JP2004026805A - 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ５ｂに特異的なモノクローナル抗体およびその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ｂを特異的に測定するために有用なモノクローナル抗体を提供することを目的とする。
【解決手段】ヒト破骨細胞から精製される酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ｂ（ＴＲＡＣＰ　５ｂ）を抗原として細胞融合により、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性が、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ａ（ＴＲＡＣＰ　５ａ）に対する反応性よりも高く、ＴＲＡＣＰ５ｂに対してより高い特異性を有するＴＲＡＣＰ　５ｂに対するモノクローナル抗体が得られる。このモノクローナル抗体を用いることにより、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを高感度に且つ特異的に検出することができる。
【選択図】　　　なし

Description

【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ｂ（ＴＲＡＣＰ　５ｂ：別名、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）に特異的なモノクローナル抗体、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたＴＲＡＣＰ　５ｂの検出方法、並びにこれに用いるキットに関する。
本発明のモノクローナル抗体によれば、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ｂの活性を特異的に測定することが可能であり、骨吸収のマーカーとして骨疾患の医学的治療や臨床検査の分野において極めて有効である。
【０００２】
【従来の技術】
血清中の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ：Ｔａｒｔｒａｔｅ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｃｉｄＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ＥＣ３．１．３．２）はその大部分が破骨細胞由来の酸性ホスファターゼとされ、その測定は、破骨細胞の機能を評価する指標として有用とされており、骨吸収マーカーとして興味が持たれている（非特許文献１）。一方、血清中の酸性ホスファターゼは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、原点より０〜５の６つのバンドに分けられ、その中で５番目が酒石酸抵抗性であることから、Ｂａｎｄ　５酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ　５）と呼ばれている。これはさらに電気泳動により糖鎖へのシアル酸結合の多い５ａと、ほとんどシアル酸結合のない５ｂに分けられる。そして、５ａは血小板やその他からの酵素であって血中値が変動しないのに対して、５ｂのみが骨吸収に伴い変動するため、５ｂが破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの本体であると考えられている（特許文献１）。
なお、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ誌（非特許文献２）でも破骨細胞由来のＡＣＰを、ＴＲＡＣＰ　５ｂと略記することを勧めている。よって本明細書においても破骨細胞由来で骨吸収の指標となるＡＣＰを意味するものはＴＲＡＣＰ　５ｂとして、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼと酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ｂを同義としてＴＲＡＣＰ　５ｂと表記する。
【０００３】
破骨細胞の活性を表す酸性ホスファターゼの指標としてＴＲＡＣＰ活性を求める従来の活性測定法は、特異性、感度、測定の煩雑さおよび測定時間の点で問題を有している。
一般的に活性測定法によるＴＲＡＣＰ　５ｂの測定は、酒石酸の存在下で合成基質としてリン酸エステルを用いて酵素反応により生ずる反応生成物（アルコールやフェノール類）を比色定量することにより酵素活性を求めている。その際、酒石酸が前立腺由来酸性ホスファターゼを阻害し、残存した酸性ホスファターゼ活性を基質で測定することにより、ＴＲＡＣＰ活性をＴＲＡＣＰ　５ｂ活性とみなして求めている。しかしながら、検体中に存在する破骨細胞由来以外の赤血球由来や血小板由来の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼも測定してしまうため、特異性の点で問題を有する。上記方法の改善法としては、血清を５倍に希釈した液を３７℃で１時間インキュベートする前処理をした後、残りのＴＲＡＣＰ活性を、酒石酸存在下、基質としてｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を用いて測定する方法が知られている（非特許文献３、非特許文献４）。この方法は赤血球由来酸性ホスファターゼの影響は回避できるが、血小板由来酸性ホスファターゼの影響は除くことは出来ない。さらにより特異的な活性測定法として、本発明者らは、ＴＲＡＣＰ　５ｂと赤血球や血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性がフッ素に対する感受性に差のあることを利用したＴＲＡＣＰ　５ｂ測定法を報告した（特許文献２）。しかしながら、赤血球及び血小板由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼの影響はないものの、ＴＲＡＣＰ　５ａの影響を除くことができず、またＴＲＡＣＰ　５ｂ活性を総酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性からフッ素存在下で阻害されなかった活性を差し引きすることにより求めており、精度の点でさらなる改良が求められている。さらに上記フッ素を利用した方法にＴＲＡＣＰ　５ａの阻害物質を組み合わせて用いることにより、より特異的にＴＲＡＣＰ　５ｂ活性を測定する方法が報告されている（特許文献３）。しかしながら、フッ素のみを用いる方法はより特異的ではあるものの、やはり差し引きで破骨細胞由来ＴＲＡＣＰ　５ｂ活性を求めているため同様に、精度の点で問題を残している。
【０００４】
一方、免疫学的測定法によるＴＲＡＣＰ　５ｂの測定方法として、ポリクローナル抗体やモノクローナル抗体を用いた免疫測定法も知られている（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０）。これらの方法は、ＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂの両者を測定してしまうため、ＴＲＡＣＰ　５ａの影響を無視できない。さらに、ＴＲＡＣＰ　５ｂをより特異的に測定する免疫学的測定法が報告されている（特許文献４、特許文献５）。この方法はよりＴＲＡＣＰ　５ｂ活性に特異的であるが、測定に用いる抗体がＴＲＡＣＰ　５ｂに特異的ではなく、ＴＲＡＣＰ　５ａとも反応するため、ＴＲＡＣＰ　５ａとＴＲＡＣＰ　５ｂの至適ｐＨの差を利用して活性測定で測定値を算出している。そのため、末期腎疾患などのＴＲＡＣＰ　５ａが亢進している患者検体での影響が懸念され、また、健常者検体と骨吸収が亢進している患者検体での差が小さく、骨吸収マーカーとして感度は十分とは言えない（非特許文献１１）。
【０００５】
【特許文献１】
特表２００２−５１００５０号公報
【特許文献２】
特開平１０−３７１９８号公報
【特許文献３】
特開２００１−２３１５９５号公報
【特許文献４】
ＷＯ９９／５０６６２号公報
【特許文献５】
特表２００２−５１００５０号公報
【非特許文献１】
骨代謝マーカー，福永仁夫，中村利孝，松本俊夫編，メディカルレビ
ュー社，１９９５
【非特許文献２】
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７：１４９７．２００１
【非特許文献３】
日大医誌．４９：９０４−９１１．１９９０
【非特許文献４】
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：４５８−４６２．１９８７
【非特許文献５】
Ｊ　Ｃｌｉｎ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ　Ｍｅｔａｂ．７１：４４２−４５１．１９９０
【非特許文献６】
Ｊ　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ．１３：６８３−６８７．１９９８
【非特許文献７】
Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｌｅｔｔ．７０：１４３−１４９．１９９９
【非特許文献８】
Ｊ　Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ　Ｒｅｓ．１４：４６４−４６９．１９９９
【非特許文献９】
Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ．４５：２１５０−２１５７．１９９９
【非特許文献１０】
Ｃｌｉｎ　Ｃｈｅｍ．４６：１７５１−１７５４．２０００
【非特許文献１１】
Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｉｍ．　Ａｃｔａ　３０１：１４７−１５８，　２０００
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
かかる問題に鑑み、本発明は、骨吸収マーカーである破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＣＰ　５ｂ）に対して特異的なモノクローナル抗体、それを産生するハイブリドーマ、該モノクローナル抗体を用いたＴＲＡＣＰ　５ｂの検出方法およびそれに使用するキットを提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ｂ（ＴＲＡＣＰ　５ｂ：別名、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）に対する反応性が、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ａ（ＴＲＡＣＰ　５ａ）に対する反応性よりも高く、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対してより高い特異性を有するＴＲＡＣＰ　５ｂに対するモノクローナル抗体に関する。
更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマに関する。
更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を用いて検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを検出するＴＲＡＣＰ　５ｂの検出方法に関する。
更に本発明は、上記のモノクローナル抗体を構成成分として含む、ＴＲＡＣＰ　５ｂの検出に用いるためのキットに関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明のモノクローナル抗体は、ヒト破骨細胞から精製されたＴＲＡＣＰ　５ｂを免疫原として使用することにより得ることができる。本明細書の以後に記載する実施例では正常破骨細胞から精製されたＴＲＡＣＰ　５ｂを抗原として用いて免疫を行ったが、これに限らず破骨細胞腫瘍などのＴＲＡＣＰ　５ｂも抗原として用いることができる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば精製ヒトＴＲＡＣＰ　５ｂを免疫原として動物を免疫し、その動物が産生する抗ヒトＴＲＡＣＰ　５ｂ抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞とを融合させることによって得られるハイブリドーマによって産生される。
【０００９】
上記ハイブリドーマは以下の方法によって得ることができる。即ち、上述のようにして得たヒトＴＲＡＣＰ　５ｂを、フロイントの完全、不完全アジュバント、水酸化アルミニウムアジュバント、百日咳アジュバント等の既に公知のものを用いて共に混和し、感作用アジュバント液を作製して数回に分けてマウス、ラット等の動物に１〜３週間おきに腹腔内皮下、または尾静脈投与することによって免疫する。感作抗原量は１μｇ〜１００ｍｇの間とされているが、一般的には５０μｇ程度が好ましい。免疫回数は２〜７回が一般的であるがさまざまな方法が知られている。次いで脾臓等に由来する抗体産生細胞と骨髄腫瘍細胞（ミエローマ細胞）等の試験管内で増殖能力を有する細胞とを融合する。抗体産生細胞はマウス、ヌードマウス、ラットなどの脾臓等より得ることができる。
上記融合法としては、既にそれ自体公知であるケーラーとミルスタインの定法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いることで融合できる。センダイウィルス、電気融合法によっても融合を行うことができる。
【００１０】
上記融合した細胞からヒトＴＲＡＣＰ　５ｂを認識する抗体を産生するハイブリドーマを選択する方法としては以下のようにして行うことができる。即ち、上記融合した細胞から限界希釈法によってＨＡＴ培地およびＨＴ培地で生存している細胞により作られるコロニーからハイブリドーマを選択する。９６穴ウェルなどにまかれた融合細胞からできたコロニー培養上清中にヒトＴＲＡＣＰ　５ｂに対する抗体が含まれている場合には、ヒトＴＲＡＣＰ　５ｂをプレート上に固定化したアッセイプレート上に上清をのせ、反応後に抗マウスイムノグロブリン−ＨＲＰ標識抗体等の２次標識抗体を反応させるＥＬＩＳＡ法により、ヒトＴＲＡＣＰ　５ｂに対するモノクローナル抗体産生クローンを選択できる。標識抗体の標識物質にはＨＲＰの他、アルカリ性ホスファターゼなどの酵素、蛍光物質、放射性物質等を用いることができる。またコントロールとしてブロッキング剤であるＢＳＡのみを結合したアッセイプレートによるＥＬＩＳＡを同時に行うことでヒトＴＲＡＣＰ　５ｂ特異的抗体のスクリーニングができる。つまりヒトＴＲＡＣＰ　５ｂプレートで陽性であり、ＢＳＡによるＥＬＩＳＡで陰性のクローンを選択できる。
【００１１】
本発明のハイブリドーマとしては、ヒトＴＲＡＣＰ　５ｂを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマのうち、特にヒトＴＲＡＣＰ　５ｂと反応し、かつ赤血球、血小板、好中球、前立腺由来の酸性ホスファターゼと交差反応しないモノクローナル抗体を産生するものが望ましい。たとえば本発明者が樹立したハイブリドーマＴｒｋ６２が挙げられる。
特に本発明のモノクローナル抗体としては、臨床検査に用いた時その検査結果が骨吸収をより明確に反映するために、ヒトＴＲＡＣＰ　５ａよりもヒトＴＲＡＣＰ　５ｂに親和性が高いモノクローナル抗体が好ましく、特にヒトＴＲＡＣＰ　５ａよりもヒトＴＲＡＣＰ　５ｂに対して検出系中で２倍以上の反応性を示すものが望ましい。このようなハイブリドーマとしては例えば本発明者が確立したハイブリドーマＴｒｋ６２が挙げられる。ハイブリドーマＴｒｋ６２は、平成１４年２月１４日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ　ＢＰ−７８９０が付与されている。
【００１２】
上記ハイブリドーマは通常細胞培養に用いられる培地、例えばα−ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＳＦ、Ｓ−ｃｌｏｎｅなどで培養し、その培養上清よりモノクローナル抗体を回収することができる。またハイブリドーマが由来する動物、ヌードマウスをあらかじめプリスタン処理しておき、その動物に細胞を腹腔内注射することによって腹水を貯留させ、その腹水からモノクローナル抗体を回収することもできる。
上記の上清、腹水よりモノクローナル抗体を回収する方法としては、通常の方法を用いることができる。たとえば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどによる塩析法やクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡ、プロテインＧなどによるアフィニティクロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００１３】
かくして得られる本発明のモノクローナル抗体は、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性が、ＴＲＡＣＰ　５ａに対する反応性よりも高く、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対してより高い特異性を有するものである。具体的には、本発明のモノクローナル抗体は、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａに対する反応性の２倍以上であり、より具体的には、等量の活性を示すＴＲＡＣＰ　５ａおよび５ｂをそれぞれ反応させた時、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａに対する反応性の２倍以上であるものが好ましい。更に具体的には、以後の実施例１の（８）の特異性検定の項で明らかにされているように、酒石酸もしくは酒石酸塩の存在下でパラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質として用いてｐＨ５．７（ＴＲＡＣＰ　５ａとＴＲＡＣＰ　５ｂが等しい酵素活性を示すｐＨ）で反応させた時に１０Ｕ／Ｌの酵素活性を示すＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂのそれぞれを、プレートに固定した本発明のモノクローナル抗体と反応させ、次いで該抗体に結合したそれぞれのＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素活性を、酒石酸もしくは酒石酸塩の存在下で上記基質ｐＮＰＰを用いてｐＨ６．１（ＴＲＡＣＰ　５ｂの至適ｐＨ）で測定した時に、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａの反応性の２倍以上、より具体的には３倍以上である、モノクローナル抗体が特に好ましい。
更に本発明のモノクローナル抗体は、同様に実施例１の（８）の特異性検定の項で明らかにされているように、赤血球、血小板、好中球および前立腺由来の酸性ホスファターゼに対しては実質的に交差反応性を示さないものである。また、実施例１の（７）のウエスタン・ブロッティングの項および実施例４で明らかにされているように、本発明のモノクローナル抗体は、ＴＲＡＣＰ　５ｂのネイティブな酵素としての立体構造を認識するものである。
【００１４】
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法によって検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを高感度で且つ特異的に検出することができる。対象となる検体としては、血液、血清、血漿、骨などの組織等が挙げられる。
本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫測定法による検出方法としては、ＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素活性の測定を利用した免疫測定法、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法、組織免疫染色法等が挙げられる。
【００１５】
ＴＲＡＣＰ５ｂの酵素活性の測定を利用した免疫測定法としては、例えば、検体、例えば血清中のＴＲＡＣＰ　５ｂを、本発明のモノクローナル抗体に結合させ、結合したＴＲＡＣＰ　５ｂに対して、ＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素基質、例えばＰ‐ニトロフェニルリン酸またはその塩を酵素反応させて、その酵素活性を測定することにより検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを免疫測定できる方法が挙げられる。その方法においては、具体的には、ＴＲＡＣＰ　５ｂを以下のようにして測定できる。まず、固相支持体に吸着している本発明のモノクローナル抗体に、測定すべき検体を加え、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂと抗体とを抗原抗体反応させてＴＲＡＣＰ　５ｂを抗体に結合させる。次いで、その固相支持体を洗浄液で洗浄して、抗体に吸着しなかった検体由来の成分を除去した後、反応系にＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素基質、例えばｐ−ニトロフェニルリン酸またはその塩を加え、抗体に結合しているＴＲＡＣＰ　５ｂと基質とを反応させる。反応停止液で酵素反応を停止した後、反応により生成したフェノール類、例えば、ｐ−ニトロフェノールを、通常３９０ｎｍ〜４５０ｎｍ、好ましくは４００〜４３０ｎｍの波長で吸光度を測定する。その吸光度の大きさは、ＴＲＡＣＰ　５ｂ酵素活性を反映するので、その値から、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを測定できる。
本発明では、上記した測定法から明らかな通り、抗体は固相支持体に結合させて用いるのが好ましく、固相支持体としては、通常、ＥＬＩＳＡ法等の固相免疫測定法に用いる固相支持体が用いられるが、特に限定されない。例えば、固相支持体の材料として、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネイト、ポリエチレン、ナイロン、メタアクリレートなどが挙げられる。固相支持体の形状としては、プレート、ビーズ等が挙げられる。
固相支持体に吸着している抗体を調製するには、直接または間接的に物理結合や化学結合、アフィニティーを利用して固相支持体にＴＲＡＣＰ　５ｂに対する抗体を結合させる。感作抗体量は、１ｎｇ〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲であることが多い。
【００１６】
本発明の測定方法を実施するときは、ＴＲＡＣＰ　５ｂを免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体、およびｉｉｉ）ＴＲＡＣＰ　５ｂ酵素基質を含むキットを用いて行える。
このキットにおいては、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体に関しては、固相支持体と抗体溶液とを別々に作製しておき、ＴＲＡＣＰ　５ｂを測定する際、抗体を固相支持体に吸着させてもよく、あらかじめ、抗体を固相支持体に吸着させた状態で提供してもよい。このキットにおいては、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。
本発明において、このキットを使用するときは、酵素反応停止液を含むことが好ましい。酵素停止液としては、例えば、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム溶液等のアルカリ水溶液を使用できる。
さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００１７】
本発明においては、本発明のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法により、ＴＲＡＣＰ　５ｂを測定することもできる。この場合、モノクローナル抗体として、本発明抗体以外に、他のＴＲＡＣＰ　５ｂに対する別な抗体も用いて実施することができる。サンドイッチアッセイによるＴＲＡＣＰ　５ｂを測定する方法の具体例は、以下の通りである。まず、一次抗体として本発明抗体を、固相支持体、例えば、プレートに吸着させ、検体、例えば、血清中のＴＲＡＣＰ　５ｂと反応させ、固相支持体を洗浄し、次いで、吸着したＴＲＡＣＰ　５ｂと、ビオチン化した２次抗体、例えばビオチン化した別なＴＲＡＣＰ　５ｂに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体とを反応させ、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンと反応させた後、ペルオキシダーゼ酵素反応、次いで、発色反応を行うことにより、ＴＲＡＣＰ　５ｂを検出することができる。また、２次抗体を直接ペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファターゼ等により酵素標識したものを用いることにより、同様の測定をすることができる。また、２次標識抗体に結合させる物質は測定方法によって酵素に限られるものではなく、放射線同位元素、蛍光物質、磁性物質、コロイドなどでもよい。
【００１８】
本発明において、本発明抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡを行うときは、サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ用のキットを用いて実施することができる。
サンドイッチアッセイＥＬＩＳＡ法で本発明の測定方法を実施するときは、例えば、ＴＲＡＣＰ　５ｂを免疫測定するためのキットであって、ｉ）固相支持体、ｉｉ）本発明抗体、ｉｉｉ）標識された、別なＴＲＡＣＰ　５ｂに対する抗体、及びｉｖ）標識を検出するための成分を含むキットを用いることによっても、ＴＲＡＣＰ　５ｂを測定することができる。
標識を検出するための成分とは、抗体が標識されたものを測定するための成分で、標識がビオチンの場合、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン、テトラメチルベンジジンのペルオキシダーゼ酵素基質、及び過酸化水素を含む試薬であり、標識がアルカリホスファターゼの場合、ｐ−ニトロフェニルリン酸を含む試薬である。このキットには、必要に応じ、洗浄液を含んでいてもよい。
本発明において、このキットを使用するときは、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを抗体に結合させた後、固相支持体に吸着しなかった成分を除去するために、洗浄液を含むことが好ましい。洗浄液としては、例えば、界面活性剤を含むトリス緩衝液を使用することができる。さらに、本発明のキットには、必要に応じ、検体希釈液を加えて含むこともできる。検体希釈液としては、例えば、トリス等の緩衝液を使用できる。その緩衝液には、必要に応じて、ＥＤＴＡ・２Ｎａ等のキレート剤、食塩等の無機塩を加えてもよい。
【００１９】
更に本発明においては、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂの存在を、本発明のモノクローナル抗体を利用した組織免疫染色法によって検出することもできる。即ち、例えば、ヒトの破骨細胞組織などから通常の方法により、例えば凍結切片を調製し、これに本発明のモノクローナル抗体を反応させ、次いで例えば、ペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した二次抗体と反応させ、次いで発色させることにより、ＴＲＡＣＰ　５ｂの存在を特異的に検出することができる。
このような、組織免疫染色法による検出は、ｉ）本発明のモノクローナル抗体、ｉｉ）標識された二次抗体およびｉｉｉ）発色試薬を構成成分として含むキットを用いて実施できる。標識された二次抗体としては、例えばペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼなどの酵素で標識した、動物由来の抗ＩｇＧ抗血清、抗ＩｇＧポリクローナル抗体などが挙げられ、発色試薬としては、標識に用いた酵素を発色するための通常用いられる発色基質などの試薬が用いられる。
【００２０】
【実施例】
以下に好ましい実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例等により何ら限定されるものではない。
実施例１
破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ ＴＲＡＣＰ　５ｂ ）に対して特異性の高いモノクローナル抗体の作成およびその特性
（１）ＴＲＡＣＰ　５ｂ の精製
インフォームド・コンセントを行った後、外科的手術により摘出されたヒト大腿骨骨頭部１３０ｇを液体窒素中で凍結させ、ハンマーで粉砕後、プロテアーゼインヒビター等を含む緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，　０．３Ｍ　ＫＣｌ　ｐＨ７．５）２００ｍＬ中に懸濁させ、超音波ホモジナイザーにてホモジナイズした。４℃一晩攪拌後、１０，０００ｒｐｍ、２０分遠心分離し、その上清を１０ｍＭ　トリス緩衝液　ｐＨ８．２に透析後ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム［シグマ社］に付し、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記トリス緩衝液の直線濃度勾配で溶出した。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性は、基質ｐＮＰＰを用い測定し、活性の高いフラクションをプールした。それを濃縮後、０．７Ｍ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　トリス緩衝液　ｐＨ７．２に透析し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラム　［アマシャムファルマシア社］に付し、同様に溶出したフラクションの酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ活性を測定し、活性フラクションをプールした。それをＨｉＴｒａｐ　Ｈｅｐａｒｉｎ　ＨＰカラム［アマシャムファルマシア社］に付し、吸着したタンパク質をＮａＣｌを含む上記２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７．４の直線塩濃度勾配により溶出した。酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ高活性フラクションをプールし、濃縮することにより、精製ＴＲＡＣＰ　５ｂを０．４ｍｇ得た。なお、タンパク量はＡ_２８０により確認し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ［ＴＩＦＣＯ社］を行い銀染色の結果、分子量３５，０００付近でシングルバンドであることによりＴＲＡＣＰ　５ｂであることを確認した（図１）。単一バンドになった酵素は精製ＴＲＡＣＰ　５ｂとして免疫抗原とした。
【００２１】
（２）精製ヒト ＴＲＡＣＰ　５ｂ によるマウスの免疫
精製ヒトＴＲＡＣＰ　５ｂを２５０μｇ／ｍｌとなるように５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で希釈し、２５μｇ（１００μｌ）をとってフロインド完全アジュバンド［和光純薬工業社］１００μｌと乳化するまでよく混和した。調製した懸濁液をＢａｌｂ／ｃ　６週齢　雌マウス［日本クレアー社］にジエチルエーテル麻酔下にて腹腔内投与した。２週間後には同量のＴＲＡＣＰ　５ｂ（２５μｇ／ｍｌ）をフロインド不完全アジュバンド［和光純薬工業社］と混和してフロインド完全アジュバンドの時と全く同様の操作により乳化懸濁液とし、それぞれマウスに感作した。以降２週間後に同様の操作を行い、４回目には最終免疫としてＴＲＡＣＰ　５ｂは２５μｇ／ｍｌを５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で調製しマウス尾静脈注射により投与した。
【００２２】
（３）ハイブリドーマの確立
最終免疫より３日後にＴＲＡＣＰ　５ｂにより感作済みのマウスよりジエチルエーテル麻酔下に外科的摘出された脾臓を無菌的に分散し脾臓細胞を調製した。融合はケーラーとミルスタインの方法（Ｎａｔｕｒｅ．２５６，４９５．１９７５）に従って行われ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４０００）［メルク社］を用いて脾細胞と骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）を融合した。ＴＲＡＣＰ　５ｂ融合時の融合比率は脾臓細胞数８×１０^７個に対して骨髄腫細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）２×１０^７個で、約４：１であった。融合細胞は１０％ＦＣＳ　［ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社］　α−ＭＥＭ　［ＩＲＶＩＮＥ社］　ＨＡＴ［コスモバイオ社］培地に分散し９６穴マイクロタイターカルチャープレート［住友ベークライト社］に分注して３７℃、５％ＣＯ_２条件にて培養した。
【００２３】
（４）コロニーのスクリーニング
約２週間後にコロニーの生育を確認してスクリーニングを実施した。実施したスクリーニング方法を以下に述べる。
スクリーニング用プレートを作製するために上記（１）にて精製したＴＲＡＣＰ　５ｂを５０ｍＭクエン酸緩衝液中に溶解し、０．５μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌとなるように９６穴マイクロタイタープレート［Ｎｕｎｃ社］に分注した。プレートを４℃で２晩静置した後に０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０［和光純薬社］を含むトリス緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ［ＳＩＧＭＡ社］溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。完成したプレートを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に、上記（３）で得られたハイブリドーマの培養上清１００μｌを反応させ、更に洗浄を行った後に２次抗体であるＨＲＰ標識抗マウスイムノグロブリン抗体［Ｚｙｍｅｄ社］を加えて反応させた。洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）［ナカライ社］クエン酸発色溶液を１００μｌ加えて一定時間の発色後、１Ｎ硫酸［和光純薬社］を停止液として更に１００μｌ添加し、測定波長４９２ｎｍにて吸光度を測定した。上記のようにして陽性になったクローンは限界希釈法によって再クローニングされ上清を再度チエックした。
【００２４】
（５）抗体の確認
ＥＬＩＳＡによって精製ＴＲＡＣＰ　５ｂとの反応性を確認すると、精製ＴＲＡＣＰ　５ｂのプレートと反応するクローンＴｒｋ６２およびＴｒｋ４９が得られた。クローンＴｒｋ６２が産生するモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２は精製ＴＲＡＣＰ　５ｂと強い反応性を示していた。一方、モノクローナル抗体Ｔｒｋ４９は、反応性が弱かった。本発明のモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２はコントロールのＢＳＡプレートとは全く反応しなかった。上記の抗体をモノクローナル抗体タイピングキット［アマシャムファルマシア社］にて検定した結果、モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２およびＴｒｋ４９は、以下のような特性を有していた。
クラス　　サブクラス　　　軽鎖
ＩｇＧ 　　　　　 ＩｇＧ１ 　　　　 　 κ 　
【００２５】
（６）モノクローナル抗体の作製及び精製
上記（４）で得られたハイブリドーマＴｒｋ６２　１×１０^７細胞個を、プリスタン［アルドリッチ社］０．５ｍｌ投与後２週間のＢａｌｂ／ｃマウス［日本クレアー社］（１０週齢、雌性）に腹腔内投与し、約２週間後にマウス腹腔内に貯留した腹水をジエチルエーテル麻酔下にて外科的に採取した。上記（４）のコロニーのスクリーニングで行ったと同様のＥＬＩＳＡ法により、腹水をサンプルとして段階希釈して確認すると高濃度のモノクローナル抗体が含まれていた。この腹水を硫安４０％で処理し、ＰＢＳに透析した後、プロテインＧカラム［アマシャムファルマシア社］により精製してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。するとモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２は非還元では分子量約１５０，０００に単一の、メルカプトエタノール還元では分子量約５０，０００のバンドと２５，０００の２本のバンドが確認された。精製されたモノクローナル抗体はマウス１匹あたり約１５ｍｇであって工業的利用を行うには十分量であった。同様にして、モノクローナル抗体Ｔｒｋ４９も、ハイブリドーマＴｒｋ４９から得た。ハイブリドーマＴｒｋ４９は、平成１４年１１月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所　特許生物寄託センターに寄託され、受託番号としてＦＥＲＭ　ＢＰ−８２４９が付与されている。
【００２６】
（７）ウエスタン・ブロッティング
ウエスタン・ブロッティングの結果等からモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２は、ＳＤＳ処理のＴＲＡＣＰ　５は認識せず、ネイティブなＴＲＡＣＰ　５を認識することが分かった。以下に詳述する。
ウエスタン・ブロッティング用サンプルとして既に公知の方法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２４：７，１１０５−１１０８．１９７８）によりインフォームド・コンセプトを行なったヒトさい帯血よりＴＲＡＣＰを精製した。このときヒトＴＲＡＣＰ　はＴＲＡＣＰ　５ａ及びＴＲＡＣＰ　５ｂの２種類に分けられた。ＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂはディスク電気泳動法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２４：２，３０９−３１２．１９７８）（図２）およびフッ素阻害による活性測定法（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：４，４６９−４７３．２０００）により確認した。また別に昆虫細胞を利用したヒト組換えＴＲＡＣＰ（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰ）を既に公知となっているハイマンらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１２９４−１３００．１９９４）を参考として作製し、精製した後に抗原の一種とした（図３に示したフラクション２６、２７および２８を合わせたものを用いた）。上記３種の酵素蛋白質（ヒトＴＲＡＣＰ　５ａ、ＴＲＡＣＰ　５ｂ、　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣ）を各２μｇにあわせて非還元条件下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ウエスタン・ブロッティング法により反応性を確認したところ、Ｔｒｋ６２はヒトＴＲＡＣＰ　５ａ、ＴＲＡＣＰ　５ｂ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰの全てに反応しなかった。しかしポジティブコントロールとして実験した抗ＴＲＡＣＰモノクローナル抗体９Ｃ５［Ｚｙｍｅｄ社］（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６：１７５−１８２，１９９７；ＢｉｏＴｅｃ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ，７３：３１６−３２４，１９９８）は３３ｋＤａヒトＴＲＡＣＰ　５ａ、ＴＲＡＣＰ　５ｂ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰ及び３種全てにみられた１６ｋＤａのスモールフラグメントと反応していた（図４）。抗ＴＲＡＣＰモノクローナル抗体９Ｃ５は加熱変性処理などを行った変性１６ｋＤａスモールフラグメントと反応することが既に知られている（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１６：１７５−１８２，１９９７；ＢｉｏＴｅｃ　Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ，７３：３１６−３２４，１９９８）。
この結果はヒトＴＲＡＣＰ　５ａ、ＴＲＡＣＰ　５ｂ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰが界面活性剤ＳＤＳによって立体構造を変化させ、本発明のモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２はＴＲＡＣＰ　５ａ、ＴＲＡＣＰ　５ｂ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰの立体構造を認識するモノクローナル抗体であるため反応性を失ったことを示しており、モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２がＴＲＡＣＰのＮａｔｉｖｅな構造を認識していることを示している。
【００２７】
（８）特異性検定
モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２の特異性を以下の通り検討した。測定方法は次の（ｉ）から（ｖ）のステップからなる。
（ｉ）上記（４）のコロニーのスクリーニングで使用したマイクロタイタープレート［Ｎｕｎｃ社］に１μｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌになるように抗マウスイムノグロブリン［ダコ社］を分注し、プレートを４℃で２晩静置した。その後０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス［ＳＩＧＭＡ社］緩衝液で３回洗浄し、非特異的反応を抑えるために１．５％ＢＳＡ［ＳＩＧＭＡ社］溶液を２００μｌ分注して、更に４℃で１晩静置した。
（ｉｉ）完成したプレートを０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に本発明のモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２、または比較例としてモノクローナル抗体Ｏ１Ａ（Ｓｕｏｍｅｎ　Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｉｋｋａ　Ｏｙ社　ＢｏｎｅＴＲＡＰ　Ａｓｓａｙキットに附属、ＷＯ９９／５０６６２号公報、特表２００２−５１００５０号公報に記載のモノクローナル抗体）を４００ｎｇ／１００μｌ／ｗｅｌｌにあわせて室温、１時間反応させ、更に０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄を行った。
（ｉｉｉ）次にモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２、Ｏ１Ａを反応させたプレートに各種酸性ホスファターゼを反応させた。使用した検体は上記（７）のウエスタン・ブロッティングで使用した精製ヒトＴＲＡＣＰ　５ａ、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰの他に、感作に使用したＴＲＡＣＰ　５ｂ、赤血球抽出液、血小板抽出液、好中球抽出液、前立腺由来酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）［ＳＩＧＭＡ社］である。これらのＡＣＰアイソフォームを含む検体はＴＲＡＣＰの酵素活性を全て１０Ｕ／Ｌ（基質溶液ｐＮＰＰ　８ｍＭ　酢酸ナトリウム０．１Ｍ　酒石酸ナトリウム４０ｍＭ　ｐＨ５．７で測定した活性値）に合わせ、その１００μｌを抗体結合プレート上に加えた。
（ｉｖ）室温、１時間反応させた後、０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄を行い、基質溶液（８ｍＭ　ｐＮＰＰ、１００ｍＭ　酢酸ナトリウム、４０ｍＭ　酒石酸ナトリウム　ｐＨ６．１）１００μｌを加えて３７℃、１時間発色させた。４０５ｎｍにおける吸光度を測定して、モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２およびＯ１Ａのそれぞれに反応した各種ＡＣＰアイソフォームの量を求めた。測定値は、各検体の吸光度より生理食塩水を検体として用いたブランク吸光度を差し引き算出した。得られた測定値を表１に示した。
【００２８】
【表１】

【００２９】
表１の結果から分かるように、モノクローナル抗体Ｏ１ＡおよびＴｒｋ６２はヒトＴＲＡＣＰ　５ｂ　、ＴＲＡＣＰ　５ａおよびＢａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰとしか反応せず、他のＡＣＰアイソフォームと交差性を示さなかった。しかしその反応比率は異なっていた。即ち、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性を１００％とすると、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ　ｒｈＴＲＡＣＰに対する反応性は両抗体とも約７０％の反応性であったが、ＴＲＡＣＰ　５ａではモノクローナル抗体Ｏ１Ａで６５％であったのに対して、モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２では３２％であった。このことは、モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２が特にＴＲＡＣＰ　５ｂにアフィニティーが高いことを示している。即ち、ＴＲＡＣＰ　５ｂとＴＲＡＣＰ　５ａの反応性の比（ＴＲＡＣＰ　５ｂ／ＴＲＡＣＰ　５ａ）を比べると、モノクローナル抗体Ｏ１Ａが１．５４に対しモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２が３．１３であり、モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２がモノクローナル抗体Ｏ１Ａに比して約２倍、ＴＲＡＣＰ
５ｂに対して特異性が高いことを示している。
更に以上の結果から、本発明のモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２は、以下のような特性を有している。
即ち、酒石酸ナトリウムの存在下でパラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質として用いてｐＨ５．７で反応させた時に１０Ｕ／Ｌの酵素活性を示すＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂのそれぞれを、プレートに固定した本発明のモノクローナル抗体と反応させ、次いでそれに結合したそれぞれのＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素活性を、酒石酸もしくは酒石酸ナトリウムの存在下で上記基質ｐＮＰＰを用いてｐＨ６．１で測定した時に、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａの反応性の３．１３倍である。
【００３０】
実施例２
モノクローナル抗体 Ｔｒｋ６２ を用いた ＴＲＡＣＰ　５ｂ の酵素活性の測定を利用した免疫測定法による臨床検体の測定
モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２の骨吸収関連疾患における臨床的意義を確認するためにホルモン補充療法（ＨＲＴ）を施された患者血清を検体として検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを測定した。
（１）方法
モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２を使用してのＴＲＡＣＰ　５ｂの測定方法は、実施例１の（８）の特異性検定と全く同様の方法で行った。ただし、標準品としてＢｏｎｅＴＲＡＰ　Ａｓｓａｙ（Ｓｕｏｍｅｎ　Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｉｋｋａ　Ｏｙ社）キット附属の組換えＴＲＡＣＰを測定し、その検量線より、吸光度をＵ／Ｌの酵素活性単位に変換して測定値を算出した。また、比較例として生化学法の総ＴＲＡＣＰ活性測定（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４４：２２１−２２５，１９９８）及びＴＲＡＣＰ　５ｂのＥＬＩＳＡ測定をＢｏｎｅＴＲＡＰ　Ａｓｓａｙをそのまま用いて測定を行った。検体はインフォームド・コンセントを行って集められ、測定まで−８０℃で保管した。また、ＨＲＴ前後の間隔は平均で７．４ヶ月であった。
（２）結果
得られた結果を表２に示した。
【００３１】
【表２】

【００３２】
理想的な臨床検査試薬はＨＲＴ後に治療前よりもダイナミックにその検査値が減少することで治療効果が的確に判断出来るものである。よって治療後の測定値が治療前よりもできるだけ小さくなればよいことになる。表２の結果を見ると実施例１で得られたモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２を使用したＥＬＩＳＡでは治療効果判定のための治療後検査値は治療前測定値の平均３３．６％であり、非常に大きな変化率を示していた。この結果は比較例であるＴＲＡＣＰ測定例の生化学測定法による総ＴＲＡＣＰ測定７７．０％及びＴＲＡＣＰ　５ｂ測定のＢｏｎｅＴＲＡＰ　Ａｓｓａｙ　５６．４％より有用であった。
【００３３】
なお、従来の骨代謝マーカーで同一検体を測定すると、Ｂ−ＡＬＰ（オステオリンク「ＢＡＰ」：血清中骨型アルカリ性ホスファターゼ測定　ＥＬＩＳＡ法）８０．５％、ＮＴｘ（オステオマークＮＴｘ：尿中Ｉ型コラーゲン分解Ｎ−テロペプチド測定　ＥＬＩＳＡ法）５７．５％、Ｐｙｒ（尿中総ピリジノリン測定　ＨＰＬＣ法）６８．６％、Ｄ−Ｐｙｒ（尿中総デオキシピリジノリン測定　ＨＰＬＣ法）５２．８％、Ｄ−Ｐｙｒ（オステオリンク「ＤＰＤ」：Ｆｒｅｅ　尿中デオキシピリジノリン測定　ＥＬＩＳＡ法）７７．８％であった。
この結果から本発明のモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２によるＴＲＡＣＰ　５ｂの測定が、従来の骨代謝マーカーの測定よりもＨＲＴ前後の変化率が大きく、骨代謝マーカーとして、臨床的に有用性が高いことを示している。
【００３４】
実施例３
モノクローナル抗体 Ｔｒｋ６２ を用いた ｐＨ５．６５ における成人および小児血清中の ＴＲＡＣＰ　５ｂ の測定
本発明のモノクローナル抗体を用いた、骨吸収能の安定した成人血清と骨吸収の盛んな小児血清中のＴＲＡＣＰ　５ｂの測定を行った。
（１）方法
測定は実施例２と同様に行い、基質試薬のｐＨのみをｐＨ６．１からｐＨ５．６５に変更して測定した。また、比較例として、前記モノクローナル抗体Ｏ１Ａを用いたＢｏｎｅＴＲＡＰ　Ａｓｓａｙでも測定した。検体はインフォームド・コンセントを行って得られた成人と小児血清、各２検体である。小児検体では盛んな骨代謝から骨吸収を表すＴＲＡＣＰ　５ｂが成人よりも高値を示すと言われている。
（２）結果
得られた結果を表３に示した。
【００３５】
【表３】

【００３６】
表３から分かるように、結果的にモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２を用いた場合、成人と小児のＴＲＡＣＰ測定値比率は４．４４倍であり、ＢｏｎｅＴＲＡＰ　Ａｓｓａｙキットの１．２４倍より大きく、ｐＨ５．６５の測定においてもＴＲＡＣＰ　５ｂの最適ｐＨ付近の６．１で測定を行っている比較例のＴＲＡＣＰ　５ｂ測定に比して、骨吸収をはるかに感度よく表しているものと考えられた。なお、小児検体では盛んな骨代謝から骨吸収を表すＴＲＡＣＰ　５ｂが成人よりも高値を示すと言われている。
【００３７】
実施例４
成人健常人血清検体と正常小児血清検体中の ＴＲＡＣＰ　５ｂ のサンドイッチアッセイ ＥＬＩＳＡ 法による測定
本発明以外のモノクローナル抗体Ｔｒｋ４９、本発明のモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２を利用して活性としてではなく蛋白質量としてＴＲＡＣＰ　５ｂを測定することができる。上記２種のモノクローナル抗体を利用して以下のような実験を行った。
（１）方法
はじめにＴＲＡＣＰ　５ｂ蛋白量測定キットの測定原理、方法を示す。測定方法は簡単には以下の（１）から（４）のステップである。（１）予め固層プレートに抗ＴＲＡＣＰ　５ｂモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２を１μｇ／１００μＬとなるように分注し、４℃、２日間反応させて抗体結合プレートを作り、（スクリーニング）と同様にブロッキングを行う。（２）使用時には０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を含むトリス緩衝液で３回洗浄した後に、血清検体５０μｌとクエン酸緩衝液５０μｌを別にプレートに加えて室温、１時間、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂをプレート上の抗体複合体に結合させる。（３）洗浄を行った後、抗体に結合して残ったＴＲＡＣＰ　５ｂに対して西洋ワサビパーオキシダーゼを標識したＴｒｋ４９希釈２次標識抗体液１００μｌを加えて室温、１時間反応させてサンドイッチ複合体を作製する。（４）３回洗浄後にＨＲＰの発色基質である３ｍｇ／ｍＬ　ＯＰＤ［ナカライ社］溶液を加えて吸光度を測定する。測定は測光波長４９０ｎｍで実行した。一定時間の後に１Ｎ硫酸反応停止液を加える。検体の発色値（ＯＤ）は精製ＴＲＡＣＰ　５ｂの標準曲線から計算することによって濃度換算ができる。上記のようにして血清中のＴＲＡＣＰ　５ｂを測定した。
【００３８】
（２）結果
実際に成人健常人血清６検体と正常小児血清６検体を測定すると表４のような結果であった。成人健常人血清６検体の平均値は９．９２　ｎｇ／ｍＬであったのに対して、骨吸収の活発な小児血清では平均値３４．００　ｎｇ／ｍＬであった。この結果は本測定系もまた活性測定法同様に骨吸収を反映するということを示している。
【００３９】
【表４】

【００４０】
実施例５
モノクローナル抗体 Ｔｒｋ６２ を用いた組織免疫染色による ＴＲＡＣＰ　５ｂ の測定
（１）方法
２μｍに薄切された凍結ヒト破骨細胞腫瘍組織を−２０℃アセトンで処理して組織固定し、洗浄後３％過酸化水素水処理を行い内因性ペルオキシダーゼ処理を施した。同一検体のパラフィン抱埋切片はミクロトームにて薄切し、キシレン各５分ずつ３回の処理で完全にパラフィンを除き、１００％エチルアルコールから１０％ずつ濃度を下げた５０％までの６段階下降系列のアルコール溶液をくぐらせた後、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸潤させた。以降凍結切片、パラフィン切片を同様に反応させている。つまり５％ＢＳＡを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）でブロッキングし、洗浄後に腹水から精製されたモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２を５％ＢＳＡを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し組織と室温２時間反応させた。陽性コントロールとして（ウエスタン・ブロッティング）で使用した抗ＴＲＡＰ抗体９Ｃ５［ＺＹＭＥＤ社］を反応させた。５回洗浄を行ってＥＮＶＩＳＩＯＮキット［ダコ社］を室温で１時間反応させ、２次抗体反応後、更に５回洗浄を行ってＤＡＢ発色キット［ダコ社］により発色させた。洗浄後、顕微鏡観察した。
【００４１】
（２）結果
顕微鏡観察の結果を図５に示した。
モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２は凍結切片の破骨細胞の細胞質のみが選択的に染まっていた。またパラフィン切片は全く反応が認められなかった。一方、抗ＴＲＡＰ抗体９Ｃ５は凍結切片では全く反応が認められず、パラフィン切片では破骨細胞が染色されていた。
この結果から、モノクローナル抗体Ｔｒｋ６２は酵素の立体構造が保持された凍結切片のみと反応性を持つことからも、立体構造を保持したＴＲＡＣＰ　５ｂを認識することが証明できた。また手術時に手術検体などを本発明のモノクローナル抗体によって素早く染色することによって組織学的判断を行う一助になり得る事も証明された。
【００４２】
【発明の効果】
以上に詳細に説明したように、本発明のモノクローナル抗体は、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａに対する反応性よりも高く、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対してより高い特異性を有するものである。従って、本発明のモノクローナル抗体により検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを特異的に検出することができる。骨吸収マーカーとして検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを本発明のモノクローナル抗体で高感度で且つ特異的に検出することができ、従って骨疾患の臨床検査等に本発明のモノクローナル抗体は極めて有効に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ヒト大腿骨骨頭部から単離精製されたＴＲＡＣＰ　５ｂをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した結果を示す。
【図２】図２は、ヒトさい帯血より精製されたＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂをディスク電気泳動法により分析した結果を示す。
【図３】図３は、昆虫細胞を宿主細胞として産生された組換えＴＲＡＣＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果を示す。
【図４】図４は、ポジティブコントロールとして用いた抗ＴＲＡＣＰモノクローナル抗体９Ｃ５の、ヒトＴＲＡＣＰ　５ａ、ＴＲＡＣＰ　５ｂおよび組換えＴＲＡＣＰに対する反応性をウエスタンブロッティングにより分析した結果を示す。
【図５】図５は、本発明のモノクローナル抗体Ｔｒｋ６２をヒト破骨細胞腫瘍組織の凍結切片と反応させた後の顕微鏡観察の結果を表す。

Claims (17)

1. 酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ｂ（ＴＲＡＣＰ　５ｂ：別名、破骨細胞由来酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）に対する反応性が、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ　５ａ（ＴＲＡＣＰ　５ａ）に対する反応性よりも高く、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対してより高い特異性を有するＴＲＡＣＰ　５ｂに対するモノクローナル抗体。
2. ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａに対する反応性の２倍以上である、請求項１のモノクローナル抗体。
3. 等量の活性を示すＴＲＡＣＰ　５ａおよび５ｂをそれぞれ反応させた時、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａに対する反応性の２倍以上である、請求項１または２のモノクローナル抗体。
4. 酒石酸もしくは酒石酸塩の存在下でパラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）を基質として用いてｐＨ５．７で反応させた時に１０Ｕ／Ｌの酵素活性を示すＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂのそれぞれを、当該モノクローナル抗体と反応させ、次いで該抗体に結合したそれぞれのＴＲＡＣＰ　５ａおよびＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素活性を、酒石酸もしくは酒石酸塩の存在下で基質ｐＮＰＰを用いてｐＨ６．１で測定した時に、ＴＲＡＣＰ　５ｂに対する反応性がＴＲＡＣＰ　５ａの反応性の２倍以上である、請求項１から３のいずれかのモノクローナル抗体。
5. 赤血球、血小板、好中球および前立腺由来の酸性ホスファターゼに対しては実質的に交差反応性を示さない、請求項１から４のいずれかのモノクローナル抗体。
6. ＴＲＡＣＰ　５ｂのネイティブな酵素としての立体構造を認識する、請求項１から５のいずれかのモノクローナル抗体。
7. 請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
8. 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ−７８９０として寄託されている、請求項７のハイブリドーマ。
9. 請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体を用いて免疫測定法により、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを検出するＴＲＡＣＰ　５ｂの検出方法。
10. 検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体に結合させ、次いで結合したＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素活性を測定して検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを検出する、請求項９の検出方法。
11. 請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体を用いたサンドイッチアッセイＥＬＩＳＡにより、検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂを検出する、請求項９の検出方法。
12. 検体中のＴＲＡＣＰ　５ｂの存在を、請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体を用いた組織免疫染色法により検出する、請求項９の検出方法。
13. 骨吸収のマーカーとして骨疾患の臨床検査に用いる、請求項９から１２のいずれかの検出方法。
14. 請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体を構成成分として含む、ＴＲＡＣＰ　５ｂの検出に用いるためのキット。
15. 請求項１０の検出方法に用いるためのキットであって、固相支持体、請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体およびＴＲＡＣＰ　５ｂの酵素基質を構成成分として含む、請求項１４のキット。
16. 請求項１１の検出方法に用いるためのキットであって、固相支持体、請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体、標識された他の別なＴＲＡＣＰ　５ｂに対する抗体、および標識を検出するための成分を構成成分として含む、請求項１４のキット。
17. 請求項１２の検出方法に用いるためのキットであって、請求項１から６のいずれかのモノクローナル抗体、標識された二次抗体、および発色試薬を構成成分として含む、請求項１４のキット。

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