NO163920B

NO163920B - Fremgangsmaate for bestemmelse av pivka-ii i fysiologiske proever.

Info

Publication number: NO163920B
Application number: NO843591A
Authority: NO
Inventors: Ichiro Matsuda; Kunihiko Motohara
Original assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 1983-09-13
Filing date: 1984-09-11
Publication date: 1990-04-30
Also published as: KR880001338B1; NO843591L; JPS6060557A; EP0142634A1; DE3480494D1; JPH0543357B2; ATE48037T1; CA1234045A; US4780410A; NO163920C; EP0142634B1; KR850002385A

Abstract

Fremgangsmåte og middel for bestemmelse av protrombin-forløp-eren PIVKA-II ved hjelp av enzym-immunobestemmelse under anvendelse av to-antistoff-sandwich-metoden hvor det som anti- , stoff i fast fase anvendes et monoklonalt anti-PIVKA-II antistoff .

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for bestemmelse av PIVKA-II i fysiologiske prøver ved hjelp av en enzymimmunoassay under anvendelse av to-antistoffsandwichmetoden, og det særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at det som faststoffantistoff for den nevnte bestemmelse anvendes et monoklonalt anti-PIVKA-II antistoff, fremstilt ved dyrking av hybridomaceller dannet ved fusjonering av miltceller fra BALB/C mus, immunisert med PIVKA-II, og tumorceller fra tumorcellestammen P3U1; og selektert mot human-protrombin og nativt PIVKA-II.

PIVKA-II er i seg selv en protrombin-forløper eller en protrombin-forløper hvor glutaminsyrerestene er ufullstendig karboksylert. På den annen side kalles en protrombinforløper med glutaminsyrerester som er fullstendig karboksylert normalt protrombin. Med andre ord kan derfor PIVKA-II betrak-tes som et normalt protrombin med dekarboksylerte 'Y-karboksy-glutaminsyrerester. Således er det f.eks. i blod tilstede i blanding et flertall substanser som er i samsvar med den ovennevnte definisjon men med forskjellige grader av karbok-sylering. En slik blanding kan samlet omtales som PIVKA-II. Da det vesentlige formål for den foreliggende oppfinnelse er å bestemme PIVKA-II inneholdt i blodet, inkluderer PIVKA-II i den foreliggende fremstilling PIVKA-II i dets omfattende be-tydning sålenge noe annet ikke spesielt nevnes. På den annen side er det kjent at PIVKA-II opptrer når vitamin K er utilstrekkelig fysiologisk eller klinisk, eller når virkningen av vitamin K inhiberes ved tilførsel av vitamin K inhibiorer. Mer spesielt blir glutaminsyrerester tilstede i protrombin-forløperen karboksylert til aktivert normalt protrombin i nærvær av vitamin K og karboksylase, men karboksyleringen blir ufullstendig når vitamin K er utilstrekkelig eller inhibert, hvilket resulterer i tilsynekomst av PIVKA-II i blodet. PIVKA-II er en forkortelse for "Protein Induced by Vitamin K Absence-II", som ble navngitt fra det ovennevnte fysiologiske synspunkt. De følgende henvisninger anføres med hensyn til PIVKA-II og forholdet mellom PIVKA-II og vitamin K 1) Stenflo, J., Fernlund, P., Egan, W., and Roepstorff, P. "Vitamin K dependent modification of glutamic acid residues in prothrombin".

Proe. Nati, Acad, Sei. USA. (1974) 71, 2730-3.

2) Nelsestuen, GL., Zytkovicz, TH., and Howard, JB. "The mode of action of vitamin K: identification of *y-carboxyglutamic acid as a component of prothrombin". ;J. Biol. Chem. (1974) 249, 6347-50. 3) Magnusson, S., Sottrup-Jensen, L., Petersen, TE., Morris, HR., and Dell, A. "Primary structure of the vitamin K-dependent part of prothrombin". ;FEBS Lett. (1974) 44, 189-93. ;Det er klinisk viktig å påvise vitamin K-mangel, spesielt vitamin K-mangel apopleksi i spedbarn, f.eks. neonatal apopleksi, i dens tidlige trinn ved bestemmelse av vitamin K i blodet. ;Hepaplastin-test (HPT) anvendes ofte for denne prognostika-tive og preventive bestemmelse. Ettersom fysiologisknedset-telse av verdier på grunn av proteinkoagulering påvises i spedbarn vil imidlertid hepaplastin-testen ikke alltid indi-kere vitamin K-mangel. Det er derfor nødvendig å direkte bestemme PIVKA-II kvantitativt for å etablere en mer egnet og nøyaktig metode for prognostisering og prevensjon. Todimen-sjonal kryss-immunoelektroforese (CIEP) anbefales praktisk anvendt for dette formål. Denne metode er imidlertid ikke fordelaktig for praktisk bruk ved kliniske undersøkelser på grunn av at operasjonene er for kompliserte for samtidig behandling av et stort antall prøver. For å etablere en enklere metode er det foretrukket å gjennomføre radioimmunoassay eller enzymimmunoassay. Den følgende litteratur (4) indikerer f.eks. en fremgangsmåte for gjennomføring aV' radioimmunoassay: 4) Rita A., Blanchard, et al., "Acquired vitamin K-dependent carboxylation defficinency in liver disease": New England J. Medicine, bind 305, nr. 5 (1981) 242-248. ;Denne metode anvender imidlertid konkurrerende radioimmunoassay og er ennå ikke i praktisk bruk. En fremgangsmåte for rensing av PIVKA-II spesifikt antistoff er videre omstendelig for denne metode og bare begrensede mengder av rensede antistoffer oppnås. ;Under disse forhold er det som grunnlag for den foreliggende oppfinnelse foretatt undersøkelser for å finne frem til en praktisk metode for en nøyaktig og enkel bestemmelse av PIVKA-II, spesielt for en samtidig behandling av store mengder prøver ved kliniske undersøkelser. Ved pediatriske kliniske undersøkelser av f.eks. samlede plasmaer forhånds-behandles prøvene vanligvis ved tørking med filterpapir før bestemmelsen. Den ettersøkte metode for en nøyaktig og enkel bestemmelse av PIVKA-II må også være forlikelig med denne forhåndsbehandling. Den foreliggende oppfinnelse foreligger som et resultat av studier hvor disse forhold er tatt i be-traktning, basert på de betingelser at en enzymimmunoassay under anvendelse av to-antistoffsandwichmetoden anvendes og at et monoklonalt anti-PIVKA-II antistoff anvendes som faststoff antistoff i denne to-antistoffsandwichmetoden. ;Mer spesielt er det et formål for den foreliggende oppfinnelse å muliggjøre en nøyaktig og enkel bestemmelse av PIVKA-II i prøver selv om mengden av prøver er stor og prøvene er blitt underkastet tørke-forbehandling før bestemmelsen. ;Oppfinnelsen skal nå beskrives mer detaljert. ;Det monoklonale anti-PIVKA-II antistoff som anvendes ved fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse fremstilles f.eks. på følgende måte: Først fremstilles PIVKA-II. Plasmaer fra pasienter som tar warfarin behandles med BaS04 og BaCC>3 slik at protrombin fjernes adsorptivt og ionebyttes deretter med DE-53 cellulose. Plasmaene adsorberes til slutt på en affinitets kolonne hvori det monoklonale antistoff av den del som er felles for både normalt protrombin og PIVKA-II anvendes. Adsorbatet elueres med 4 M guanidinhydroklorid, dialyseres og konsentreres og gir PIVKA-II. 50 ug av det således fremstilte PIVKA-II tilføres abdominalt til BALB/C mus sammen med det samme volum av Freunds fullstendige tilsetningsmiddel. Etter to uker tilføres 15 ug PIVKA-II ytterligere til caudalvenen og etter 3 døgn ekstraheres miltcellene og underkastes øyeblikkelig celle-fusjon med tumorceller fra tumorcellestammen P3U1 i nærvær av polyetylenglykol 4000 i henhold til metoden til Watanabe et al. ^.(se litteraturen (5) angitt senere). Kloning gjennom-føres så tre ganger med grensefortynning. Kloningen foretas under anvendelse av f.eks. mono-AB-Screen G sett (Zymed) med seleksjon av en slik fordypning som ikke reagerer med normalt protrombin men bare reagerer med dekarboksylert protrombin. De monoklonale anti-PIVKA-II antistoff-produserende cellelinjer etableres ved ytterligere bekreftelse av at fordyp-ningen reagerer med nativt unormalt protrombin. De normale og dekarboksylerte protrombiner som anvendes her kan fremstilles ved hjelp av metodene beskrevet i den følgende litteratur (6) (av Shapiro et al.) og (7) (av Tuhy et al.). Normalt protrombin fremstilles f.eks. som følger: DE-52 cellulose og sitronsyre tilsettes til friskt frosset plasma. Resten vaskes etter omrøring av blandingen, elueres med en citratbufferoppløsning, adsorberes ved tilsetning av BaCl2, elueres på nytt med en citratbufferoppløsning og utsaltes ved tilsetning av mettet ammoniumsulfat. Den saltede substans suspenderes i en citratbufferoppløsning, dialyseres og gelfUtreres gjennom en "Sephadex G-100" kolonne for oppsamling av fraksjonene tilsvarende den forutbestemte topp. ;De oppnådde fraksjoner behandles med en DE-52 cellulosekolonne og elueres med en citratbufferoppløsning med en konsen-trasjonsgradient av NaCl for å oppnå det ønskede normale protrombin . 5) Watanabe og Kaitsu: "Cell fusion method of lymphocytes. ;Biomedical Sciences", bind 1, nr. 1, 46-51 (1980). ;6) Shapiro, S. S., og D. E. Waugh: "The purification of human prothrombin", Thromb. Diath Haemorph., 16, 469-490 (1966). ;7) Tuhy, PM., Bloom, JW., og Mann, KG: ;"Decarboxylation of bovine prothrombine fragment I and prothrombine", Biochemistry (1939) 18, 5842-8. ;Enzymimmunoassay som anvender to-antistoffsandwichmetoden i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse gjennomføres f.eks. på følgende måte. ;Hele bestemmelsessystemet er sammensatt av en fast fase, et monoklonalt anti-PIVKA-II antistoff (primært antistoff) for fastfasebelegning, et standard antigen eller plasmaprøve, et merkings-antistoff (sekundært antistoff), et enzym og et substrat. En fordypning i en mikrotiterplate for enzymimmunoassay kan anvendes som den faste fase. Før bestemmelsen opp-løses et monoklonalt anti-PIVKA-II antistoff i en karbonat-bufferoppløsning (pH 8.5). Oppløsningen innfylt i en poly-styrenfordypning for enzymimmunoassay etterlates over natten ved 4°C slik at overflaten av den faste fase er belagt. Da imidlertid noen deler av overflaten ikke er belagt med det monoklonale antistoff, belegges disse deler med bovint serumalbumin som er blitt oppløst i en fosfatbufferoppløsning, innført i en fordypning og etterlatt for henstand på samme måte som ovenfor. ;Plasma fra en pasient med en forutbestemt konsentrasjon anvendes som standard antigen. Standard antigenet oppløses i en fosfatbufferoppløsning inneholdende bovint serumalbumin (pH 7.4), innføres i den belagte fordypning for reaksjon, og vaskes. ;Et passende antihuman protrombin-antistoff, f.eks. antihuman-protrombin kanin IgG, selekteres som merkingsantistoffet ;(sekundært antistoff). Antihuman-protrombin kanin IgG kan fremstilles på følgende måte. ;Først fremstilles human-protrombin fra friskt frosset plasma i henhold til metoden til Shapiro et al. nevnt i det fore-gående. En kanin immuniseres med det oppnådde human-protrombin. Blodet samles fra kaninen og ammoniumsulfat tilsettes til blodserumet. Serumet utsaltes, dialyseres og ionebyttes deretter med DE-52 cellulose. Det ionebyttede produkt absor-beres på en human-protrombin affinitetskolonne og elueres så med 4 M guanidin-hydroklorid og gir det ønskede antihuman-protrombin kanin IgG. Human-protrombin affinitetskolonnen prepareres ved aktivering med CNBr ved hjelp av den vanlige metode og humanprotrombin tilsettes oppløst i en fosfatbuf-feroppløsning til denne for å gjennomføre adsorpsjonen. ;Det enzym som anvendes her inkluderer alkalifosfatase, glu-koseoksydase, peroksydase og beta-oksydase. Før bestemmelsen bindes enzymet til merkings-antistoffet til å danne et konjugat med et bindemiddel som f.eks. glutaraldehyd. Dette konjugat kan fremstilles på forhånd som en del av reagensene for gjennomføringen av bestemmelsen i henhold til den foreliggende oppfinnelse. ' Merkingen kan gjennomføres i samsvar med f.eks. den følgende metode nevnt i litteraturen (8) (av Nakane et al.) 8) PK. Nakane, RM. Nakamura, WR. Dito og ES. Tucker: "Preparation and standardization of enzyme labelled con-jugate". Immunoassays in the clinical laboratory (3. utgave) side 81, Alan R Liss Inc. NY, USA. ;Et passende substrat anvendes tilsvarende det selekterte enzym. Når f.eks. alkalifosfatase selekteres som enzym anvendes p-nitrofenyl-fosfat som et substrat, mens når peroksydase selekteres anvendes ABTS (2,2'-azinobi(3'-etyl-benzo-thiazolinsulfonsyre)). ;Bestemmelsen gjennomføres i. samsvar med vanlige prosesser ved enzymimmunoassay under anvendelse av to-antistoffsandwichmetoden. Mer detaljert, som beskrevet i de etterfølgende eksempler, tilføres standard antigenet eller plasma-prøven til den belagte fordypning og inkuberes, etterfulgt av tilsetning av det enzymmerkede antistoff, og inkuberes på nytt, og endelig tilsettes substratet og inkuberes ytterligere. Etter avsluttet reaksjon måles mengden spaltet substrat ved hjelp av et spektrofotometer. ;Fordelene ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse oppsummeres som følger. ;For det første er fremgangsmåten hvor en enzymimmunoassay gjennomføres under anvendelse av to-antistoffsandwichmetoden, enkel og gjennomføres lett og store mengder prøver kan derfor behandles samtidig. Dette er av stor verdi for den praktiske bruk ved kliniske undersøkelser. ;For det annet, selv om ordinære antistoffer oppnådd ved immu-nisering med PIVKA-II krysser normalt protrombin på grunn av den ekstreme likhet i molekylstrukturer av PIVKA-II og normalt protrombin, kan sådan kryssing unngås ved fremgangsmåten i henhold den foreliggende oppfinnelse hvori et monoklonalt anti-PIVKA-II antistoff anvendes som faststoff antistoff. Målingen med hensyn til PIVKA-II er derfor meget høy som vist i eksemplene med forsøk beskrevet i det følgende, og god samsvarighet finnes mellom bestemmelsen i henhold til den foreliggende oppfinnelse og den todimensjonale kryssimmunoelek-troforese (CIEP) som er blitt anbefalt som en metode for nøy-aktig bestemmelse av positivitet og negativitet av PIVKA-II. ;Den mest bemerkelsesverdige fordel ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse er at plasmaprøver kan måles, hvis de er blitt forhåndsbehandlet før bestemmelsen ved f.eks. tørking med tørt filterpapir for seleksjon av congenital dysbolisme og de samme resultater oppnås som når plasmaprøvene bestemmes direkte. ;Kort beskrivelse av tegningene.- ;Fig. 1 tilsvarer fig. 1 beskrevet i resultatene fra forsøks-eksempel 1 og representerer grafisk forholdet mellom mengde protein og de målte verdier oppnådd ved en utførelsesform av fremgangsmåten for bestemmelse i samsvar med den foreliggende oppfinnelse. Fig. 2 tilsvarer fig. 2 beskrevet i resultatene fra forsøks-eksempel 2 og representerer grafisk samsvarigheten mellom bestemmelsen i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse og den todimensjonale kryss-immunoelektroforese. Fig. 3 tilsvarer fig. 3 beskrevet i resultatene fra forsøks-eksempel 3 og representerer grafisk målekurven i tilfellet av forbehandling av plasmaprøvene med filterpapir for tørking. Fig. 4 tilsvarer fig. 4 beskrevet i resultatene av forsøks-eksempel 4 og representerer grafisk samsvarigheten mellom de målte verdier ved den direkte bestemmelse av plasmaprøvene og resultatene ved bestemmelsen etter tørkebehandling av disse. ;Fordelene ved fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse vil lettere forstås ut fra de følgende undereksempler. ;Undereksempel 1 ;Prøver og metode: ;Tre typer prøver ble fremstilt: protrombin-fritt plasma hvori normalt protrombin er fjernet på forhånd ved ad-sorpsjon. Prøve a) ble fremstilt ved å tilsette BaS04 og BaCC>3 i en mengde på hver 100 mg pr. ml av normalt plasma og blandingen omrøres i 120 minutter. Prøve b) hvori normalt protrombin oppnådd ved metoden beskrevet i eksempel 1 i det følgende var tilsatt til prøve a), og prøve c), hvori PIVKA-II var tilsatt til prøve a), ble så fremstilt. De tre prøver ble ført inn i fordypninger belagt med monoklonale anti-PIVKA-II antistoffer med forskjellige mengder protein i fordypningene, og bestemt i henhold til de samme metoder som beskrevet i eksempel 4 i det følgende. ;Resultater: ;Resultatene er vist i fig. 1. Absissen viser mengden PIVKA-II eller av protrombin-protein (ug) i hver fordypning og ordinaten viser verdien av OD^<gn>m. Linjen X i figuren står for resultatene med prøve a), linjen ^ står for prøve b), ;og linjen med£) står for prøve c) . Det forstås fra fig. 1 at man ved fremgangsmåten forden foreliggende oppfinnelse oppnår høy spesifisitet og utmerket målenøyaktighet med hensyn til PIVKA-II. ;Undereksempel 2 ;Prøver og metode: ;32 plasmaprøver fra pasienter som tok warfarin og 3 prøver av plasma fra barnepasienter med vitamin K-mangelapopleksi ble fremstilt og underkastet den negative eller positive bestemmelse ved hjelp av den todimensjonale kryss-immunoelektroforese og bestemmelsen i henhold til den foreliggende oppfinnelse på samme måte som beskrevet i eksempel 4 i det ;følgende. 25 prøver av plasmaer fra sunne voksne personer ble også underkastet bestemmelsen gjennomført ved framgangsmåten i samsvar med den foreliggende oppfinnelse på samme måte som beskrevet i eksempel 4. 16 plasmaprøver fra pasienter som tok warfarin som viste en protrombin-periode på 20 sekunder eller mer ble samlet og fratatt normalt protrombin ved hjelp av forbehandling med BaS04 og BaCC>3. PIVKA-II som standard antigen ble fremstilt og kvantitativt bestemt ved hjelp av Laurel-metoden. Resultatene ble beregnet basert på den definisjon at mengden av antigenet tilsvarende 1 ug av normalt protrombin var 1 A.U. Kalibreringskurven mellom verdiene for A.U./ml og verdiene for OD^q1™ oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse var fremstilt på forhånd. CV for denne målekurve innenfor rammen av bestemmelsen var 0,015 til 0.06. ;Resultater: ;Resultatene er vist i fig. 2. Resultatene med plasmaer fra de friske voksne personer er vist i venstre spalte og resultatene fra pasientene som tok warfarin og fra barne pasienter med vitamin K-mangel apopleksi i den høyre spalte. Merkene i den høyre kolonne står for resultatene med plasmaer fra barnepasienter med vitamin K-mangelapopleksi, markeringene med for resultatene med plasmaer fra de warfarin-tagende pasienter som ble bestemt som positive ved hjelp av CIEP, og markeringene Q for resultatene med plasmaene fra de warfarintagende pasienter som ble bestemt som negative ved hjelp av CIEP. Det .forstås fra fig. 2 at en god samsvarighet foreligger mellom resultatene ved bestemmelsen gjennomført i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse og resultatene fra CIEP, som var blitt anbefalt som en metode for nøyaktig bestemmelse og at bestemmelsen i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse kan erstatte CIEP-metoden. ;Undereksempel 3 ;Prøver og metode: ;Røde blodlegemer av o-typen ble tilsatt plasmaene som var fratatt normalt protrombin som beskrevet i prøver og metode for forsøkseksempel 2, i forholdet 55:45. Et tørt filterpapir for congenitus dysbolisme-seleksjon ble impregnert med de nevnte røde blodlegemeholdige plasmaer, tørket i 6 timer ved romtemperatur og skåret ut til sirkler med 5 mm diameter. Åtte av de utkuttede sirkler ble selektert, 0.3 ml fosfat-buf f eroppløsning inneholdende bovint serumalbumin ble tilsatt dertil for eluering, som prøver på standard antigen. Oppnådd standard antigen ble innført i fordypninger i en rekke forskjellige konsentrasjoner og underkastet bestemmelse i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelsen på samme måte som beskrevet i det etterfølgende eksempel 4. ;Resultater: ;Resultatene er vist i fig. 3. Fig. 3 viser målekurven hvor CV i området 63 til 63 x 10"3 A.U./ml var 0.063 til 0.092. Det forstås fra fig. 3 at måleegenskapene ved bestemmelsen i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse ikke tapes hvis prøvene forbehandles med filterpapir for tørking. ;Undereksempel 4 ;Prøver og metode: ;21 plasmaprøver fra de warfarin-tagende pasienter og 3 prøver fra barnepasienter med vitamin K-mangelapopleksi ble fremstilt. Både den direkte bestemmelse på samme måte som beskrevet i eksempel 4 og forbehandlingen med filterpapir for tørking ved metodene beskrevet i prøver og metode for forsøkseksempel 3 etterfulgt av bestemmelsen i eksempel 4 ble gjennomført med de nevnte prøver. ;Resultater: ;Resultatene er vist i fig. 4. Absissen i fig. 4 står for verdiene ved den direkte bestemmelse og ordinaten for verdiene ved bestemmelsen etter forbehandlingen med filterpapir for tørking. Avsetningene med merket <*> er resultatene av bestemmelsen på plasmaer fra barnepasientene med vitamin K-mangel apopleksi. Formelen representert ved regresjons-linjen i figuren er Y = 0.57X + 3.67 og korrelasjonskoeffisi-enten y derav er 0.954 (P<0.005). Det forstås fra fig. 4 at der er god samsvarighet mellom de to verdier og når forbehandlingen for tørking gjennomføres på grunn av vanskelig-heten med å samle plasmaer, oppnås de samme resultater ved den direkte bestemmelse av plasmaprøvene.

Oppfinnelsen vil belyses ytterligere ved hjelp av de følgende eksempler.

Eksempel 1

A. "DE-52" cellulose og 200 ml av 10 mM natriumcitratopp-løsning (pH 7.0) ble tilsatt til 400 ml av friskt frosset plasma. Blandingen ble omrørt i 5 minutter og sentrifugert ved 1500 rpm. Resten ble vasket tre ganger med 400 ml porsjoner av en 100 mM trinatriumcitratoppløsning (pH 7.0). 400 ml av en 500 mM trinatriumcitratoppløsning (pH 7.0) ble så tilsatt for eluering og 2000 ml av en 20 mM trinatrium-citratoppløsning (pH 7.0) ble ytterligere tilsatt eluatet. Deretter ble 20 g BaCl2 tilsatt og eluatet ble omrørt i 15 minutter og sentrifugert ved 5000 rpm i 15 minutter. Resten ble vasket tre ganger med avionisert vann og eluert med 40 ml av en 170 mM trinatriumcitratoppløsning (pH 7.0). 20 ml mettet ammoniumsulfat ble tilsatt til eluatet som så ble sentrifugert ved 3500 rpm i 10 minutter. 60 ml mettet ammoniumsulfat ble ytterligere tilsatt supernatanten som så ble sentrifugert ved 9000 rpm i 20 minutter. Resten ble suspendert i en 10 mM trinatriumcitratoppløsning (pH 7.0, inneholdende 250 mM NaCl), dialysert, og gelfiltrert gjennom en "Sephadex G-100" kolonne. Fraksjonene omkring toppen ble samlet, absorbert, på en "DE-52" cellulosekolonne, eluert ved konsentrasjonsgradienten fra en 20 mM trinatriumcitratopp-løsning (inneholdende 100 mM NaCl) til en 20 mM trinatrium-citratoppløsning (inneholdende 5 00 mM NaCl) og fraksjonene omkring toppen ble: samlet. Renset normalt human-protrombin ble således oppnådd med endelig utbytte fra 25 til 35%.

En kanin ble immunisert med det således oppnådde normale human-protrombin og 35% ammoniumsulfat ble tilsatt til anti-serumet derav. Den oppnådde rest ble dialysert, absorbert på en DEAE-cellulosekolonne og behandlet med en 17 mM fosfat-bufferoppløsning (pH 6.8) for oppsamling av IgG fraksjoner. På den annen side ble normalt protrombin oppløst i en 10 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7.2, inneholdende 130 mM NaCl) slik at konsentrasjonen av oppløsningen på forhånd ble absorbert på aktivert CNBr ved hjelp av den vanlige metode for fremstilling av en protrombin-affinitetskolonne. De nevnte IgG fraksjoner ble absorbert på denne protrombin-af f initetskolonne- og eluert med 4 M guanidin-hydroklorid til å gi antihuman-protrombin kanin IgG. Dekarboksylert human-protrombin ble oppnådd ved dekarboksylering av normalt human-protrombin ved hjelp av Tuhys metode.

B. BaSC>4 og BaCC>3 ble tilsatt til plasmaene fra warfarin-tagende pasienter i en mengde på 100 mg/ml hver. Etter at plasmablandingen var omrørt i 120 minutter ble normalt pro-trombin fjernet ved absorpsjon. Plasmablandingen ble således ionebyttet med "DE-52" cellulose, absorbert på en affinitetskolonne hvori de monoklonale antistoffer av den del som var felles for normalt protrombin og PIVKA-II ble anvendt, eluert med 4 M guanidin-hydroklorid, dialysert og konsentrert til å gi renset PIVKA-II. 50 ug av det således oppnådde PIVKA-II ble abdominalt til-ført BALB/C mus (hunnmus, 4 uker gamle) med det samme volum av Freunds fullstendige tilsetningsmiddel. Etter 2 uker ble 15 ug PIVKA-II ytterligere administrert til caudalvenen. Etter 3 døgn ble miltcellene ekstrahert og fusjonert med tumorceller fra tumorcellestammen P3U1. Denne cellefusjone-ring ble gjennomført i samsvar med metoden til Watanabe et al. under anvendelse av polyetylenglykol 4000. Kloning ble så gjennomført 3 ganger ved begrensende fortynning under anvendelse av en 9 6fordypningers mikroplate. Det dekarboksylerte human-protrombin beskrevet under A og endelig nativt PIVKA-II ble anvendt ved bestemmelsen for kloningen. Markeringene MU-1, MU-2, MU-3, MU-4 og MU-5 ble merket på cellelinjene av antistoffproduserende hybridomer etablert ved kloningen. Et RPMI 1640 medium inneholdende 20% FCS og 10% DMSO ble anvendt som medium for opprettholdelsen av disse cellelinjer. Prøvene ble frosset ved -160°C og smeltet ved 37°C. Overlevingen av prøvene ble bekreftet ved mikroskopisk observasjon av morfologi og endringer i formeringsevnen av cellene med tiden. Monoklonale anti-PIVKA-II antistoffer ble oppnådd fra cellelinjen MU-3 ved hjelp av den ordinære metode. De oppnådde monoklonale anti-PIVKA-II antistoffer ble fremstilt for anvendelse ved bestemmelsen i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse. En kombina-sjon av det monoklonale anti-PIVKA-II antistoff og antihuman-protrombinkanin IgG oppnådd under A ble også fremstilt for anvendelse ved bestemmelsen i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 2

De monoklonale anti-PIVKA-II antistoffer oppnådd i eksempel 1 ble oppløst i en 0.1 M karbonatbufferoppløsning (pH 8.5) i en konsentrasjon på 10 til 15 ug antistoffer i 50 ug bufferopp-løsning, tilført på en multiplate for enzymimmunoassay med 100 ul pr. fordypning, og fikk stå over natten ved 4°C. Belagte faste faser ble fremstilt ved å spyle prøvene en gang med en 10 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7.4, inneholdende 0.2 % bovint serumalbumin og 0.15 M NaCl), idet det ytterligere deri ble innlemmet 1 % bovint serumalbumin, blandingen fikk stå over natten, og ble spylt 3 ganger med den nevnte bufferoppløsning. Enzymmerkede antistoffer ble fremstilt ved å konjugere peroksydase med antihuman-protrombinkanin IgG oppnådd i eksempel 1 ved metoden til Nakane et al. En kombi-nasjon av den nevnte belagte faste fase og det nevnte enzymmerkede antistoff ble fremstilt for anvendelse ved bestemmelse i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelsen.

Eksempel 3

Tørt filterpapir for seleksjon ble ytterligere tilsatt reagenset beskrevet i eksempel 2 og fremstilt som reagenset for bruk ved bestemmelse i samsvar med fremgangsmåten for den foreliggende oppfinnelse.

Eksempel 4

100 ul porsjoner av plasmaprøvene ble innført i fordypningene av den belagte faste fase oppnådd i eksempel 2 og inkubert i 24 timer ved 4°C. Prøvene ble så spylt 3 ganger med en 10 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7.4, inneholdende 0,2 % bovint serumalbumin og 0.15 M NaCl) og inkubert i 60 minutter ved 37°C med 50 ul av det enzymmerkede antistoff oppnådd i eksempel 2 tilsatt dertil. Prøvene ble spylt 3 ganger med den nevnte bufferoppløsning og fikk stå i 3 0 minutter etter tilsetningen av 100 ul av en ABTS-oppløsning og reaksjonen ble avsluttet ved å tilsette 5 0 ul av 2 mM natriumazid når OD42gnm ble bestemt.

Claims

Fremgangsmåte for bestemmelse av PIVKA-II i fysiologiske prøver ved hjelp av en enzymimmunoassay under anvendelse av to-antistoffsandwichmetoden,karakterisert ved at det som faststoffantistoff for den nevnte bestemmelse anvendes et monoklonalt anti-PIVKA-II antistoff, fremstilt ved dyrking av hybridomaceller dannet ved fusjonering av miltceller fra BALB/C mus, immunisert med PIVKA-II, og tumorceller fra tumorcellestammen P3U1; og selektert mot human-protrombin og nativt PIVKA-II.