WO2004077059A1

WO2004077059A1 - 酒石酸抵抗性酸性ホスファタ－ゼ５ｂの免疫測定法およびそれに用いるキット

Info

Publication number: WO2004077059A1
Application number: PCT/JP2004/001957
Authority: WO
Inventors: Toshihide Miura; Tatsuya Ohashi; Kumiko Sasagawa; Katsuhiro Katayama
Original assignee: Nitto Boseki Co., Ltd.
Priority date: 2003-02-25
Filing date: 2004-02-20
Publication date: 2004-09-10
Also published as: DE602004007112D1; EP1598670B1; ATE365323T1; US7465556B2; US20060154317A1; DK1598670T3; JP4483780B2; JPWO2004077059A1; DE602004007112T2; EP1598670A4; EP1598670A1

Abstract

　検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5b（TRACP 5b）を抗体に結合させ、次いで、抗体に結合した TRACP 5b を、TRACP 5b の基質である２−ハロ−４−ニトロフェニルリン酸またはその塩と酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより、検体中の TRACP 5b を特異的に正確に免疫測定することができる。

Description

明細書酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5b の免疫測定法およぴそれに用いるキット技術分野

本努明は、骨吸収マーカーとしての破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の免疫測定方法およびそれに用いるキットに関する。本発明によれば、特異的な破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性の測定が可能であり、骨吸収のマーカーとして骨疾患の医学的治療や臨床検査の分野において極めて有効である。背景技術

血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRACP： Tartrate Resistant acid Phosphatase) はその大部分が破骨細胞由来の酸性ホスファターゼとされ、その測定は、破骨細胞の機能を評価する指標として有用とされており、骨吸収マーカ一として興味が持たれている（骨代謝マーカー，福永仁夫，中村利孝，松本俊夫編，メディカルレビュー社， 1995) 。一方、血清中の酸性ホスファターゼは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、原点より 0〜5 の 6 つのバンドに分けられ、その中で 5番目が酒石酸抵抗性であり、 Band 5酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ (TRACP 5 : Tartrate Resistant Acid Phosphatase 5) と呼ばれてレヽる。これはさらに電気泳動により糖鎖へのシアル酸結合の多い 5a と、ほとんどシアル酸結合のない 5b に分けられる。そして、 5a は破骨細胞以外からの酵素であって血中値が変動しないのに対して、 5b のみが骨吸収に伴い変動するため、 5b が破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの本体であると考えられている。また Clinical Chemistry 誌（Clin. Chem. 47 : 1497. 2001) でも TRACP 5b を破骨細胞由来の ACP とし、 TRACP 5b と略記することを勧めている。よって本発明においても破骨細胞由来で骨吸収の指標となる ACP を意味するものは TRACP 5b として、本明細書においては以降破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと酒石酸抵抗' [·生酸性ホスファターゼ 5b は同義としてすベて TRACP 5b と表記する。

破骨細胞の活性を表す酸性ホスファターゼの指標として TRACP活性を求める従来の活性測定法は、特異性、感度、測定の煩雑さ及び測定時間の点で問題を有している。

一般的に活性測定法による TRACP 5b の測定は、酒石酸の存在下で合成基質としてリン酸エステルを用いて酵素反応により生ずる反応生成物（アルコールゃフェノール類）を比色定量することにより酵素活性を求めている。その際、酒石酸が前立腺由来酸性ホスファターゼを阻害し、残存した酸性ホスファターゼ活性を基質で測定することにより、 TRACP活¾^を TRACP 5b活性とみなして求めている。し力しながら、検体中に存在する破骨細胞由来以外の赤血球由来や血小板由来の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼも測定してしまうため、特異性の点で問題を有する。

このような方法の改善法としては、血清を 5倍に希釈した液を 37°Cで 1 時間インキュベートする前処理をした後、残りの TRACP活性を、酒石酸存在下、基質として p—二トロフエニルリン酸を用いて測定する方法が知られている（日大医誌. 49 : 904-911. 1990；および Clin. Chem. 33 : 458 - 462. 1987) 。この方法は赤血球由来酸性ホスファターゼの影響は回避できる力血小板由来酸性ホスファタ一ゼの影響は除くことは出来な！/ヽ。さらにより特異的な活性測定法として、本発明者らは、 TRACP 5b と赤血球や血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性がフッ素に対する感受性に差のあることを利用した TRACP 5b測定法を報告した (特開平 10— 37198号公報）。し;^しながら、赤血球及び血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの影響はないものの、 TRACP 5a の影響を除くことができず、また TRACP 5b活性を総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性からフッ素存在下で阻害されなかった活性を差し引きすることにより求めており、精度の点で問題がある。さらに上記フッ素を利用した方法に TRACP 5a の阻害物質を組み合わせて用いることにより、より TRACP 5b活性を測定する方法が報告されている (特開 2001— 231595号公報）。し力しながら、フッ素のみを用いる方法はより特異的ではあるものの、やはり差し引きで破骨細胞由来 TRACP 5b活性を求めているため同様に、精度の点で問題を残している。一方、免疫測定法による TRACP 5b の測定方法として、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いた免疫測定法も知られている（J Clin Endocrinol Metab. 71 :442-451. 1990 ； J Bone Miner Res. 13 :683- 687. 1998 ； Immunol Lett. 70 : 143-149. 1999 ； J Bone Miner Res. 14 :464 - 469. 1999 ； Clin Chem. 45:2150-2157. 1999；および Clin Chem. 46: 1751-1754. 2000) 。これらの方法は、 Band 5全体を測定してしまうため、 TRACP 5aの影響を無視できない。さらに、 TRACP 5b をより特異的に測定する免疫測定法（特表 2002 - 510050号公報）が報告されている。この方法では、 5a と 5b の至適 pH の差を利用して活十生測定で測定値を算出しているため、より TRACP 5b活性に特異的な測定法であるとしている。し力し、用いる抗体は、 5b に特異性があるものではないため、 5bへの特異性が必らずしも十分とはいえず、骨吸収マーカーとして使用するには、さらなる改良が求められている。発明の開示

本発明は、カかる問題に鑑み、骨吸収マーカーとしての TRACP 5b を感度よく特異的に測定する方法及ぴそれに使用するキットを提供することを目的とする。本発明は、検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5b (TRACP 5b) を免疫測定する方法であって、

検体中の TRACP 5b を抗体に結合させ、次いで、抗体に結合した TRACP 5b を、 TRACP 5b の基質である一般式（1 )

(ただし、式中、 Xは、 C l、 F、 B rまたは Iを示す）

で表される 2—ハロー 4—ニトロフエ二ルリン酸またはその塩と酵素反応させてその酵素活性を測定することにより、検体中の TRACP 5b を免疫測定する方法である。

また、本発明は、 TRACP 5b を免疫測定するためのキットであって、

i ) 固相支持体、

ii) TRACP 5b に対する抗体、および

iii) 一般式 ( 1 )

(ただし、式中、 Xは、 C 1、 F、 B rまたは Iを示す)

で表される 2—ハロー 4一二トロフエニルリン酸またはその塩である TRACP 5b の基質

を含むキットである。図面の簡単な説明

図 1は、酵素基質として 2—クロ口一 4—ニトロフエニルリン酸（CNPP) を用いて TRACP 5bおよび TMCP 5aの酵素活性を測定した時の至適 pH を示すグラフである。

図 2は、 TRACP 5b に対する抗体を固定化したプレートに検体（標準液又は血清）作用させ、その後、酵素基質として 2—クロ口 _ 4一二トロフエニルリン酸を用いてレート法により酵素活性を測定したグラフである。発明の実施するための形態

本発明で対象となる検体は、ヒトの血液、血清、血漿などが挙げられるが、 TRACP 5b を含む可能性のある検体であれば、特に限定しない。

本発明においては、抗体は、固相支持体に結合していることが好ましい。また、抗体は、 TRACP 5b に対する抗体であればモノクローナル抗体、ポリクローナノレ抗体のいずれもが使用可能であるが、特異性の面からモノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体としては、従来既知の TRACP 5b に対するモノクロ一ナル抗体が使用可能である。

本発明に使用する抗体として、ヒト破骨細胞から精製された TRACP 5b を免疫原として TRACP 5b のモノクローナル抗体を製造することができる。モノクロ一ナル抗体は、例えば精製ヒト TRACP 5b を免疫原として動物を免疫し、その動物が産生する抗ヒト TRACP 5b抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。

上記ハイプリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち、ヒト TRACP 5b を、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムァジュバント、百日咳アジュバント等の既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に 1〜3週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は 1 / g〜100rag の間とされているが、一般的には 50 μ ₅程度が好ましい。免疫回数は 2〜7 回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と、骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラシトなどの脾臓等より得ることができる。

融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法 (Nature. 256, 495. 1975) によってポリエチレングリコール (PEG) を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。

融合した細胞からヒト TRACP 5b を認識する抗体を産生するハイプリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、融合した細胞から限界希釈法によって HAT培地および HT培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。 96 穴ゥエルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒト TRACP 5b に対する抗体が含まれている場合には、ヒト TRACP 5b をプレート上に固定ィヒしたアツセィプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスィムノグロブリン -HRP標識抗体等の 2 次標識抗体を反応させる ELISA法により、ヒト TRACP 5b に対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質には HRP の他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。コントロールとしてブロッキング剤である BSA のみを結合したアツセィプレートによる ELISA を同時に行うことでヒト TRACP 5b 特異的抗体のスクリーユングができる。つまりヒト TRACP 5b プレートで陽性であり、 BSA による ELISA で陰性のクローンを選択できる。

このようにして選択された TRACP 5b に対するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマとしては、ハイプリドーマ TrK27、 TrK49 および TrK62 を例示することができる。ハイプリドーマ TrK27、 TrK49 および TrK62 は、〒305 - 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (IP0D) に、それぞれ、平成 14年 2 月 14 日に受託番号 IPOD FERMBP-7889 として、平成 14年 11 月 27 日に受託番号 IPOD FERM BP - 8249 として、平成 14 年 2 月 14 日に受託番号 IP0D FERMBP-7890 として寄託されている。

ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えば α - MEM、 RPMI1640、 ASF、 S- clone などで培養し、その培養上清よりモノクローナル *t体を回収することができる。またハイプリドーマが由来する動物、例えばマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物にハイプリドーマを腹腔内注射することによつて腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。例えば硫酸アンモニゥム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法ゃクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテイン A、プロティン G などによるァフィ二ティクロマトグラフィーなどが挙げられる。

本発明に用いるモノクローナル抗体は、 TRACP 5b ばかりでなく TRACP 5a とも反応するモノクローナル抗体でも構わない。また、本発明では、ポリクローナル抗体であつてもよく、ポリクローナル抗体は、例えば、ヒト破骨細胞から精製された TRACP 5b を免疫原として、ラット、マウスなどの動物に免疫し、その動物から抗血清を調製することよって得られる。本発明においては、検体中の TRACP 5b を上記した抗体に結合させ、結合した TRACP 5b に対して、酵素基質として一般式（1 ) で表される 2—ハロー 4一二トロフエニルリン酸またはその塩を酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより検体中の TRACP 5b を免疫測定する。

本発明に用いる 2—ハロー 4—ニトロフエニルリン酸としては、 2—クロ口一 4—ニトロフエ二ノレリン酸、 2—フツイ匕一 4一二トロフエ二ノレリン酸、 2—プロモー 4一二トロフエニノレリン酸を例示できる。 2—ハロー 4一二トロフエニノレリン酸の塩としては、アンモニゥム塩、イミダゾリウム塩、シクロへキシルアンモニゥム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、トリスヒドロキシアンモニゥム塩が例示できる。

本発明に用いる上記基質は、その Km 力 p—ニトロフヱニルリン酸 (PNPP) に比べ、 TRACP 5b では小さく、 TRACP 5a では大きいため、 TRACP5b を測定する際に用いると、感度、特異性の面から極めて有利である。

本発明で、検体中の TRACP 5b とその基質である 2—ハロー 4—二トロフエ二ルリン酸またはその塩とを酵素反応させるとき、反応時の pH は、 6. 3 より大きく 6. 8 以下が好ましく、 6. 35〜6. 75 がさらに好ましく、 6. 38〜6. 70 が特に好ましい。 pH が小さすぎると TRACP 5a の酵素反応がしゃすくなるため、（TRACP 5b反応性) / (TRACP 5a反応性) が小さくなり、 TRACP 5b 特異性に問題が起こりやすくなる。また、 pH が大きすぎると TRACP 5b 自体の酵素反応がおきにくく測定感度が低下しゃす!/、。

本発明では、具体的には、例えばエンドポイント法を用いて、 TRACP 5b を、以下のようにして測定できる。まず、固相支持体に吸着している抗体に測定すベき検体を加え、検体中の TRACP 5b と抗体とを抗原抗体反応させて TRACP 5b を抗体に結合させる。次いで、その固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、反応系に酵素基質として 2—ハロー 4一ニトロフエニルリン酸またはその塩を加え、抗体に結合している TRACP 5b と基質とを、好ましくは pH 力 S 6. 3 より大きく 6. 8 以下で反応させる。反応停止液で酵素反応を停止した後、反応により生成した 2—ハロー 4一二トロフエノールを、通常 390nm〜450nm、好ましくは 400〜430nm の波長で吸光度を測定する。その吸光度の大きさは、 TRACP 5b酵素活性を反映するので、その値から、検体中の TRACP 5b を測定できる。

本発明にお！/ヽては、酵素活性を測定する際、従来の P—二トロフエニルリン酸を用いる方法と異なり、 2—ハロー 4一二トロフヱノールは反応時の pHで発色するので、レートアツセィすることもできる。レートアツセィするときは、

TRACP 5b と基質との反応性を、一定時間、通常、 1 分間あたりの平均吸光度変化量として求めることにより、検体中の TRACP 5b を測定ることができる。その結果、測定時間が短くなりより好ましい。

本発明では、上記した測定法から明らかな通り、抗体は固相支持体に結合させて用いるのが好ましく、固相支持体としては、通常、 ELISA法等の固相免疫測定法に用いる固相支持体が用いられるが、特に限定されない。例えば、固相支持体の材料として、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ナイロン、メタアタリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、ビーズ等が挙げられる。

固相支持体に吸着している抗体を調製するには、直接または間接的に物理結合や化学結合、ァフィ二ティーを利用して固相支持体に TRACP 5b に対する抗体を結合させる。感作抗体量は、 lng〜100mg/ml の範囲であることが多い。

本発明を実施するときは、 TRACP 5b を免疫測定するためのキットであって、 i ) 固相支持体、 ii) TRACP 5b に対する抗体、および iii) 一般式 ( 1 ) で表される 2 —ハロー 4一二トロフエ二ルリン酸またはその塩である基質を含むキットを用いて行える。

このキットにおいては、 i ) 固相支持体、 ii) TRACP 5b に対する抗体に関しては、固相支持体と抗体溶液とを別々に作製しておき、 TRACP 5b を測定する際、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、あらかじめ、抗体を固相支持体に吸着させた状態で提供してもよい。このキットにおいては、検体中の TRACP 5b を抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。

ェンドボイント法でこのキットを使用するときは、酵素反応停止液を含むことが好ましい。酵素反応停止液としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリゥム溶液等のアル力リ水溶液を使用できる。

さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、 EDTA ' 2Na等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。

以下、本発明を参考例および実施例を挙げて更に詳細に説明するが、本発明はこれら参考例および実施例に何ら限定されるものではない。

参考例 1

TRACP 5bに対するモノクローナル抗体の製造

( 1 ) 破骨細胞由来酸性ホスファターゼ TRACP 5b の精製

インフォームド · コンセントを行った後、外科的手術により摘出されることになったヒト大腿骨骨頭部 130g を液体窒素中で凍結させ、ハンマーで粉砕後、プ口テアーゼインヒビターを含む緩衝液 (50ιτιΜ Tris-HCl, 0. 3M KCI, ImM PMSF, IraM EDTA - 2Na, 0. 1 % Triton X - 100， 0. 02% NaN₃, 1 unit/ml ァプロチニン _PH7. 5) 200mL 中に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにてホモジナイズした。 4°C ー晚攪拌後、 10, 000rpm， 20 分遠心分離し、その上清を 10mM トリス緩衝液 pH8. 2に透析後 CM— S印 haroseカラム（φ 40腿 X 40cm) [シグマ社]にアプライし、吸着したタンパク質を NaCl を含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配（0—0. 5M NaCl) で溶出した。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性は、基質 2 , 6—ジクロ口 _4ーァセチルフエ二ルリン酸 [日東紡社製]を用い測定し、活性の高い部分をプールした。それを濃縮後、 0. 7M NaCl を含む 20mM トリス緩衝液 pH7. 2 に透

プライし、同様に溶出したフラクションの酒石酸耐性酸性ホスファターゼ活性を測定し、活性部分をプールした。それを 20mM トリス緩衝液 pH7. 2 で 2倍に希釈し、 HiTrap Heparin HPカラム（5mL) [アマシャムフアルマシア社]にアプライし、吸着したタンパク質を NaCl を含む上記 20mM トリス緩衝液 pH7. 4 の直線塩濃度勾配（0. 35M- 1 M NaCl) をかけ溶出した。酒石酸耐性酸性ホスフ了ターゼ髙活性フラクションをプールし、濃縮することにより、精製破骨細胞由来酸性ホスファターゼを 0- 4mg得た。なお、タンパク量は A280 により確認し、純度は SDS- PAGE [TIFC0社]を行い銀染色の結果、分子量 35， 000 付近でシングルバンドであることにより確認した。単一バンドになった酵素は精製 TRACP 5b として免疫抗原とした。

( 2 ) 免疫

精製ヒト破骨細胞由来酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（TRACP 5b) を 250 μ g/ml となるように 50raM クェン酸緩衝液 (pH5. 5) で希釈し、 (100 μ 1) をとつてフロインド完全ァジュバンド口光純薬工業社] 100 μ ΐ と乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液を Balbん 6 週齡雌マウス [日本クレア一社]にジェチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。 2 週間後には同量の TRACP 5b (25 μ g/ml) をフロインド不完全ァジュパンド [和光純薬工業社]と混和してフロィンド完全アジュパンドの時と全く同様の操作により化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降 2 週間後に同様の操作を行い、 4 回目には最終免疫として TRACP 5b は 25 /i g/ral をそれぞれ 50mM クェン酸緩衝液 (pH5. 5) で調製しマウス尾静脈注射により投与した。

( 3 ) ハイプリドーマの確立

最終免疫より 3 日後に TRACP 5b により感作済みのマウスよりジェチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法 (Nature. 256， 495. 1975) に従って行われ、ポリエチレングリコール（PEG4000) [メルク社]を用レ、て脾細胞と骨髄腫細胞 P3- X63- Ag8- Ul (P3U1) を融合した。その融合比率は脾臓細胞数 8 X 10⁷個に対して骨髄腫細胞 P3- X63- Ag8-Ul (P3U1 ) 2 X 10⁷個で、 4 : 1 であった。融合細胞は 10%FCS [INVITROGEN社] a - MEM [IRVINE社] HAT [コスモバイオ社]培地に分散し 96 穴マイクロタイターカルチャープレート [住友べ一クライトネ土]に分注して 37 °C、 5%C0₂ 条件にて培養した。

( 4 ) スクリーニング

約 2 週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。スクリ一二ングの実施法を以下に述べる。スクリーニング用プレートを作製するために上記（1 ) にて精製した TRACP 5b を 50mM クェン酸緩衝液中に溶解し、 0. 5 g/100 μ 1/well となるように 96 穴ゥエル [Nunc社]に分注した。プレートを 4°C で 2晚静置した後に 0. 05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3回洗浄し、非特異的反応を抑えるために 1. 5%BSA溶液を 200 μ ΐ 分注して、更に 4°Cで 1 晚静置した。完成したプレートを 0. 05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄した後に培養上清 100 /z l を反応させ、更に洗浄を行った後に 2 次抗体である HRP標識抗マウスィムノグロプリン抗体 [Zymed社]を加えて反応させた。洗浄後に HRPの発色基質である 3mg/ml 0-フエ二レンジァミン（0PD) [ナカライテスタ社]クェン酸発色溶液を ΙΟΟ μ Ι加えて一定時間の発色後、 1N硫酸を停止液として更に 100 1 添加し、測定波長 492nm にて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローユングされ上清を再度チェックした。

( 5 ) 抗体の確認

ELISA によって精製 TRACP 5b との反応を確認し、 TRACP 5b と反応する抗体を産生するクローンとして TrK27 を選抜した。このハイプリドーマ TrK27 は、 T 305-8566 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（IP0D) に、平成 14年 2 月 14 日に受託番号 IP0D FERMBP-7889 として寄託されている。

このハイブリドーマが産生する抗体をモノクローナル抗体タイピングキット [アマシャムフアルマシア社]にて検定した結果、クラスは IgGl、軽鎖は κであつた。この抗体の特異性を以下の通り検討した。検体として TRACP 5b及びヒト血清より HiTrap Heparin HP カラムにて溶出した TRACP 5a及ぴ前立腺由来 ACP、血小板由来 ACP (血小板抽出液）、赤血球由来 ACP (赤血球抽出液）を用いて ELISA を行った。その結果、この抗体は TRACP 5b及ぴ 5a とは反応した、その他のァイソフォームとは反応しなかった。

( 6 ) モノクローナル抗体の作製おょぴ精製

得られたハイブリドーマ TrK27 I X 10⁷細胞個をプリスタン [アルドリツチ社] 0. 5ml 投与後 2週間の Balbんマウス [日本クレア一社]、 10週齢、雌性に腹腔内投与し、約 2週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジェチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。スクリーニングで行った ELISA法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安 40% で処理し、 PBS に透析した後、プロテイン G カラム [アマシャムフアルマシア社]により精製して SDS- PAGE により確認した。その結果、非還元では分子量約 150, 000 に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約 50, 000 のバンドと 25, 000 の 2 本のバンドが確認された。精製された抗体はマウス 1匹あたり約 15mg であって工業的利用を行うには十分量であつた。

( 7 ) 抗 TRACP 5b抗体固定ィヒプレートの作製

上記（ 6 ) により得られた抗体を PBS 中に溶解し、 1 μ g/200 μ 1/well となるように 96 穴プレート [Nunc社]に分注した。プレートを 4°Cで 2 晚静置した後に 0. 05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄し、非特異的反応を抑えるために 1. 5%BSA溶液を 200 // 1 分注して、更に 4°C 1 晚静置し、抗 TRACP 5b 抗体固定化プレートを完成させた。

参考例 2

Km の測定等による本発明で用いる基質と他の基質との比較

2 _クロ口一 4—二トロフエ二ノレリン酸 (CNPP) に対する TRACP 5b 及び 5a の反応性の違いをみるため、それぞれの場合の Km を求めた。その結果、 TRACP 5b では 1. 5mM (ρΗ6. 4) 、 5a では 3. 5mM (pH5. 6) であった。 5b に対する Km が 5a の 2 分の 1 以下であり、この基質が TRACP 5a に比べ 5b の測定に適した基質であることを示している。

一方、 Clin. Chem. , 47 (l)， 74〜80 によると、 p —ニトロフエニルリン酸 (PNPP) に対する TRACP 5b、 5a の反応での Km は、それぞれ、 7. 0m (pH5. 8)、 1. 9mM (pH5. 2)である。すなわち、本発明で用いる CNPP 力 S PNPP に比べ、 TRACP 5b を測定するのに、親和性、特異性の面から有利である。

実施例 1

種々の p H での TRACP 5b または 5a の測定

CNPP を含む基質緩衝液の pH を 5. 6 から 6. 8 まで変化させ、この基質における TRACP 5b及ぴ 5a の活性を求めた。基質緩衝液の組成は、 CNPP 5mM, MES 0. 1M, 酒石酸ナトリゥム 40mMで pH を 5. 6 から 6. 8 まで 0. 2刻みに調製した。検体として用いた TMCP 5a、 5b はヒト血清を H印 arin カラムにて分離し、 TRACP 5a、 5b の各ピークを濃縮することにより調製した。なお、 TRACP 5a は pH5. 6 (TRACP 5aの至適）で吸光度 0. 8、 TRACP 5b は pH6. 4 (TRACP 5bの至適）で吸光度 0. 8 になるような濃度の検体を用いた。測定方法は、抗 TRACP 5b抗体 Trk27 プレートを用い、ゥエルに検体 100 /z L を加え、室温で 1時間振とう攪拌した。その後反応液を廃棄し、各ゥエルを 200 しの 0. 05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄した。その後、基質緩衝液を I OO JU L加え、 30秒間振とう後、 37°Cのインキュベーターで 1 時間反応後、 0. 2N NaOH 50 μ ΐ を加え酵素反応を停止させ、その 405nm の吸光度をマイクロプレートリーダーにて測定した。その結果を図 1に示す。この条件下において、 TRACP 5b の至適 pH は約 6. 4であり、 5a は 5. 6 であった。

実施例 2

PNPP (従来の基質）を用いた方法と本発明との比較

CNPP を含む基質緩衝液の pH6. 2、 6. 4、 6. 6及び 6. 8 での 5a, 5b の反応吸光度と、比較例として TRACP 5b の測定に適しているとされる PNPP を基質とした緩衝液 pH6. 1 を用いた結果とを比較した。特表 2002-510050号公報記載の方法に従い、 PNPP基質緩衝液の組成は、 PNPP 8mM, 酢酸ナトリウム 0. 1M, 酒石酸ナトリウム 0mM, pH6. 1 とした。 TRACP 5b の検体は、実施例 1と同様なものを用いた。 TRACP 5a の検体は、特表 2002- 510050号公報記載のデータに従い、比較例 (PNPP を pH6. 1 で使用）のとき、 TRACP 5a での値が、 TRACP 5b での値の 1/10 になるように調製したものを用いた。測定操作は実施例 1と同様にして吸光度を用い酵素活性の指標とした。その結果を表 1に示す。結果から明らかなように CNPP pH6. 4, 6. 6 での 5b/5a比がそれぞれ 17 と 18 であり、本発明の方法が、従来法（比較例）に比べ、 TRACP 5b の測定に適していることを示している。表 1

実施例 3

レート法による TRACP 5b活性測定法

抗 TRACP 5b抗体 TrK27 固定化プレートに検体（標準液又は血清） lOO ^ L を分注し、室温で 1時間振とう攪拌する。その後反応液を廃棄し、各ゥエルを 200 i Lの 0. 05% Tween 20 を含むトリス緩衝液で 3 回洗浄する。その後、基質 (CNPP) 緩衝液を 100 z L加え、 30 秒間振とう後、マイクロプレートリーダーにて、 405讓の吸光度を測定した。その後、 37°Cのインキュベーターで 60 分間加温したが、その間、 10 分毎に 405nm の吸光度を測定した。一方、比較（ェンドポイント法）として、 60 分後に反応停止液として 0. 2N NaOH 50 μ Ι を加えて、同様に 405nmの吸光度を測定した。図 2に 60 分までの反応タイムコースを示した。なお TRACP 5b活性値は下記の式より計算される。 U/L=検体の AOD/minZ標準液の AOD/min X標準液の表示値

△ 0D/minは測定波長 405nmにおける 1分間当りの吸光度変ィ匕レート法として 10分から 20 分の 1 分間当りの吸光度変化を求め、活性を上式より算出した。その結果、血清検体 1， 2 の TRACP 5b 活性は 4. 1U/L と 9. 1U/L であり、この値は、エンドポイント法での 60 分反応させた後、反応停止液を加えて測定した値の 4. 2 U/L と 9. 3 U/L とほとんど変らなかった。したがって、本発明では、停止液を用いず、レート法でしかも約 20 分以内でも TRACP 5b活性が測定可能な事を示している。産業上の利用の可能性以上に詳細に説明したように、本発明の免疫測定法においては、検体中の TRACP 5a の影響をほとんど受けることなく、検体中の TRACP 5b を感度良く特異的に測定することができる。従って、従来より、正確に TRACP 5b を測定することができる。

Claims

請求の範囲

1. 検体中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ 5b (TRACP 5b) を免疫測定する方法であって、

検体中の TRACP 5b を抗体に結合させ、次いで、抗体に結合した TRACP 5b を、 TRACP 5b の基質である一般式 (1)

X

(ただし、式中、 Xは、 C l、 F、 B rまたは Iを示す)

で表される 2—ハロー 4 _ニトロフエ二ルリン酸またはその塩と酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより、検体中の TRACP 5b を免疫測定する方法。

2. 酵素反応の際、 pH 力 6.3 より大きくかつ 6.8 以下である請求項 1の免疫測定方法。

3. 酵素反応の際、 pH が 6.35〜6.75 である請求項 1または 2の免疫測定方法。

4. 酵素活性の測定をレート法により実施する請求項 1から 3のいずれかの免疫測定方法。

5. TRACP 5b を免疫測定するためのキットであって、

i ) 固相支持体、

ii) TRACP 5b に対する抗体、および

iii) —般式 (1)

(ただし、式中、 Xは、 C l、 F、 B r、または Iを示す）で表される 2—ハロー 4 _ニトロフエニルリン酸またはその塩である TRACP 5b の基質

を含むキット。