma
cantidad de hueso que forman los osteoblastos. La osteoporosis es el
resultado de una mayor actividad de los osteoclastos, lo cual deriva
en un trastorno en el que los osteoclastos resorben más hueso del
que los osteoblastos producen.
La fosfatasa ácida resistente al tartrato (TRAP,
EC 3.1.3.2.) pertenece a la clase del tipo 5 de las fosfatasas
ácidas, de acuerdo con su movilidad elecroforética y por lo tanto,
también se la conoce como fosfatasa ácida del tipo 5. Pueden
identificarse al menos siete fosfatasas ácidas por electroforesis
con gel de poliacrilamida ácida. La más ácida de todas ellas es la
fosfatasa ácida de la banda 5 (Acp5) y es la única resistente a la
inhibición por el tartrato, de allí su nombre de TRAP
[Tartrate-Resistant Acid Phosphatase]. Esta
enzima es una glicoproteína básica que contiene una unidad de hierro
acoplado a espín en el sitio activo de la molécula. La unidad de
hierro binuclear de TRAP contiene dos iones férricos, que dan a la
proteína un color púrpura y también se llama fosfatasa ácida
púrpura. Esta proteína tiene un peso molecular de 32 kd. Cuando la
enzima se reduce, por ejemplo con
\exists-mercaptoetanol, uno de los iones férricos
se reduce y la enzima se torna de color rosa. La TRAP puede actuar
como una fosfatasa de tirosina proteica in vitro y su
secuencia de aminoácidos contiene regiones homólogas a las de las
fosfatasas fosfoproteicas. Sin embargo, sus sustratos naturales
todavía son desconocidos.
La fosforilación de la tirosina es un importante
mecanismo de regulación para la función y diferenciación de muchas
células. Se cree que la TRAP desempeña una función importante en la
regulación de la función de los osteoclastos. Se sabe que la TRAP es
capaz de producir radicales hidroxilo, que son capaces de reaccionar
y destruir compuestos que tienen una naturaleza química. Los
osteoclastos producen radicales de oxígeno libres durante la
resorción ósea y es evidente que son significativos en la resorción
ósea. Su origen es desconocido, pero parece que al menos parte de
los radicales hidroxilo se forma por la TRAP. Ambos tipos que
células que normalmente contienen TRAP, es decir, los osteoclastos y
los macrófagos alveolares asimilar compuestos químicos y los
degradan. Esta característica común avala firmemente la presunción
de que la TRAP participa en la resorción ósea.
Hayman, A. R. y colaboradores (Development
122: 3151-3162, 1996) han investigado la función de
la TRAP por alteración dirigida del gen de la TRAP en ratones.
Hallaron que aquellos ratones que carecen del gen tienen una
osificación endocondral alterada y una osteopetrosis leve. Llegaron
a la conclusión que la TRAP es necesaria para la mineralización
normal del cartílago en los huesos en desarrollo y que también
mantiene la integridad y el remodelado del esqueleto adulto mediante
una contribución crítica a la resorción de la matriz ósea.
Las únicas células humanas normales que contienen
cantidades significativas de TRAP son los osteoclastos y los
macrófagos activados. En ciertas condiciones patológicas, la TRAP
también se puede encontrar en otras células. Se ha descubierto que
la TRAP se secreta desde los osteoclastos hacia la circulación de la
sangre durante la resorción ósea. Por lo tanto, la concentración de
TRAP en suero se ha sugerido como un marcador de la resorción ósea y
se ha hallado que la concentración de TRAP en suero se correlaciona
con el índice de resorción ósea (Kraenzlin M. E. y colaboradores
Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism
71(2): 442-451, 1990; Cheung C. K. y
colaboradores Clin. Chem. 41(5):679-686,
1995; Chamberlain P. y colaboradores Clin. Chem.
41(10): 1495-1499, 1995 y Halleen J. y
colaboradores Journal of Bone and Mineral Research
11(10): 1444-1452, 1996).
En 1978 Lam W. K. W. y colaboradores (Clip. Chem.
24(7): 1105-1108, 1978) informaron un estudio
de las propiedades bioquímicas de la TRAP en el suero de adultos y
niños. Mediante un método electroforético mejorado, encontraron dos
bandas diferenciadas de la TRAP, a las que denominaron como 5a y 5b.
La TRAP 5a tenía una óptima de pH menor que la TRAP 5b. Ambas formas
de enzima, la TRAP 5a y TRAP 5b se encontraron en los sueros de
seres humanos. Se halló que la cantidad de TRAP 5a era constante en
adultos y en niños, pero la cantidad de TRAP 5b era elevada en
niños.
En otro documento (Chen y colaboradores, Clin.
Chem. 25, 719-722, 1979), el mismo grupo de
investigadores estudió la significancia de la alta actividad de la
fosfatasa ácida en el suero de niños normales. Ellos demostraron que
la actividad sérica de la TRAP, correspondiente a al banda 5, estaba
presente en los tumores de células gigantes y no en los sarcomas
osteogénicos, lo cual sugiere que la TRAP derivaría de los
osteoclastos.
W.K.W. Lam y colaboradores (Clin. Biochem.
14, 177-181, 1981) aislaron la TRAP del suero y del
bazo de pacientes afectados por la enfermedad de Gaucher.
Demostraron que el suero en la enfermedad de Gaucher contenía banda
5b, mientras que el bazo en la enfermedad de Gaucher contenía la
banda 5a. Las bandas 5a y 5b tenían una estructura idéntica de la
proteína y la eliminación del carbohidrato de la 5a por sialidasa la
convertía en 5b, lo cual sugiere que la única diferencia estructural
entre 5a y 5b sería la presencia de residuos de ácido siálico en 5a
que no están presentes en 5b. Las óptimas de pH de las dos formas
fueron diferentes, siendo de 5,0 para 5a y de
5,5-6,0 para 5b.
W.K.W. Lam y R.J. Desnick (Progress in
Clinical and Biological Research 95, 267-278,
1982) estudiaron en mayor profundidad las formas de la banda 5 en la
enfermedad de Gaucher. También resumieron los perfiles
electroforéticos de las fosfatasas ácidas en el espécimen normal y
patológico. Demostraron que en el suero normal hay cantidades traza
tanto de 5a como de 5b y no observaron una elevación de la banda 5a
en ningún suero patológico. En cambio, encontraron niveles elevados
de 5b en los tumores óseos osteoclásticos, en el suero de pacientes
con malignidades metastatizadas hasta el hueso y en el suero de
pacientes con enfermedad de Gaucher. Basándose en estos resultados,
los autores llegaron a la conclusión que los resultados podrían
sugerir que el nivel de fosfatasa ácida sérica y en particular la
forma 5b, depende básicamente de la actividad fisiológica de los
osteoclastos. Sin embargo, indicaron que se necesitaban más pruebas
para respaldar la hipótesis. Otra observación importante que emana
del documento es la declaración de los autores respecto de que las
enzimas (bandas 5a y 5b) están íntimamente relacionadas y que son
antigénicamente idénticas. De acuerdo con esta declaración, no sería
posible desarrollar un inmunoensayo que midiera específicamente ya
fuera la 5a o 5b. Después del año 1982, el origen de la TRAP 5a y 5b
sérica no se ha estudiado en mayor profundidad y el origen
osteoclástico sugerido de 5b no se ha verificado.
La actividad de la TRAP se puede determinar
espectrofotométricamente, por ejemplo introduciendo fosfato de
p-nitrofenilo (pNPP) como un sustrato en presencia
de tartrato, que inhibe la mayoría de otras fosfatasas ácidas. Sin
embargo, este método no es muy específico y por lo tanto, se han
desarrollado métodos más específicos es decir, inmunoensayos para la
determinación de la TRAP.
Stepan J.J. y colaboradores (Biochem. Biophys.
Res. Commun. 165: 1027-1034, 1989) y Kraenzlin
M. E. y colaboradores (Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism 71(2): 442-451, 1990) han
desarrollado un inmunoensayo para la TRAP usando anticuerpos
policlonales creados contra la TRAP purificada del bazo de un
paciente con leucemia de células pilosas. Sugieren que su ensayo
puede ser útil para detectar pacientes con trastornos en el
metabolismo mineral.
Cheung C. K. y colaboradores (Clip. Chem.
41(5):679-686, 1995) describen un
inmunoensayo de la TRAP que utiliza anticuerpos policlonales
preparados contra la TRAP aislada del plasma del cordón. Hallaron
que la concentración de TRAP era significativamente superior en
niños y en mujeres posmenopáusicas y analizaron la posibilidad de
usar la TRAP como un marcador para evaluar el remodelado óseo.
También se han preparado anticuerpos policlonales
contra la TRAP aislada y purificada del hueso humano. Una vez más,
se demostró que los niños y las mujeres posmenopáusicas tenían
concentraciones elevadas de la TRAP en su suero (Halleen J. y
colaboradores Journal of Bone and Mineral Research
11(10): 1444-1452, 1996).
Chamberlain P. y colaboradores (Clip. Chem.
41(10): 1495-1499, 1995) describen un
inmunoensayo sérico en dos etapas de la TRAP usando un par de
anticuerpos monoclonales, que se han creado contra la TRAP producida
por técnicas recombinantes. Los monoclonales reconocieron diferentes
epitopos de la TRAP y posibilitaron un ensayo sensible de los
mismos.
Todos los inmunoensayos publicados hasta el
momento miden el contenido total de la TRAP en suero. Sin embargo,
la presente invención se basa en el hallazgo de que la TRAP 5b es un
marcador bioquímico mucho más específico para la resorción ósea que
la TRAP total. Con relación a esto, cabe destacar que las isoformas
de la TRAP informadas por Stepan y colaboradores y Kraenzlin y
colaboradores supra no deberían confundirse con las
reportadas por Lam y colaboradores supra, aunque a las dos se
las designa como 5a y 5b.
Un objeto de la presente invención es, por lo
tanto, el de aprovechar a la TRAP 5b como un marcador específico
para la resorción ósea.
Otro objeto de la presente invención es el de
proveer un método simple y específico para medir el índice de
resorción ósea y especialmente, para proveer un método de
diagnóstico para un trastorno asociado con un cambio significativo
en el índice de resorción ósea, como por ejemplo, la osteoporosis u
otras enfermedades óseas metabólicas, lesiones óseas o metástasis
óseas.
Otro objeto de la presente invención consiste en
proporcionar un método que permita monitorear la resorción ósea en
sujetos que sufren presunta o fehacientemente de estos trastornos y
hacer un seguimiento del efecto del tratamiento de los mismos.
Otro objeto de la presente invención consiste en
proporcionar un equipo de pruebas útil para dichos métodos.
Los objetos de la presente invención pueden
logarse usando fosfatasa ácida resistente al tartrato 5b (TRAP 5b)
como marcador para el índice de resorción ósea en el
inmunoensayo.
La invención provee consecuentemente un método
para medir el índice de resorción ósea en un sujeto, caracterizado
porque la fosfatasa ácida resistente al tartrato 5b (TRAP 5b) se
determina en una muestra de fluido corporal proveniente de dicho
sujeto por inmunoensayo, por el que la cantidad de TRAP 5b refleja
el índice de resorción ósea.
Especialmente, el inmunoensayo para medir el
índice de resorción ósea en un sujeto, comprende las etapas de:
(a) determinar la fosfatasa ácida resistente al
tartrato 5b (TRAP 5b) en una muestra de fluido corporal proveniente
de dicho sujeto, uniendo la TRAP presente en la muestra de fluido
corporal a un anticuerpo que une la TRAP total (TRAP 5a y TRAP 5b),
y
(b) determinar la actividad de la TRAP unida, a
un pH de entre 5,7 y 6,3, por lo que la cantidad de actividad de la
TRAP, que es principalmente TRAP 5b, refleja el índice de resorción
ósea.
La presente invención también provee un método
para diagnosticar un trastorno asociado con un cambio en el índice
de resorción ósea en un sujeto, caracterizado porque la fosfatasa
ácida resistente al tartrato 5b (TRAP 5b) se determina por un
inmunoensayo en una muestra de fluido corporal proveniente de dicho
sujeto, por el que una cantidad anormal de TRAP 5b indica un
trastorno asociado con un cambio en el índice de resorción ósea.
La invención provee, asimismo, un método para
monitorear el efecto de una droga para el tratamiento de un
trastorno asociado con un aumento en el índice de resorción ósea en
un sujeto, caracterizado porque la fosfatasa ácida resistente al
tartrato 5b (TRAP 5b) se determina mediante un inmunoensayo en
muestras de fluidos corporales provenientes de dicho sujeto, por el
que una cantidad reducida de TRAP 5b indica el efecto de dicha
droga.
Además se provee un método para estudiar sujetos
a fin de determinar su susceptibilidad a los trastornos asociados
con un mayor índice de resorción ósea, caracterizado porque la
fosfatasa ácida resistente al tartrato 5b (TRAP 5b) se determina
mediante un inmunoensayo en las muestras de fluidos corporales
provenientes de dichos sujetos, por el que un nivel elevado de TRAP
5b indica susceptibilidad al citado trastorno.
La invención provee asimismo un equipo de pruebas
que comprende anticuerpos específicos para la fosfatasa ácida
resistente al tartrato 5a (TRAP 5a) y anticuerpos que reconocen la
TRAP total. Este equipo de pruebas resulta de utilidad para llevar a
cabo los métodos de la invención.
La Figura 1 muestra el efecto del tratamiento con
estrógenos sobre la cantidad de TRAP total y TRAP 5b en los
sueros.
La Figura 2 muestra la correlación negativa entre
la TRAP 5b sérica y la densidad mineral ósea (DMO).
Cuando se determina la TRAP 5b específicamente,
en lugar de la TRAP total en una muestra de fluido corporal
proveniente de un sujeto, se logra una correlación
significativamente mejor entre el contenido de la TRAP y el índice
de resorción ósea. Se halló inesperadamente que es posible
determinar la TRAP 5b específicamente en un inmunoensayo, utilizando
anticuerpos contra la TRAP. Asombrosamente, pudieron encontrarse
anticuerpos que distinguían entre la TRAP 5a y TRAP 5b. Sin embargo,
los anticuerpos utilizados en la presente invención no
necesariamente tenían que ser específicos de la TRAP 5a o bien, de
la TRAP 5b, sino que también podían usarse anticuerpos que
reconocieran la TRAP total. En ese caso, se logra entonces la
distinción entre las dos formas de enzimas por otros medios, después
de la reacción con anticuerpos anti-TRAP no
específicos. Por ejemplo, se halló que la actividad de la TRAP podía
medirse a un intervalo de pH donde prácticamente toda la actividad
de la TRAP se deduciera partiendo de la TRAP 5b. Estos hallazgos
pueden proporcionar un método mejorado para diagnosticar
enfermedades óseas primarias y secundarias asociadas con los cambios
en el índice de resorción ósea, tales como enfermedades óseas
metabólicas, lesiones o metástasis óseas y especialmente,
osteoporosis. El método para medir la cantidad de TRAP 5b también se
puede usar en el monitoreo del efecto de tratamiento de las
enfermedades óseas, por ejemplo el efecto del tratamiento de la
osteoporosis con estrógeno o bifosfonato. También se puede usar para
analizar personas con el propósito de determinar su susceptibilidad
a una mayor resorción ósea, posibilitando así el tratamiento para
prevenir fracturas
óseas.
óseas.
"Sujeto", tal como se usa en el presente
contexto, se refiere a un mamífero, preferiblemente, a un ser
humano.
"TRAP", tal como se usa en la presente
solicitud, se refiere a la fosfatasa ácida resistente al tartrato
(EC 3.1.3.2.), que pertenece a la clase del tipo 5 de las fosfatasas
ácidas, incluso ambas formas de 5a y 5b de la enzima.
"TRAP 5b" se refiere a la forma de enzima b
de la TRAP que carece de ácido siálico en su cadena de carbohidratos
y que tiene un óptima de pH de entre aproximadamente 5,7 y 6,0.
"TRAP 5a" se refiere a la forma de enzima a
de la TRAP, que comprende ácido siálico y su cadena de carbohidratos
y que tiene una óptima de pH ubicada en aproximadamente 4,9.
Dichas enzimas se describen en mayor detalle, por
ejemplo en Lam W. K. W. y colaboradores (Clin. Chem.
24(7):1105-1108, 1978) y Lam W.K.W. y
colaboradores (Clip. Biochem. 14, 177-181,
1981).
La muestra de fluido corporal es preferible,
aunque no necesariamente, una muestra de sangre, tal como plasma o
especialmente, suero.
En el inmunoensayo de la invención se usan
anticuerpos contra la TRAP. Por "inmunoensayo" en este contexto
debe entenderse cualquier ensayo en el que el compuesto a determinar
se detecte por una reacción antígeno-anticuerpo. El
inmunoensayo puede ser un ensayo directo o indirecto, competitivo o
no competitivo. Puede ser una técnica en sándwich o una simple. El
antígeno o bien, el anticuerpo pueden marcarse para mejorar la
detección. Los principios de estos métodos son bien conocidos en la
técnica.
Los "anticuerpos contra la TRAP", tal como
se utilizan en la presente invención incluyen anticuerpos
anti-TRAP, tanto específicos de 5a como no
específicos de 5a y 5b.
Los anticuerpos contra la TRAP son
preferiblemente anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos
monoclonales pueden ser anticuerpos, que sean capaces de distinguir
entre la TRAP 5b y la TRAP 5a. Los anticuerpos "capaces de
distinguir entre la TRAP 5b y TRAP 5a" pueden ser específicos de
la TRAP 5a o pueden consistir en cualquier combinación de dichos
anticuerpos específicos con anticuerpos que reconocen la TRAP total,
es decir, tanto a la TRAP 5b como a la TRAP 5a.
Los anticuerpos capaces de distinguir entre la
TRAP 5a y la TRAP 5b se pueden usar se varias maneras para
determinar la concentración de la TRAP 5b en un fluido corporal.
Es posible usar una combinación de anticuerpos
específicos para la TRAP 5a y anticuerpos que reconozcan a la TRAP
total. En tal caso la TRAP 5a primero se une a los anticuerpos
específicos de la TRAP 5a y luego, la actividad de la TRAP no unida
remanente, que debe ser la forma 5b, se determina usando los
anticuerpos que reconocen ambas formas de enzima.
Los anticuerpos usados en el método de la
invención se pueden marcar de una manera convencional por ejemplo,
con un marcador radioactivo, un marcador enzimático, un marcador
quimioluminiscente o un marcador fluorescente para mejorar su
detección. El sistema de estreptavidina-biotinilo
provee una detección sensible. Se han obtenido resultados
especialmente buenos usando el sistema Delfia, que es un
fluoro-inmunoensayo de resolución tardía descrito
por ejemplo in Hellman J. y colaboradores J. Bone Miner. Res.
11: 1165-1175, 1996; y Hemmilä I. y colaboradores,
Anal. Biochem. 137: 335-343, 1984. Se
prefiere asimismo usar al menos dos anticuerpos diferentes, que
reconozcan epitopos diferentes de la TRAP. Esto posibilita un
fluoroinmunoensayo de dos sitios altamente sensible y
reprodu-
cible.
cible.
El equipo de pruebas de la presente invención
comprende anticuerpos capaces de distinguir entre la TRAP 5b y la
TRAP 5a. Este equipo de pruebas resulta de utilidad para evaluar el
índice de resorción ósea y para diagnosticar trastornos asociados
con un cambio en el índice de resorción ósea de acuerdo con la
invención. El equipo de pruebas puede comprender anticuerpos que
reconozcan específicamente a la TRAP 5a junto con anticuerpos que
reconozcan la TRAP total, o puede comprender anticuerpos específicos
de la TRAP 5a. Los anticuerpos son, preferiblemente, anticuerpos
monoclonales.
Otra posibilidad de medir la actividad de la TRAP
5b de acuerdo con la presente invención es llevar a cabo un método
espectrofotométrico convencional para la actividad de la fosfatasa
ácida en presencia de tartrato (véase por ejemplo, Halleen J. y
colaboradores Journal of Bone and Mineral Research
11(10): 1444-1452, 1996) a un intervalo de
pH, que se encuentre dentro del pico de actividad enzimática de la
TRAP 5b, pero fuera del de la TRAP 5a. La óptima de pH de la TRAP 5a
es de aproximadamente 4,9 y la de la TRAP 5b es de aproximadamente
5,7 a 6,0 según lo han medido los inventores. La TRAP total
normalmente se mide a un pH de 5,5. Sin embargo, se halló que un
intervalo de pH adecuado para la determinación de TRAP 5b en
presencia de TRAP 5a es 5,7 - 6,3, preferiblemente 5,8 - 6,2 y
especialmente, 6,0 - 6,2. Un pH de 6,1 es el más preferible. Aunque
el método espectrofotométrico no distingue entre la TRAP 5a y TRAP
5b, la actividad medida dentro de dicho intervalo de pH es
sustancialmente la de la TRAP 5b. La actividad de la TRAP 5a a un pH
de 6,1 es sólo aproximadamente el 20 - 30% de la actividad a un pH
de 4,9. (Si la TRAP 5b se determina en ausencia de TRAP 5a, se logra
una actividad levemente mayor a un pH de aproximadamente 5,9). A un
pH de 6,1, la proporción de actividad 5a a actividad de la TRAP
total es inferior al 10%. De este modo, más del 90% de la actividad
medida de la TRAP a un pH de 6,1 es de la forma 5b.
El aprovechamiento de la diferencia en la óptima
de pH de la TRAP 5b y de la TRAP 5a en el inmunoensayo proporciona
un método sencillo y económico de determinar la TRAP 5b. Este
procedimiento permite el uso de anticuerpos
anti-TRAP no específicos (se unen tanto a 5a como
5b), que primero se usan para unir la TRAP total del fluido
corporal. Después, se mide la actividad de la TRAP por ejemplo, por
espectrofotometría, en el intervalo de pH comprendido entre 5,7 y
6,3, que favorece la actividad de la TRAP 5b.
La diferencia en el contenido de carbohidratos
también se puede usar para distinguir entre la TRAP 5b y la TRAP 5a.
La TRAP total por ejemplo, se une primero por anticuerpos que
reconocen tanto a 5a como a 5b. La TRAP total unida luego se hace
reaccionar con la lectina Galanthus Nivalis Agglutinin (GNA)
marcada o con la lectina Concanavalina A (ConA), que se une a
los carbohidratos que tienen manosa terminal, tal como la TRAP 5b,
pero que no se une a la TRAP 5a, dado que tiene ácido siálico
terminal en su cadena de carbohidratos.
Por supuesto que es posible usar cualquier
combinación de los procedimientos antes descritos para determinar la
TRAP 5b en los métodos de la presente invención. La invención se
describe en mayor detalle en los siguientes ejemplos no
limitativos.
Se produjeron anticuerpos monoclonales usando los
protocolos estándar. Se inyectaron unos ratones BALB/c cuatro veces,
a intervalos de 2 semanas con (20 \mug/ratón por vez) de TRAP ósea
humana purificada (Halleen J. y colaboradores Journal of Bone and
Mineral Research 11(10): 1444-1452,
1996), emulsionada en el coadyuvante de Freund, después de lo cual
se sacrificaron los animales. Las células del bazo se hibridaron con
la línea de células de mieloma
p3-X63-Ag8.653 y los hibridomas se
cultivaron en el medio de HAT. Los clones se analizaron incubando
100 \mul de sobrenadante en cavidades de microtitulación
recubiertas con IgG anti-ratón, a lo cual siguió la
incubación de TRAP ósea humana purificada. Finalmente, se determinó
la actividad de la enzima unida incubando 200 \mul de la mezcla de
reacción (acetato de sodio 0,1 M, pH 6,0, pNPP 8 mM y tartrato de
sodio 40 mM) en cavidades durante 1 hora. Las reacciones se
detuvieron adicionando 16 \mul de hidróxido de sodio 0,5 M. La
absorbancia a 405 nm se midió con un lector de placas ELISA. Se
obtuvieron dos anticuerpos monoclonales de la TRAP, O1A y J1B. Ambos
anticuerpos reconocieron tanto a la TRAP 5a como a la TRAP 5b, pero
epitopos diferentes.
Se halló que un anticuerpo monoclonal 4E6
desarrollado usando TRAP recombinante como antígeno (Chamberlain P.
y colaboradores Clin. Chem. 41(10):
1495-1499, 1995) no reaccionaba con la TRAP aislada
y purificada del hueso. En cambio, se descubrió que el mismo
reconocía específicamente la forma 5a de la TRAP que contenía ácido
siálico. Se incubaron 400 ng de 4E6 durante 1 hora en cavidades de
microtitulación recubiertas con IgG anti-ratón.
Luego las muestras séricas (200 \mul) se incubaron durante 1 hora
en las cavidades. Como control, se incubaron de un modo similar las
muestras de los mismos sueros en cavidades de microtitulación
recubiertas con IgG anti-ratón vacías. Se tomaron
triplicados de 50 \mul de las cavidades y se mezclaron con 100 ul
del tampón para ensayos Delfia, que contenía 400 ng de O1A marcado
con europio y J1B biotinilado. Luego las mezclas se incubaron
durante 2 horas en cavidades de microtitulación recubiertas con
estreptavidina, con una agitación constante en un agitador de placas
Delfia (Agitador de placas 1296-001 Delfia, Wallac
Oy, Turku, Finlandia) y luego se lavaron con el tampón de lavado
Delfia. Por último, las cavidades se llenaron con solución
mejoradora Delfia, se agitaron durante 5 minutos y se midió la
fluorescencia unida. Este método se describe en mayor detalle, por
ejemplo, en Hellman J. y colaboradores J. Bone Miner. Res.
11: 1165-1175, 1996; y Hemmilä 1. y colaboradores,
Anal. Biochem. 137:335-343, 1984.
Los resultados se resumen en la Tabla 1. Se halló
que la cantidad de TRAP 5a fue casi la misma en mujeres pre- y
posmenopáusicas, pero la diferencia en cantidad de TRAP 5b entre los
dos grupos fue significativa. Así, la determinación específica de la
TRAP 5b -en comparación con la TRAP total- mejoró en forma
significativa la utilidad de la TRAP como un marcador para la
resorción ósea. También se confirmó que el nivel de TRAP 5b es
significativamente mayor en los niños que en los adultos, mientras
que el nivel de la TRAP 5a es casi constante.
| \begin{minipage}[t]{145mm} ^{1}Post/Pre = la relación de las formas enzimáticas de la TRAP en las mujeres posmenopáusicas vs. mujeres premenopáusicas \end{minipage} | |
| \begin{minipage}[t]{145mm} ^{2}Niños/Pre = la relación de las formas enzimáticas de la TRAP en los niños vs. mujeres premenopáusicas. \end{minipage} |
Las cavidades de microtitulación recubiertas con
IgG anti-ratón se pre-lavaron y el
01A monoclonal del anticuerpo de la TRAP- (400 ng de
anticuerpo/cavidad) se incubaron durante 1 hora en las cavidades,
con agitación constante. Las cavidades se lavaron y las muestras
séricas de 40 adultos sanos se incubaron en las cavidades durante 1
hora con agitación constante. Las cavidades se lavaron y la
actividad de la TRAP unida se midió incubando 200 ml de una mezcla
de reacción (acetato de sodio 0,1 M, pH 5,9, pNPP 8 mM y tartrato de
sodio 40 mM) en las cavidades durante 1 hora. Las reacciones se
detuvieron adicionando 25 ml de hidróxido de sodio 0,32 M. La
absorbancia a 405 nm se midió con un lector de placas ELISA.
Basándose en los resultados se formaron dos
grupos: "Alto" que contenía las ocho muestras con la máxima
actividad total de la TRAP y "Bajo", que contenía las ocho
muestras con la mínima actividad total de la TRAP. Se determinaron
específicamente la TRAP 5a y la TRAP 5b en los dos grupos, uniendo
primero la 5a al anticuerpo 4E6 y luego determinando la actividad no
unida, es decir la TRAP 5b con el anticuerpo O1A como se describiera
más arriba. La actividad de la TRAP 5a se midió a un pH de 5,0 y la
actividad de la TRAP 5b, a un pH de 5,9. Los resultados (absorbancia
a 405 nm) se muestran en la Tabla 2. Puede observarse que ambos
grupos contenían aproximadamente la misma cantidad de TRAP 5a,
mientras que la cantidad de TRAP 5b fue notablemente superior en el
grupo
Alto.
Alto.
Por último, la TRAP total de ambos grupos se
determinó por unión al anticuerpo O1A y la actividad de la TRAP se
midió como se describiera anteriormente a diferentes valores de pH.
Los resultados (absorbancia a 405 nm) se muestran en la Tabla 3. Los
resultados muestran claramente que cuando el pH aumenta, la
diferencia entre los dos grupos aumenta. La mejor diferencia (2,46)
se logró a un pH de 6,1.
Se estudió la actividad de la TRAP 5a y TRAP 5b
sérica a diferentes pH. Esto se hizo uniendo la TRAP 5a proveniente
de muestras séricas, usando el anticuerpo 4E6, y luego uniendo la
TRAP 5b remanente usando el anticuerpo O1A. La actividad de la TRAP
unida se midió tal como se describe en el primer párrafo del Ejemplo
2, salvo que el pH del tampón de acetato se cambió tal como se
indica. La Tabla 4 muestra los valores de absorbancia (A_{405})
obtenidos para la TRAP 5a y TRAP 5b a diferentes pH usando pNPP como
sustrato. La columna de % 5a indica la relación de la actividad de
la de 5a con la actividad total de la TRAP (5a + 5b) en cada pH; por
ejemplo a un pH de 4,7, el % de 5a es 0,256 / 0,354 = 72%.
Basándose en la Tabla 4, el pH 6,1 parece ser el
mejor valor de pH para detectar la TRAP 5b específicamente, dado que
la interferencia de TRAP 5a es muy baja (9,3%), mientras que la TRAP
5b es casi tan activa como en el intervalo de la óptima de pH
(5,7-5,9). Por lo general, la actividad sérica de la
TRAP se detecta usando un pH de 5,5, porque éste es el valor óptimo
de pH observado midiendo la actividad sérica total de la TRAP (que
se debe al hecho de que la actividad combinada de la TRAP 5a y TRAP
5b es la máxima a un pH de 5,5, como se observa en la tabla
anterior, columna 5a + 5b).
El método específico de la TRAP 5b del Ejemplo 3,
donde la actividad de la TRAP 5b sérica unida al O1A se mide a un pH
de 6,1 se comparó luego con un ensayo de dos centros, donde la TRAP
sérica total se determinó uniendo la TRAP a O1A y detectando la TRAP
total usando el sistema Delfia con J1B marcado con europio. Las
muestras séricas de un grupo de mujeres posmenopáusicas (de > 70
años de edad) se usaron para estudiar el efecto de una terapia de
reemplazo de estrógeno de 6 meses (HRT) en la cantidad de TRAP
sérica. De acuerdo con el método específico de la TRAP 5b hubo una
caída del 48% en la actividad de la TRAP 5b después de una HRT de 6
meses (p = 0,001), mientras que en el grupo de control (que recibía
placebo en lugar de estrógeno), se observó un 2% de aumento en la
actividad del TRAP 5b después de 6 meses. El ensayo de dos sitios
para la TRAP total detectó una caída del 15-20%
después de 6 meses en estos dos grupos. Estos resultados indican que
el método de dos sitios que mide la TRAP total no es sensible para
detectar los cambios en el índice de resorción ósea después de una
HRT de seis meses, mientras que el método de medir la TRAP 5b
específicamente detecta una reducción de casi el 50% después de 6
meses de HRT, lo cual sugiere que es altamente útil en el monitoreo
del tratamiento con HRT de pacientes con osteoporosis. De esta
manera, la TRAP 5b es un marcador significativamente mejor para
detectar los cambios en el índice de resorción ósea durante la
terapia con reemplazo de estrógenos que el ensayo de dos sitios que
mide la TRAP total. Los resultados se muestran en la Figura 1.
Finalmente, se estudió la correlación de las
cantidades de TRAP 5b sérica y TRAP sérica total a la densidad
mineral ósea (DMO) usando un panel de muestras séricas de mujeres
posmenopáusicas. Los resultados muestran que la TRAP 5b tiene una
correlación negativa significativamente mejor con la DMO (r =
-0,540, p = 0,001, ***) que la TRAP total (r = -0,156, p = 0,1488,
sin correlación significativa). La Figura 2 muestra la curva de
correlación para la TRAP 5b con la DMO.
Estos datos muestran de una manera convincente
que la TRAP 5b sérica es un marcador significativamente más
específico y sensible del índice de resorción ósea que la TRAP
sérica total.
Claims (16)
1. Un método para determinar el índice de
resorción ósea llevando a cabo un inmunoensayo para determinar la
fosfatasa ácida resistente al tartrato 5b (TRAP 5b), en una muestra
de fluido corporal proveniente de un sujeto, por el que la cantidad
de TRAP 5b refleja el índice de resorción ósea, comprendiendo dicho
inmunoensayo:
(a) unir primero la TRAP presente en la muestra
de fluido corporal a un anticuerpo que se une a la TRAP total (TRAP
5a y TRAP 5b), después de lo cual la actividad de la TRAP unida se
determina a un pH de entre 5,7 y 6,3; o
(b) unir primero la TRAP presente en la muestra
de fluido corporal a un anticuerpo específico de la TRAP 5a, después
de lo cual se determina la actividad de la TRAP no unida.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se usan anticuerpos monoclonales contra la fosfatasa ácida
resistente al tartrato (TRAP).
3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
2, en el que la actividad de la TRAP en el ítem (a) se determina
espectrofotométricamente a un pH de aproximadamente 6,1.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la actividad de la TRAP no unida en el ítem (b) se
determina espectrofotométricamente o en un inmunoensayo.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que la actividad de la TRAP no unida en el ítem (b) se
determina a un pH de entre 5,7 y 6,3.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 5,
en el que la actividad de la TRAP no unida se determina a un pH de
aproximadamente 6,1.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1,
en el que se usan al menos dos anticuerpos monoclonales diferentes,
que reconocen distintos epitopos de la TRAP.
8. El método de acuerdo con la reivindicación 7
en el que se usa un fluoroinmunoensayo de resolución tardía.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que la muestra de fluido
corporal es una muestra de suero.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para usar en el diagnóstico de un trastorno
asociado con un cambio en el índice de resorción ósea en un sujeto,
por el que una cantidad anormal de TRAP 5b indica un trastorno
asociado con un cambio en el índice de resorción ósea.
11. El método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que dicho trastorno es la osteoporosis.
12. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para usar en el monitoreo del efecto de una
droga para el tratamiento de un trastorno asociado con un aumento en
el índice de resorción ósea en un sujeto, por el que una cantidad
reducida de TRAP 5b indica el efecto de dicha droga.
13. El método de acuerdo con la reivindicación
12, en el que el trastorno es la osteoporosis.
14. El método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9 para usar en el estudio de sujetos a fin de
determinar su susceptibilidad a los trastornos asociados con un
mayor índice de resorción ósea, por el que un nivel elevado de TRAP
5b indica susceptibilidad a dicho trastorno.
15. El método de acuerdo con la reivindicación
14, en el que dicho trastorno es la osteoporosis.
16. Un equipo de pruebas que comprende
anticuerpos específicos de la TRAP 5a y anticuerpos que reconocen la
TRAP total.
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