KR19980702438A - 항인자-xa.조직인자 응고계 저해제-복합체 모노클로날 항체 및 그의 용도 - Google Patents

항인자-xa.조직인자 응고계 저해제-복합체 모노클로날 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

인자-Xa·조직인자 응고계 저해제 복합체 (Xa·TFPI)와 특이적으로 반응하지만, 유리된 인자-X, 유리된 인자-Xa 및 유리된 조직인자-응고계 저해제 복합체(TFPI)와는 반응하지 않는 모노클로날 항체, 이 모노클로날항체를 분비하는 하이브리도마 및 이 모노클노날 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 인자-Xa·조직인자 응고계 저해제 복합체의 면역학적 측정방법.

Description

항인자-Xa·조직인자 응고계 저해제-복합체 모노클로날 항체 및 그의 용도
임상분야에 있어서, 혈중의 프로트롬빈을 트롬빈으로 변환시키는 인자-Xa(이하, Xa라고도 한다.)를 측정하는 것은, 파종성 혈관내 응고증후군(DIC)이나 혈전증 등의 응고항진 상태를 파악하는데 있어서 중요하다. 그러나, 생성된 Xa를 직접 측정하기는 매우 곤란하다. 왜냐하면, Xa는 생성되자마자 저해제인 조직인자 응고계 저해제(Tissue Factor Pathway Inhibitor, 이하, TFPI라고 한다.)와 결합하여, 인자-Xa·조직인자 응고계 저해제-복합체(이하, Xa·TFPI라고 한다.)를 형성하기 때문이다.
그러므로, 혈중에서 생성된 Xa량을 측정하기 위한 가장 간편한 방법은, 생성된 Xa량을 간접적으로 반영하고 있는 Xa·TFPI를 정량하는 것이다. 그 양으로부터 Xa량을 추정하여 응고활성화의 지표로 삼을 수 있다. 종래에는, Xa·TFPI를 측정하는데 인자-X (이하, X라고도 한다.)와 Xa에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체와, TFPI에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 2종류를 한 세트로 한 샌드위치 EIA법이 사용되어 왔다.
그러나, 종래의 측정방법으로는, 검체중에 공존하는 유리된 X 또는 유리된 TFPI의 간섭을 받기 때문에, 정확하게 Xa·TFPI를 측정하는 것은 곤란하였다.
본 발명은 항인자-Xa·조직인자 응고계 저해제-복합체 모노클로날 항체, 상기 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 및 상기 모노클로날 항체를 사용하는, 인자-Xa·조직인자 응고계 저해제-복합체의 면역학적 측정방법에 관한 것이다.
도 1은 항Xa·TFPI 모노클로날 항체 (XT-1)의 Xa, TFPI 및 Xa·TFPI와의 결합력을, 항원을 직접 96 웰 마이크로 플레이트에 코팅하여, 복수(腹水)중의 XT-1과의 반응성에 의해, 효소면역분석법으로 측정한 결과를 표시하는 그래프이다.
도 2는 LPIA-100을 사용하여 측정한 라텍스 응집반응속도와 Xa·TFPI의 농도와의 검량선을 표시한 그래프이다.
도 3은 항 TFPI 모노클로날 항체를 1차 항체로 하고, 항 Xa·TFPI 모노클로날 항체(XT-1)를 효소 표지 2차 항체로 하여 실시한, Xa·TFPI 등의 샌드위치 효소면역분석의 결과를 표시한 그래프이다.
바람직한 실시의 형태
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
항Xa·TFPI 모노클로날 항체는 신규 마우스·하이브리도마를, 각각 배지 또는 마우스의 복강내에서 배양함으로써 제조할 수 있다.
이 때 사용하는 마우스·하이브리도마는 일반적으로 Xa·TFPI로 면역한 마우스의 비장 세포와 마우스의 골수종 세포를, Kohler 및 Milistein의 세포융합의 기본방법 [Nature 제256권 495면 (1975년) 참조]에 의해 세포융합하여 제조할 수 있다. 상세하게는, 아래의 실시예에서 설명하는 것과 같다.
상기의 하이브리도마를 배양하는 배지로는, 하이브리도마의 배양에 적합한 배지이면 되고, 가장 적절한 것은 둘베코씨 변형 이글씨 최소필수배치(Dulbecco's modified Eeagle's minimum essential medium 이하, DME라고 표기한다.)에 소의 태아 혈청, L-글루타민, L-피루빈산 및 항생물질 (페니실린 G와 스트렙토마이신)을 포함하는 배지가 사용된다.
이와 같은 방법으로 제조된 배양액 또는 마우스의 복수에서, 단백질의 단리, 정제에 일반적으로 사용되는 방법에 의하여 전술한 항Xa·TFPI 모노클로날 항체를 분리 정제할 수 있다.
그와 같은 방법으로서는, 황산암모늄 염석법, 이온교환 셀룰로스를 사용하는 이온 교환 컬럼 크로마토그래피, 분자절 겔을 사용하는 분자절 컬럼 크로마토그래피, 단백질 A 결합다당류를 사용하는 친화성 컬럼 크로마토그래피, 투석, 동결건조 등이 있다.
이렇게해서 얻어진 항Xa·TFPI 모노클로날 항체는, 유리된 X, Xa 및 TFPI와는 결합하지 않고, Xa·TFPI하고만 결합하는 능력을 가지므로 Xa·TFPI의 면역정량용 시약으로서 유용하다. 본 발명의 항Xa·TFPI 모노클로날 항체(예를 들면 후술한 실시예에서 얻은 XT-1)는, 효소면역정량법(EIA), 형광면역정량법(FIA), 발광면역정량법(LIA) 또는 방사능면역정량법(RIA) 등에 시약으로 사용할 수 있다. 효소면역정량법으로는, 마이크로 플레이트 또는 플라스틱 튜브를 사용한 원·스텝·샌드위치 효소면역정량법을 예로 들 수 있다.
이 효소면역정량법의 구체적인 예로는, 하기 실시예 7에 표시한 대로이나, 일반적으로는, 항Xa·TFPI 모노클로날 항체를 사용하여 실시한다. 먼저 마이크로 플레이트의 구멍 (웰) 또는 플라스틱 튜브를 미리 일차 항체로 하여, 본원 발명의 항Xa·TFPI 모노클로날 항체(XT-1)로 감작시켜두고, 다음으로, 이 구멍 또는 플라스틱 튜브에 Xa·TFPI를 포함한 피검체 및 2차 항체로서 효소표지한 항TFPI 항체용액을 넣고, 약 30분간 정치한 후 청정하고, 효소기질 용액을 첨가하여 30분 정도 효소반응을 실시한다. 반응종료후, 비색법 등에 의해, 피검체 중의 Xa·TFPI의 량을 정량하는 것에 의해 실시할 수 있다.
또는, 1차 항체로는 항 TFPI 모노클로날 항체 [예를 들면, 화학 및 혈청요법연구소에서 취득한 하이브리도마 HTFPI-K9 (기탁번호 : FERM-P-14467)이 생산하는 항 TFPI 모노클로날 항체], 2차 항체로는 효소 등으로 표지한 본원 발명의 항Xa·TFPI 모노클로날 항체 (XT-1)을 사용하여 상기와 동일한 조작을 하여도 혈중의 Xa·TFPI를 정량할 수 있다.
또한, 본 발명의 모노클로날 항체는, 후술하는 바와 같이 라텍스 응집면역법에도 사용할 수있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 감작한 라텍스와 피검체를 접촉시켜, 그 접촉에 의한 응집의 유무를 측정하는 것으로, 피검체 중의 Xa·TFPI를 정량할 수 있다.
본 발명은, 혈중에 존재하는 Xa·TFPI의 정량에 사용되어온 종래의 샌드위치 EIA법에 있어서, 검체중에 공존하는 유리된 X 또는 유리된 TFPI의 간섭을 받는다는 결점을 해소하기 위하여 예의 연구한 결과, Xa와 TFPI가 결합되어 복합체를 형성함으로써, 새로 만들어지는 항원결정기를 인식하는 모노클로날 항체를 생산, 분비하는 하이브리도마를 얻고, 이 하이브리도마의 배양물을 분리, 정제하여 Xa·TFPI에 특이성을 나타내는 모노클로날 항체를 발견하였다. 따라서, 본 발명은 새로 발견한 모노클로날 항체를 이용하여, Xa·TFPI를 간편하고 정확하게 그리고 재현성이 우수하게 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명은, Xa·TFPI와 특이적으로 반응하지만, 유리된 인자-X, 유리된 인자-Xa 및 TFPI와는 반응하지 않는 모노클로날 항체에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Xa·TFPI로 면역시킨 포유동물의 비장 세포와 포유동물의 골수종 세포의 융합에 의해 형성되고, Xa·TFPI와 특이적으로 반응하지만, 유리된 인자-X, 유리된 인자-Xa 및 유리된 TFPI와는 반응하지 않는 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 또는 그것으로부터 유래하는 세포주에 관한 것이다.
본 발명은, 상기의 모노클로날 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는, Xa·TFPI의 면역학적 측정방법에 관한 것이다.
다음에 본 발명의 실시예를 들어 더욱 상세하게 설명한다.
[실시예 1]
Xa·TFPI의 조제
Xa·TFPI의 조제는 다음과 같은 조작으로 실시하였다. 정제한 Xa 5㎎(0.5㎎/㎖의 Xa용액, 10㎖)과 정제한 TFPI 15㎎(5㎎/㎖의 TFPI용액, 3㎖)를 혼합하고 (몰비 1:2), 37℃에서 한 시간 반응시킨 후, 1M의 디이소프로필 플루오로인산 용액을 13㎖ 반응액에 첨가함으로써 반응을 정지시켰다. 이 혼합액을 미리 0.1M NaCl을 포함한 20mM 트리스 염산완충액 (ph7.4)에서 평형화한 헤파린 세파로스 컬럼 (컬럼용량 100㎖)를 충전하였다.
이 컬럼을 상기의 완충용액 400㎖로 세정한 후, 0.1M NaCl을 함유하는 20mM트리스 염산완충액 (pH 7.4)과 0.5M NaCl을 함유하는 20mM 트리스 염산 완충액(pH7.4)에 의한 직선농도구배에 의해 용출한다. 용축액은 5㎖씩 모았다. 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동법에 의해, 복합체에 포함되어 있는 분획을 측정하였다. Xa·TFPI가 포함되어 있는 분획번호 61-120을 모아, 50mM NaCl을 함유한 20mM 트리스 염산 완충액을 투석하였다.
다음으로 미리 50mM NaCl을 함유한 20mM 트리스 염산 완충액으로 평형화되어 있는 DEAE 세파셀 컬럼(컬럼 용량 50㎖, 파마시아사 제조)에 충전한다. 이 컬럼을 상기 완충액 약 200㎖로 세정한 후, 0.05M NaCl을 포함한 20mM 트리스염산 완충액에 의한 직선농도구배에 의해 용출하였다. 용출액은 2㎖씩 모았다. 상기 방법으로 조사한 Xa·TFPI가 포함된 분획을 모아, 한외여과법으로 농축하고, A280nm = 1.0의 Xa·TFPI, 5㎖를 얻었다. 이와 같이 하여 얻은 Xa·TFPI용액은, 면역원으로서 또는 항Xa·TFPI 항체 산생 하이브리도마를 선별하기 위한 ELISA용 항원으로서 사용하였다.
[실시예 2]
(a) 면역화한 비장세포의 조제
상기 Xa·TFPI 면역원용액 (A280nm = 0.1)을 동량의 프로인드씨 완전 어쥬번드와 유화될 때까지 혼합하고, 그 혼합액 200μl을 마우스의 복강내에 투여하는 것에 의해 면역을 실시하였다. (제 1 차 면역). 30일 경과후, 그 마우스에 상기와 같은 방법으로 마우스의 복강내에 투여하였다. (제 2차 면역). 제2회 면역으로부터 21일 경과후, Xa·TFPI 면역원 용액 (A280nm = 0.1)을 동량의 생리식염수로 희석하고, 그 희석액 200μl를 마우스의 복강내에 투여하였다. (최종 면역). 최종면역으로부터 30일 경과후, 비장세포를 마우스에서 적출하여 세포융합에 사용하였다.
(b) 세포융합:
무균적으로 적출한 상기의 비장을, 10∼15% 소의 태아 혈청을 포함한 DME 배지 5㎖를 넣은 샤알레에 넣는다. 다음으로 비장을 10∼15% 소태아혈청을 포함한 DME배지 약 15㎖에서 환류시켜 비장세포를 유출시킨후, 그 비장세포 현탁액을 나일론 멧슈에 통과시킨다. 이 바장세포를 50㎖원심 튜브에 모아 500×g, 10분간 원심분리한다. 이렇게 하여 얻어진 펠릿에 3∼5㎖의 헤모라이딩용액(155㎖ NH4CI, 10mM KHCO3, 1mM Na2EDTA, pH7.0)을 첨가하여, 현탁시킨다. 0℃에서 5∼10분간 방치하면 현탁액중의 적혈구가 파괴된다. 10∼15㎖의 10∼15% 소태아혈청을 함유한 DME배지를 넣은 후 원심분리한다. 이렇게하여 얻은 세포 펠릿을 DME 배지에서 원심법에 의해 세정하고, 살아있는 비장세포수를 측정한다.
한편으로, 미리 배양해둔 마우스 골수종세포(미엘로마 세포) SP2/0-Ag14 약2×107개에 1×108개의 상기 비장세포를 넣어, DME배지안에서 잘 혼합하고, 원심분리를 실시하였다.(500×g, 10분) 그 상등액을 흡인하고, 펠릿을 잘 분해시켜, 38℃에서 보온해둔 40% 폴리에스텔글리콜 4000용액의 0.5㎖를 적하하고, 원심 튜브를, 손으로 1분간 천천히 회전시킴으로써 폴리에틸렌 글리콜용액과 세포 펠릿을 혼합시켰다. 다음으로, 38℃에 보온해둔 DME배지를, 30초마다 1㎖추가하여 튜브를 천천히 회전시켰다.
이 조작을 10회 반복한 후, 20∼30㎖의 10∼15% 소의 태아 혈청을 포함한 배지에 넣어, 원심분리(500×g, 10분)을 실시하였다. 상등액을 제거한 후, 세포 펠릿을 10∼15%를 소 혈청을 포함한 HAT 배지 (DME배지 아미노프테린 4×10-7M, 티미딘 1.6×10-5M, 하이포잔틴 1×10-4M이 되도록 첨가한 것)으로, 원심법에 의해 2회 세정한 후, 40㎖의 상기 HAT배지를 현탁하였다. 이 세포현탁액을 96웰 세포배양 플레이트의 각 웰200μl씩 분주하고, 37℃, 5% 탄산가스를 포함한 탄산가스기에서 배양을 개시하였다.
배양중, 2∼3일간격으로 웰의 배지를 약 100μl 제거하고, 다시 상기 HAT배지 100μl 를 첨가함으로써 HAT배지안에서 증식하는 하이브리도마를 선택하였댜. 8일째 경부터, 10∼15% 소혈청을 포함하는 HT배지(DME배지에 티미딘 1.6×10-5M, 하이포잔틴 1×10-4M이 되도록 첨가한 것)으로 교환하고, 하이브리도마의 증식을 관찰함과 동시에, 약 10일째에 후술하는 ELISA법에 의해 항 Xa·TFPI항체 생산 하이브리도마를 스크리닝하였다.
(C)하이브리도마의수립
하이브리도마 배양상등액중의 생산항체의 유무는 ELISA 법에 의해 측정하였다. 96웰 ELISR용 플레이트(1mmulon, 일본 다이나텍 주식회사)의 각 웰에, 전술한 정제 Xa·TFPI 용액 (A280nm = 0.05, 생리식염수로 희석한 것)을 50μl 씩 분주하여, 25℃에서 2시간 방치하였다. 다음으로, 0.05% Tween20(ICI사의 등록상표) - 생리식염수에서 3회 세정한 후, 각 웰에 배양 상등액을 50μl 첨가하고, 25℃에서 1시간 반응시켰다.
다음으로, 0.05% Tween20 - 생리식염수로 200배 희석한 퍼옥시타제 결합 항마우스항체 (다코사, 덴마크) 50μl 을 각 웰에 첨가하였다. 반응종료후, 0.05% Tween 20-생리식염수에서 각 웰을 3회 세정하고, 0.5mM 아미노안티피린, 10mM 페놀, 및 0.005% 과산화수소수를 포함한 용액 250μl 을 각각 웰에 첨가하고, 25℃에서 30분간 반응시키고, 각 웰의 490nm에 있어서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 192웰 중 23웰에 항체 생산이 확인되었다.
상기의 ELISA법에 의해 확인된 배양상등액중의 항Xa·TFPI 항체가 TFPI 및 Xa와 반응할 지 여부를, TFPI 및 Xa를 감작시킨 96웰 ELISA용 플레이트를 사용하여, 상기와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, Xa·TFPI와 반응한 23웰의 배양 상등액중, 18웰의 배양상등액이 TFPI와도 반응하였다. 한편, Xa와는 전혀 반응하지 않았다.
TFPI 및 Xa와는 반응하지 않고 Xa·TFPI에만 특이적으로 반응하는 1웰 중의 하이브리도마는 24웰 플레이트 이동시키고, 10∼15% 소의 태아 혈청으로 포함한 HT배양으로 4∼5일간 배양하였다.
그 후, 재차 ELISA법에 의해 항Xa·TFPI 특이적인 항체 (이하 항Xa·TFPI항체라고 한다.)의 생산의 유무를 확인한 다음 한계희석법에 의해 클로닝하였다. 한계희석법은, HT배지에서 하이브리도마가 5개/㎖이 되도록 희석한 세포부유액을, 미리 정상 BALB/C계 마우스의 복강세포가 웰 당 2×104개 분주해 놓은 96웰 플레이트의 각 웰에 100μl 씩 분주하였다. 약 10일 후, ELISA법에 의해, 항Xa·TFPI항체를 생산하는 하이브리도마의 클론을 스크리닝하였다. 그 결과, 각 하이브리도마에 대해서, 20∼40개의 항체생산 클론이 얻어졌다.
이 클론들 중에서, 증식이 잘되고, 항체분비능력이 뛰어나며, 안정된 클론을 선택해, 전술한 것과 동일한 방법으로 재클론화를 실시하고, 항Xa·TFPI 특이적 항체 생산 하이브리도마 XT-1을 수립하였다.
하이브리도마 XT-1은, 공업기술원 생명공학 공업기술 연구소에 FERM P-15357로서, 1995년12월 20일에 기탁되어, FERM BP 5776으로서 1996년 12월 20일자로 부다페스트조약에 따라 국제기탁에 이관되었다.
[실시예 3]
모노클로날 항체의 제조
생체외 (in vitro)법
마우스 하이브리도마 XT-1을 15% 소아 태아 혈청을 포함한 DME배지 안에서, 37℃, 5% 이산화탄소 분위기중 72∼96시간 배양하였다. 배양물을 원심분리 (10000×g, 10분)후, 상등액에 고형 황산암모늄을 50% 최종농도가 되도록 서서히 첨가하였다. 혼합물을 영하에서 30분간 교반시킨 후 60분간 방치하고, 원심분리 (10000×g, 10분)후, 얻어진 침전물을 소량의 10mM 인산완충액(pH 8.0)에 용해시키고, 1000배의 10mM 인산완충액에 대해 투석하였다.
이것을 10mM 인산완충액에 미리 평형화시킨 DEAE셀룰로스의 컬럼에 충진하였다. 모노클로날 항체의 용출은 10mM 인산완충액(pH8.0)과 0.2M NaCl을 함유한 10mM 인산완충액(pH8.0)의 사이에서 농도구배법에 의해 실시하였다. 용출된 모노클로날항체를 한외여과법으로 농축하여, 0.1M 인산완충액(pH8.0)에 대해 투석한다. 소 혈청 IgG를 제거하기 위하여, 투석자를 염소 항 소혈청 IgG-세파로스 4B의 컬럼에 통과시켰다. 다음으로 통과액을 0.1M 인산완충액(pH8.0)으로 평형화한 단백질 A-세파로스 4B의 컬럼에 충전하였다. 컬럼 pH3.5의 완충액으로 용출하여 정제한 항Xa·TFPI 항체 XT-1 용액을 얻었다.
생체내 (in vivo)법
프리스탄 (2, 6, 1, 14-테트라메틸펜타데칸) 0.5㎖를 10 내지 12주된 BALB/C계 마우스의 복강내에 투여한 후 14∼20일째의 마우스 복강내에 생체외법으로 증식시킨 하이브로도마 XT-1을 마우스 한 마리당 2×106세포가 되도록 접종하였다.
각 하이브리도마에 대해 한 마리의 마우스에서 약 10∼15㎖의 복수가 얻어졌다. 항체농도는 2∼10㎎/㎖였다. 복수중의 모노클로날 항체의 정제는, 상기의 생체외 정제법과 동일한 방법으로 실시하였다. (단, 염소 항 소혈청 IgG-세파로스 4B의 칼럼을 통과시키는 조작은 제외한다. )
[실시예 4]
모노클로날 항체의 면역 글로불린 클래스 및 특이성의 동정
항Xa·TFPI 모노클로날 항체 XT-1의 면역 글로불린·클래스 및 특이성의 동정은, 각각 옥테로니-면역확산법, 및 효소면역분석법으로 실시하였다. 그 결과, 모노클로날 항체 XT-1의 면역 글로불린·클래스는 「IgG2a」였다. 특이성은 마우스 복수의 희석예를 사용하여 실시한 결과를 도 1에서 표시한다.
[실시예 5]
라텍스 응집면역 정량법
항Xa·TFPI 모토클로날 항체에 의한 라텍스(일본합성고무사 제조, 0.497μm)의 감작은 다음과 같은 조작으로 실시하였다.
모노클로날 항체 XT-1의 농도가 0.1㎎/㎖의 용액 10㎖에, 라텍스 농도가 1%(w/v)가 되도록 라텍스를 추가하여, 25℃에서 격렬하게 교반시켰다. 다음으로, 소의 알부민용액(10㎎/㎖)을 0.2㎖ 첨가하고, 25℃에서 30분간 격렬하게 교반시킨 후, 원심분리(2000×g, 30 분간)를 실시하였다. 침전물을 50㎖의 물에 현탁시키고, 항Xa·TFPI 모노클로날 항체 감작 라텍스액을 얻었다.
상기 항Xa·TFPI 모노클로날 항체 대신, 항 TFPI 모노클로날 항체 [하이브리도마 HTPI-K9 (기탁번호 : FERM-P-14467)로부터 얻은 모노클로날 항체]를 이용하여 조작을 행하여, 항 TFPI 모노클로날 항체 감작 라텍스액을 얻었다. 이것을 아래의 라텍스 응집반응에 사용하였다.
상기의 2종류의 항체감작 라텍스액을 동량혼합하고, 이 혼합액 라텍스와 Xa·TFPI를 포함한 검체를 혼합하여 반응시키고, 분광학적으로 응집반응속도를 LPIA-100 (상품명, 미쓰비시화학제조)를 사용하여 측정하였다. 에피토프를 2개 가지는 Xa·TFPI는 응집하지만, 에피토프를 한 개밖에 갖지 않은 X 및 TFPI는 응집하지않기 때문에, 정확하게 검체중의 Xa·TFPI를 측정할 수 있었다. 도2에 Xa·TFPI농도와 응집반응속도와의 관계(검량선)를 나타낸다.
[실시예 6]
원·스텝·샌드위치 효소면역정량법
서양 와사비·퍼옥시다제를 항Xa·TFPI 모노클로날 항체 XT-1에 결합시키는 방법은, 나카네 및 카와오이 [저널 오브 히스토케미스트리 앤드 사이토케미스트리 - 제 22권 1084∼1091 항 (1974)년]의 방법에 준하여 실시하였다. 이 효소 라벨항체를 사용하여 Xa·TFPI의 샌드위치 효소 면역정량법을 다음과 같이 하여 실시하였다.
항 TFPI 모노클로날 항체 (상기 실시예 5에서 사용한 모노클로날항체)를 20mM탄산완충액중에 10㎍/㎖의 농도로 한 용액을, 96웰 평저형 폴리스틸렌 마이크로플레이트에 100㎕ 넣었다. 25℃에서 30분간 정치하였다. 이 플레이트를 0.05% Tween-20을 함유한 생리식염수로 3회 세정하였다. 이렇게 하여 얻은 항체를 감작한 플레이트의 웰에 50㎕의 피검체 및 상기에서 조제한 퍼옥시다제 표지 항 Xa·TFPI모노클로날 항체, 0.15M NaCl 및 2% 소알부민을 함유한 20mM 인산완충액(pH8.0)100㎕을 첨가하였다.
25℃에서 30분간 정치한 후, 플레이트를 0.05% Tween-20을 포함한 생리식염수에서 3회 세정하였다. 다음으로, 효소기질액 910mM 페놀, 20mM4-아미노 안티피린 및 0.005% 과산화 수소를 포함한 액 200㎕씩 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 25℃에서 30분 반응후, 각 웰의 490nm에 있어서 흡광도를 MP-590형 사이크로엘라이자 미니 리더 (다이나텍사 제조)로 측정하였다. 피검체중의 Xa·TFPI 량은, 동시에 측정한 검량용 복합체의 490nm에 있어서 흡광도로부터 그린 검량선에서 구하였다. 도 3에 그 때의 검량선을 표시하였다.
본 발명은 유리된 TFPI, Xa와는 반응하지 않고, Xa·TFPI에 특이적으로 반응하는 항Xa·TFPI 모노클로날 항체를 신규로 얻고, 이것을 사용하면, 상술한 바와 같이, Xa·TFPI를 우수한 감도로 정량할 수 있따.
규칙 13 규칙의 2의 기탁받은 미생물에의 언급 및 기탁기관
기탁기관 : 통산산업성 공업기술원 생명공학 공업 기술 연구소
수탁자 : 일본국 이바라키현 쓰구바시 히가시 1쪼메 1번 3호
수탁번호 및 기탁한 날짜 :
FERM BP-57761995년 12월 20일

Claims (5)

  1. 항인자-Xa·조직인자 응고계 저해제-복합체 (Xa·TFPI)와 특이적으로 반응하지만, 유리된 인자-X, 유리된 인자-Xa 및 유리된 조직인자 응고계 저해제(Tissue Factor Pathway Inhibitor: TFPI)와는 반응하지 않는 모노클로날 항체.
  2. 하이브리도마 XT-1 (FERM BP-5776)에 의해 생산된 청구항에 기재된 모노클로날 항체.
  3. 인자-Xa·조직인자 응고계 저해제 복합체로 면역시킨 포유동물의 비장세포와 포유동물의 골수종 세포와의 융합에 의해 형성되고, Xa·TFPI와 특이적으로 반응하지만, 유리된 인자-X, 유리된 인자-Xa 및 유리된 TFPI와는 반응하지 않는, 모노클로날항체를 분비하는 하이브리도마 또는 그것으로부터 유래하는 세포주.
  4. 하이브리도마 XT-1 (FERM BP-5776)에 의해 청구항에 기재된 하이브리도마 도는 그로부터 유래하는 세포주.
  5. 제 1 항 또는 2항에 기재된 모노클로날항체를 이용하는 것을 특징으로 하는, 인자-Xa·조직인자 응고계 저해제 복합체의 면역학적 측정방법.
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