WO1997023509A1 - ANTICORPS MONOCLONAL, ANTI COMPLEXE 'Xa . TFPI' ET SON UTILISATION - Google Patents

ANTICORPS MONOCLONAL, ANTI COMPLEXE 'Xa . TFPI' ET SON UTILISATION Download PDF

Info

Publication number
WO1997023509A1
WO1997023509A1 PCT/JP1996/003832 JP9603832W WO9723509A1 WO 1997023509 A1 WO1997023509 A1 WO 1997023509A1 JP 9603832 W JP9603832 W JP 9603832W WO 9723509 A1 WO9723509 A1 WO 9723509A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
monoclonal antibody
factor
tfpi
free
tfp1
Prior art date
Application number
PCT/JP1996/003832
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Isao Kohno
Yumiko Itoh
Kosuke Kumeta
Yuichi Kamikubo
Gilbu Soe
Original Assignee
Iatron Laboratories, Inc.
Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Iatron Laboratories, Inc., Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute filed Critical Iatron Laboratories, Inc.
Priority to EP96943313A priority Critical patent/EP0812859B1/en
Priority to DE69619226T priority patent/DE69619226T2/de
Priority to AU12089/97A priority patent/AU706547B2/en
Publication of WO1997023509A1 publication Critical patent/WO1997023509A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/36—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood coagulation factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/81—Protease inhibitors
    • G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • G01N2333/8114—Kunitz type inhibitors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)

Definitions

  • the present invention relates to an anti-factor Xa 'tissue factor pathway inhibitory complex monoclonal antibody, a hybridoma secreting the monoclonal antibody, and the monoclonal antibody.
  • the present invention relates to a method for immunological measurement of factor X-inhibitor complex using factor Xa.
  • measuring the factor Xa (hereinafter also referred to as Xa) that converts prothrombin in the blood to thrombin can be performed by disseminated intravascular coagulation (DIC) or It is important to know the hypercoagulable state such as thrombosis.
  • DIC disseminated intravascular coagulation
  • TFPI Tissue Factor Pathway Inhibitor
  • Xa-TFP1 factor-passway inhibitor complex
  • the simplest method for measuring the amount of Xa produced in blood is to quantify Xa ⁇ TFP1, which indirectly reflects the amount of Xa produced. It is possible to estimate the amount of Xa from that amount and use it as an indicator of coagulation activation.
  • X factor X
  • Sandwich EIA method which combines two kinds of antibodies, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against Xa and a polyclonal antibody or a monoclonal antibody against TFPI, is used.
  • the present inventor has reported that in the conventional sandwich EIA method used for the quantification of XaTFPI present in blood, free X or free TFP1 coexisting in the sample is interfered.
  • Xa and TFPI combine to form a complex, which produces hybridomas that produce and secrete monoclonal antibodies that recognize newly generated antigenic determinants.
  • the culture of this hybridoma was separated and purified, and a monoclonal antibody showing specificity for Xa'TFPl was found. Accordingly, the present invention provides a method for simply, accurately and reproducibly measuring Xa * TFPI using a newly discovered monoclonal antibody.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically reacts with Xa ⁇ TFP1, but does not react with free factor X, free factor Xa and free TFPI.
  • the present invention is formed by fusion of mammalian spleen cells immunized with Xa TFP1 and mammalian myeloma cells, and specifically reacts with Xa.
  • the present invention relates to a hybridoma secreting a monoclonal antibody that does not react with free factor Xa and free TFPI, or a cell line derived therefrom.
  • the present invention relates to a method for immunologically measuring Xa • TFP1, comprising using the above-mentioned monoclonal antibody.
  • FIG. 1 shows the binding strength of anti-Xa • TFP1 monoclonal antibody (XT-1) to Xa, TFPl and Xa.TFPI.
  • the antigen was directly coated on a 96-well microplate and ascites.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measurement by the Enzymimnoassay method based on the reactivity of XT-1 with XT-1.
  • Fig. 2 is a graph showing the calibration curve of latex agglutination reaction rate and concentration of Xa'TFPl measured using LP1A-100.
  • FIG. 3 shows a sample of Xa • TFPl and other anti-Xa'TFPl monoclonal antibodies (XT-1), which were used as primary antibodies and anti-Xa'TFP1 monoclonal antibodies as primary antibodies.
  • FIG. 9 is a graph showing the result of Chensimmyno Atssey.
  • Anti-Xa ⁇ TFP1 monoclonal antibodies can be produced by culturing the novel mouse 'hybridoma in the medium or intraperitoneally of the mouse, respectively.
  • mice / hyperidoma used here is a basic method for cell fusion of Kohler and Milstein with spleen cells and mouse myeloma cells of mice immunized with Xa ⁇ TFPI [Nature 256, 495 (Nature). 1975) Reference] to produce cells by cell fusion. The details are as described in the following example.
  • the medium for culturing the above-mentioned hybridoma may be any medium suitable for culturing the hybridoma, and is preferably a medium modified by Dulbecco.
  • DME Dulbecco's modified Eeagle's minimum essential medium
  • fetal serum, L-glutamine, L-pyruvic acid and antibiotics were added.
  • a medium containing the substances penicillin G and streptomycin is used.
  • the anti-Xa * TFPI monoclonal antibody described above can be separated and purified from the culture solution or the ascites of the mouse thus produced by a method generally used for protein isolation and purification. It is.
  • Examples of such methods include ammonium sulfate salting-out, ion exchange force chromatography using ion-exchanged cellulose, molecular chromatography using molecular gels, column chromatography using molecular gels, and protein A-binding chromatography. Affinity column chromatography using saccharides, dialysis, lyophilization, etc.
  • the anti-XaTFPI monoclonal antibody thus obtained has the ability to bind only to XaTFPI without binding to free X, Xa, and TFPI, and is used for immunoassay of XaTFPI.
  • Useful as a reagent for The anti-Xa ⁇ TFPI monoclonal antibody of the present invention can be used for enzyme immunoassay (EIA), fluorescence immunoassay (F1A), luminescence immunoassay (LIA). ) Or as a reagent in radioimmunoassay (RIA).
  • EIA enzyme immunoassay
  • F1A fluorescence immunoassay
  • LIA luminescence immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • An example of the enzyme immunoassay is a one-step / sandwich enzyme immunoassay using microplates or plastic tubes.
  • Example 7 A specific example of this enzyme immunoassay is shown in Example 7 below.
  • the enzyme immunoassay is carried out using an anti-Xa ⁇ TFPI monoclonal antibody, and firstly, the microplate hole (pellet) is used.
  • the plastic tube was previously sensitized with the anti-Xa * TFPI monoclonal antibody (XT-1) of the present invention as a primary antibody, and then Xa * TFP1 was added to this hole or plastic tube.
  • XT-1 anti-Xa * TFPI monoclonal antibody
  • XT-1 anti-Xa * TFP1
  • a solution of an anti-TFPI antibody enzyme-labeled as a secondary antibody and allowed to stand for approximately 30 minutes, followed by cleaning. Add the solution and perform the enzyme reaction for about 30 minutes. After completion of the reaction, it can be performed by quantifying the amount of Xa'TFPl in the sample by a colorimetric method or the like.
  • an anti-TFP1 monoclonal antibody for example, an anti-TFP I monoclonal antibody produced by Hypridoma HTFP K9 (deposit number: FE-P-14467) obtained at the Chemical and Serum Therapy Research Institute] Antibody
  • an anti-Xa′TFPi monoclonal antibody (XT-1) of the present invention labeled with an enzyme or the like as a secondary antibody Xa ⁇ TFP1 in blood can be obtained in the same manner as described above. Can be determined.
  • the monoclonal antibody of the present invention can also be used for latex agglutination immunization as described below.
  • Xa'TFPl in the test sample can be quantified by contacting the test sample with the latex sensitized with the monoclonal antibody of the present invention and measuring the presence or absence of aggregation associated therewith.
  • Preparation of Xa ⁇ TFPI was performed by the following operation. A mixture of 5 mg of purified Xa (0.5 mg / inl of Xa solution, 10 ml) and 15 mg of purified TFPI (5 mg / ml of TFPI solution, 3 ml) (molar ratio 1: 2) was added at 37 ° C. After the reaction for 1 hour, the reaction was stopped by adding 1 ml of a 1 M solution of diisopropylfluorophosphoric acid to the reaction solution.
  • This mixed solution was packed in a heparin-sepharose column (column volume: 100 ml) which had been equilibrated with 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) containing 0.1 M NaCl in advance.
  • the column is packed in a DEAE-Sephacel column (column volume 50 ml, manufactured by Farma ⁇ a) that has been equilibrated with a 20 mM Tris-HCl buffer solution containing 50 niM NaCl in advance.
  • the column was eluted with a linear concentration gradient using 20 mM Tris-HCl buffer containing 0.05 M NaCl.
  • the eluate was collected in 2 ml portions.
  • the Xa ⁇ TFPI solution thus obtained was used as an immunogen and as an antigen for ELISA for selecting anti-Xa ⁇ TFPI antibody-producing hybridomas.
  • the above spleen aseptically removed is placed in a petri dish containing 5 ml of DME medium containing 10 to 15% fetal serum.
  • the spleen is perfused with about 15 ml of DME medium containing 10 to 15% fetal serum and the spleen cells are drained. Pass the spleen cell suspension through the Nipple Mesh. Collect the spleen cells in a 50 ml centrifuge tube and centrifuge at 500 xg for 10 minutes. This was in Perez Bok obtained 3-5 got Managing ml of solution into the (155mM NH ⁇ Cl, 10mM KHC0 3, 1 mM Na2EDTA, pH7.0) was added and suspended.
  • red blood cells in the suspension will be destroyed.
  • the presence or absence of the produced antibody in the hybridoma culture supernatant was measured by the EL1SA method.
  • a 96-well ELISA plate Immulon, Nippon Dynatec Co., Ltd.
  • the cells were washed three times with 0.05% Tween20 (registered trademark of IC1) monophysiological saline, and 50 ⁇ l of the culture supernatant was added to each well, followed by reaction at 25 ° C. for 1 hour.
  • an anti-Xa ⁇ TFPI-specific antibody (hereinafter simply referred to as an anti-Xa * TFPI antibody) was again confirmed by ELISA, and then cloned by limiting dilution.
  • 2 x 10 "peritoneal cells of a normal BALB / C mouse peritoneal cell were previously dispensed from a cell suspension diluted to 5 cells / ml of hybridoma in HT medium. 100 ⁇ l was dispensed into each well of a 96-well plate, and after about 10 days, clones of hybridomas producing anti-Xa ⁇ TFP1 antibodies were screened by ELISA. 20-40 antibody-producing clones were obtained per dorma.
  • Hypri-Dorma XT-1 was deposited at the Institute of Biotechnology, Industrial Science and Technology as FERM P-15357 on December 20, 1995, and as FERM BP 5776 on December 20, 1996. It was transferred to an international deposit under the Swedish Treaty on that day.
  • Mouse hybridoma XT-1 was cultured in DME medium containing 15% fetal calf serum at 37 ° C and 5% carbon dioxide for 72 to 96 hours. After the culture was centrifuged (10,000 xg, 10 minutes), solid ammonium sulfate was gradually added to the supernatant to a final concentration of 50%. The mixture was stirred under ice-cooling for 30 minutes, left to stand for 60 minutes, centrifuged (10,000 Xg, 10 minutes), and the resulting precipitate was dissolved in a small amount of 10 mM phosphate buffer (pH 8.0). It was dialyzed against 1000 volumes of 10 mM phosphate buffer. This was applied to a column of DEAE-cellulose already equilibrated with 10 mM phosphate buffer. Elution of monoclonal antibodies is 10 mM phosphate buffer
  • the column was packed in a column of Protein A-Sepharose 4B equilibrated with (pH 8.0). The column was eluted with a loose mouth solution of PH3.5 to obtain a purified anti-Xa ⁇ TFPI antibody XT-1 solution.
  • Pristane (2,6,1,14-tetramethyl pentadecane) 0.5m 1 was intraperitoneally administered to BALB / C mice aged 10 to 12 weeks after intraperitoneal injection on days 14 to 20 Hypridoma XT-1 grown in vitro was inoculated at 2 ⁇ 10 6 cells per mouse.
  • the immunoglobulin, class, and specificity of the anti-Xa • TFP1 monoclonal antibody XT-1 were identified by the octeroimmunoassay method and the enzymimino assay method, respectively.
  • the immunoglobulin class of the monoclonal antibody XT-1 was “lgG2a”.
  • Fig. 1 shows the results of specificity obtained using dilution series of mouse ascites.
  • Example 5 Latex agglutination immunoassay
  • an anti-TFPI monoclonal antibody [monoclonal antibody obtained from Hypridoma HTFP K9 (deposit number: FERM-P-14467)] was used. The same operation was performed to obtain an anti-TFPI monoclonal antibody-sensitized latex solution. These were used in the following latex agglutination reaction.
  • agglutination reaction rate is LP1A-100 (product Name, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation).
  • Xa ⁇ TFP I with two epitopes is agglutinating power, and X and TFP have only one epitope! Since X did not aggregate, Xa ⁇ TFPI in the sample could be accurately measured.
  • Figure 2 shows the relationship (calibration curve) between Xa ⁇ TFP 1 degree and the agglutination reaction rate.
  • a solution of anti-TFP1 monoclonal antibody (monoclonal antibody used in Example 5 above) at a concentration of 10 / ig / ml in 20 mM carbonate buffer was applied to a 96-well flat bottom polystyrene microplate. , 100 1 put. The mixture was allowed to stand at 25 ° C for 30 minutes. The plate was washed three times with saline containing 0.05% Tween-20.
  • a novel anti-Xa'TFPI monoclonal antibody that does not react with free TFPi and Xa but specifically reacts with Xa and TFP1 is obtained. Can be quantified with high sensitivity.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

明 細 書 抗フ ァ ク タ一 Xa ' ティ シュフ ァ ク タ ーパスウ ェ イ イ ン ヒ ビター複合 体モノ ク ローナル抗体及びその使用
発明分野
本発明は、 抗フ ァ ク タ一 Xa ' テ ィ シュ フ ァ ク ターパスウ ェ イ イ ン ヒ ビタ一複合体モノ ク ローナル抗体、 前記モノ ク ローナル抗体を分 泌するハイプリ ドーマ及び前記モノ ク ローナル抗体を用いる、 フ ァ ク タ一 Xa . ティ シュ フ ァ ク タ一パスゥ ヱ イ イ ン ヒ ビタ ー複合体の免 疫学的測定方法に関する。 関連技術
臨床分野において血中のプロ ト ロ ン ビンを ト ロ ン ビンに変換させ るフ ァ ク ター Xa (以下、 Xaと もいう） を測定するこ とは、 播種性血 管内凝固症候群 （DIC ) や血栓症等の凝固亢進状態を知る うえで重 要である。 しかしながら、 生成した Xaを直接測定する こ とは非常に 困難である。 なぜなら、 Xaは生成するやいなや阻害剤のティ シュフ ア クターパスゥ ヱイイ ンヒ ビター 〔組織因子凝固系阻害剤 （Tissue Factor Pathway Inhibior) 、 以下、 TFPIと もいう〕 と結合 して、 フ ァ ク ター Xa . ティ シュ フ ァ ク ターパスウ ェ イ イ ン ヒ ビター複合体 ( 以下、 Xa · TFP1と もいう） を形成するからである。
それ故、 血中で生成した Xa量を測定するための最も簡便な方法は 、 生成した Xa量を間接的に反映している Xa · TFP1を定量するこ とで ある。 その量から Xa量を推定して凝固活性化の指標とするこ とがで
3る。
従来、 Xa · TFP1を測定するには、 フ ァ ク ター X (以下、 Xと もい う） と Xaに対するポ リ ク ロ一ナル抗体あるいはモノ クロ一ナル抗体 と、 TFPIに対するポリ ク ローナル抗体あるいはモノ ク ローナル抗体 の 2種類を抗体を組み合わせたサン ドィ ツチ EIA 法が用いられてい o
しかしながら、 従来の測定方法では、 検体中に共存する遊離の X あるいは遊離の TFP1の干渉を受けてしま うため、 正確に Xa， TFP1を 測定する こ とは困難であつた。 発明の開示
本発明者は、 血中に存在する Xa · TFPIの定量に用いられていた従 来のサン ドイ ッチ EIA 法において、 検体中に共存する遊離の Xある いは遊離の TFP1の干渉を受けるという欠点を解消するべく鋭意研究 をした結果、 Xaと TFPIが結合して複合体を形成することによって、 新たに生じる抗原決定基を認識するモノ ク 口一ナル抗体を産生、 分 泌するハイプリ ドーマを得、 このハイプリ ドーマの培養物を分離、 精製して Xa ' TFPlに特異性を示すモノ ク ローナル抗体を見出した。 従って、 本発明は、 新たに見出したモノ ク ロ一ナル抗体を利用 して 、 Xa * TFPIを簡便に、 正確にそして再現性よ く測定する方法を提供 するものである。
即ち、 本発明は、 Xa · TFP1と特異的に反応するが、 遊離のフ ァ ク ター X、 遊離のフ ァ ク タ一 Xa及び遊離の TFPIとは反応しないモノ ク ローナル抗体に関する。
また、 本発明は、 Xa · TFP1で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺乳 動物の ミ エローマ細胞との融合によって形成され、 Xa . TFPlと特異 的に反応するが、 遊離のフ ァ ク ター X、 遊離のフ ァ クタ一 Xa及び遊 離の TFPIとは反応しないモノ ク ローナル抗体を分泌するハィブリ ド —マまたはそれに由来する細胞株に関する。 更に、 本発明は、 前記のモノ ク ローナル抗体を用いるこ とを特徴 とする、 Xa · TFP1の免疫学的測定方法に関する。 図面の簡単な説明
図 1 は抗 Xa · TFPlモノ ク ロ一ナル抗体 （XT— 1 ) の Xa、 TFPl及び Xa . TFPIとの結合力を、 抗原を直接 96ウェルマイ ク 口プレー トにコ ー ト して、 腹水中の XT— 1 との反応性により、 ェンザィムィムノア ッセィ法で測定した結果を表すグラフ図である。
図 2 は LP1A- 100を用いて測定したラテッ クス凝集反応速度と Xa ' TFPlの濃度との検量線のダラフ図である。
図 3 は扰 TFPIモノ ク ローナル抗体を一次抗体と し、 抗 Xa ' TFPlモ ノ ク ローナル抗体 （XT— 1 ) を酵素標識二次抗体と して行った、 Xa • TFPlなどのサン ドィ ッチェンザィムィムノ アツセィの結果を表す グラフ図である。 発明の実施の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
抗 Xa · TFPlモノ ク ローナル抗体は新規なマウス ' ハイプリ ドーマ を、 それぞれ培地またはマウスの腹腔内で培養することによって製 造できる。
ここで用いるマウス · ハイプリ ドーマは一般的には Xa · TFPIで免 疫したマウスの脾臓細胞とマウス骨髄腫細胞とを、 Kohler及び Mil i stein の細胞融合の基本方法 [Nature第 256 巻 495 頁 （ 1975年） 参 照] により細胞融合して製造することが可能である。 詳細には、 下 記実施例に述べる如く である。
また、 上記のハイプリ ドーマを培養する培地と しては、 ハイプリ ドーマの培養に適した培地であればよ く 、 好適にはダルベッ コ氏変 法ィ一ク "ノレ氏最ノ Jヽ必須培地 （Dulbecco' s modified Eeagle' s minim um essential medium 以下、 DME と記す） にゥ シ胎児血清、 L—グ ルタ ミ ン、 L一 ピルビン酸および抗生物質 （ペニ シ リ ン G と ス ト レ プ トマイ シ ン） を含む培地が用いられる。
このよう にして製造された培養液またはマウ スの腹水から、 蛋白 質の単離、 精製に一般的に用いられる方法により前述の抗 Xa * TFPI モノ ク ローナル抗体を分離、 精製するこ とが可能である。
そのよ う な方法と しては、 硫安塩析、 イオ ン交換セルロースを用 いるィォン交換力ラムク ロマ トグラフ ィ ー、 分子節ゲルを用いる分 子節カラムク ロマ ト グラフ ィ ー 、 プロテイ ン A結合多糖類を用いる 親和性カ ラ ムク ロマ ト グラ フ ィ ー、 透析、 凍結乾燥等がある。
このよ うにして得られた抗 Xa · TFPIモノ ク ローナル抗体は、 遊離 の X、 Xa及び TFPIとは結合しないで、 Xa · TFPIとだけ結合する能力 を有し、 Xa · TFPIの免疫定量用の試薬と して有用である。 この発明 の抗 Xa · TFPIモノ ク 口ーナル抗体 （例えば後述の実施例で得られた XT— 1 ) は、 酵素免疫定量法 （EIA ) 、 蛍光免疫定量法 （F1A ) 、 発光免疫定量法 （LIA ) あるいは放射能免疫定量法 （RIA ) 等にお ける試薬と して使用できる。 酵素免疫定量法と しては、 マイ ク ロプ レー トあるいはプラスチッ クチューブを用いるワ ン · ステップ . サ ン ドイ ッチ酵素免疫定量法が例と して挙げられる。
この酵素免疫定量法の具体例は、 下記実施例 7 に示す通りである が、 一般的には、 抗 Xa · TFPIモノ ク ローナル抗体を用いて行い、 ま ずマイ ク ロプレー トの穴 （ゥ ヱル） あるいはプラスチッ クチューブ を前もって一次抗体と して、 本願発明の抗 Xa * TFPIモノ ク ロ一ナル 抗体 （XT— 1 ) で感作させておき、 次に、 この穴あるいはプラスチ ッ クチューブに Xa * TFP1を含む被検体および二次抗体と して酵素標 識した抗 TFPI抗体の溶液を入れ、 約 30分間静置後清浄し、 酵素基質 溶液を加えて 30分間程度酵素反応を行う。 反応終了後、 比色法等に より、 被検体中の Xa ' TFPlの量を定量するこ とにより行う ことが可 能である。
または、 一次抗体と して抗 TFP1モノ ク ローナル抗体 [例えば、 化 学及血清療法研究所で取得したハイプリ ドーマ HTFP卜 K9 (寄託番号 ： FE -P-14467) が産生する抗 TFP Iモノ ク ローナル抗体] 、 二次抗 体と して酵素等で標識した本願発明の抗 Xa ' TFPiモノ ク ローナル抗 体 （XT— 1 ) を用いて前記と同様の操作を行っても血中の Xa · TFP1 を定量することができる。
また、 本発明のモノ ク ローナル抗体は、 後述するよう にラテッ ク ス凝集免疫法にも使用できる。 本発明のモノ ク ローナル抗体を感作 したラテッ ク スと被検体を接触させ、 それに伴う凝集の有無を測定 することで、 被検体中の Xa ' TFPlを定量することができる。 実施例
次にこの発明の実施例により更に詳細に説明する。
実施例 1 . Xa · TFP1の調製
Xa · TFPIの調製は次のような操作で行った。 精製した Xa 5 mg (0. 5mg/inlの Xa溶液、 10ml) と精製した TFPI 15mg ( 5 mg/ml の TFPI溶液 、 3 ml) を混合し （モル比 1 ： 2 ) 、 37°Cで 1 時間反応後、 1 Mの ジイ ソプロ ピルフルォロ リ ン酸溶液を 13ml反応液に添加するこ とに よって反応を停止させた。 この混合液を前もって 0.1 M NaClを含 む 20mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH7.4 ) で平衡化したへパリ ン一セフ ァ ロースカラム （カラム容量 100 ml) に充塡した。
このカラムを上記の緩衝液約 400ml で洗浄後、 0.1 M NaClを含 む 20mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH7.4 ) と 0· 5 M NaC 1を含む 20mMト リ ス塩酸緩衝液 （PH7.4 ) による直線濃度勾配によって溶出する。 溶 出液は、 5 mlずつ集めた。 ポ リ アク リルア ミ ドゲル電気泳動法によ つて、 複合体の含まれている分画を測定した。 Xa ' TFPlが含まれて いる分画番号 61-120を集め、 50mM NaC 1を含む 20mMト リ ス塩酸緩衝 液で透析した。
次に、 前もって 50niM NaClを含む 20mMト リ ス塩酸緩衝液で平衡化 してある DEAE—セフ ァセルカラム （カラム容量 50ml、 フ ァルマンャ 社製） に充填する。 このカラムを上記の緩衝液約 200ml で洗浄後、 0.05M NaClを含む 20mMト リ ス塩酸緩衝液による直線濃度勾配によ つて溶出 した。 溶出液は 2 mlずつ集めた。 上記の方法で調べた Xa ' TFPIの含まれている分画を集め、 限外濾過法によって濃縮し、 A280 nm= 1.0 の Xa · TFP1、 5 mlを得た。 このよう にして得た Xa · TFPI溶 液は、 免疫原と して、 また抗 Xa · TFPI抗体産生ハイプリ ドーマを選 別するための EL ISA 用抗原と して使用 した。
実施例 2.
( a ) 免疫化した脾臓細胞の調製 ：
上記の Xa · TFPI免疫原溶液 （A280nm二 0.1 ) を等量のフ ロイ ン ド 氏完全アジュバン ドと乳化するまで混合し、 その混合液 200 u 1 を マウス腹腔内に投与するこ とにより免疫を行った （第 1 回免疫） 。 30日経過後、 該マウスに上記の同様の方法でマウス腹腔内に投与し た （第 2 免疫） 。 第 2回免疫から 21日経過後、 Xa * TFPI免疫原溶液 (A280nm= 0.1 ) を等量の生理食塩水で希釈し、 その希釈液 200 1 を、 該マウスの静脈内に投与した （最終免疫） 。 最終免疫から 3 日経過後、 脾臓細胞をマウスから取り出し、 細胞融合に使用 した。
( b ) 細胞融合 ：
無菌的に摘出した上記の脾臓を、 10〜15%ゥ シ胎児血清を含む DM E 培地 5 mlを入れたシャーレに入れる。 次に脾臟を 10〜15%ゥ シ胎 児血清を含む DME 培地約 15mlで還流して脾細胞を流出させた後、 こ の脾細胞懸濁液をナイ口 ンメ ッ シュに通す。 この脾細胞を 50ml遠心 チューブに集めて 500 x g、 10分間遠心する。 こう して得たペレツ 卜に 3〜 5 mlのへモライ ジング溶液 （ 155mM NH^Cl, 10mM KHC03, 1 mM Na2EDTA, pH7.0) を加え、 懸濁させる。 0 °Cで、 5〜 10分間放置 すると懸濁液中の赤血球は破壊される。 10〜20mlの 10〜15%ゥシ胎 児血清を含む DME 培地を加えてから遠心分離する。 このようにして 得た細胞べレッ トを DME 培地で遠心法によつて洗浄し、 生きている 脾細胞数を測定する。
一方、 予め培養しておいたマウス骨髄腫細胞 （ミエローマ細胞） SP2/0-Agl4約 2 X 107 個に 1 x 108 個の上記脾細胞を加え、 DME 培 地中でよく混合し、 遠心分離を行った （ 500 x g、 10分間） 。 その 上清を吸引 し、 ペレツ トをよく解きほぐ し、 38°Cに保温しておいた 40%ポリエチレングリ コ一ル 4000溶液 0.5 mlを滴下し、 遠心チュー ブを、 手で 1分間穏やかに回転することによってポリエチレングリ コール溶液と細胞ペレツ トを混合させた。 次に、 38°Cに保温してお いた DME 培地を、 30秒毎に 1 ml加えてチューブを穏やかに回転させ る o
この操作を 10回繰り返した後、 20〜30mlの 10〜15%ゥ シ胎児血清 を含む DME 培地を加えて、 遠心分離 （500 x g、 10分間） を行った 。 上清を除去した後、 細胞ペレツ トを 10〜 15%ゥ シ胎児血清を含む HAT 培地 （DME 培地にア ミ ノプテリ ン 4 X 10— 7M、 チミ ジン 1.6 X 10"5M, ヒポキサンチン 1 X 10— 4Mになるように添加したもの） で 、 遠心法によって 2回洗浄後、 40mlの上記 HAT 培地に懸濁した。 こ の細胞懸濁液を 96ゥエル細胞培養プレー 卜の各ゥエルに 200 1 ず つ分注し、 37°C、 5 %炭酸ガスを含む炭酸ガス培養器で培養を開始 した。
培養中、 2〜 3 日間隔で各ゥエルの培地を約 100 1 除き、 新た に上記の HAT 培地を 100 1 加えるこ とにより HAT 培地中で増殖す るハイブリ ドーマを選択した。 8 日目頃から 10〜15%ゥ シ胎児血清 を含む HT培地 （DME 培地にチ ミ ジン 1.6 X 10— 5M、 ヒポキサンチン
1 X 10— 4Mになるように添加したもの） に交換し、 ハイプリ ドーマ の増殖を観察するとと もに、 約 10日目に、 下述の ELISA 法により、 抗 Xa · TFPI抗体産生ハイプリ ドーマをクスリ ーニングした。
( c ) ハイプリ ドーマの樹立
ハブリ ドーマ培養上清中の産生抗体の有無は EL1SA 法により測定 した。 96ゥエル ELISA 用プレー ト （ Immulon 、 日本ダイナテッ ク株 式会社） の各ゥエルに、 前述の精製 Xa · TFPI溶液 （A280nm= 0.05、 生理食塩水で希釈したもの） を 50 1 ずつ分注し、 25°Cで 2 時間放 置した。 次に、 0.05%Tween20 ( IC1 社の登録商標） 一生理食塩水 で 3 回洗浄した後、 各ゥエルに培養上清を 50〃 1 加え、 25°Cで 1 時 間反応させた。
次に、 0.05%Tween20 —生理食塩水で 200 倍希釈したペルォキシ ダ一ゼ結合抗マウス抗体 （ダコ社、 デンマーク） 50 1 を各ゥエル に加えた。 反応終了後、 0.05%Tween20 —生理食塩水で各ゥエルを 3 回洗浄し、 0.5mM ァ ミ ノ アンチピリ ン、 10mMフ エ ノ 一ル、 及び 0. 005 %過酸化水素水を含む溶液 250 1 を各ゥエルに加え、 25°Cで 30分間反応させ、 各ゥエルの 490nm における吸光度を測定した。 そ の結果、 192 ゥエル中 23ゥエルに抗体産生が認められた。
上記の ELISA 法によって認められた培養上清中の抗 Xa · TFPI抗体 が、 TFPI及び Xaと反応するか否かを、 TFPI及び Xaを感作した 96ゥェ ル ELISA 用プレー トを用いて上記と同様の方法で測定した。 その結 果、 Xa · TFPIと反応した 23ゥエルの培養上清中、 18ゥエルの培養上 清が TFPIと も反応した。 一方、 Xaとは全く 反応しなかった。
TFPI及び Xaとは反応しないで、 Xa · TFPIのみに特異的に反応する 1 ゥエル中のハイブリ ドーマは 24ゥエルプレー トに移し、 10~ 15% ゥシ胎児血清を含む HT培養で 4〜 5 日間培養した。
その後、 再度 ELISA 法によって抗 Xa · TFPI特異的抗体 （以下単に 抗 Xa * TFPI抗体という） の産生の有無を確認してから限界希釈法に より ク ロ一ニングした。 限界希釈法は、 HT培地でハイプリ ドーマが 5個/ mlとなるように希釈した細胞浮遊液を、 予め正常 BALB/C系マ ウスの腹腔細胞がゥエルあたり 2 X 10" 個分注してある 96ゥエルプ レー トの各ゥエルに 100 〃 1 ずつ分注した。 約 10日後、 ELISA 法に よって、 抗 Xa · TFP1抗体を産生するハイプリ ドーマのク ローンをス ク リ ーニングした。 その結果、 各ハイプリ ドーマにつき、 20~ 40個 の抗体産生ク ローンが得られた。
これらのク ローンの中から、 増殖のよい、 抗体分泌能の高い、 し かも安定なク ローンを選び、 前述と同様の方法で再ク ローン化を行 い、 抗 Xa · TFPI特異的抗体産生ハイプリ ドーマ XT— 1 を樹立した。
なお、 ハイプリ ドーマ XT— 1 は、 工業技術院生命工学工業技術研 究所に FERM P- 15357と して、 平成 7年 12月 20曰に寄託され、 FERM B P 5776と して 1996年 12月 20日にブタぺス 卜条約に基づく 国際寄託に 移管された。
実施例 3. モノ クローナル抗体の製造
イ ン ' ビ ト ロ法
マウスハイプリ ドーマ XT— 1 を 15%ゥ シ胎児血清を含む DME 培地 中で 37°C、 5 %二酸化炭素棼囲気中 72〜96時間培養した。 培養物を 遠心分離 （ 10000 x g、 10分） 後、 上清に固形の硫酸アンモニゥム を 50%最終濃度となるよう に徐々に加えた。 混合物を氷冷下 30分間 撹拌した後 60分間放置し、 遠心分離 （ 10000 X g、 10分） 後、 得ら れた沈渣を少量の 10mMリ ン酸緩衝液 （pH8.0 ) に溶解し、 1000倍量 の lOmMリ ン酸緩衝液に対して透析した。 これを、 10mMリ ン酸緩衝液で既に平衡化した DEAE—セルロースの カ ラムに充塡した。 モノ ク ロ一ナル抗体の溶出は 10mMリ ン酸緩衝液
(pH8.0 ) と 0.2 M NaClを含む 10mMリ ン酸緩衝液 （pH8.0 ) の間 で濃度勾配法により行った。 溶出されたモノ ク ロ ーナル抗体を限外 濂過法で澳縮し、 0.1 Mリ ン酸緩衝液 （pH8.0 ) に対して透析した 。 ゥ シ血清 IgG を除く ために、 透析者をャギ抗ゥ シ血清 G —セフ ァ ロース 4 Bのカラムに通した。 次に通過液を 0.1 Mリ ン酸緩衝液
(pH8.0 ) で平衡化したプロテイ ン A—セフ ァ ロ一ス 4 Bのカ ラ ム に充填した。 カラムを PH3.5 の緩銜液で溶出して精製した抗 Xa · TF PI抗体 XT— 1 の溶液を得た。
ィ ン · ビボ法
プリ スタ ン （ 2， 6， 1 ， 14ーテ ト ラ メ チルペンタデカ ン） 0.5m 1 を 10から 12週齢の BALB/C系マウスの腹腔内に投与後 14〜20日目の マウス腹腔内にイ ンビ トロで増殖させたハイプリ ドーマ XT— 1 をマ ウス一匹あたり 2 X 106 細胞となるように接種した。
各ハイブリ ドーマにつき一匹のマウスから約 10〜15inlの腹水が得 られた。 その抗体濃度は、 2〜1 Omg/ml であった。 腹水中のモノ ク ローナル抗体の精製は、 上記のイ ンビ ト ロ精製法と同様の方法で行 つた （但し、 ャギ抗ゥシ血清 IgG —セフ ァ ロ一ス 4 Bのカラムを通 す操作は除く 。 ） 。
実施例 4 . モノ ク ローナル抗体の免疫グロブリ ンクラス及び特異 性の同定
抗 Xa · TFP1モノ ク ローナル抗体 XT— 1 の免疫グロブリ ン . ク ラ ス 、 及び特異性の同定は、 各々ォクテロ二一免疫拡散法、 及びェンザ ィ ムィムノ ア ッセィ法により行った。 その結果、 モノ ク ローナル抗 体 XT— 1 の免疫グロブ リ ン ' ク ラ スは 「 lgG2a 」 であっ た。 また、 特異性はマウスの腹水の希釈列を用いて行っ た結果を図 1 に示す。 実施例 5 . ラテ ッ ク ス凝集免疫定量法
抗 Xa ' TFPIモノ ク ローナル抗体によるラテツ クス （日本合成ゴム 社製、 0.497 u m) の感作は次のよ うな操作で行った。
モノ ク ロ一ナル抗体 XT— 1 の濃度が 0. lmg/mlの溶液 10mlに、 ラテ ッ クス濃度が 1 % ( w/v ) になるようにラテッ クスを加え、 25°Cで 1 時間激しく撹拌した。 次に、 牛アルブミ ン溶液 （10mg/ml ) を 0. 2 ml 添加し、 25°Cで 30分間激しく撹拌後、 遠心分離 （20000 x g、 30分間） を行う。 沈渣を 50mlの水に懸濁し、 抗 Xa · TFP1モノ ク ロ一 ナル抗体感作ラテッ クス液を得た。
上記抗 Xa · TFPIモノ ク ローナル抗体に代えて、 抗 TFPIモノ ク ロー ナル抗体 [ハイ プリ ドーマ HTFP卜 K9 (寄託番号 ： FERM-P-14467) よ り得られたモノ ク ローナル抗体] を用いて同様の操作を行い、 抗 TF PIモノ ク ロ ーナル抗体感作ラテ ッ ク ス液を得た。 これらを以下のラ テッ ク ス凝集反応に用いた。
上記の 2種類の抗体感作ラテッ クス液を等量混合し、 この混合液 ラテッ クスと Xa * TFPIを含む検体とを混合して反応させ、 分光学的 に凝集反応速度を LP1A- 100 (商品名、 三菱化学製） を用いて測定し た。 ェピ トープを 2個もつ Xa · TFP Iは凝集する力く、 ェピ トープを 1 個しかもたない X及び TFP！は凝集しないため、 正確に検体中の Xa · TFP Iを測定する ことができた。 図 2 に Xa · TFP 1澳度と凝集反応速度 との関係 （検量線） を示す。
実施例 6. ワ ンステ ッ プサン ドイ ッチ酵素免疫定量法
西洋ヮサビ · ペルォキシダーゼを抗 Xa · TFPIモノ ク ロ一ナル抗体 XT— 1 に結合させる方法は、 ナカネ及びカ ヮオイ [ジ ャーナル ' ォ づ ' ヒ ス ト ケ ミ ス ト リ一 · ア ン ド · サイ トケ ミ ス ト リ 一第 22巻 1084 〜 1091頁 （ 1974年） ] の方法に準じて行った。 この酵素ラベル抗体 を用いて Xa · TFP1のサン ドイ ッチ酵素免疫定量を次のようにして行 つ た o
抗 TFP1モノ ク ローナル抗体 （前記実施例 5で用いたモノ クローナ ル抗体） を 20mM炭酸緩衝液中に 10/i g/mlの濃度にした溶液を、 96ゥ エル平底型ポリ スチレン製マイクロプレー トに、 100 1 入れた。 25°Cで 30分間静置した。 そのプレー トを 0.05%Tween- 20を含む生理 食塩水で 3回洗浄した。 このようにして得た抗体を感作したプレー 卜のゥエルに、 50〃 1 の被検体、 及び上記で調製したペルォキシダ ーゼ標識抗 Xa · TFP1モノ ク ローナル抗体、 0. 15M NaCK 及び 2 % ゥシアルブミ ンを含む 20mMリ ン酸緩衝液 （pH8.0 ) 100 〃 1 を加え
？ o
25°Cで 30分間静置後、 プレー トを 0.05%Tween- 20を含む生理食塩 水で 3回洗浄した。 次いで、 酵素基質液 UOmMフヱノ ール、 20mM4 - ァ ミ ノ ア ンチ ピ リ ン、 及び 0.005 %過酸化水素を含む液） 200 1 ずつをプレー 卜のそれぞれのゥエルに添加した。 25°Cで 30分反応後 、 各ゥエルの 490nm における吸光度を MP- 590型マイクロエライザ · ミニリーダ一 （ダイナテック社製） で測定した。 被検体中の Xa . TF PIの量は、 同時に測定した検量用複合体の 490nm における吸光度か ら描いた検量線から求めた。 図 3 にそのときの検量線を示す。 産業上の利用可能性
この発明は遊離の TFPi， Xaとは反応せず、 Xa · TFP1に特異的に反 応する抗 Xa ' TFPIモノ ク ローナル抗体を新規に得、 これを使用すれ ば、 上述の如く、 Xa · TFP1を感度よく定量することができる。
規則 13規則の 2の寄託された微生物への言及及び寄託機関
寄託機関 ： 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所
あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1 番 3号
受託番号及び寄託した日付 PERM BP- 5776 1995年 12月 20曰

Claims

請 求 の 範 囲
1. フ ァ ク タ ー Xa * テ ィ シュ フ ァ ク ターノヽ。スウ ェ イ イ ン ヒ ビター 複合体 （Xa . TFPl) と特異的に反応するが、 遊離のフ ァ ク ター X、 遊離のフ ァ クタ一 Xa及び遊離のティ シュフ ァ ク タ一パスウ ェイイ ン ヒ ビター （TFP1) とは反応しないモノ ク ローナル抗体。
2. ハイプリ ドーマ XT— 1 (FERM BP- 5776により生産される請求 項に記載のモノ ク ローナル抗体。
3. フ ァ ク タ一 Xa * ティ シュフ ァ クターパゥウ ェイイ ンヒ ビ夕一 複合体で免疫した哺乳動物の脾臓細胞と哺乳動物の ミ エローマ細胞 との融合によって形成され、 Xa · TFP1と特異的に反応するが、 遊離 のフ ァ ク タ一 X、 遊離のフ ァ クタ一 Xa及び遊離の TFP Iとは反応しな いモノ ク ローナル抗体を分泌するハイプリ ドーマまたはそれに由来 する細胞株。
4. ハイプリ ドーマ XT— 1 (FERM BP-5776) である請求項に記載 のハイプリ ドーマ又はそれに由来する細胞株。
5. 請求項 1 又は 2記載のモノ ク ローナル抗体を用いるこ とを特 徴とする、 フ ァ ク タ一 Xa ' ティ シュフ ァ ク ターパスウ ェイイ ンヒ ビ ター複合体の免疫学的測定方法。
PCT/JP1996/003832 1995-12-26 1996-12-26 ANTICORPS MONOCLONAL, ANTI COMPLEXE 'Xa . TFPI' ET SON UTILISATION WO1997023509A1 (fr)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP96943313A EP0812859B1 (en) 1995-12-26 1996-12-26 ANTIFACTOR Xa-TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR COMPLEX MONOCLONAL ANTIBODY AND USE OF THE SAME
DE69619226T DE69619226T2 (de) 1995-12-26 1996-12-26 Monoklonaler antikörper gegen den komplex aus faktor xa und dem inhibitor für den gewebefaktor (xa. tfpi)
AU12089/97A AU706547B2 (en) 1995-12-26 1996-12-26 An antifactor Xa-tissue factor pathway inhibitor complex monoclonal antibody and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7/339229 1995-12-26
JP33922995A JP3681206B2 (ja) 1995-12-26 1995-12-26 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1997023509A1 true WO1997023509A1 (fr) 1997-07-03

Family

ID=18325482

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP1996/003832 WO1997023509A1 (fr) 1995-12-26 1996-12-26 ANTICORPS MONOCLONAL, ANTI COMPLEXE 'Xa . TFPI' ET SON UTILISATION

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP0812859B1 (ja)
JP (1) JP3681206B2 (ja)
KR (1) KR100249314B1 (ja)
AU (1) AU706547B2 (ja)
DE (1) DE69619226T2 (ja)
ES (1) ES2168521T3 (ja)
WO (1) WO1997023509A1 (ja)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130028907A1 (en) * 2010-02-26 2013-01-31 Novo Nordisk A/S Stable Antibody Containing Compositions
US8962563B2 (en) 2009-12-21 2015-02-24 Baxter International, Inc. TFPI inhibitors and methods of use
US9018167B2 (en) 2010-03-19 2015-04-28 Baxter International Inc. TFPI inhibitors and methods of use
US9574011B2 (en) 2008-12-22 2017-02-21 Novo Nordisk A/S Antibodies against tissue factor pathway inhibitor
US9777051B2 (en) 2008-12-19 2017-10-03 Baxalta GmbH TFPI inhibitors and methods of use
CN110437335A (zh) * 2008-08-04 2019-11-12 拜耳医药保健有限公司 针对组织因子途径抑制剂(tfpi)的单克隆抗体
US10835602B2 (en) 2010-05-28 2020-11-17 Novo Nordisk A/S Stable multi-dose compositions comprising an antibody and a preservative

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002316999A (ja) * 2001-04-17 2002-10-31 Dai Ichi Pure Chem Co Ltd モノクローナル抗体
DK2542257T3 (en) * 2010-03-01 2017-10-16 Bayer Healthcare Llc OPTIMIZED MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST Tissue FACTOR ROAD INHIBITOR (TFPI)
WO2016157513A1 (ja) * 2015-04-03 2016-10-06 株式会社日立製作所 抗原抗体間相互作用量の同定法及び装置

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. BIOCHEM., Vol. 115, No. 4, (1994), "Amino Acid Sequence and Inhibitory Activity ...", pages 708-714. *
J. BIOCHEM., Vol. 118, No. 1, (1995), "An Anti-Tissue Factor Pathway Inhibitor Monoclonal Antibody ...", pages 178-182. *
See also references of EP0812859A4 *

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110437335A (zh) * 2008-08-04 2019-11-12 拜耳医药保健有限公司 针对组织因子途径抑制剂(tfpi)的单克隆抗体
US9873720B2 (en) 2008-12-19 2018-01-23 Baxalta GmbH TFPI inhibitors and methods of use
US11001613B2 (en) 2008-12-19 2021-05-11 Takeda Pharmaceutical Company Limited TFPI inhibitors and methods of use
US9777051B2 (en) 2008-12-19 2017-10-03 Baxalta GmbH TFPI inhibitors and methods of use
US9574011B2 (en) 2008-12-22 2017-02-21 Novo Nordisk A/S Antibodies against tissue factor pathway inhibitor
US8962563B2 (en) 2009-12-21 2015-02-24 Baxter International, Inc. TFPI inhibitors and methods of use
US9795674B2 (en) * 2010-02-26 2017-10-24 Novo Nordisk A/S Stable antibody containing compositions
US20130028907A1 (en) * 2010-02-26 2013-01-31 Novo Nordisk A/S Stable Antibody Containing Compositions
US10709782B2 (en) 2010-02-26 2020-07-14 Novo Nordisk A/S Stable antibody containing compositions
US10201586B2 (en) 2010-03-19 2019-02-12 Baxalta GmbH TFPI inhibitors and methods of use
US9556230B2 (en) 2010-03-19 2017-01-31 Baxalta GmbH TFPI inhibitors and methods of use
US9018167B2 (en) 2010-03-19 2015-04-28 Baxter International Inc. TFPI inhibitors and methods of use
US11793855B2 (en) 2010-03-19 2023-10-24 Takeda Pharmaceutical Company Limited TFPI inhibitors and methods of use
US10835602B2 (en) 2010-05-28 2020-11-17 Novo Nordisk A/S Stable multi-dose compositions comprising an antibody and a preservative
US10800816B2 (en) 2012-03-21 2020-10-13 Baxalta GmbH TFPI inhibitors and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
EP0812859A4 (en) 2000-04-26
JPH09176199A (ja) 1997-07-08
EP0812859A1 (en) 1997-12-17
DE69619226T2 (de) 2002-08-14
KR100249314B1 (ko) 2000-03-15
AU1208997A (en) 1997-07-17
EP0812859B1 (en) 2002-02-13
JP3681206B2 (ja) 2005-08-10
DE69619226D1 (de) 2002-03-21
AU706547B2 (en) 1999-06-17
KR19980702438A (ko) 1998-07-15
ES2168521T3 (es) 2002-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4902614A (en) Monoclonal antibody to human protein C
US5500345A (en) Hybridomas producing monoclonal antibodies specific for C-reactive protein and methods for detection of C-reactive protein
JP2818116B2 (ja) 心筋トロポニンｔに対する特異的抗体を用いる心筋トロポニンｔの測定方法
JP3681206B2 (ja) 抗ファクターＸａ・ティシュファクターパスウェイインヒビター複合体モノクローナル抗体及びその使用
JP3889084B2 (ja) 新規なモノクローナル抗体並びにｅ−Ｄダイマー及びｅ−ＤＤ／Ｅ複合体の免疫学的測定法
JPH0746104B2 (ja) Ｆｄｐの測定法
JP3307422B2 (ja) ヒトｐｉｖｋａ−ｉｉの免疫学的測定方法
EP1098198A1 (en) Method for the qualitative and quantitative determination of class igG human antibodies
JPH0644876B2 (ja) 抗トロンビン・アンチトロンビン３複合体モノクローナル抗体、及びその製造方法、並びにそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の免疫定量法、及びそれを用いるトロンビン・アンチトロンビン３複合体の精製方法
JPH058679B2 (ja)
JPH0548119B2 (ja)
WO1992011384A1 (en) ANTIBODY AGAINST HUMAN PLASMIN-α2-PLASMIN INHIBITOR COMPLEX, HYBRIDOMA AND IMMUNOASSAY
JP2001021557A (ja) Ｄダイマー及びｄｄ／ｅ複合体の免疫学的分析方法及び分析用キット
JP3841364B2 (ja) 抗ヒトビトロネクチン・トロンビン・アンチトロンビンｉｉｉ 複合体モノクローナル抗体、ハイブリドーマ及び免疫学的測定方法
JP2840852B2 (ja) Ｃ反応性蛋白質に対するモノクローナル坑体
JP3102484B2 (ja) モノクローナル抗体及びその用途
JP4028925B2 (ja) モノクローナル抗体
JP4451518B2 (ja) ハイブリッド細胞、モノクローナル抗体、製造方法および測定方法
JPH06121695A (ja) 抗ヒトマンノース結合蛋白モノクローナル抗体およびその利用
JPH10142226A (ja) 動脈硬化症の測定用キット
WO1989002078A1 (en) Method for diagnosing chronic articular rheumatism
JP2837030B2 (ja) 抗ヒトプラスミン−α▲下２▼−プラスミンインヒビター複合体特異抗体及び免疫学的測定方法
JPH0475597A (ja) ヒト免疫不全ウイルスの逆転写酵素に対するモノクローナル抗体、その製法及びその抗体産生株
JPH0461639B2 (ja)
WO1989003997A1 (en) Method for diagnosis of liver cancer

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU KR

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE

CFP Corrected version of a pamphlet front page
CR1 Correction of entry in section i
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1019970705837

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1996943313

Country of ref document: EP

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1996943313

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1019970705837

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1019970705837

Country of ref document: KR

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 1996943313

Country of ref document: EP