JP2005120096A

JP2005120096A - モノクローナル抗体及びこれを用いる免疫学的測定法

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Publication number: JP2005120096A
Application number: JP2004309724A
Authority: JP
Inventors: Hirokazu Yago; 弘和矢後; Takashi Hanada; 尚花田; Kakujin Wada; 格人和田; Koji Ushizawa; 幸司牛澤
Original assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pure Chemicals Co Ltd
Priority date: 2004-10-25
Filing date: 2004-10-25
Publication date: 2005-05-12

Abstract

【課題】抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（ＴＡＴ）に特異的なモノクローナル抗体、及びこれを用いる抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体の免疫学的測定法を提供する。
【解決手段】本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴを特異的に認識し、かつこれと高い親和性を有するものである。従って、このモノクローナル抗体を用いることにより、検体中の交差反応物の影響を受けず、ＴＡＴ濃度を精度良く測定することができ、特に血液凝固傾向の診断等に有用である。
【選択図】なし

Description

本発明は、新規なモノクローナル抗体、及びこれを用い、ヒト検体中のトロンビン・アンチトロンビンIII複合体濃度を精度良く測定することができ、血液凝固傾向の診断に有用な免疫学的測定法に関する。

ヒトアンチトロンビンIII（以下、ＡＴIII という）は、血液凝固系のセリンプロテアーゼの重要なインヒビターであり、トロンビンを始めとして活性化されたXII、XI、Ｘ、IX因子の活性を阻害する。ＡＴIII とセリンプロテアーゼとの反応は、１：１のモル比で進行し、ＡＴIII のアルギニン残基がセリンプロテアーゼの活性中心であるセリン残基とエステル結合して複合体を形成することによりセリンプロテアーゼの活性を抑制する。この様な複合体の一つとして、トロンビン・アンチトロンビンIII複合体（以下、ＴＡＴという）が挙げられる。
ヒトの血液中におけるＴＡＴの増加は、血液凝固機序の始動、及びその活性化によってトロンビン又は他の血液凝固系のセリンプロテアーゼが生成されたことを示すものと考えられている。従って、血液中のＴＡＴの量を測定することにより、血液凝固系の動態の一端を知り得るものと推察され、それによって血液凝固面から患者の病態を解明すること、例えば血栓形成あるいは汎発性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）への病態の進展を早期に予知し、適切な治療をすることが可能となる。

ヒト検体中のＴＡＴを免疫学的に測定する方法として、抗ＴＡＴneoantigen−ポリクローナル抗体を、¹²⁵Ｉで標識したＴＡＴを用いてｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎａｓｓａｙすることによりＴＡＴを測定する方法（非特許文献１）；抗トロンビン−ポリクローナル抗体を固相抗体に用い、抗ＡＴIII −ポリクローナル抗体を酵素標識抗体に用いたサンドイッチ系によるヒト検体中のＴＡＴの測定方法（非特許文献２）などが提案されている。更に、Ｈ．Ｐｅｌｚｅｒらの方法に準じた、ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチ系のキット（特許文献１）が提案され、商品化されている。

しかしながら、これらの測定方法は、いずれもポリクローナル抗体を利用するため、抗体の均一性に問題がある。すなわち、この均一でない抗体は検体中に含まれる交差反応物と反応する確率が高く、測定値が変動しやすいため、これまでの方法は、感度、精度、簡便性などの点で、現在の医療ニーズに合致するものとは言い難かった。

かかる欠点を克服するにはモノクローナル抗体の利用が考えられ、抗ＴＡＴモノクローナル抗体としては、固相化ＡＴIII 及び天然のＡＴIII とは反応しないセリンプロテアーゼ・ＡＴIII 複合体のＡＴIII のネオ抗原に対するモノクローナル抗体（非特許文献３及び特許文献２）及び特許文献３が知られている。ところが、血液等の臨床検体中のＴＡＴは種々の形態で存在するため、これらのモノクローナル抗体を使用しても実際に臨床検体中のＴＡＴを正確に測定することはできなかった。
Ｈｅｒｂｅｒｔ，Ｌ．Ｌａｕ，ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５５，５８８５−５８９３（１９８０）Ｈ．Ｐｅｌｚｅｒ，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ＆Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，５９，１０１−１０６（１９８８）Ｓ．Ａｓａｋｕｒａら，ＢｉｏｃｈｉｍｉｃａＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ，９５２，３７−４７（１９８８）特開平３−４８１５８号公報フランス特許第２６４５６４７号特開昭６２−１３８１８７号公報

従って、本発明の目的は、ＴＡＴを特異的に認識し、これと親和性が高く臨床検体中のＴＡＴ測定に有用なモノクローナル抗体、及びこれを用いたＴＡＴの測定方法を提供することにある。

そこで本発明者らは、ＡＴIII が血液凝固系のセリンプロテアーゼと結合（不可逆的結合）することによりネイティブなＡＴIII にない新しい抗原部位が生じる（ネオ抗原）こと、またＡＴIII がヘパリンと結合（可逆的結合）して構造変化を生じることを利用し、他の条件においてもネオ抗原が生じると考え、ＡＴIII を固相化したり、ＡＴIII に抗体を結合させることによってもセリンプロテアーゼと結合して生じるネオ抗原と類似したネオ抗原が生じることを見出した。更に、プロトロンビンにおいても固相化することによりα−トロンビンと類似のエピトープが生じることを見い出した。かかる知見に基づき、モノクローナル抗体を作成する際に、従来のスクリーニング法に加え、固相化ＡＴIII や固相化プロトロンビンとも反応を示す抗体を反応せしめるスクリーニング方法を新たに導入することにより、従来とは異なる反応性を有するモノクローナル抗体が得られ、これを用いれば臨床検体中のＴＡＴが正確に定量できることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、遊離のプロトロンビンとは反応せず；遊離及び固相化したトロンビン・アンチトロンビンIII複合体、遊離のトロンビン並びに固相化したプロトロンビンの三者と反応する抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を提供するものである。

また、本発明は、遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず；遊離及び固相化したトロンビン・アンチトロンビンIII複合体と反応し；セリンプロテアーゼと反応したアンチトロンビンIII、固相化したアンチトロンビンIII、及び抗アンチトロンビンIIIモノクローナル抗体が反応したアンチトロンビンIIIに共通して生じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応する抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を提供するものである。

また、本発明は、遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず；固相化したトロンビン・アンチトロンビンIII複合体との反応性が、遊離のトロンビン・アンチトロンビンIII複合体との反応性より強い抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体を提供するものである。

更に、本発明は、上記モノクローナル抗体の製造法及びこれを利用したＴＡＴの免疫学的測定法を提供するものである。

本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴを特異的に認識し、かつこれと高い親和性を有するものである。従って、このモノクローナル抗体を用いることにより、検体中の交差反応物の影響を受けず、ＴＡＴ濃度を精度良く測定することができ、特に血液凝固傾向の診断等に有用である。

本発明のモノクローナル抗体は、ＴＡＴで免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合して得られるハイブリドーマにより産生される。

免疫原として用いられるＴＡＴは、トロンビンとＡＴIII を結合させることにより作成される。ここで用いられるトロンビンとＡＴIII は、通常の市販されているものであればいずれでも使用することができるが、市販のトロンビン製剤には安定化剤としてタンパク質が多く含まれるため、陽イオン交換樹脂やアフィニティークロマトグラフィー等により精製して得られるα−トロンビンを使用するのが好ましい。トロンビンとＡＴIII は、１：１〜１：５のモル比で混合し、結合したＴＡＴはカラムクロマトグラフィー等で精製して用いるのが好ましい。

次に、得られたＴＡＴを免疫原として用い、常法により、ハイブリドーマ細胞を調製する。すなわち、まず免疫原としてのＴＡＴを哺乳動物に注射して免疫する。ここで免疫する哺乳動物は特に制限されず、後の操作において細胞融合に使用する骨髄腫細胞との適合性を考慮して選択することが好ましく、マウス、ラットなどが具体例として挙げられ、ＢＡＬＢ／ｃマウスが一般的である。

上記の免疫原を哺乳動物に免疫する方法としては特に制限されず、例えばＴＡＴ単独又は２種以上を組合わせ、これを哺乳動物に皮下注射、腹腔内注射、血管内注射、筋肉注射、脾臓内注射などによる方法や、飼料又は水に加え、これと共に経口的に投与、免疫する方法等の通常の方法が採用できる。また、免疫する際に、必要に応じてアジュバントと併用することもできる。

次に、免疫動物から採取した脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させる。マウス骨髄腫細胞としては、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（ＨＧＰＲＴ^-）やチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ^-）等の適切なマーカーを有するものが好ましい。融合は、公知の手法に準じて行うことができる。また、融合促進剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、センダイウイルス（ＨＶＪ）等を用いることができる。脾臓細胞と骨髄腫細胞との混合比は１：１〜１０：１が好ましい。場合によっては、電気融合法等により細胞融合を行うこともできる。

細胞融合した後、通常の選択用培地で培養することによりハイブリドーマを選択的に得ることができる。
ハイブリドーマのコロニーが充分に大きくなったところで目的とする抗体を産生する株の検索及びクローニングを行う。抗原に特異的な抗体の検索は、一般に抗体の検出に用いられている方法、例えば、ＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法等により行うことができる。
また、選択されたハイブリドーマを単クローン化するには、例えば限界希釈法や軟寒天法により行うことができる。この際、フィーダーとしてマウス胸腺細胞や腹腔マクロファージ、あるいはこれらと同様の効果を有する公知の添加剤を用いることが好ましい。

得られた単クローン化ハイブリドーマを用いて本発明モノクローナル抗体を製造するには、当該ハイブリドーマを適当な培地中で培養するか、又はマウス等の腹腔内で培養すればよい。ここで用いられる培地としては、ハイブリドーマの培養に適した培地であれば特に制限されず、例えば牛胎児血清、Ｌ−グルタミン、Ｌ−ピルビン酸及び抗生物質（ペニシリンＧとストレプトマイシン）を含むＲＰＭＩ１６４０培地等が好適である。培養は、例えば上記ハイブリドーマを１０⁴〜１０⁵個／ml濃度で培地に加え、５％炭酸ガス濃度、３７℃の条件下で２〜４日間程度行うのが好ましい。この培養により得られた上清を遠心分離等すれば、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。一方、腹腔内培養は、ハイブリドーマをマウス腹腔内に投与し、その腹水を回収すればよい。

このようにして得られた培養上清中の本発明モノクローナル抗体はこのままでも使用可能であるが、例えば硫安沈澱による分画法、イオン交換クロマトグラフィー法、プロテインＡ結合担体、抗ＩｇＧ抗体カラム等によって精製して用いることがより好ましい。
また、得られたモノクローナル抗体の特異性は、例えばウェスタンブロッティング法、遊離の抗原を用いたＥＬＩＳＡ、固相化抗原を用いたＥＬＩＳＡ、抗体結合抗原を用いたＥＬＩＳＡなどにより、確認することができる。

本発明モノクローナル抗体は、その反応性により次の三種に大別することができる。
（１）遊離のプロトロンビンと反応せず；遊離及び固相化したＴＡＴ、遊離のトロンビン並びに固相化したプロトロンビンと反応するモノクローナル抗体。
このモノクローナル抗体には、後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６２０２、２６２０３及び２６２０７が含まれる。より具体的には、遊離のプロトロンビン、遊離のＡＴIII 、抗ＡＴIII モノクローナル抗体とＡＴIII との結合物、固相化したＡＴIII 、及び固相化したセリンプロテアーゼ（活性化血液凝固第１０因子等）と反応したＡＴIII と反応せず；遊離のＴＡＴ、固相化したＴＡＴ、抗ＡＴIII モノクローナル抗体と反応したＴＡＴ、遊離のトロンビン、固相化したトロンビン及び固相化したプロトロンビンと反応するモノクローナル抗体である。

（２）遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず；遊離及び固相化したＴＡＴと反応し；セリンプロテアーゼと反応したＡＴIII 、固相化したＡＴIII 、及び抗ＡＴIII モノクローナル抗体が反応したＡＴIII に共通して生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクローナル抗体。
このモノクローナル抗体には、後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６２０５、２６２０８、２６２０９、２６２１４、２６２１６、２６２１８及び２６２１９が含まれる。より具体的には、遊離のＡＴIII 、遊離のトロンビン、遊離のプロトロンビン、固相化したトロンビン及び固相化したプロトロンビンと反応せず；遊離のＴＡＴ、固相化したＴＡＴ、抗ＡＴIII モノクローナル抗体と反応したＴＡＴ、固相化したＡＴIII 、固相化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴIII 、及び抗ＡＴIII モノクローナル抗体が反応したＡＴIII と反応するモノクローナル抗体である。

（３）遊離のＡＴIII とは反応せず、固相化したＴＡＴとの反応性が遊離のＴＡＴの反応性より強いモノクローナル抗体。
このモノクローナル抗体には、後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６２０６、２６２１０及び２６２１３が含まれる。
より具体的には、遊離のＴＡＴ、遊離のＡＴIII 、遊離のトロンビン、遊離のプロトロンビン、固相化したＡＴIII 、固相化したトロンビン、固相化したプロトロンビン及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が反応したＡＴIII と反応せず；固相化したＴＡＴ、固相化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴIII 及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が反応したＴＡＴと反応するモノクローナル抗体である。

本発明のモノクローナル抗体の１種又は２種以上を組合わせて用い、通常の免疫学的測定法を実施すれば、検体中のＴＡＴを精度良く定量することができる。

本発明のＴＡＴ測定法は、前記本発明モノクローナル抗体の２種以上を組合わせ、被検体と接触させて免疫測定すればよいが、抗体とＡＴIII 、プロトロンビン等との反応による誤差をなくし、正確にＴＡＴを測定するには、異なる反応性を有するモノクローナル抗体を組合わせるのが好ましい。すなわち、前記（１）、（２）及び（３）のモノクローナル抗体並びに遊離のＡＴIII と反応せず、セリンプロテアーゼと反応したＡＴIII に生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクローナル抗体から選ばれるモノクローナル抗体の２種以上を任意に組合わせて用いるのが好ましい。このうち、特に前記（１）のモノクローナル抗体と、前記（２）及び（３）のモノクローナル抗体並びに遊離のＡＴIII と反応せず、セリンプロテアーゼと反応したＡＴIII に生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクローナル抗体から選ばれた１種以上とを組合わせて用いるのが好ましい。ここで、遊離のＡＴIII と反応せず、セリンプロテアーゼと反応したＡＴIII に生じるＡＴIII のネオ抗原と反応するモノクローナル抗体としては、後記モノクローナル抗体Ｎｏ．２６２１１、２６２１２、２６２１７及び２６２２０が含まれる。より具体的には、遊離のＡＴIII 、遊離のトロンビン、遊離のプロトロンビン、固相化したＡＴIII 、固相化したトロンビン、固相化したプロトロンビン及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体と反応したＡＴIII と反応せず；遊離のＴＡＴ、固相化したＴＡＴ、固相化したセリンプロテアーゼと反応したＡＴIII 及び抗ＡＴIIIモノクローナル抗体が反応したＴＡＴと強く反応するモノクローナル抗体である。

免疫学的測定法としては特に制限されず、例えばオクタロニー法、一次元免疫拡散法、免疫比濁法、酵素免疫測定法、ラテックス免疫測定法、ラジオイムノアッセイ、フロロイムノアッセイなどを利用することができる。これらのうち、酵素免疫測定法を使用する場合には、例えば抗ＴＡＴモノクローナル抗体のいずれかを適当な緩衝液中で不溶性担体に固定化して不溶化抗体とし、別の抗ＴＡＴモノクローナル抗体を酵素で標識し、これらを被検体と反応させ、第二の抗体に結合させた酵素の活性を測ることにより、検体中のＴＡＴを測定することができる。
上記で使用する不溶性担体としては、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレンなどの各種合成高分子、ガラス、シリコン、不溶性多糖（架橋デキストラン、ポリサッカライド）などが好ましく、これらの担体は球状、棒状、微粒子等の形状、あるいは試験管、マイクロプレートなどの形態で用いることができる。なお、不溶化抗体作成の条件としては、球状、棒状、試験管、マイクロプレートの形態の場合及び微粒子の形態の場合、抗体濃度は各々１〜１０μg ／ml及び１〜１０mg／ml、緩衝溶液はリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液などのpH７〜１０の中性からアルカリ性、室温又は４℃で１時間〜７２時間で調製することが好ましい。

また、使用する酵素標識抗体は公知の方法によって作成することができ、例えば中根らの方法（ＮａｋａｎｅＰ．Ｋｅｔａｌ，Ｊ．ＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｙｔｏｃｈｅｍ，２２，１０８４−１０８９，１９７４）あるいは石川らの方法（マレイミド法：「酵素免疫測定法第３版」医学書院）などに従い、断片化していない免疫グロブリン分子をそのままか、あるいは必要に応じて抗体を適当なプロテアーゼで限定分解してＦ（ａｂ'）₂、又はＦａｂ'とした後、酵素で標識することができる。標識に使用する酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられる。

標識物質が酵素である場合には、その活性を測定するために基質、及び必要により発色剤が用いられる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質として過酸化水素を用い、発色剤としてｏ−フェニレンジアミン、３，３′，５，５′−テトラメチルベンチジン、２，２′−アジノジ−〔３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸〕アンモニウム塩等；酵素としてアルカリフォスファターゼを用いる場合には、基質として、ｐ−ニトロフェニルフォスフェート、３−（４−メトキシスピロ｛１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ−〔３．３．１．１^3,7〕デカン｝−４−イル）フェニルフォスフェート：ＡＭＰＰＤ等；酵素としてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合には、基質として、β−Ｄ−ガラクトピラノシド、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等；酵素としてグルコースオキシダーゼを用いる場合には、ペルオキシダーゼの共存下で基質として、β−Ｄ−グルコース、発色剤としてペルオキシダーゼの発色剤を用いることができる。

次に、実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１
（１）ＴＡＴの調製：
市販のトロンビン製剤（ミドリ十字社製）には安定化剤としてのタンパク質が多く含まれるため、これを精製した。すなわち、α−トロンビン５００００ｕｎｉｔｓを５０mlの５０mMリン酸緩衝液（pH７．０）（以下、リン酸緩衝液と略す）に溶かしたものをＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２．５×１１cm）にアプライし、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含むリン酸緩衝液の直線濃度勾配（０−０．４ＭＮａＣｌ）で溶出した。α−トロンビン活性は、合成基質Ｓ−２２３８（第一化学薬品社製）を用い、４０５nmの吸光度の増加で確認し、活性ピークをプールした。これをＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６Ｂカラム（２×６cm）にアプライし、吸着したタンパク質を０−０．１ＭＢｅｎｚａｍｉｄｉｎ及び０．５ＭＮａＣｌ含有リン酸緩衝液を用いた直線濃度勾配にて溶出した。そして、得られたα−トロンビンは０．１ＭＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）に対して透析した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度検定を行い、−８０℃で保存した。α−トロンビンは、−８０℃で保存することにより自己分解が防げる。
こうして得たα−トロンビンと市販のＡＴIII 製剤（ヘキスト社製）をpH７．４の条件でモル比１：１．５で混合し、３７℃で１０分間保温した。反応生成物中にはＴＡＴ、α−トロンビン及びＴＡＴ分解物が残存するので、これをＨｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（２×６cm）にアプライした。吸着したタンパク質を０．１−２ＭＮａＣｌを含む２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）で溶出し、ＴＡＴ画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した後、回収した。こうして得られた精製ＴＡＴは、モノクローナル抗体作成の免疫原及びスクリーニングに使用するのに充分な純度を有していた。なお、精製ＴＡＴは、自己分解を防ぐため、−８０℃で保存した。
精製したＴＡＴ濃度は、バイオ−ラッド社から市販されているブラッドフォード法に基づく比色定量法（プロテインアッセイ）により、ＢＳＡを標準品として定量した。その結果、ＴＡＴ濃度は３５μg ／mlであり、この値をＥＬＩＳＡ、ＬＴＩＡの測定に利用した。

（２）免疫：
上記方法により精製したＴＡＴについて、２８０nmの吸光度における１００mOD 量を１回の免疫に使用した。初回免疫はフロインドの完全アジュバントを用い、追加免疫ではフロインドの不完全アジュバントを使用した。ＴＡＴ１００μl とフロインドのアジュバント１００μl を混合し、得られたエマルジョン２００μl を１回の免疫につき、１匹のＢＡＬＢ／ｃ♂マウスの腹腔に注射を行い、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。
また、フロインドのアジュバントの他、フナコシより市販されているリビ−アジュバントシステムの変法により免疫を行った。この免疫エマルジョンの作成は次の操作により行った。すなわち、ポッターホモジナイザーを使用し、グラインダーチューブに精製ＴＡＴ１００mOD 量を加え、窒素を吹き付けて乾固させ、更に、クロロホルム：メタノール＝４：１の混合液に溶解しているトレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）及びモノリン酸リピッドＡ（ＭＰＬ）を加え、窒素を吹き付け乾固させた。本チューブにスクアレン４μl を加え、スリーワンモーターにセットしたテフロン（登録商標）棒にて抗原、アジュバント及びスクアレンを１２００rpm で３分間混合した。その後、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０及び０．７２％ＮａＣｌを含む１３mMリン酸緩衝液（pH７．２）を２００μl 加え、１２００rpm で４分間混合し、免疫エマルジョンを作成した。得られたエマルジョン２００μl を１回の免疫につき１匹のＢＡＬＢ／ｃ♂マウス腹腔に注射し、４回免疫を２週間間隔で繰り返した。なお、初回免疫ではＴＤＭ５０μg 及びＭＰＬ５０μg を、追加免疫ではＴＤＭを５０μg 及びＭＰＬ５μg を使用した。
これらの２方法により免疫したマウスの眼底静脈から採血し、抗体価をＥＬＩＳＡ法で測定し、抗体価の高いマウスを選んで細胞融合に使用した。

（３）細胞融合：
４回目の免疫から４週間後、生理食塩水２００μl に希釈した精製ＴＡＴ１００mOD 量をマウス腹腔に注射し、その３日後にマウスから脾臓を摘出した。摘出した脾臓をＲＰＭＩ１６４０培地中でピンセット及びスライドグラスの磨りの部分でよくほぐし、脾細胞を回収した。これを１５００rpm で５分間遠心して脾細胞を集め、更に同培地で洗浄、遠心した。最終的に１５％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含む同培地２mlを加え、脾細胞懸濁液を調製した。生きた脾細胞数は、アクリジンオレンジ／臭化エチジュウム溶液（各０．１mgをＰＢＳ１mlに溶解）と懸濁液を１：１で混ぜ、蛍光顕微鏡下で数えた。生きた脾細胞１０⁸個と予め培養しておいた対数増殖期のマウス骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）ＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４の１０⁷個を混合した後、１５００rpm で５分遠心した。上清を除去後、細胞をよく解きほぐした後、ＧＫＮ溶液（ＮａＣｌ：８ｇ，ＫＣｌ：０．４ｇ，グルコース：２ｇ，Ｎａ₂ＨＰＯ₄：１．４１ｇ，ＮａＨ₂ＰＯ₄・２Ｈ₂Ｏ：０．７８ｇを精製水１ｌに溶解）にて懸濁させ、１５００rpm で５分間遠心を行い、細胞の洗浄を行った。同洗浄を繰り返した後、５０％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール１５４０を含むＧＫＮ溶液０．５mlを徐々に加え、静かに１分間攪拌した。これに、ＧＫＮ溶液１０mlを徐々に静かに加えて反応を停止させ、１５００rpm で５分間遠心した。得られた細胞を、３０mlの１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０に浮遊させ、ＨＡＴ培地（１０^-4Ｍヒポキサンチン、４×１０^-7Ｍアミノプテリン、１．５×１０^-5Ｍチミジン及び１５％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地）及びフィーダー細胞が含まれる（１ウエル当り２００μl ）９６穴マイクロカルチャープレート３枚に１ウエル当り０．１mlづつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス培養器中で培養した。１０日後に全てのウエルで融合細胞の増殖を確認した。

（４）抗ＴＡＴ抗体産生ハイブリドーマの選択とクローン化：
培養上清中の抗ＴＡＴ抗体の存在の有無をＥＬＩＳＡ法で測定した。すなわち、精製ＴＡＴ（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）、α−トロンビン（２μg ／ml）、プロトロンビン（２μg ／ml）を固相化した９６穴マイクロプレート、更に、抗ＡＴIIIモノクローナル抗体（Ｆ（ａｂ'）２：５mOD ）を固相化した９６穴マイクロプレートにＴＡＴ（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）を結合させた９６穴マイクロプレート、すなわち６種類のプレートを使用してスクリーニングを行った。

具体的には、ＴＡＴ又はモノクローナル抗体の各濃度を、０．７２％ＮａＣｌを含む１３mMリン酸緩衝液（pH７．２：ＰＢＳ）で希釈し、５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。これを、１％牛血清アルブミン及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（pH７．２：ＢＳＡ−ＰＢＳ）で３回洗浄した。更に、各抗原を結合した９６穴マイクロプレートは、ＢＳＡ−ＰＢＳで各抗原を希釈し、５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置し、スクリーニング用の各プレートを調製した。各プレートの各ウエルに培養上清５０μl を加え、３７℃で１時間保温した。次いでＰＢＳで３回洗浄した後、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由来）を５０μl 加え、３７℃で１時間保温した。これをＰＢＳで５回洗浄した後、０．２％オルトフェニレンジアミン及び０．０２％過酸化水素水を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH５．０）を５０μl ／ウエル加え、室温で３０分反応させた後、４．５Ｍ硫酸を５０μl ／ウエル加えて反応を停止させた。この反応で、５５０nmにおける吸光度が高い結果を出した上清を得たウエルを選択した。
なお、固相化したモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡに用いたペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的，ヤギ由来）が反応しない様にペプシン処理によりＦ（ａｂ'）２とし、未反応のＩｇＧ画分を除くため、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ（陰イオン交換樹脂）にて精製した。

単クローン化は限界希釈法で行った。すなわち、フィーダー細胞としてＢＡＬＢ／ｃマウスの胸腺細胞を１ウエル当たり１０⁶個／０．２mlづつ分注した９６穴マイクロカルチャープレートに特異抗体陽性ウエル中のハイブリドーマを１０個／mlとなるように希釈したものを０．１mlづつ分注した。培地は、初回はＨＡＴ培地を、２回目はＨＴ培地を、３回目以降は１５％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０を用い、３７℃、５％炭酸ガス培養器中で１０日間培養した。
ＥＬＩＳＡ法による特異抗体陽性ウエルの選択及び限界希釈法による単クローン化操作を各３回繰り返した。スクリーニング２回目以降は、ＴＡＴ固相化プレートのみで行った。その結果、抗ＴＡＴモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ１７株を確立した。
得られた１７株のハイブリドーマは、それぞれ２６２０２、２６２０３、２６２０５、２６２０６、２６２０７、２６２０８、２６２０９、２６２１０、２６２１１、２６２１２、２６２１３、２６２１４、２６２１６、２６２１７、２６２１８、２６２１９、２６２２０と命名し、そのうち７株について、工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託した。当該株名と受託番号を表１に示す。

また、各モノクローナル抗体のクラス・サブクラスはＺｙｍｅｄ社のＭｏｎｏＡｂ−ＩＤＥＩＡｋｉｔを用いて決定し、表２に示した。

（５）モノクローナル抗体の分離及び精製：
前項の方法によって得られた抗ＴＡＴモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをマウス腹腔内で培養し、モノクローナル抗体を作らせた。
前処理として、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に０．５mlのブリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）を投与した。８日後、０．５mlのＲＰＭＩ１６４０培地に浮遊したハイブリドーマ４〜１５×１０⁵個をこのマウスの腹腔内に投与した。投与後９日目から腹水を繰り返し採取してプールした。集めた腹水は３０００rpm で１０分間遠心分離を行い、細胞等の不溶物を除去した。上清部分に等容の飽和硫酸アンモニウム溶液を攪拌しながら加え、一夜、４℃に放置して得られた沈澱を遠心分離によって回収した。沈澱を２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（pH８．０）に溶解、透析した。同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムに透析内容物を吸着させた後、同緩衝液中のＮａＣｌ０−０．３Ｍの直線濃度勾配で溶出させ、精製抗体を得た。

実施例２モノクローナル抗体の反応特異性
（１）ウエスタンブロッティング：
上記で得られた１７種類のモノクローナル抗体の反応特異性をウエスタンブロッティングにより確認した。すなわち、４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて１ウエル当り、α−トロンビン（１μg ）とＡＴIII （２．６μg ）の３７℃、５分間の反応物にα−トロンビン（１μg ）を添加した物をアプライした。また、ＦＸ（１μg ）にラッセルバイパーベノム（ＲＶＶ；２０ng）を加え、３７℃で５分間反応させた後、更に、ＡＴIII （２μg ）を加え、３７℃で５分間反応させた物に、ＦＸ、ＦＸａ（各０．５μg ）を添加した物をアプライした。これらサンプルを電気泳動後、２５mM Ｔｒｉｓ、１９２mM グリシン、２０％メタノールの転写緩衝液を用い、４０Ｖ／５cm、４時間の条件でニトロセルロース膜に転写した。ニトロセルロース膜は、ＢＳＡ−ＰＢＳにて４℃で一晩ブロッキング後、今回得た各モノクローナル抗体を反応させた。転写膜を短冊状に切り、短冊当り各ハイブリドーマの培養上清５００μl を室温で１時間反応させた後、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄し、ＢＳＡ−ＰＢＳで１０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体（Ｆｃ部位に特異的）５００μl を室温で１時間反応させた。更に、ＰＢＳＴで３回洗浄後、５０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．６）１００mlにジアミノベンチジン２５mg、過酸化水素２０μl を含む基質液を加え酵素反応を行った。バンドが確認でき次第、水洗にて反応停止を行った。その結果を表３に示す。
１７種類のモノクローナル抗体は、ＴＡＴ、α−トロンビン及びＦＸａ・ＡＴと反応するものの、他の物とは反応が認められなかった。このことから、２０種類のモノクローナル抗体はα−トロンビンとＡＴIII のネオ抗原に対するものであることが明らかとなった。

表３の結果から、Ｎｏ．２６２０２、２６２０３及び２６２０７はＴＡＴ及びα−トロンビンと反応し、他の抗原とは反応しなかったことから、これらはＴＡＴ及びα−トロンビンに対する抗体であることが明らかとなった。また他の抗体はＴＡＴ及びＦＸａ・ＡＴと反応し、他の抗原とは反応しなかったことから、これらはＴＡＴ及びＡＴIII のネオ抗原に対する抗体に対する抗体であることが明らかとなった。

（２）ＥＬＩＳＡ（固相化抗原）：
上記で得られた１７種類のモノクローナル抗体の反応特異性をＥＬＩＳＡにより確認した。すなわち、ＴＡＴ（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）、α−トロンビン（２μg ／ml）、プロトロンビン（２μg ／ml）、ＦＸａ（ＦＸとして０．５μg ／ml：ＦＸ１０μg にＲＶＶ０．２μg を加え、３７℃で１５分間反応させた物）、ＦＸａ・ＡＴ（ＦＸとして０．５μg ／ml：ＦＸａ５．５μg にＡＴIII ５μg を加え、３７℃で５分間反応させた物で、遊離のＡＴIII はほとんど含まない）の各濃度をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置し、ＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄したプレートを固相化抗原との反応特異性の試験に使用した。モノクローナル抗体を反応させる操作以降は、実施例１（４）のハイブリドーマの選択に従って行った。その結果を表４に示す。

（３）ＥＬＩＳＡ（抗体結合抗原）：
Ｆ（ａｂ'）２にした２種類の抗ＡＴIII モノクローナル抗体（５mOD ）をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。これをＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＡＴ（０．５mOD ）、ＡＴIII （２μg ／ml）をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注した。これを、４℃で一晩放置し、抗体に結合させた抗原プレートを作成し、抗体結合抗原との反応特異性の試験に使用した。モノクローナル抗体を反応させる操作以降は、実施例１（４）のハイブリドーマの選択に従って行った。その結果を表５に示す。

（４）ＥＬＩＳＡ（遊離の抗原）：
ＴＡＴ（０．２mOD ）をＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、４℃で一夜放置した。これをＢＳＡ−ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＡＴ（１００mOD ）、ＡＴIII （１００μg ／ml）、α−トロンビン（１００μg ／ml）又はプロトロンビン（１００μg ／ml）をＢＳＡ−ＰＢＳで希釈して５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注し、更に各モノクローナル抗体の培養上清を５０μl ／ウエルの割合で９６穴マイクロプレートに分注した後、３７℃で１時間反応させた。ペルオキシダーゼ標識抗体を反応させる操作以降は、実施例１（４）のハイブリドーマの選択に従って行った。その結果を表６に示す。

表４、５及び６より、本発明の１７種類のモノクローナル抗体は、前記の（１）、（２）及び（３）のグループに大別できることがわかる。

実施例３酵素免疫測定法
（１）ペルオキシダーゼ標識抗体調製：
抗体を標識する酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を用い、中根らの方法（Ｎａｋａｎｅｅｔａｌ．Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．２２：１０８４，１９７４）に従って標識した。すなわち、断片化していない１７種類のＩｇＧ分子各５OD相当を、０．２Ｍ炭酸緩衝液（pH９．５）で透析してＴｒｉｓを除き、コロジオンバッグで約５００μl にまで濃縮した。各抗体当たりＨＲＰ５mgを使用した。ＨＲＰ（東洋紡社製）５mgを１mlの精製水に溶かし、０．１ＭＮａＩＯ₄ ７５μl を加え、室温で２０分攪拌し、これを１mM酢酸緩衝液（pH４．０）に対して透析してpHを４程度に下げた。０．２Ｍ炭酸緩衝液（pH９．５）を１００μl 加えてpHを９付近にし、前記のＩｇＧ溶液と混合して室温で２時間攪拌し、ＩｇＧとＨＲＰの標識を行った。反応停止は４mg／ml ＮａＢＨ₄ １００μl を加えることで行い、ＰＢＳで透析した後、４℃で保存した。

（２）ＴＡＴの測定：
まず、抗体（ＩｇＧ）を４mOD となるようにＰＢＳで希釈し、９６穴マイクロプレートに１００μl ／ウエルづつ分注し、４℃にて一晩静置して固定化した。これを吸引除去後、ＢＳＡ−ＰＢＳを３００μl ／ウエル分注して室温で１時間放置した。ＢＳＡ−ＰＢＳを吸引除去後、精製ＴＡＴをＢＳＡ−ＰＢＳでそれぞれ０．３ng／ml〜６０ng／mlまで６段階希釈したものを各々１００μl ／ウエルづつ加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで３回洗浄後、上記で作成したＨＲＰ−標識モノクローナル抗体を８mOD の濃度にＢＳＡ−ＰＢＳで希釈後、１００μl ／ウエルづつ加え、室温で２時間反応させた。ＰＢＳで５回洗浄後、Ｈ₂Ｏ₂を基質にオルトフェニレンジアミンを発色剤として酵素反応を行い、４９２／６９０nmの吸光度で活性を測定した。なお、基質溶液は実施例１（４）のハイブリドーマの選択に従って調製した。酵素免疫測定法において、ＴＡＴ（１０ng／ml）、ＡＴIII （３００μg ／ml）及びプロトロンビン（１７０μg ／ml）を測定した時のそれぞれの吸光度を表７に示した。

実施例４ラテックス免疫比濁法
（１）モノクローナル抗体感作ラテックスの調製：
５mM ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１５０mM ＮａＣｌを含む５０mM グリシン緩衝液（pH９．６）で各抗体を１ OD（２８０nmにおける吸光度）の濃度に希釈した溶液と、同緩衝液で１％の濃度に希釈したラテックス（φ０．１２μm ）を各１容量混合し、４℃、３時間ウエイブローターで混和した。本混合液（２容量）と等容量の０．５％牛血清アルブミンを含む同緩衝液を加え、４℃、２時間ウエイブローターで混和した。２５０００×ｇ、１時間の遠心にてラテックスを回収し、上清を吸引除去し、沈渣に０．１％牛血清アルブミン及び０．００５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む同緩衝液を２容量加え、４℃、１７時間程度ウエイブローターで混和した。更に、２５０００×ｇ、１時間の遠心にてラテックスを回収し、上清を吸引除去し、沈渣に０．１％牛血清アルブミン及び１０％グリセロールを含む同緩衝液を２容量加え、４℃、一晩ウエイブローターで混和・懸濁した。本懸濁液を抗体感作ラテックスとして測定に使用した。

（２）ＴＡＴの測定：
１％牛血清アルブミン、５mM ＥＤＴＡ・２Ｎａ及び１５０mM ＮａＣｌを含む１００mMリン酸緩衝液（pH７．２）３００μl と、上記抗体感作ラテックス２種類、各５０μl づつを混合した。これに、１％ＢＳＡを含む１００mMリン酸緩衝液（pH７．２）で所定の濃度に希釈したＴＡＴ溶液１００μl を加えて混合し、５分後に波長６００nmの吸光度を測定した。試薬ブランクはサンプルの代わりにＴＡＴを含まない同リン酸緩衝液を用いた。本ラテックス免疫比濁法において、ＴＡＴ（１μg ／ml）、ＡＴIII （３００μg ／ml）及びプロトロンビン（１７０μg ／ml）を測定した時の吸光度を表８に示した。

Claims

遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず；遊離及び固相化したトロンビン・アンチトロンビンIII複合体と反応し；セリンプロテアーゼと反応したアンチトロンビンIII、固相化したアンチトロンビンIII、及び抗アンチトロンビンIIIモノクローナル抗体が反応したアンチトロンビンIIIに共通して生じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応する抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体。
遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず；固相化したトロンビン・アンチトロンビンIII複合体との反応性が、遊離のトロンビン・アンチトロンビンIII複合体との反応性より強い抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体。
遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず；セリンプロテアーゼと反応したアンチトロンビンIIIに生じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応する抗トロンビン・アンチトロンビンIII複合体モノクローナル抗体。
トロンビン・アンチトロンビンIII複合体で免疫した哺乳動物の抗体産生細胞と、哺乳動物の骨髄腫細胞とを融合させて得られた、請求項１〜３のいずれかの項記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
請求項１及び２記載のモノクローナル抗体並びに遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず、トロンビン、セリンプロテアーゼと反応したアンチトロンビンIIIに生じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応するモノクローナル抗体から選ばれるモノクローナル抗体の２種以上を組合わせ、被検体と接触させて免疫測定を行うことを特徴とするトロンビン・アンチトロンビンIII複合体の測定法。
請求項１及び２記載のモノクローナル抗体並びに遊離のアンチトロンビンIIIとは反応せず、セリンプロテアーゼと反応したアンチトロンビンIIIに生じるアンチトロンビンIIIのネオ抗原と反応するモノクローナル抗体から選ばれるモノクローナル抗体の１種以上とを組合わせ、被検体と接触させて免疫測定を行うことを特徴とするトロンビン・アンチトロンビンIII複合体の測定法。