ES2281363T3 - Ensayo de diagnostico para el accidente cerebrovascular. - Google Patents
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Abstract
Método de ensayo de diagnóstico para accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en una muestra de fluido corporal tomada de un paciente que se sospecha que padece un accidente cerebrovascular, que comprende determinar la concentración de proteína de unión a ácidos grasos de corazón o cerebro (H-FABP o B-FABP) en la muestra.
Description
Ensayo de diagnóstico para el accidente
cerebrovascular.
Esta invención está en el campo del ensayo de
diagnóstico que utiliza una proteína o un anticuerpo para ello.
El accidente cerebrovascular constituye la
tercera mayor tasa de muerte en países industrializados. Esto
resulta de una reducción o bien permanente o bien transitoria en el
flujo sanguíneo cerebral. Esta reducción en el flujo, en la mayoría
de los casos, está producida por la oclusión arterial debido o
bien a un émbolo o bien una trombosis local. Dependiendo de la
ubicación de la lesión cerebral y de la intensidad de las neuronas
necrosadas, los síntomas del accidente cerebrovascular pueden
llegar a ser un impedimento vital para los pacientes y la tasa de
muerte de los acontecimientos de accidentes cerebrovasculares se
aproxima al 30%.
Recientemente, se describió S100B como un
marcador bioquímico potencial para el diagnóstico de accidentes
cerebrovasculares, véase U. Missler et al., "S100 protein
and neuron-specific enolase concentrations in blood
as indicators of infarct volume and prognosis in acute ischemia
stroke", Stroke 1997; 28:1956-60. Sin embargo,
se ha notificado que S100B es un marcador útil para la detección
temprana de metástasis de melanoma y complicaciones cerebrales del
traumatismo craneoencefálico y la cirugía cardiaca. Por tanto, la
sensibilidad y especificidad de la prueba de S100B estaban
limitados al 44% y al 67%, respectivamente, véase M. Takahashi
et al., "Rapid and sensitive immunoassay for the
measurement of serum S100B using isoform-specific
monoclonal antibody", Clin. Chem. 1999;
45:1307-11. El desarrollo de nuevos marcadores de
accidentes cerebrovasculares ayudaría a los médicos a establecer
diagnósticos tempranos y de este modo evitar una posible recaída
del paciente.
El documento WO 98 45440 describe una proteína
humana de unión a ácidos grasos, y la prevención, tratamiento y
diagnóstico de enfermedades asociadas con expresión de la
misma.
Se ha descubierto ahora sorprendentemente que
dos proteínas de unión a ácidos grasos (FABP: fatty acid binding
protein), conocidas como de corazón (H-FABP:
heart-FABP) y de cerebro (B-FABP:
brain-FABP), son marcadores para el accidente
cerebrovascular. Por tanto, la invención proporciona un método de
ensayo de diagnóstico para el accidente cerebrovascular o la
posibilidad del mismo en una muestra de fluido corporal tomada de
un paciente que se sospecha que padece un accidente
cerebrovascular, que comprende determinar la concentración de la
proteína de unión a ácidos grasos de corazón o cerebro
(H-FABP o B-FABP) en la muestra. La
concentración así determinada se usa para realizar o ayudar en la
realización de un diagnóstico.
El método se lleva a cabo convenientemente
usando un anticuerpo frente a H-FABP o
B-FABP, por el que el grado de reacción entre el
anticuerpo y la FABP en la muestra se somete a ensayo y se
relaciona con la concentración de FABP en la muestra.
La presente invención permite que se lleve a
cabo un ensayo de alta sensibilidad, especificidad y valor positivo
predictivo para el accidente cerebrovascular. La
"sensibilidad" se define como el porcentaje de verdaderos
positivos obtenidos mediante el ensayo sobre muestras tomadas de
pacientes en los que el examen clínico ha confirmado accidente
cerebrovascular. Se calcula como el % de verdaderos
positivos/(verdaderos positivos + falsos negativos). La
"especificidad" quiere decir el porcentaje de verdaderos
negativos obtenidos mediante el ensayo sobre muestras control, es
decir de pacientes en los que el examen clínico no ha revelado
accidente cerebrovascular. Se calcula como el % de verdaderos
negativos/(falsos positivos + verdaderos negativos). El "valor
positivo predictivo" quiere decir la razón en % de verdaderos
positivos/(verdaderos positivos + falsos positivos).
La H-FABP es un marcador
conocido de infarto de miocardio agudo (AMI: acute myocardial
infarction), véase J. Ishii et al., "Serum concentrations
of myoglobin vs human heart-type cytoplasmic
fatty-acid binding protein in early detection of
acute myocardial infarction", Clinical Chemistry 1997;
43:1372-1378. Por tanto, con el fin de usar un
ensayo para la H-FABP para determinar el accidente
cerebrovascular con mayor provecho, es deseable llevar a cabo otro
tipo de ensayo para el AMI (uno en el que el marcador no sea una
FABP) con el fin de eliminar del diagnóstico para accidente
cerebrovascular a los pacientes que son positivos en el ensayo del
AMI.
Por tanto, en una realización particular, la
invención proporciona un método que comprende determinar la
concentración de H-FABP en un primer ensayo, tal
como se definió anteriormente, mediante el que un resultado
positivo indica la posibilidad de, o bien un accidente
cerebrovascular o bien infarto de miocardio agudo, y que comprende
adicionalmente llevar a cabo un segundo ensayo de diagnóstico, para
el infarto de miocardio agudo (AMI) solamente, mediante el que un
resultado positivo en el ensayo de H-FABP y un
resultado negativo en el ensayo para AMI indica que el paciente
podría estar padeciendo un accidente cerebrovascular. Los ensayos
que usan troponina-I y creatina
cinasa-MB (CK-MB) como marcadores
bioquímicos tempranos del infarto de miocardio agudo (AMI) se
conocen bien y son adecuados para el fin anterior. Pueden llevarse
a cabo en plasma, suero o sangre. Por supuesto, los términos
"primero" y "segundo" son etiquetas meramente
convenientes: los dos ensayos pueden llevarse a cabo en cualquier
orden.
Una H-FABP similar y también una
proteína de unión a ácidos grasos específica del cerebro
(B-FABP) se han encontrado en el cerebro de ratón,
véase L. Pu et al., Molecular and Cellular Biochemistry
1999;198 69-78. Se cree que la
H-FABP del cerebro (no ha de confundirse con
B-FABP) difiere de la H-FABP del
corazón por una sustitución de un único aminoácido. Sin embargo, la
B-FABP difiere considerablemente. P. A. Sellner
et al., "Development role of fatty acid binding proteins
in mouse brain" Dev. Brain Res. 1995; 89:33-46
estimaron la homología del ADN en un 69%, mientras que A. Schreiber
et al., "Recombinant human heart-type
fatty acid binding protein as standard in immunochemical assays"
mencionan un 64% de homología de secuencia de aminoácidos y que un
anticuerpo monoclonal frente a la H-FABP humana
reacciona de manera cruzada con la B-FABP humana
hasta el grado de sólo el 1,7%.
Ahora que los presentes inventores han
encontrado que la H-FABP es un marcador para el
accidente cerebrovascular, es una predicción muy razonable que la
B-FABP lo será también. Debido a que
B-FABP es específica para el tejido cerebral y no
aparece reaccionar significativamente con un anticuerpo monoclonal
frente a H-FABP, no dará positivos para AMI,
haciendo innecesario un ensayo para AMI.
La única figura es una representación gráfica en
el eje y de la concentración de H-FABP representada
mediante la medición de la densidad óptica a 405 nm, tal como se
determina mediante el método de la invención, para (a) el grupo
control que no tienen ni accidente cerebrovascular ni AMI (b) el
grupo que tiene AMI y (c) el grupo de accidente cerebrovascular, en
cuatro puntos de tiempo tras el ingreso (0 horas, 1 día, 3 días y
7 días).
Para el método de ensayo, la muestra puede
tomarse de la sangre, plasma o suero del paciente. El marcador,
H-FABP o B-FABP, se mide
preferiblemente mediante un inmunoensayo, usando un anticuerpo
específico frente a H-FABP y midiendo el grado de
interacción antígeno (H-FABP o
B-FABP)/anticuerpo. Para el diagnóstico de
pacientes humanos, el anticuerpo es preferiblemente
anti-B-FABP o
anti-H-FABP humanas. De manera
similar, si el paciente es un animal, el anticuerpo debería ser
frente a la H-FABP o la B-FABP de la
misma variedad animal, por ejemplo,
anti-B-FABP o
anti-H-FABP equinas si el paciente
es un caballo. Puede ser un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo
modificado por ingeniería genética. Se usa convenientemente un
anticuerpo monoclonal de ratón anti-equino,
anti-humano etc. Se conocen anticuerpos frente a la
H-FABP, por ejemplo 66E2 y 67D3, descritos por W.
Roos et al., "Monoclonal antibodies to human heart type
fatty acid-binding protein", J. Immunol. Methods
1995; 183 149-153, que están disponibles
comercialmente. Además, puede usarse el método de
Kóhler-Milstein usual para producir anticuerpos
frente a B-FABP o H-FABP. La fuente
de proteínas para este fin puede ser la proteína preparada a partir
de ADN de manera recombinante o derivada de manera natural. Las
H-FABP y B-FABP humanas
recombinantes se han descrito por A. Schreiber, citado
anteriormente y F. Shimizu et al., "Isolation and
expression of a cDNA for human brain fatty acid binding protein
(B-FABP)", Biochim. Biophys. Acta 1997;
1354:24-28, respectivamente. Menos preferiblemente,
el anticuerpo puede ser policlonal.
Puede usarse cualquier método de inmunoensayo
conocido. Se prefiere un ensayo de intercalación. En este método,
un anticuerpo (por ejemplo policlonal) frente a la FABP se une a
la fase sólida, tal como un pocillo de una placa de microtitulación
de plástico, y se incuba con la muestra y con un segundo anticuerpo
marcado específico frente a la H-FABP o la
B-FABP que va a detectarse. Alternativamente, podría
usarse un ensayo de captura de anticuerpos (también denominado
"inmunoensayo indirecto"). En este caso, se permite unir la
muestra de prueba a una fase sólida, y entonces se añade el
anticuerpo (policlonal o monoclonal) anti-FABP y se
permite que se una. Si se usa un anticuerpo policlonal en este
contexto, sería deseable que fuera uno que mostrara una reactividad
cruzada baja con otras formas de FABP. Tras eliminar por lavado el
material no unido, la cantidad de anticuerpo unido a la fase sólida
se determina usando un segundo anticuerpo marcado, anti- con
respecto al primero.
Podría realizarse un ensayo directo usando un
anticuerpo anti-FABP marcado. Se permite que la
muestra de prueba se una a la fase sólida y se añade el anticuerpo
anti-FABP. Tras eliminar por lavado el material no
unido, se determina la cantidad de anticuerpo unido a la fase
sólida. El anticuerpo puede marcarse directamente en lugar de
mediante un segundo anticuerpo.
En otra realización, podría realizarse un ensayo
de competencia entre la muestra y una FABP marcado o un péptido
derivado de la misma, estando estos dos antígenos en competencia
por una cantidad limitada de anticuerpo anti-FABP
unido a un soporte sólido. La FABP marcada o el péptido podrían
incubarse previamente con el anticuerpo sobre la fase sólida,
mediante lo que la FABP en la muestra desplaza parte de la FABP o
péptido de la misma unido al anticuerpo.
En todavía otra realización, se permite que los
dos antígenos compitan en una incubación conjunta individual con
el anticuerpo. Tras la eliminación del antígeno no unido del
soporte mediante lavado, se determina la cantidad de marcador unida
al soporte y se mide la cantidad de proteína en la muestra mediante
referencia a curvas de titulación patrón establecidas
previamente.
En todos los casos, el marcador es
preferiblemente una enzima. El sustrato para la enzima puede ser un
agente formador de color, fluorescente o quimioluminiscente.
Alternativamente, el marcador puede ser un radioisótopo o agente
fluorescente, por ejemplo usando fluoresceína conjugada.
La enzima es preferiblemente fosfatasa alcalina
o peroxidasa de rábano picante y puede usarse de manera
conveniente colorimétricamente, por ejemplo, usando fosfato de
p-nitrofenilo como sustrato formador de color
amarillo con fosfatasa alcalina.
Para un ensayo de quimioluminiscencia, el
anticuerpo puede marcarse con éster de acridinio o peroxidasa de
rábano picante. Esta última se usa en un ensayo de
quimioluminiscencia (ECL) mejorado. En este caso, el anticuerpo,
marcado con peroxidasa de rábano picante, participa en una reacción
quimioluminiscente con luminol, un sustrato de peróxido y un
compuesto que mejora la intensidad y duración de la luz emitida,
normalmente 4-yodofenol o ácido
4-hidroxicinámico.
Puede usarse un inmunoensayo amplificado tal
como inmuno-PCR. En esta técnica, el anticuerpo se
une covalentemente a una molécula de ADN arbitrario que comprende
cebadores de PCR, mediante lo que el ADN con el anticuerpo unido a
él se amplifica mediante la reacción en cadena de la polimerasa.
Véase E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Research 1995;
23, 522-529 (1995) o T. Sano et al., en
"Molecular Biology and Biotechnology" editado por Robert A.
Meyers, VCH Publishers, Inc. (1995), páginas 458 - 460. La señal se
lee igual que anteriormente.
En un procedimiento particularmente preferido,
se desarrolló un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA)
para detectar la H-FABP. Debido a que la
H-FABP es también un marcador para el AMI, se
sometieron a ensayo las concentraciones de
troponina-I o CK-MB con el fin de
excluir cualquier lesión cardiaca. Tal como se describe en el
ejemplo, estos ensayos se evaluaron en muestras de plasma en serie,
de 22 pacientes que carecían de AMI y accidente cerebrovascular, 20
pacientes con AMI y 22 pacientes con accidente cerebrovascular
confirmado en cuatro puntos de tiempo tras el ingreso en el centro
médico. La sensibilidad, especificidad y valor positivo predictivo
para la H-FABP en accidentes cerebrovasculares
fueron del 59,1%, 90,9% y 86,7% respectivamente. Sólo uno de los 22
pacientes con accidente cerebrovascular había aumentado la
expresión de troponina-I y H-FABP.
Por tanto, la detección de H-FABP combinada con el
ensayo de CK-MB o troponina-I
proporciona un marcador útil de diagnóstico del accidente
cerebrovascular o lesión cerebral.
El uso de un inmunoensayo turbidimétrico
mejorado para micropartículas rápido, desarrollado para
H-FABP en el caso de AMI, M. Robers et al.,
"Development of a rapid microparticle-enhanced
turbidimetric immunoassay for plasma fatty
acid-binding protein, an early marker of acute
myocardial infarction", Clin. Chem. 1998;
44:1564-1567, debería reducir drásticamente el
tiempo del ensayo. Por tanto, la automatización completa en un
analizador de química clínica ampliamente usado tal como el sistema
COBAS^{TM} MIRA Plus de Hoffmann-La Roche,
descrito por M. Robers et al. citado anteriormente, o el
sistema AxSYM^{TM} para Abbott Laboratories, debería ser posible
y poder aplicarse para el diagnóstico clínico habitual del
accidente cerebrovascular.
Las concentraciones de H-FABP o
B-FABP pueden medirse mediante otros medios aparte
del inmunoensayo. Por ejemplo, la muestra puede someterse a
electroforesis bidimensional (2D) en gel y la cantidad de FABP
puede estimarse mediante exploración densitométrica del gel o de
una inmunotransferencia el mismo. Sin embargo, es deseable llevar a
cabo el ensayo de una manera rápida, de forma que el paciente pueda
tratarse de inmediato.
El siguiente ejemplo ilustra la invención.
Ejemplo
La población del estudio consistió en 22
pacientes control ajustados por edad y sexo (grupo Control), 20
pacientes con AMI confirmado (grupo AMI) y 22 pacientes con
accidente cerebrovascular confirmado (grupo Accidente
cerebrovascular). El grupo Control incluía 14 hombres, edad media
66 años, intervalo 34-86 años, y 8 mujeres, edad
media 63 años, intervalo 51-81 años. El grupo AMI
incluía 16 hombres, edad media 65 años, intervalo
29-90 años, y 4 mujeres, edad media 72 años,
intervalo 66-81 años. El grupo Accidente
cerebrovascular incluía 14 hombres, edad media 65 años, intervalo
30-87, y 8 mujeres, edad media 64 años, intervalo
51-85 años. Se recogieron cuatro muestras de sangre
por cada paciente del grupo Accidente cerebrovascular tras el
ingreso (t_{0}=0 h; t_{1}=1 día, t_{3}=3 días, t_{7}=7
días). Se recogieron las muestras de sangre en tubos que contenían
heparina en seco. Tras la centrifugación a 1500 g durante 15
minutos a 4ºC, se almacenaron las muestras de plasma como alícuotas
a - 20ºC hasta el análisis. Los pacientes del grupo Accidente
cerebrovascular se sometieron a evaluaciones clínicas en serie
realizadas por neurólogos con el fin de confirmar un diagnóstico de
accidente cerebrovascular. Los pacientes del grupo AMI ingresaron
en el hospital con un AMI confirmado (concentración de
troponina-I > 2 ng/ml). Se realizó una
evaluación clínica en todos los pacientes del grupo Control para
excluir Accidente cerebrovascular y AMI.
Se midieron las concentraciones de
H-FABP en plasma mediante un ELISA de
intercalación. Una microplaca de poliestireno de 96 pocillos (NUNC)
se recubrió con 100 \mul/pocillo de anticuerpo policlonal de cabra
anti-FABP humana de músculo (Spectral Diagnóstico
HC, Ontario, EE.UU.), 20,4 ng/ml en un tampón carbonato 0,1 M, pH
9,6, durante la noche a 4ºC. La placa se lavó automáticamente con
PBS (Na_{2}PO_{4} 15 mM - NaCl 120 mM - KC1 7 mM pH 7,4, Sigma)
en un lavador BioRad NOVAPATH^{TM}. Cada etapa de lavado se
realizó con PBS fresco. Se bloquearon los sitios de unión no
específicos con 200 \mul/pocillo de caseína al 2% en un tampón
carbonato durante 2 h a 37ºC. Tras la etapa de lavado, se
pipetearon las muestras por duplicado a 100 \mul/pocillo. Se
incubó la placa 2 h a 37ºC. Tras la etapa de lavado se incubaron 100
\mul/pocillo de anticuerpo de ratón anti-FABP
humana de corazón (clon 66E2, HyCult Biotechnology BV, Uden, Países
Bajos), 0,3 ng/ml en PBS-BSA al 1%, durante 1 h a
temperatura ambiente (T.A.) con agitación. Tras la etapa de lavado,
se incubaron 100 \mul/pocillo de inmunoglobulina
anti-ratón marcada con fosfatasa (Dako, Dinamarca),
15 ng/ml en PBS, 1 h 30 min. a T.A. con agitación. Tras la etapa de
lavado, se incubaron 50 \mul/pocillo de sustrato de fosfatasa,
1,5 mg/ml de fosfato de para- nitrofenilo en dietanolamina, 30 min.
Se paró la reacción con 100 \mul/pocillo de NaOH 1 M. Se midió el
desarrollo del color con un lector de microplaca a una longitud de
onda de 405 nm.
Se diagnosticó AMI mediante evaluación clínica y
mediciones de troponina-I y CK-MB.
Se centrifugaron las muestras a 1500 g durante 15 min, y se
almacenaron a -20ºC. Se determinaron las concentraciones de
troponina-I y CK-MB en suero usando
un inmunoensayo enzimático por micropartículas fluorescentes (MEIA:
microparticle enzyme immunoassay) con un sistema AxSYM^{TM}
analizador químico automatizado (Abbott Laboratories, Abbott Park,
IL, EE.UU.). La velocidad de formación de productos fluorescentes
era directamente proporcional a la cantidad de
troponina-I en la muestra. El límite de detección
para la troponina-I fue de 0,3 \mug/l. La medición
de CK-MB es proporcional a la cantidad de sondas
fluorescentes y el límite de detección fue de 0,7 \mug/l.
Las concentraciones de H-FABP se
expresaron en valores de densitometría óptica (DO) o bien como
media \pm DE o bien como mediana e intervalo intercuartílico. Las
concentraciones de troponina-I y
CK-MB se expresaron en unidades de concentración
(ng/ml). Se usó la prueba U de Mann-Whitney no
paramétrica para comparar las concentraciones de
CK-MB, troponina-I y
H-FABP en plasma entre los grupos. Se usó el
software PRISM^{TM} para elaborar diagramas de cajas/bigotes
(box/whisker) y de dispersión. Los intervalos de confianza (IC) al
95% y las curvas característica operativas del receptor (ROC),
definidas mediante el software Analyse-it^{TM}
para Microsoft EXCEL^{TM}, se usaron para evaluar el punto
temporal discriminatorio de los indicadores. Véase J. M. Murphy
et al., "Performance of screening and diagnostic
tests", Arch. Gen. Psychiatry 1987;
44:550-555.
Se usó una prueba Z de variable única para
comparar las áreas bajo las curvas ROC de la
H-FABP. Se evaluaron las diferencias en
sensibilidad, especificidad y valor positivo predictivo de
concentraciones de H-FABP en cada punto de tiempo.
P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
A los pacientes del grupo Accidente
cerebrovascular se les dio una evaluación clínica completa. Se
diagnosticaron la isquemia y la hemorragia con la ayuda de una
tomografía axial computerizada (TAC) y respuesta de RMN cerebral
así como su ubicación (datos no mostrados). Se confirmó el
diagnóstico de accidente cerebrovascular para cada paciente del
grupo Accidente cerebrovascular. El tipo de lesión y la ubicación
no se correlacionaron con la concentración de H-FABP
(datos no mostrados).
Los pacientes del grupo Control ingresaron en el
hospital y se excluyó accidente cerebrovascular y AMI mediante
evaluación clínica.
Los pacientes del grupo AMI ingresaron en el
hospital con AMI confirmado con niveles de
troponina-I elevados (> 2 ng/ml).
Los resultados del ensayo se muestran en la
tabla 1 a continuación.
Las concentraciones en plasma de
H-FABP (medición de DO) en el grupo AMI eran
significativamente superiores a las del grupo Control (tabla 1). El
grupo AMI tenía una concentración media de H-FABP
(intervalo 25-75%) de 2,65
(2,27-2,86) mientras el grupo Control tenía una
concentración de 0,19 (0,14-0,35). La concentración
de H-FABP disminuye con el tiempo después de que el
acontecimiento agudo cerebral aumentase. La concentración media de
H-FABP (intervalo 25-75%) en el
grupo Accidente cerebrovascular era de 0,64 para to
(0,28-1,01), 0,46 para t_{1}
(0,25-0,98), 0,37 para t_{3}
(0,20-0,76) y 0,33 para t_{7}
(0,18-0,73). Existe algún solapamiento entre el
intervalo intercuartílico de los grupos Accidente cerebrovascular y
Control debido a la presencia de falsos negativos. La distribución
de la concentración de H-FABP se visualizó mediante
el diagrama de dispersión del dibujo. Los diagramas de las curvas
operativas del receptor se realizaron con la sensibilidad frente a
la especificidad a tiempos diferentes, concretamente en el ingreso
del paciente y a 1, 3 y 7 días tras el ingreso. Las curvas ROC se
usaron para optimizar la sensibilidad y especificidad y para
maximizar la suma de sensibilidad y especificidad escogiendo un
valor límite adecuado en unidades de densidad óptica, representando
la concentración de H-FABP. Los diagramas mostraban
que la mejor sensibilidad y especificidad para este grupo de
pacientes se obtuvo en el ingreso del paciente, con un valor límite
en la DO de 0,53. En estas condiciones, la sensibilidad,
especificidad y valor positivo predictivo de las concentraciones de
H-FABP eran del 59,1%, 90,9% y 86,7%,
respectivamente. La comparación entre las curvas ROC en el ingreso
con las realizadas en los tiempos posteriores no mostró ninguna
mejora de los valores de sensibilidad y especificidad más allá de
los obtenidos en el ingreso.
Para confirmar las diferencias en las
concentraciones de H-FABP entre los grupos AMI y
Control, se sometieron a ensayo la CK-MB y la
troponina-I. Además, con el fin de distinguir entre
AMI y Accidente cerebrovascular, también se sometieron a ensayo en
muestras de accidente cerebrovascular. Las concentraciones de
troponina-I y CK-MB se midieron en
cada grupo. Las concentraciones de troponina-I y
CK-MB en el grupo AMI eran significativamente (P
> 0,01) superiores a en el grupo Control. No se encontraron
diferencias significativas de concentración de estos indicadores
entre el grupo Control y Accidente cerebrovascular. ABBOTT
Laboratories demostró que los valores esperados usando el ensayo
AxSYM^{TM} de troponina-I y el ensayo
AxSYM^{TM} de CK-MB para diagnóstico de AMI se
determinan en el límite de 2 ng/ml y 9,3 ng/ml, respectivamente. El
valor de CK-MB esperado para el grupo Control es de
hasta 3,8 ng/ml. A la concentración de troponina-I
> 2 ng/ml, la sensibilidad y especificidad del ensayo MEIA de
troponina-I eran del 93,3% y el 94,4%,
respectivamente, a t_{1}. Se calcularon las concentraciones
medias de troponina-I y CK-MB
(25-75%) en el plasma y se muestran en la tabla
1.
La tabla 2 resume la evaluación del ensayo.
En el grupo Control se detectaron dos falsos
positivos. La H-FABP se aumentó a t_{0} (tabla
2). Uno de éstos tenía concentraciones de
troponina-I y CK-MB en el límite
entre sano y dolor miocárdico (3,8 ng/ml), indicando que esta
persona debería padecer AMI carente de músculo miocárdico. En
efecto, uno de éstos tenía epilepsia y ambos tenían varias
fracturas. En el grupo Accidente cerebrovascular se detectaron 13
verdaderos positivos (10 tenían isquemia y 3 tenían hemorragia). Se
midieron elevadas concentraciones de H-FABP y se
confirmó el diagnóstico de accidente cerebrovascular. Se midieron
las concentraciones de troponina-I y
CK-MB en pacientes sanos y se permitió la exclusión
de un diagnóstico de AMI, excepto para un paciente. Para esta
excepción, la evaluación clínica no detectó padecimiento miocárdico
y no lo correlacionó con la concentración de
troponina-I para AMI. La H-FABP
medida no permitió la distinción entre dolor miocárdico o cerebral.
En el grupo Accidente cerebrovascular se detectaron 9 falsos
negativos con bajos niveles de H-FABP (6 tenían
isquemia y 3 hemorragia). No se encontró explicación para estos
casos. No se encontró correlación entre la baja concentración de
H-FABP y la evaluación clínica.
Los resultados anteriores indican que la
H-FABP es un marcador potencial para el diagnóstico
de accidente cerebrovascular. Debido a que la
H-FABP se presentó como un marcador de infarto de
miocardio agudo hace unos años, el accidente cerebrovascular y el
AMI tenían que distinguirse mediante otro marcador bioquímico tal
como troponina-I o CK-MB. Tras la
distinción de AMI para pacientes con accidente cerebrovascular, la
concentración de H-FABP en el suero podría usarse
como un marcador específico del accidente cerebrovascular.
En el ingreso, el ensayo de
H-FABP permitió determinar una sensibilidad, una
especificidad y un valor positivo predictivo (respuesta de DO >
0,531) del 59,1%, 90,9% y 86,7%, respectivamente. Estos valores
eran significativamente superiores a los de la proteína S100B para
la detección del accidente cerebrovascular. La sensibilidad y la
especificidad del ensayo con S100B para el accidente
cerebrovascular eran del 44% y 67%, respectivamente. La ventaja del
análisis con S100B era el desarrollo de un inmunoensayo rápido de
menos de 3 h. Sin embargo, la especificidad de S100B no estaba
limitada al accidente cerebrovascular sino también a metástasis de
melanoma, complicaciones cerebrales de lesión cerebral y cirugía
cardiaca. La cinética de la H-FABP en el torrente
sanguíneo se estudiaron midiendo la H-FABP en cuatro
puntos de tiempo tras el ingreso en la clínica de investigación
(t_{0} (0 h), t_{1} (1 día), t_{3} (3 días) y t_{7} (7
días)) para cada paciente con accidente cerebrovascular confirmado.
Las concentraciones máximas de H-FABP se observaron
en su mayoría a t_{0}. El tiempo de variación entre el comienzo
cerebral y el ingreso no interfirió con el resultado porque la
concentración de H-FABP permanecía elevada a
t_{1}. El área de la curva ROC confirmó las concentraciones de
H-FABP más elevadas a t_{0} y t_{1} comparadas
con t_{3} y t_{7}. Las mejores características del ensayo
(sensibilidad, especificidad) se obtuvieron a t_{0}.
El infarto de miocardio agudo se diagnostica con
la ayuda de un ensayo por marcador bioquímico tal como un ensayo
de troponina-I, creatina cinasa MB, mioglobina y,
recientemente, H-FABP, cardiacas. Debido a que las
concentraciones de H-FABP podrían indicar AMI, se
realizó la distinción entre AMI y accidente cerebrovascular con el
uso de otro marcador de AMI.
La troponina-I es un marcador
temprano de AMI o de lesión por isquemia, con la ventaja de
permanecer elevada durante varios días tras el AMI. Debido a que la
concentración de troponina-I liberada alcanza un
máximo 12-24 h tras el ingreso, se analizó el grupo
Accidente cerebrovascular a t_{0} y t_{1}. La concentración de
troponina-I en el grupo AMI era significativamente
superior a la del valor límite de 2 ng/ml. Las mayoría de los
pacientes del grupo Accidente cerebrovascular mostraron una
concentración de troponina-I normal por debajo del
valor límite, lo que excluía a los pacientes con AMI del estudio,
excepto un paciente. Su evaluación clínica no diagnosticó ningún
padecimiento miocárdico y esto no se correlacionó con su
concentración de troponina-I. En este único caso,
la medición de H-FABP no permitió distinción entre
dolor miocárdico o cerebral.
Paralelamente, se midió la concentración de
creatina cinasa MB en plasma para cada paciente. Este marcador es
menos específico que la troponina-I porque detecta
cualquier tipo de padecimiento muscular. Empezando entre 2 y 6
horas tras el comienzo de los síntomas, se libera
CK-MB al torrente circulatorio y su concentración
en el mismo aumenta hasta 18 horas tras el comienzo de los
síntomas. Permanece a concentración elevada hasta aproximadamente 2
días tras el comienzo de los síntomas, tras lo cual disminuye hasta
el nivel normal.
En el grupo Control se detectaron dos falsos
positivos. Uno de éstos tenía epilepsia que interfería con el
accidente cerebrovascular. Ambos se cayeron al suelo y se rompieron
el fémur y el pie. El aumento de CK-MB se
correlacionó bien con el aumento de H-FABP. La
epilepsia podría explicar el nivel de H-FABP
aumentado. La H-FABP permitió una correlación del
98,6% con el ensayo por CK-MB. Debido a que la
troponina-I no permitió la detección de estos
falsos positivos, la medición de H-FABP y
troponina-I dieron una correlación del 95,3%.
Claims (8)
1. Método de ensayo de diagnóstico para
accidente cerebrovascular o la posibilidad del mismo en una muestra
de fluido corporal tomada de un paciente que se sospecha que
padece un accidente cerebrovascular, que comprende determinar la
concentración de proteína de unión a ácidos grasos de corazón o
cerebro (H-FABP o B-FABP) en la
muestra.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
la concentración de H-FABP se determina en un
primer ensayo, mediante el que un resultado positivo indica o bien
un accidente cerebrovascular o un infarto de miocardio agudo, y
que comprende adicionalmente llevar a cabo un segundo ensayo de
diagnóstico, para infarto de miocardio agudo (AMI) solamente,
mediante el que un resultado positivo en el ensayo de
H-FABP y un resultado negativo en ensayo para AMI
indica que el paciente puede estar padeciendo un accidente
cerebrovascular.
3. Método según la reivindicación 2, en el que
el ensayo para AMI comprende determinar la concentración de
troponina-1 o creatina cinasa MB en plasma, sangre o
suero.
4. Método según la reivindicación 1, 2 ó 3, en
el que se usa un anticuerpo frente a H-FABP en el
ensayo para H-FABP.
5. Método según la reivindicación 4, en el que
se usa un anticuerpo policlonal
anti-H-FABP humana.
6. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 4 ó 5, en el que el ensayo para
H-FABP comprende un ELISA de intercalación.
7. Método según la reivindicación 1, en el que
se usa la B-FABP o un anticuerpo frente a la misma
sin ningún ensayo para AMI en combinación con el mismo.
8. Método según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el ensayo de
H-FABP o B-FABP se lleva a cabo en
una muestra de sangre, suero o plasma.
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