JP2003507712A - 血液凝固状態の間接的測定方法 - Google Patents
血液凝固状態の間接的測定方法Info
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-
- G—PHYSICS
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、血液の凝固状態を間接的に測定するための方法に関する。本発明の方法は、ａ）ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性可能なプロテインを含む体液を採取するステップ、ｂ）カルボキシル化プロテインの第１の濃度Ｃ１、脱カルボキシル化プロテインの第２の濃度Ｃ２、およびカルボキシル化プロテインと脱カルボキシル化プロテインとの総濃度Ｃ３からなる群から選ばれる少なくとも２つの濃度を測定するステップであって、これにより第１の濃度Ｃ１は第１の抗体Ａ１を用いて測定され、第２の濃度Ｃ２は第２の抗体Ａ２を用いて測定され、第３の濃度Ｃ３は第３の抗体Ａ３を用いて測定され、ｃ）第１Ｃ１と第２の濃度Ｃ２とから第１の比率Ｑ１を生成するステップ、または第３Ｃ３と第１の濃度Ｃ１とから第２の比率Ｑ２を生成するステップ、または第３Ｃ３と第２の濃度Ｃ２とから第３の比率Ｑ３を生成するステップであって、これにより、ステップｂ）で測定されず、かつ第１Ｑ１、第２Ｑ２、または第３Ｑ３の比率の生成に必要な濃度Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３を次の関係に従って計算し、Ｃ３−Ｃ２＝Ｃ１、ｄ）第１、第２、または第３の比率Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３を血液の凝固状態と相関させるステップを備える。
Description
【０００１】
本発明は、血液の凝固状態を間接的に測定する方法に関する。
【０００２】
血液の凝固状態は、ヒト体液中のプロトロンビン濃度を測定することにより間
接的に測定され得る。プロトロンビンは、主にヒト血漿中に生じるプロテインで
ある。このプロテインは、ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性され
得る。プロトロンビンが血液凝固の原因の一端であり、フィブリノゲン（繊維素
原）をフィブリン（繊維素）に転換する。
接的に測定され得る。プロトロンビンは、主にヒト血漿中に生じるプロテインで
ある。このプロテインは、ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性され
得る。プロトロンビンが血液凝固の原因の一端であり、フィブリノゲン（繊維素
原）をフィブリン（繊維素）に転換する。
【０００３】
この、プロトロンビンにより誘起されるフィブリノゲンの転換は、プロトロン
ビンが自然状態のカルボキシル化された場合にのみ起きる。カルボキシル化は、
カルボキシラーゼが補助因子であるビタミンＫと結合することにより、肝臓にお
いて引き起こされる。カルボキシラーゼ活性はビタミンＫの濃度により左右され
る。カルボキシラーゼ活性が減少すると、異常状態で脱カルボキシル化され、凝
固活性を有さないプロトロンビンが生成される。
ビンが自然状態のカルボキシル化された場合にのみ起きる。カルボキシル化は、
カルボキシラーゼが補助因子であるビタミンＫと結合することにより、肝臓にお
いて引き起こされる。カルボキシラーゼ活性はビタミンＫの濃度により左右され
る。カルボキシラーゼ活性が減少すると、異常状態で脱カルボキシル化され、凝
固活性を有さないプロトロンビンが生成される。
【０００４】
健康体においては、プロトロンビンは自然状態、すなわちカルボキシル化され
た状態にある。カルボキシル化の際に、ビタミンＫは補助因子の役割を果たす。
病人、特に肝臓疾患者あるいは抗凝固剤投与者においては、プロトロンビンは異
常状態で生じる。
た状態にある。カルボキシル化の際に、ビタミンＫは補助因子の役割を果たす。
病人、特に肝臓疾患者あるいは抗凝固剤投与者においては、プロトロンビンは異
常状態で生じる。
【０００５】
カルボキシル化プロトロンビンは、Ｃａ2+イオンが予め結合している場合にの
み凝固を引き起こす。カルボキシル化プロトロンビンは、その場合に初めて血液
の血小板の膜と結合して凝固を引き起こすようになる。プロトロンビンは、カル
ボキシル化状態でのみカルシウム結合が可能である。このように、血液の凝固状
態は、カルボキシル化プロトロンビンの含有量によって推定可能である。
み凝固を引き起こす。カルボキシル化プロトロンビンは、その場合に初めて血液
の血小板の膜と結合して凝固を引き起こすようになる。プロトロンビンは、カル
ボキシル化状態でのみカルシウム結合が可能である。このように、血液の凝固状
態は、カルボキシル化プロトロンビンの含有量によって推定可能である。
【０００６】
米国特許第４，７６９，３２０号に開示の方法では、カルボキシル化プロトロ
ンビンの含有量は、免疫測定法で抗体を使用して測定される。これら抗体は、カ
ルシウムが存在する状態でカルボキシル化プロトロンビンに特異なものであり、
脱カルボキシル化プロトロンビンには結合しない。血漿サンプル中のカルボキシ
ル化プロトロンビンのレベルを測定し、このような抗体を含むキットが説明され
ている。
ンビンの含有量は、免疫測定法で抗体を使用して測定される。これら抗体は、カ
ルシウムが存在する状態でカルボキシル化プロトロンビンに特異なものであり、
脱カルボキシル化プロトロンビンには結合しない。血漿サンプル中のカルボキシ
ル化プロトロンビンのレベルを測定し、このような抗体を含むキットが説明され
ている。
【０００７】
米国特許第５，２５２，７１２号では、脱カルボキシル化プロトロンビンに特
異なモノクローナル抗体を開示している。免疫測定法でこの抗体を使用すること
で、脱カルボキシル化プロトロンビンの濃度測定が可能になる。さらに、血液凝
固の状態に関する情報を得ることも可能になる。
異なモノクローナル抗体を開示している。免疫測定法でこの抗体を使用すること
で、脱カルボキシル化プロトロンビンの濃度測定が可能になる。さらに、血液凝
固の状態に関する情報を得ることも可能になる。
【０００８】
米国特許第４，７８０，４１０号では、脱カルボキシル化プロトロンビンを定
量化するためのサンドイッチ免疫測定法を開示している。この方法では、脱カル
ボキシル化プロトロンビン向けの固定化モノクローナル抗体が使用され、この抗
体に結合した脱カルボキシル化プロトロンビンは、プロトロビン向けの第２の抗
体によって検出される。この方法を実行するためのキットも説明されている。
量化するためのサンドイッチ免疫測定法を開示している。この方法では、脱カル
ボキシル化プロトロンビン向けの固定化モノクローナル抗体が使用され、この抗
体に結合した脱カルボキシル化プロトロンビンは、プロトロビン向けの第２の抗
体によって検出される。この方法を実行するためのキットも説明されている。
【０００９】
コーンバーグ Ａ等、”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８８（１９９３）”、第４
５４〜４６０頁では、コンペティタを使用する、サンプル中のカルボキシル化プ
ロトロンビンの濃度測定法を開示している。この場合、抗プロトロンビン固定化
抗体との結合に対して、ペルオキシダーゼで標識化されたプロトロンビンが、サ
ンプル中のプロトロンビンとコンペティタとして競合的に反応する。抗プロトロ
ンビン抗体に結合した、ペルオキシダーゼで標識化されたプロトロンビンは、酵
素反応により検出され得る。この結果生成される信号の大きさは、サンプル中の
プロトロンビン濃度に対して反比例する。
５４〜４６０頁では、コンペティタを使用する、サンプル中のカルボキシル化プ
ロトロンビンの濃度測定法を開示している。この場合、抗プロトロンビン固定化
抗体との結合に対して、ペルオキシダーゼで標識化されたプロトロンビンが、サ
ンプル中のプロトロンビンとコンペティタとして競合的に反応する。抗プロトロ
ンビン抗体に結合した、ペルオキシダーゼで標識化されたプロトロンビンは、酵
素反応により検出され得る。この結果生成される信号の大きさは、サンプル中の
プロトロンビン濃度に対して反比例する。
【００１０】
特開平５−２８４９９４号公報では、３種類のモノクローナル抗体を開示して
いる。第１の抗体は、ヒト脱カルボキシル化プロトロンビンに特異的に結合し、
第２の抗体は、ヒトプロトロンビン、ヒトトロンビン、およびヒト脱カルボキシ
ル化プロトロンビンに特異的に結合し、第３の抗体は、ヒト脱カルボキシル化プ
ロトロンビン、およびヒトプロトロンビンに特異的に結合する。
いる。第１の抗体は、ヒト脱カルボキシル化プロトロンビンに特異的に結合し、
第２の抗体は、ヒトプロトロンビン、ヒトトロンビン、およびヒト脱カルボキシ
ル化プロトロンビンに特異的に結合し、第３の抗体は、ヒト脱カルボキシル化プ
ロトロンビン、およびヒトプロトロンビンに特異的に結合する。
【００１１】
モノクローナル抗体を用いての、エライサ（ＥＬＩＳＡ）による血液中の脱カ
ルボキシル化プロトロンビンの測定法は、フォン−クリース Ｒ等、”Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｓ ６８（１９９２）”、第３８
３〜３８７頁に開示されている。
ルボキシル化プロトロンビンの測定法は、フォン−クリース Ｒ等、”Ｔｈｒｏ
ｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉｓ ６８（１９９２）”、第３８
３〜３８７頁に開示されている。
【００１２】
従来例における問題は、分析用サンプルがその採取後、直ちに分析されるとは
限らない点にある。サンプルの輸送に１、２日かかる場合もある。血液凝固に関
与する因子のほとんどが高感度であり、かつすぐに不活性化してしまう。この間
、主にサンプル中のカルボキシル化、および脱カルボキシル化プロトロンビンが
分解してしまう。その結果、血液凝固の状態が事実に反するものとなる。
限らない点にある。サンプルの輸送に１、２日かかる場合もある。血液凝固に関
与する因子のほとんどが高感度であり、かつすぐに不活性化してしまう。この間
、主にサンプル中のカルボキシル化、および脱カルボキシル化プロトロンビンが
分解してしまう。その結果、血液凝固の状態が事実に反するものとなる。
【００１３】
本発明の目的は、従来例の不都合を解消することにある。特に、プロトロンビ
ンの含有量の測定法を利用して、血液凝固の状態をより正確に測定することにあ
る。さらに、血液凝固の状態のより正確な測定を可能にするキットを提供するこ
とにある。
ンの含有量の測定法を利用して、血液凝固の状態をより正確に測定することにあ
る。さらに、血液凝固の状態のより正確な測定を可能にするキットを提供するこ
とにある。
【００１４】
本目的は、請求項１および１１の特徴により達成される。本発明の好適な成果
は、請求項２〜１０、および１２〜２０の特徴により明らかである。
は、請求項２〜１０、および１２〜２０の特徴により明らかである。
【００１５】
本発明によれば、血液の凝固状態を間接的に測定する方法であって、
ａ）ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性可能なプロテインを含
む体液を除去するステップ、 ｂ）カルボキシル化プロテインの第１の濃度、脱カルボキシル化プロテイン
の第２の濃度、およびカルボキシル化プロテインと脱カルボキシル化プロテイン
との総濃度からなる群から選ばれる少なくとも２つの濃度を測定するステップで
あって、第１の濃度は第１の抗体を用いて測定され、第２の濃度は第２の抗体を
用いて測定され、第３の濃度は第３の抗体を用いて測定され、 ｃ）第１と第２の濃度とから第１の比率を構成するステップ、または 第３と第１の濃度とから第２の比率を構成するステップ、または 第３と第２の濃度とから第３の比率を構成するステップであって、第１
、第２、または第３の比率の構成に必要であり、かつステップｂ）で測定されな
い濃度を以下の関係に従って計算し、 Ｃ３−Ｃ２＝Ｃ１、 ｄ）第１、第２、または第３の比率を血液の凝固状態と相関させるステップ
を備える、方法。
む体液を除去するステップ、 ｂ）カルボキシル化プロテインの第１の濃度、脱カルボキシル化プロテイン
の第２の濃度、およびカルボキシル化プロテインと脱カルボキシル化プロテイン
との総濃度からなる群から選ばれる少なくとも２つの濃度を測定するステップで
あって、第１の濃度は第１の抗体を用いて測定され、第２の濃度は第２の抗体を
用いて測定され、第３の濃度は第３の抗体を用いて測定され、 ｃ）第１と第２の濃度とから第１の比率を構成するステップ、または 第３と第１の濃度とから第２の比率を構成するステップ、または 第３と第２の濃度とから第３の比率を構成するステップであって、第１
、第２、または第３の比率の構成に必要であり、かつステップｂ）で測定されな
い濃度を以下の関係に従って計算し、 Ｃ３−Ｃ２＝Ｃ１、 ｄ）第１、第２、または第３の比率を血液の凝固状態と相関させるステップ
を備える、方法。
【００１６】
ここで、ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性可能なプロテインは
、血液の凝固状態に応じて、カルボキシル化、および脱カルボキシル化状態の両
方に比例して存在するプロテインであってもよい。このプロテインは、患者から
の採取が容易なプロテイン、例えば唾液からのプロテインであってもよい。また
、このプロテインは、プロトロンビンと同比率で低変性されたプロテインであっ
てもよい。抗体は、本発明における目的のために、カルボキシル化プロテイン、
脱カルボキシル化プロテイン、またはその両方に対して結合特異性を有する抗体
、抗体フラグメント、またはその他物質であってもよい。
、血液の凝固状態に応じて、カルボキシル化、および脱カルボキシル化状態の両
方に比例して存在するプロテインであってもよい。このプロテインは、患者から
の採取が容易なプロテイン、例えば唾液からのプロテインであってもよい。また
、このプロテインは、プロトロンビンと同比率で低変性されたプロテインであっ
てもよい。抗体は、本発明における目的のために、カルボキシル化プロテイン、
脱カルボキシル化プロテイン、またはその両方に対して結合特異性を有する抗体
、抗体フラグメント、またはその他物質であってもよい。
【００１７】
本発明における方法によれば、変性可能なプロテインの含有量に基づいて、血
液の凝固状態を正確に測定することが可能になる。この血液の凝固状態測定法に
よる誤差は、カルボキシル化プロテインの含有量と脱カルボキシル化プロテイン
の含有量との両方とこれら２つのプロテイン含有量の関連を考慮に入れることに
より、さらに最小化される。
液の凝固状態を正確に測定することが可能になる。この血液の凝固状態測定法に
よる誤差は、カルボキシル化プロテインの含有量と脱カルボキシル化プロテイン
の含有量との両方とこれら２つのプロテイン含有量の関連を考慮に入れることに
より、さらに最小化される。
【００１８】
本発明の一実施形態によれば、さらにステップｂ）において、少なくとも、第
１の濃度測定に第１のコンペティタを使用し、第２の濃度測定に第２のコンペテ
ィタを使用し、または第３の濃度測定に第３のコンペティタを使用する。ここで
いうコンペティタは、抗体の１つと結合するために、カルボキシル化プロテイン
、または脱カルボキシル化プロテイン、またはカルボキシル化／脱カルボキシル
化プロテインと競合的に反応する物質である。このコンペティタは、カルボキシ
ル化プロテインまたは脱カルボキシル化プロテインのどちらであってもよく、い
ずれの場合においても、標識化物質が付与される。完全なプロテインの代わりに
、このプロテインのフラグメントをコンペティタとして使用することもできる。
１の濃度測定に第１のコンペティタを使用し、第２の濃度測定に第２のコンペテ
ィタを使用し、または第３の濃度測定に第３のコンペティタを使用する。ここで
いうコンペティタは、抗体の１つと結合するために、カルボキシル化プロテイン
、または脱カルボキシル化プロテイン、またはカルボキシル化／脱カルボキシル
化プロテインと競合的に反応する物質である。このコンペティタは、カルボキシ
ル化プロテインまたは脱カルボキシル化プロテインのどちらであってもよく、い
ずれの場合においても、標識化物質が付与される。完全なプロテインの代わりに
、このプロテインのフラグメントをコンペティタとして使用することもできる。
【００１９】
これら抗体の少なくとも１つ、またはこれらコンペティタの少なくとも１つを
標識化物質、特に酵素、蛍光色素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビオチン
、ストレプトアビジン、またはアビジンと共役させるのが好ましい。酵素的反応
により検出可能な酵素であれば、酵素として使用し得る。金粒子で抗体を標識化
すれば、結合抗体がプラズモン共鳴法で検出可能になる。
標識化物質、特に酵素、蛍光色素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビオチン
、ストレプトアビジン、またはアビジンと共役させるのが好ましい。酵素的反応
により検出可能な酵素であれば、酵素として使用し得る。金粒子で抗体を標識化
すれば、結合抗体がプラズモン共鳴法で検出可能になる。
【００２０】
ステップｂ）で少なくとも２つの濃度を測定する代わりに、それらに相関する
合成信号を生成して、その信号を、第１、第２、および第３の抗体からなる群か
ら選ばれる２つの抗体と、必要であれば少なくとも１つのコンペティタとを使用
して測定し、血液の凝固状態と直接的に関連づけることも可能である。合成信号
は、それぞれ異なる信号が共に作用することによって生成され、第１、第２、ま
たは第３の比率に対応する。ステップｃ）におけるこれら比率の構成が不要にな
るため、この方法のより素早い簡便な実行が可能になる。合成信号は、特に蛍光
色素、フォルスター効果により誘発される蛍光信号、または蛍光信号内の消光剤
により引き起こされる還元により生成される合成色であってもよい。さらに、こ
の合成色は、それぞれ特有の色反応に触媒作用を及ぼす２つの酵素によって生成
されてもよい。フォルスター効果は、励起された第１の蛍光体から、隣接する第
２の蛍光体への無放射エネルギー移動に関与する。その結果、第２の蛍光体が励
起されて蛍光を発している間、第１の蛍光体は基底状態に移行する。、本発明の
方法によれば、例えば、第１および第２の抗体を、第１の効果を実現するこれら
蛍光体と共役させることも可能である。フォルスター効果により誘発される蛍光
信号により、第１の抗体と、隣接する第２の抗体との結合が実現できる。蛍光体
から消光剤への無放射エネルギー移動がなされると、その蛍光体は消光される。
従って、測定可能な総蛍光信号が低減する。
合成信号を生成して、その信号を、第１、第２、および第３の抗体からなる群か
ら選ばれる２つの抗体と、必要であれば少なくとも１つのコンペティタとを使用
して測定し、血液の凝固状態と直接的に関連づけることも可能である。合成信号
は、それぞれ異なる信号が共に作用することによって生成され、第１、第２、ま
たは第３の比率に対応する。ステップｃ）におけるこれら比率の構成が不要にな
るため、この方法のより素早い簡便な実行が可能になる。合成信号は、特に蛍光
色素、フォルスター効果により誘発される蛍光信号、または蛍光信号内の消光剤
により引き起こされる還元により生成される合成色であってもよい。さらに、こ
の合成色は、それぞれ特有の色反応に触媒作用を及ぼす２つの酵素によって生成
されてもよい。フォルスター効果は、励起された第１の蛍光体から、隣接する第
２の蛍光体への無放射エネルギー移動に関与する。その結果、第２の蛍光体が励
起されて蛍光を発している間、第１の蛍光体は基底状態に移行する。、本発明の
方法によれば、例えば、第１および第２の抗体を、第１の効果を実現するこれら
蛍光体と共役させることも可能である。フォルスター効果により誘発される蛍光
信号により、第１の抗体と、隣接する第２の抗体との結合が実現できる。蛍光体
から消光剤への無放射エネルギー移動がなされると、その蛍光体は消光される。
従って、測定可能な総蛍光信号が低減する。
【００２１】
便宜上、体液は血漿、血液、唾液、尿などでもよい。原則的に、変性可能なプ
ロテインを測定可能な含有量含んでいれば、どの体液も好適である。
ロテインを測定可能な含有量含んでいれば、どの体液も好適である。
【００２２】
本発明の進歩的特徴によれば、第１、第２、および／または第３の濃度、また
は合成信号の測定は、免疫学的方法で行われる。この場合の免疫学的方法は、支
持体、特にプラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリッ
プ、または膜によって固定化される、少なくとも１つの抗体に関与する。プラス
チックの形状は、試験用チューブ、試験用ストリップ、プラスチック粒子、また
は微量定量プレートのくぼみであってもよい。
は合成信号の測定は、免疫学的方法で行われる。この場合の免疫学的方法は、支
持体、特にプラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリッ
プ、または膜によって固定化される、少なくとも１つの抗体に関与する。プラス
チックの形状は、試験用チューブ、試験用ストリップ、プラスチック粒子、また
は微量定量プレートのくぼみであってもよい。
【００２３】
第１、第２、および／または第３の濃度、および／または合成信号は、色反応
あるいは蛍光検出によっても測定可能である。この場合、血液の凝固状態を特に
素早く簡便に測定することができる。
あるいは蛍光検出によっても測定可能である。この場合、血液の凝固状態を特に
素早く簡便に測定することができる。
【００２４】
好ましくは、ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性可能なプロテイ
ンは、脱カルボキシル化の状態において「ビタミンＫ拮抗作用、または欠乏によ
り誘起されるプロテイン」と称される、凝固因子（ＰＩＶＫＡ因子）、すなわち
プロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子のうちの１つ、またはネ
フロカルシンあるいはオステオカルシンである。ビタミンＫ依存性カルボキシラ
ーゼによってカルボキシル化され、経口用の抗凝固薬により同様に作用し得る他
のプロテインでも、血液の凝固状態の測定に使用することができる。例えば、ネ
フロカルシンは、尿中などで検出可能である。その際、このプロテイン用に血液
を採取する必要はない。そのため、血液の凝固状態の絶え間ないモニタリングを
必要とする患者の苦痛を著しく緩和できる。
ンは、脱カルボキシル化の状態において「ビタミンＫ拮抗作用、または欠乏によ
り誘起されるプロテイン」と称される、凝固因子（ＰＩＶＫＡ因子）、すなわち
プロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子のうちの１つ、またはネ
フロカルシンあるいはオステオカルシンである。ビタミンＫ依存性カルボキシラ
ーゼによってカルボキシル化され、経口用の抗凝固薬により同様に作用し得る他
のプロテインでも、血液の凝固状態の測定に使用することができる。例えば、ネ
フロカルシンは、尿中などで検出可能である。その際、このプロテイン用に血液
を採取する必要はない。そのため、血液の凝固状態の絶え間ないモニタリングを
必要とする患者の苦痛を著しく緩和できる。
【００２５】
さらに、本発明の方法を実行するためのキットが提供され、このキットには、
カルボキシル化プロテインの第１の濃度を免疫学的に測定するための第１の抗体
と、脱カルボキシル化プロテインの第２の濃度を免疫学的に測定するための第２
の抗体と、カルボキシル化および脱カルボキシル化プロテインの総濃度を免疫学
的に測定するための第３の抗体からなる群から選ばれる少なくとも２つの抗体が
含まれる。
カルボキシル化プロテインの第１の濃度を免疫学的に測定するための第１の抗体
と、脱カルボキシル化プロテインの第２の濃度を免疫学的に測定するための第２
の抗体と、カルボキシル化および脱カルボキシル化プロテインの総濃度を免疫学
的に測定するための第３の抗体からなる群から選ばれる少なくとも２つの抗体が
含まれる。
【００２６】
第１、第２、および第３の抗体は従来技術で既知の抗体であってよい。それら
抗体は、例えば、米国特許第５，２５２，７１２号、および米国特許第４，７６
９，３２０号に開示されており、その内容は参照目的でここに援用する。
抗体は、例えば、米国特許第５，２５２，７１２号、および米国特許第４，７６
９，３２０号に開示されており、その内容は参照目的でここに援用する。
【００２７】
キットは、少なくとも、第１の濃度を測定するための第１のコンペティタ、第
２の濃度を測定するための第２のコンペティタ、または第３の濃度を測定するた
めの第３のコンペティタをさらに含んでいてもよい。このキットに含まれるこれ
ら抗体またはコンペティタのうちの少なくとも１つは、標識化物質、特に酵素、
蛍光色素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビオチン、ストレプトアビジン、
またはアビジンと共役させるのが好ましい。
２の濃度を測定するための第２のコンペティタ、または第３の濃度を測定するた
めの第３のコンペティタをさらに含んでいてもよい。このキットに含まれるこれ
ら抗体またはコンペティタのうちの少なくとも１つは、標識化物質、特に酵素、
蛍光色素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビオチン、ストレプトアビジン、
またはアビジンと共役させるのが好ましい。
【００２８】
第１および第２の抗体は、好ましくは支持体により固定化される。支持体はプ
ラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリップ、または膜
であってよい。支持体が試験用ストリップである場合、第１および第２の抗体を
それぞれ試験用ストリップの異なる領域に吸収させる。好ましくは、このキット
には、標識化物質、特に酵素、蛍光色素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビ
オチン、ストレプトアビジン、またはアビジンと共役させた第３の抗体が含まれ
る。その場合、例えば試験用ストリップ上の色反応により、それぞれの含有量の
測定がとりわけ簡便化される。
ラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリップ、または膜
であってよい。支持体が試験用ストリップである場合、第１および第２の抗体を
それぞれ試験用ストリップの異なる領域に吸収させる。好ましくは、このキット
には、標識化物質、特に酵素、蛍光色素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビ
オチン、ストレプトアビジン、またはアビジンと共役させた第３の抗体が含まれ
る。その場合、例えば試験用ストリップ上の色反応により、それぞれの含有量の
測定がとりわけ簡便化される。
【００２９】
本発明のさらなる成果によれば、第３の抗体は上記、または別の支持体、特に
プラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリップ、または
膜により固定化される。支持体が上記、または別の試験用ストリップである場合
、第３の抗体をその試験用ストリップの領域に吸収させることが可能になる。好
ましくは、このキットには、いずれも標識化物質、特に酵素、蛍光色素、または
消光剤に共役させた第１および第２の抗体が含まれ、これら標識化物質は共に合
成信号、特に合成色、フォルスター効果により誘発された蛍光信号、または蛍光
信号内の消光剤により引き起こされる還元を生成できるように選ばれる。合成信
号は第１の比率に対応する。
プラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリップ、または
膜により固定化される。支持体が上記、または別の試験用ストリップである場合
、第３の抗体をその試験用ストリップの領域に吸収させることが可能になる。好
ましくは、このキットには、いずれも標識化物質、特に酵素、蛍光色素、または
消光剤に共役させた第１および第２の抗体が含まれ、これら標識化物質は共に合
成信号、特に合成色、フォルスター効果により誘発された蛍光信号、または蛍光
信号内の消光剤により引き起こされる還元を生成できるように選ばれる。合成信
号は第１の比率に対応する。
【００３０】
好ましくは、プロテインはプロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ
因子、ネフロカルシン、またはオステオカルシンである。
因子、ネフロカルシン、またはオステオカルシンである。
【００３１】
本発明の方法について、以下に図面を参照して説明する。
図１は、血液の凝固状態とｃＰＴ／ｄｃＰＴとの関連を示し、
図２は、血液の凝固状態とｄｃＰＴ／ｃＰＴとの関連を示し、
図３は、血液の凝固状態とｄｃＰＴとの関連を示す。
【００３２】
図１は、血液凝固状態ＩＮＲに対する、カルボキシル化、および脱カルボキシ
ル化プロトロンビンの濃度の比率を示すグラフである。この場合の濃度はＯＤ値
として測定される。血液凝固状態ＩＮＲは、測定比率が０．５である場合、３．
８である。
ル化プロトロンビンの濃度の比率を示すグラフである。この場合の濃度はＯＤ値
として測定される。血液凝固状態ＩＮＲは、測定比率が０．５である場合、３．
８である。
【００３３】
図２は、血液凝固状態ＩＮＲに対する脱カルボキシル化、およびカルボキシル
化プロトロンビンの濃度の比率を示すグラフである。この場合の比率は、特に血
液凝固状態ＩＮＲとよく相関していることが判る。
化プロトロンビンの濃度の比率を示すグラフである。この場合の比率は、特に血
液凝固状態ＩＮＲとよく相関していることが判る。
【００３４】
図３は、血液凝固状態ＩＮＲと、従来技術のｄｃＰＴとの関連性を示すグラフ
であり、サンプル採取者の年齢が高くなるにつれて変化する。
であり、サンプル採取者の年齢が高くなるにつれて変化する。
【００３５】
（実施例１）
微量定量プレートを使用する、いわゆるエライサ（ＥＬＩＳＡ）が連続測定に
は特に適している。
は特に適している。
【００３６】
ａ）サンプルの準備
微量定量プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）のくぼみを、それぞれ５０
μｌの抗体（炭酸塩緩衝液中で１０μｇ／ｍｌ）で一晩、４℃の温度でコーティ
ングする。その後、くぼみをＰＢＳで３回洗浄する。そのくぼみごとに、非特異
的な結合部をＰＢＳ中で１％ＢＳＡを５０μｌで１時間、室温で飽和させる。そ
の後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で３回洗浄す
る。
μｌの抗体（炭酸塩緩衝液中で１０μｇ／ｍｌ）で一晩、４℃の温度でコーティ
ングする。その後、くぼみをＰＢＳで３回洗浄する。そのくぼみごとに、非特異
的な結合部をＰＢＳ中で１％ＢＳＡを５０μｌで１時間、室温で飽和させる。そ
の後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で３回洗浄す
る。
【００３７】
次に、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ（くぼみごとに５０μｌ）で１：５０に希釈し
た以下のサンプルを微量定量プレートにそれぞれ載せる。 キャリブレーション血漿、 正常血漿、 患者の血漿、および プロトロンビン欠乏血漿（陰性対照）。
た以下のサンプルを微量定量プレートにそれぞれ載せる。 キャリブレーション血漿、 正常血漿、 患者の血漿、および プロトロンビン欠乏血漿（陰性対照）。
【００３８】
微量定量プレートを室温で１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．
０５％トウィーン２０で３回洗浄する。くぼみごとに、ウサギ抗完全プロトロン
ビンを５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）添加する。次に、微量定量プレートを室温で
１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０で３回
洗浄する。ビオチンに共役させた（Ｄｉｏｎｏｖａ、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで
１：２００００）ヤギ抗ウサギ抗体をくぼみごとに５０μｌ添加する。その微量
定量プレートを室温で１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％
トウィーン２０で３回洗浄する。
０５％トウィーン２０で３回洗浄する。くぼみごとに、ウサギ抗完全プロトロン
ビンを５０μｌ（１０μｇ／ｍｌ）添加する。次に、微量定量プレートを室温で
１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０で３回
洗浄する。ビオチンに共役させた（Ｄｉｏｎｏｖａ、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで
１：２００００）ヤギ抗ウサギ抗体をくぼみごとに５０μｌ添加する。その微量
定量プレートを室温で１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％
トウィーン２０で３回洗浄する。
【００３９】
ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ複合体をくぼみごとに５０μｌ添加す
る（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、共役緩衝液中で１：１０００）。そ
の微量定量プレートは室温で１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．
０５％トウィーン２０で３回洗浄する。
る（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、共役緩衝液中で１：１０００）。そ
の微量定量プレートは室温で１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．
０５％トウィーン２０で３回洗浄する。
【００４０】
進歩的反応を実現するために、くぼみごとにＡＢＴＳ溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉ
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ、 １ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加する。その後、微量定量
プレートを室温で３０分から１時間培養させる。吸収度（ＯＤ値）をエライサ（
ＥＬＩＳＡ）読み取り装置で測定する。
ａｇｎｏｓｔｉｃｓ、 １ｍｇ／ｍｌ）を５０μｌ添加する。その後、微量定量
プレートを室温で３０分から１時間培養させる。吸収度（ＯＤ値）をエライサ（
ＥＬＩＳＡ）読み取り装置で測定する。
【００４１】
結合プロトロンビンの検出に使用する抗プロトロンビン抗体が、ペルオキシダ
ーゼなどの酵素を標識化物質としてすでに含んでいる場合、この方法が著しく短
縮され得ることは自明である。この方法をさらに短縮するには、蛍光体などの直
接検出可能な標識化物質を使用する。そのような標識化物質を使用する場合、進
歩的反応は必要ない。
ーゼなどの酵素を標識化物質としてすでに含んでいる場合、この方法が著しく短
縮され得ることは自明である。この方法をさらに短縮するには、蛍光体などの直
接検出可能な標識化物質を使用する。そのような標識化物質を使用する場合、進
歩的反応は必要ない。
【００４２】
ｂ）評価
下記のものが測定される。
ａａ）完全プロトロンビンのＯＤ値（くぼみはモノクローナル抗完全プロトロ
ンビン抗体でコーティングされる） ｂｂ）脱カルボキシル化プロトロンビンのＯＤ値（くぼみはモノクローナル抗
脱カルボキシル化プロトロンビン抗体でコーティングされる） ｃｃ）カルボキシル化プロトロンビンのＯＤ値（完全プロトロンビンのＯＤ値
と、脱プロトロンビンのＯＤ値との差）。
ンビン抗体でコーティングされる） ｂｂ）脱カルボキシル化プロトロンビンのＯＤ値（くぼみはモノクローナル抗
脱カルボキシル化プロトロンビン抗体でコーティングされる） ｃｃ）カルボキシル化プロトロンビンのＯＤ値（完全プロトロンビンのＯＤ値
と、脱プロトロンビンのＯＤ値との差）。
【００４３】
その後、キャリブレーション血漿の測定ＯＤ値（図１〜３、ポイントＡ、Ｂ、
ＣおよびＤ参照）、および患者の測定血漿のＩＮＲに基づいて、キャリブレーシ
ョングラフを構成する。
ＣおよびＤ参照）、および患者の測定血漿のＩＮＲに基づいて、キャリブレーシ
ョングラフを構成する。
【００４４】
凝固状態は、ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性可能な、プロト
ロンビン以外のプロテインの対応濃度を測定することによっても測定できること
は自明である。例えば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、ネフロカルシン
、またはオステオカルシンなどのプロテインである。
ロンビン以外のプロテインの対応濃度を測定することによっても測定できること
は自明である。例えば、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、ネフロカルシン
、またはオステオカルシンなどのプロテインである。
【００４５】
（実施例２）
微量定量プレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、ＮＵＮＣ）の各くぼみを、カルボキシ
ル化および脱カルボキシル化プロトロンビン向けの抗体、または脱カルボキシル
化プロトロンビン向けの抗体（炭酸塩緩衝液中で１０μｇ／ｍｌ）５０μｌで、
一晩、４℃の温度でコーティングする。その後、くぼみをＰＢＳで３回洗浄する
。そのくぼみごとに、非特異的な結合部をＰＢＳ中で１％ＢＳＡを５０μｌで１
時間、室温で飽和させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０
で３回洗浄する。
ル化および脱カルボキシル化プロトロンビン向けの抗体、または脱カルボキシル
化プロトロンビン向けの抗体（炭酸塩緩衝液中で１０μｇ／ｍｌ）５０μｌで、
一晩、４℃の温度でコーティングする。その後、くぼみをＰＢＳで３回洗浄する
。そのくぼみごとに、非特異的な結合部をＰＢＳ中で１％ＢＳＡを５０μｌで１
時間、室温で飽和させる。その後、くぼみをＰＢＳ／０．０５％トウィーン２０
で３回洗浄する。
【００４６】
次に、ペルオキシダーゼで標識化された脱カルボキシル化プロトロンビンを、
以下のサンプル、すなわちＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：５０に希釈し、最終的
な濃度が３０μｇ／ｍｌのサンプルと共に、くぼみが抗体でコーティングされた
微量定量プレートに載せる（くぼみごとに５０μｌ）。 キャリブレーション血漿、 正常血漿、 患者の血漿、および プロトロンビン欠乏血漿（陰性対照）。
以下のサンプル、すなわちＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１：５０に希釈し、最終的
な濃度が３０μｇ／ｍｌのサンプルと共に、くぼみが抗体でコーティングされた
微量定量プレートに載せる（くぼみごとに５０μｌ）。 キャリブレーション血漿、 正常血漿、 患者の血漿、および プロトロンビン欠乏血漿（陰性対照）。
【００４７】
その微量定量プレートを室温で１時間培養させる。その後、くぼみをＰＢＳ／
０．０５％トウィーン２０で３回洗浄する。、そのくぼみごとに、ＡＢＴＳ溶液
（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加する。
その後、微量定量プレートを３０分から１時間室温で培養させる。この微量定量
プレートのくぼみにおけるＯＤ値を、エライサ（ＥＬＩＳＡ）読み取り装置で測
定する。くぼみのＯＤ値が高いほど、その特定サンプル中のプロトロンビン濃度
が低いことを示す。患者の血漿中のプロトロンビン濃度を、キャリブレーション
血漿を利用して構成したキャリブレーショングラフにより測定する。カルボキシ
ル化、および脱カルボキシル化プロトロンビン向けの抗体でコーティングされた
くぼみは、カルボキシル化および脱カルボキシル化プロトロンビンの総濃度測定
に使用する。脱カルボキシル化プロトロンビン向けの抗体でコーティングされた
くぼみは、脱カルボキシル化プロトロンビンの濃度測定に使用する。カルボキシ
ル化および脱カルボキシル化プロトロンビンの測定総濃度と、脱カルボキシル化
プロトロンビンの濃度との比率が判る。キャリブレーション血漿の比率に基づい
て、この比率から凝固状態を測定することができる。
０．０５％トウィーン２０で３回洗浄する。、そのくぼみごとに、ＡＢＴＳ溶液
（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加する。
その後、微量定量プレートを３０分から１時間室温で培養させる。この微量定量
プレートのくぼみにおけるＯＤ値を、エライサ（ＥＬＩＳＡ）読み取り装置で測
定する。くぼみのＯＤ値が高いほど、その特定サンプル中のプロトロンビン濃度
が低いことを示す。患者の血漿中のプロトロンビン濃度を、キャリブレーション
血漿を利用して構成したキャリブレーショングラフにより測定する。カルボキシ
ル化、および脱カルボキシル化プロトロンビン向けの抗体でコーティングされた
くぼみは、カルボキシル化および脱カルボキシル化プロトロンビンの総濃度測定
に使用する。脱カルボキシル化プロトロンビン向けの抗体でコーティングされた
くぼみは、脱カルボキシル化プロトロンビンの濃度測定に使用する。カルボキシ
ル化および脱カルボキシル化プロトロンビンの測定総濃度と、脱カルボキシル化
プロトロンビンの濃度との比率が判る。キャリブレーション血漿の比率に基づい
て、この比率から凝固状態を測定することができる。
【図１】
図１は、血液の凝固状態とｃＰＴ／ｄｃＰＴとの関連を示す。
【図２】
図２は、血液の凝固状態とｄｃＰＴ／ｃＰＴとの関連を示す。
【図３】
図３は、血液の凝固状態とｄｃＰＴとの関連を示す。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１１月９日（２００１．１１．９）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ
Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ
，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，
ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ
Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ
，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，
ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ
Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 ベルトリンク ウォルフ
ドイツ連邦共和国 エルランゲン 91056
マイゼンヴェーク 22
Ｆターム(参考） 2G045 AA25 BA01 CA25 CA26 CB03
CB07 DA36 DA77 FA18 FB03
FB07 FB11 FB17 GC10 JA01
2G054 AA02 AA06 AB04 BA01 CA23
CE01 EA03 EA04 EA07 GB04
GE06 JA07
Claims (20)
- 【請求項１】 血液の凝固状態を間接的に測定する方法であって、 ａ）ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性可能なプロテインを含む
体液を除去するステップ、 ｂ）カルボキシル化プロテインの第１の濃度（Ｃ１）、脱カルボキシル化プロ
テインの第２の濃度（Ｃ２）、およびカルボキシル化プロテインと脱カルボキシ
ル化プロテインとの総濃度（Ｃ３）からなる群から選ばれる少なくとも２つの濃
度を測定するステップであって、第１の濃度（Ｃ１）は第１の抗体（Ａ１）を用
いて測定され、第２の濃度（Ｃ２）は第２の抗体（Ａ２）を用いて測定され、第
３の濃度（Ｃ３）は第３の抗体（Ａ３）を用いて測定され、 ｃ）第１と第２の濃度（Ｃ２）とから第１の比率（Ｒ１）を構成するステップ
、または 第３（Ｃ３）と第１の濃度（Ｃ１）とから第２の比率（Ｒ２）を構成する
ステップ、または 第３（Ｃ３）と第２の濃度（Ｃ２）とから第３の比率（Ｒ３）を構成する
ステップであって、第１（Ｒ１）、第２（Ｒ２）、または第３（Ｒ３）の比率の
構成に必要であり、かつステップｂ）で測定されない濃度（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）
を以下の関係に従って計算し、 Ｃ３−Ｃ２＝Ｃ１、 ｄ）第１、第２、または第３の比率（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）を血液の凝固状態と
相関させるステップを備える、方法。 - 【請求項２】 さらにステップｂ）において、少なくとも、第１の濃度（Ｃ
１）測定に第１のコンペティタ（Ｋ１）を使用し、第２の濃度（Ｃ２）測定に第
２のコンペティタ（Ｋ２）を使用し、または第３の濃度（Ｃ３）測定に第３のコ
ンペティタ（Ｋ３）を使用することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 抗体（Ａ１、Ａ２、Ａ３）の少なくとも１つ、またはコンペ
ティタ（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）の少なくとも１つを標識化物質、特に酵素、蛍光色
素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビオチン、ストレプトアビジン、または
アビジンと共役させることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。 - 【請求項４】 ステップｂ）で少なくとも２つの濃度を測定する代わりに、
それらに相関する合成信号を生成して、その信号を、第１（Ａ１）、第２（Ａ２
）、および第３（Ａ３）の抗体からなる群から選ばれる２つの抗体と、必要であ
れば少なくとも１つのコンペティタ（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）とを使用して測定し、
血液の凝固状態と直接的に関連づけることを特徴とする、上記請求項のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項５】 合成信号は、特に蛍光色素、フォルスター効果により誘発さ
れる蛍光信号、または蛍光信号内の消光剤により引き起こされる還元により生成
される合成色であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 体液は血漿、血液、唾液、尿などであることを特徴とする、
上記請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 第１（Ｃ１）、第２（Ｃ２）、および／または第３の濃度（
Ｃ３）、または合成信号の測定は、免疫学的方法で行われることを特徴とする、
上記請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 免疫学的方法において、抗体（Ａ１、Ａ２、Ａ３）の少なく
とも１つは、支持体、特にプラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、
試験用ストリップ、または膜によって固定化されることを特徴とする、請求項７
に記載の方法。 - 【請求項９】 第１（Ｃ１）、第２（Ｃ２）、および／または第３の濃度（
Ｃ３）、および／または合成信号は、色反応あるいは蛍光検出によって測定され
ることを特徴とする、上記請求項のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 ビタミンＫ依存性γカルボキシラーゼにより変性可能なプ
ロテインは、プロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、ネフロカ
ルシン、またはオステオカルシンであることを特徴とする、上記請求項のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項１１】 上記請求項のいずれかに記載の方法を実行するためのキッ
トであって、カルボキシル化プロテインの第１の濃度（Ｃ１）を免疫学的に測定
するための第１の抗体（Ａ１）と、脱カルボキシル化プロテインの第２の濃度（
Ｃ２）を免疫学的に測定するための第２の抗体（Ａ２）と、カルボキシル化およ
び脱カルボキシル化プロテインの総濃度（Ｃ３）を免疫学的に測定するための第
３の抗体（Ａ３）からなる群から選ばれる少なくとも２つの抗体を含むことを特
徴とする、キット。 - 【請求項１２】 少なくとも、第１の濃度（Ｃ１）を測定するための第１の
コンペティタ（Ｋ１）、第２の濃度（Ｃ２）を測定するための第２のコンペティ
タ（Ｋ２）、または第３の濃度（Ｃ３）を測定するための第３のコンペティタ（
Ｋ３）をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載のキット。 - 【請求項１３】 抗体（Ａ１、Ａ２、Ａ３）の少なくとも１つ、またはコン
ペティタ（Ｋ１、Ｋ２、Ｋ３）の少なくとも１つは、標識化物質、特に酵素、蛍
光色素、消光剤、金粒子、ラテックス粒子、ビオチン、ストレプトアビジン、ま
たはアビジンと共役されていることを特徴とする、請求項１１または１２に記載
のキット。 - 【請求項１４】 第１（Ａ１）および第２の抗体（Ａ２）は、支持体、特に
プラスチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリップ、または
膜によって固定されることを特徴とする、請求項１１から１３のいずれかに記載
のキット。 - 【請求項１５】 支持体が試験用ストリップであり、第１（Ａ１）および第
２の抗体（Ａ２）をそれぞれ試験用ストリップの異なる領域に吸収させることを
特徴とする、請求項１４に記載のキット。 - 【請求項１６】 標識化物質、特に酵素、蛍光色素、消光剤、金粒子、ラテ
ックス粒子、ビオチン、ストレプトアビジン、またはアビジンと共役させた第３
の抗体（Ａ３）が含まれることを特徴とする、請求項１４または１５に記載のキ
ット。 - 【請求項１７】 第３の抗体（Ａ３）が前記、または別の支持体、特にプラ
スチック、磁気粒子、ラテックス粒子、金粒子、試験用ストリップ、または膜に
より固定化されることを特徴とする、請求項１１から１６のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項１８】 支持体が前記、または別の試験用ストリップであり、第３
の抗体（Ａ３）をその試験用ストリップの領域に吸収させることを特徴とする、
請求項１７に記載のキット。 - 【請求項１９】 標識化物質、特に酵素、蛍光色素、または消光剤に共役さ
せた第１（Ａ１）および第２の抗体（Ａ２）が含まれ、これら標識化物質は共に
合成信号、特に合成色、フォルスター効果により誘発される蛍光信号、または蛍
光信号内の消光剤により引き起こされる還元を生成できるように選ばれることを
特徴とする、請求項１７または１８に記載のキット。 - 【請求項２０】 プロテインはプロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子
、第Ｘ因子、ネフロカルシン、またはオステオカルシンであることを特徴とする
、請求項１１から１９のいずれかに記載のキット。
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